Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie rozkładu endogennego łącznika, teryny i pcam podczas migracji trans śródbłonka leukocytów w warunkach przepływu fizjologicznego. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw leukocytów wielojądrzastych lub PMN z pełnej krwi zdrowych ochotników za pomocą gradientu proco. Drugim krokiem jest dodanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał do monowarstwy ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej stymulowanej TNF alfa, hodowanej na szkiełkach przepływowych 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przepływowego.

Umożliwi to wizualizację dynamiki połączeń komórek śródbłonka podczas migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu. Następnie szkiełko przepływowe zawierające znakowane fluorescencyjnie komórki śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej stymulowane TNF alfa podłącza się do systemu przepływu i umieszcza na stoliku mikroskopowym. Pompa wciągnie bufor przepływu ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki.

Ostatnim krokiem jest powolne wstrzykiwanie PMN do systemu przepływowego przez port iniekcyjny. Ostatecznie PMN są wizualizowane za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i transmigrują.

Eksperyment można przerwać w dowolnym momencie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak statyczne testy transmigracji, jest to, że dzięki niej można badać adhezję i transmigrację w prawdziwym życiu w fizjologicznych warunkach przepływu. Pomoże nam to zrozumieć, dlaczego leukocyty wybierają jeden korzeń zamiast drugiego, a więc PGA kontra migracja międzykomórkowa.

Robimy to, wizualizując połączenia komórkowe komórek z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HU X w tym eksperymencie są hodowane zgodnie z instrukcjami producenta na naczyniach pokrytych fibronektyną przy użyciu pożywki uzupełnionej wzrostem śródbłonka. Średni. Hodowlę komórkową stosuje się od czterech do ośmiu pasaży, gdy komórki osiągną 80 do 90%Confluence, ostrożnie umyj je PBS o temperaturze pokojowej o pH 7,4, a następnie trypsyna to komórki po trypsyny i odwirowaniu.

Zawieszamy na poziomie 800 000 komórek na mililitr za pomocą pożywki. W eksperymencie wykorzystuje się komory przepływowe, które zostały pokryte fibronektyną na płytce z poprzedniego dnia. 80 000 komórek w każdym kanale komór przepływowych kodowanych fibronektyną i delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla następnego dnia.

Odśwież media w szkiełku komory przepływowej, delikatnie przechylając suwak pod kątem 45 stopni. Zaleca się usuwanie mediów tylko ze zbiorników, a nie z samego kanału. Usunięcie pożywki z kanałów może spowodować utratę komórek śródbłonka i śmierć z powodu siły ciągnięcia pożywki spowodowanej pipetowaniem.

Sprawdź za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, czy komórki śródbłonka utworzyły monowarstwę. Jeśli komórki nie są w 100% zbieżne, zmieniaj pożywkę dwa razy dziennie, aż osiągną 100% zbieżności. Gdy komórki osiągną 100% płynności CO, stymuluj komórki pożywką zawierającą mediator stanu zapalnego.

TNF alfa stymulujący uix przez noc z TNF alfa powoduje zapalny fenotyp śródbłonka IE regulację w górę cząsteczek adhezyjnych komórek, takich jak ICAM one i VA M1. Przed wyizolowaniem leukocytów wielojądrzastych lub PMN. Przygotować bufor przepływowy do przemywania izolowanych PMN i do użycia w teście przepływu do 100 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu podstawowego. Na 100 mikrolitrów świeżego jednomolowego chlorku wapnia, 2,5 mililitra albuminy ludzkiej ze stężenia 200 gramów na litr i 0,1 grama glukozy.

Przefiltruj bufor przepływu za pomocą filtra 0,45 mikrona. 10% roztwór cytrynianu trisodowego lub TNC w PBS o pH 7,4 jest również przygotowywany przed izolacją PMN. PMN zostaną wyizolowane z 20 mililitrów pełnej krwi pobranej w heparynie sodowej od zdrowego ochotnika.

Najpierw rozcieńczyć krew pełną jeden do jednego 10% PBST NNC w 15-mililitrowej probówce. Następnie użyj chłopca do pipetowania na najwolniejszym ustawieniu, aby ostrożnie pipetować 20 mililitrów rozcieńczonej krwi na 12,5 mililitra roztworu koloidalnego na 12,5 mililitra na co roztwór koloidalny w wodzie o gęstości 1,130 grama na mililitr w nowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Probówka zawierająca per coll powinna być przechylona pod kątem 45 stopni podczas dodawania krwi.

Ostrożnie umieścić probówki w wirówce i wirować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy sile 800 G przy niskim przyspieszeniu i z wyłączonymi hamulcami po zakończeniu wirowania. Usuń cały płyn i napełnij każdą probówkę lodowatym buforem do lizy erytrocytów, aby ługować erytrocyty. Pozostaw probówki na lodzie, od czasu do czasu odwracając je, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnoczerwony, wiruj w temperaturze 500 GS przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy włączonych hamulcach.

Powstała frakcja osadu zawiera PMN Wraz z erytrocytami usunąć supernatant i dwukrotnie umyć osad w lodzie. Bufor do lizy na zimno o stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu z drugiego przemycia, ponownie zawiesić osad z buforem przepływowym w temperaturze pokojowej i określić stężenie PMN za pomocą automatycznego licznika komórek.

Na koniec zawiesić PMN w buforze przepływowym jednorazowo od 10 do sześciu komórek na mililitr i utrzymywać w temperaturze pokojowej, aby oznaczyć śródbłonkową złącze VA kadheryny i pcam jeden. Dodać przeciwciało pcam LOR 6 47 w rozcieńczeniu jeden do 100 i niezależne od wapnia przeciwciało kadheryny FE ZI w rozcieńczeniu jeden do 50 do hodowli VE, pożywkę w komorze przepływowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować PMN do testu, umieść je w łaźni wodnej na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem do systemu przepływowego.

Podłącz rurkę do pustej komory przepływowej i napełnij ją buforem ciepłego przepływu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Podczas ustawiania systemu przepływu. Za pomocą silikonowej rurki podłącz jedną stronę pustej komory przepływowej do systemu przepływu pompy strzykawkowej zawierającego strzykawkę o pojemności 20 mililitrów.

Umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu. Test zostanie przeprowadzony przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektyw olejowy 63 x oraz komorę klimatyczną ustawioną na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Podłącz drugą stronę pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza i uruchom pompę strzykawkową w celu napełnienia wszystkich przewodów buforem przepływowym, pompa wciągnie bufor przepływu ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki.

Ta rurka zawiera również wbudowany port do wstrzykiwania przynęty, który umożliwia wstrzykiwanie PMN za pomocą igły do działającego eksperymentu bez zatrzymywania przepływu i tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie wymień pustą komorę przepływową na komorę przepływową zawierającą VE poddane działaniu TNF alfa ściśnij rurki przed odłączeniem i ponownym podłączeniem ich do komory zawierającej VE.To uniknąć pęcherzyków powietrza w układzie, bardzo ważne jest, aby ścisnąć i zacisnąć rurki. Podczas łączenia szkiełka zawierającego komórki.

Umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu, dostosuj prędkość przepływu do jednego centymetra kwadratowego zgodnie z fizjologiczną prędkością przepływu w kapilarnach zamkniętych, która wynosi od jednego do pięciu dines na centymetr kwadratowy rekordowy kontrast interferencyjny różnicowy lub DIC fite LOR 6 47. Jednocześnie, za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra, powoli wstrzykuj PMN do systemu przepływu przez port do wstrzykiwania przynęty w linii. Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i transmigrują, zatrzymując eksperyment w dowolnym momencie.

Odłączając rurkę od komory przepływowej i pipetując utrwalacz af fixative do komory przepływowej, zmierzono oporność monowarstw śródbłonka w celu zbadania, czy przeciwciała zakłócają funkcję barierową śródbłonka. Nie zaobserwowano żadnej zmiany w oporności, gdy VE mógł usłyszeć klon przeciwciała 55 7 H jeden lub kontrolny izotyp został dodany do komórek. W przeciwieństwie do tego, przeciwciało blokujące słuch VE CL 75 znacznie zmniejszyło oporność.

Analiza RAP nie wykazała zmian w odzyskiwaniu fluorescencji w obecności lub braku VE CADHERIN 55 7 H jednego przeciwciała, co wskazuje, że przeciwciało nie zmieniło dynamiki dystrybucji kadheryny VE, kadheryny VE i pcam one podczas migracji trans śródbłonka neutrofili lub TEM w czasie rzeczywistym. Górny panel pokazuje neutrofile obrysowany na biało, przylegający do śródbłonka i przecinający połączenie komórka z komórką bez szkody dla dystrybucji koherentu VE i pcam jeden. Podczas diapedezy można zaobserwować miejscową dyspersję koherentu VE i P chem jeden, gdy neutrofile wystają przez komórkę do połączeń komórkowych zaznaczonych na biało, to neutrofile na szczycie śródbłonka.

Żółty kontur pokazuje błonę neutrofili, która znajduje się już pod śródbłonkiem. Po zakończeniu diapedezy połączenia zamykają się i są koherentne, a pcam jeden jest przenoszony w miejscach diapedozy. Granice migrujących neutrofili trans są zaznaczone na żółto.

Po tej procedurze można przeprowadzić migrację trans śródbłonka leukocytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy leukocyty przekraczają śródbłonek za pomocą baggi czy korzenia transkomórkowego.