Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym transmigracji neutrofili przez śródbłonek pod wpływem przepływu fizjologicznego. Technika umożliwia wizualizację dynamiki białek VE-cadherin i PECAM-1 w komórkach endotelialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. P.L. Hordijkowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Defibrylator AED jest wspierany przez stypendium Fundacji Landsteiner na rzecz Badań nad Transfuzją Krwi (LSBR) (grant #1028). JK jest wspierany przez Holenderską Fundację Kardiologiczną (2005T3901). JDvB jest stypendystą NHS Dekker (grant #2005T039).

Neutrofile zostały wyizolowane od zdrowych ochotników, którzy podpisali świadomą zgodę. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.
1. Poszycie i pielęgnacja komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zgodnie z instrukcjami producenta. Hoduj HUVEC na szalkach pokrytych fibronektyną (FN) (10 μg/ml, rozpuszczonych w wodzie demineralizowanej) przy użyciu pożywki (pożywka Endothelial Basal Medium (EBM-2) uzupełniona pojedynczymi kwotami Endothelial Growth Medium (EGM-2)). Do eksperymentów należy użyć hodowli komórkowej między 4-8 pasażami.</li>
	<li>Dzień 1: Pokryć komory przepływowe 100 μl fibronektyny (10 μg/ml w PBS) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dzień 2: Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, trypsynizuj komórki po dokładnym umyciu solą fizjologiczną buforowaną fosforanem RT (PBS) o pH 7,4, odwiruj przy 800 x g i ponownie zawieś przy 800 000 komórek/ml za pomocą pożywki. Umieść 80 000 komórek w każdym kanale komór przepływowych pokrytych FN i delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół. Hodowla O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dzień 3: Odświeżyć pożywkę w szkiełku komory przepływowej, delikatnie przechylając szkiełko pod kątem 45°. (patrz rysunek 1A). 
	UWAGA: Zaleca się usuwanie mediów tylko ze zbiorników, a nie z samego kanału. Usunięcie pożywki z kanałów może spowodować utratę komórek śródbłonka i śmierć z powodu siły ciągnięcia pożywki spowodowanej pipetowaniem.</li>
	<li>Sprawdź za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, czy komórki śródbłonka utworzyły monowarstwę (tj. 100% zlewającą się). Jeśli komórki nie są w 100% zlewne, zmieniaj pożywkę dwa razy dziennie, aż osiągną 100% konfluencję.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieżność, stymulować je pożywką (patrz krok 1.1) zawierającą mediator stanu zapalnego (TNF-α (10 ng / ml)). Stymulacja HUVEC O/N (tj. 12 godzin) za pomocą TNF-α powoduje fenotyp zapalny śródbłonka, tj. regulację w górę cząsteczek adhezyjnych komórek, takich jak ICAM-1 i VCAM-1 13.</li>
</ol>
2. Izolacja leukocytów wielojądrzastych za pomocą gradientów Percoll
<ol>
	<li>Przygotować bufor kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) (zwanego dalej: buforem przepływowym) przed wyizolowaniem leukocytów wielojądrzastych (PMN). Bufor przepływowy służy do mycia izolowanych PMN oraz jako bufor w teście przepływowym. Aby przygotować bufor przepływowy: rozcieńczyć 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO4•7H2O (1 mM), K2HPO4•3H2O (1,2 mM) w 1 l wody zdemineralizowanej i dostosować do pH 7,4 (ten bulion można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni).</li>
	<li>Dodać świeże 100 μl 1 M CaCl2 (1 mM), 2,5 ml albuminy ludzkiej o stężeniu podstawowym 200 g/l (0,5% v/v) i 0,1 g glukozy do 100 ml (0,1% w/v) buforu przepływowego. Następnie przefiltruj bufor przepływowy za pomocą filtra 0,45 μm. UWAGA: Ten bufor przepływu musi być przygotowywany na świeżo do każdego eksperymentu.</li>
	<li>Przed izolacją PMN należy przygotować 10% roztwór cytrynianu trisodowego (TNC) w PBS o pH 7,4.</li>
	<li>Zbierz 20 ml krwi pełnej w wakuetach heparyny sodowej od zdrowego ochotnika. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 10% PBS/TNC w probówkach o pojemności 50 ml i ostrożnie odpipetować 20 ml rozcieńczonej krwi na 12,5 ml Percollu (23% (w/w) roztworu koloidalnego w wodzie o gęstości 1,130 g/ml) w nowej probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie umieścić probówki w wirówce i wirować przez 20 minut przy 800 x g z niskim przyspieszeniem i bez przerwy ustawionej na RT. 
	UWAGA: Podczas dodawania rozcieńczonej krwi do Percollu, przechyl probówkę zawierającą Percoll pod kątem 45° i delikatnie pipetuj rozcieńczoną krew w probówce przy najwolniejszym ustawieniu pipetownika.</li>
	<li>Usuń cały płyn, a następnie napełnij probówkę lodowatym buforem do lizy erytrocytów (4,15 g NH4Cl [0,155 M], 0,5 g KHCO3 [0,01 M] i 18,5 mg EDTA (triplex III) [0,1 mM] do 500 ml lodowategoH2O) w celu lizy erytrocytów. Pozostawić probówkę na lodzie, od czasu do czasu odwracając probówkę, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnoczerwony, a następnie odwirować 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C z włączonymi przerwami. 
	UWAGA: Frakcja osadu zawiera PMN (neutrofile, eozynofile, bazofile) wraz z erytrocytami.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć osad w lodowatym buforze do lizy o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad z buforem przepływowym w temperaturze pokojowej i określić stężenie PMN za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić PMN w buforze przepływowym o stężeniu 1 x 106 komórek/ml i utrzymywać w temperaturze pokojowej uwagi.</li>
</ol>
3. Oznakowanie śródbłonkowej złącza VE-kadheryny i PECAM-1
<ol>
	<li>Dodać przeciwciało PECAM Alexa Fluor 647 (klon WM59) w rozcieńczeniu 1:100 i niezależne od wapnia przeciwciało VE-kadheryna-FITC (klon 55-7H1) w rozcieńczeniu 1:50 do pożywki hodowlanej HUVEC (patrz krok 1.1) i inkubować przez 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przepływowego, aby uwidocznić dynamikę połączeń komórek śródbłonka podczas migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu. 
UWAGA: Przed dodaniem bezpośrednio znakowanych przeciwciał do komór przepływowych należy upewnić się, że objętość w każdym kanale nie przekracza 100 μl. Pomaga to utrzymać wydatki na przeciwciała na jak najniższym poziomie.</li>
</ol>
4. Test PMN TEM w przepływie
<ol>
	<li>Umieścić PMN w łaźni wodnej na 15 minut w temperaturze 37 °C przed wstrzyknięciem ich do systemu przepływowego.</li>
	<li>Podłącz rurkę do pustej komory przepływowej i napełnij ją ciepłym (np. 37 °C) buforem przepływowym (patrz krok 4.3), aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas ustawiania systemu przepływu.</li>
	<li>Podłączyć jedną stronę pustej komory przepływowej do systemu przepływu pompy strzykawkowej za pomocą silikonowej rurki zawierającej strzykawkę o pojemności 20 ml i umieścić komorę przepływową w stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Podłączyć drugą stronę pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 °C (rysunek 1B) i uruchomić pompę strzykawkową w celu napełnienia całego przewodu buforem przepływowym. Pompa przeciągnie bufor przepływowy ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki. UWAGA: Ten przewód zawiera również wbudowany port do wstrzykiwania Luer, który umożliwia wstrzykiwanie PMN za pomocą igły do działającego eksperymentu bez zatrzymywania przepływu i tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zastąp pustą komorę przepływową komorą przepływową zawierającą HUVEC nasączone TNF-α, podłącz rurkę zawierającą bufor przepływowy i umieść ją w stoliku mikroskopu (Rysunek 1C). Ściśnij rurki przed odłączeniem i ponownym podłączeniem ich do komór zawierających HUVEC, ponieważ brak ściśnięcia może spowodować tworzenie się pęcherzyków powietrza wewnątrz przewodów i/lub komór przepływowych.</li>
	<li>Ustawić prędkość przepływu na 1 dyn/cm2, zgodnie z fizjologiczną prędkością przepływu w żyłkach podkapilarnych (1-5 dyn/cm2).</li>
	<li>Rejestruj jednocześnie kontrast interferencyjny różnicowy (DIC), FITC (488 nm) i Alexa Fluor 647 (647 nm) za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
	<li>Wstrzykiwać PMN (krok 4.1) powoli do systemu przepływowego przez wbudowany port do wstrzykiwań Luer (rysunek 1D) za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i migrują. Przerwij eksperyment w dowolnym momencie, odłączając rurkę od komory przepływowej i pipetując utrwalacz (3,7% formaldehydu w PBS) do komory przepływowej. Pozostawić do utrwalenia na 10 minut, a następnie przemyć PBS. Dane są analizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz tabela materiałów i sprzętu). 
	UWAGA: Eksperyment należy przeprowadzić przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w komorę klimatyczną o stałej temperaturze 37 °C, 5%CO2 i obiektyw olejowy 63X.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis--an+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases%3A+%27+vascular+rheumatology%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224(2008).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li>
<li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+migration%3A+cell-cell+contacts+get+intimate%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li>
<li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li>
<li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li>
<li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li>
<li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li>
<li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li>
<li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro%3A+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li>
<li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W przypadku tego protokołu kluczowe znaczenie ma zapobieganie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorach przepływowych, ponieważ spowoduje to apoptozę komórek i zakłócenie monowarstwy. Aby tego uniknąć, pragniemy podkreślić, aby zwrócić szczególną uwagę na kroki 4.2 i 4.5, w których rurki są podłączone do komory przepływowej. Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest zalewanie PMN, które są utrzymywane w temperaturze pokojowej poprzez inkubację przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C przed wstrzyknięciem do komory przepływowej (krok 4.1). Powoduje to pobudzenie integryn leukocytów, umożliwiając im przyleganie do cząsteczek adhezyjnych, takich jak ICAM-1 lub VCAM-1 w śródbłonku.
Protokół ten nie ogranicza się do badania transmigracji neutrofili. Można również stosować inne typy leukocytów, takie jak monocyty lub limfocyty. Należy pamiętać, że krok 4.1, tj. przygotowanie leukocytów, może się różnić w zależności od typu leukocytów. Można również stosować inne rodzaje komórek śródbłonka. W tym celu kluczowe znaczenie ma stymulacja komórek śródbłonka odpowiednimi bodźcami zapalnymi, takimi jak TNF-α lub IL-1β. Jeśli neutrofile nie reagują podczas transmigracji, można rozważyć krótkie leczenie neutrofili (5 min) peptydem N-formylo-L-metionylo-L-leucylo-L-fenyloalaniny (fMLP)16. To jeszcze bardziej pobudzi neutrofile, w szczególności ich integryny, czyniąc je bardziej podatnymi na przyleganie do śródbłonka.
Zazwyczaj stosuje się prędkość przepływu 1 dyn/cm2 . Ta prędkość przepływu jest mierzona w żyłkach zakapilarnych, miejscach, w których zachodzi większość migracji przezśródbłonkowej leukocytów17. Za pomocą opisanych komór przepływowych możliwe jest zwiększenie prędkości przepływu do 10 dyn/cm2. Nie zaleca się jednak dalszego zwiększania ścinania. Może to spowodować niepożądany wyciek rurki i odłączenie ogniw od komory przepływowej.
Wyniki opisane na rycinie 3 wskazują, że przeciwciała te można wykorzystać do wizualizacji i badania dynamiki połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas diapedezy leukocytów. W szczególności, oprócz istniejących testów transmigracji, protokół ten pozwala na odróżnienie migracji parakomórkowej od transkomórkowej w fizjologicznych warunkach przepływu w czasie rzeczywistym. Ponieważ przeciwciała barwią połączenia komórka-komórka, można ocenić liczbę leukocytów, które przecinają połączenia VE-kadheryna/PECAM-1-dodatnie w porównaniu z niedodatnimi miejscami VE-kadheryna/PECAM-1. W ten sposób migrację transkomórkową można odróżnić od migracji parakomórkowej.
Należy podkreślić, że przeciwciała te nie zakłócają funkcji białek, z którymi się wiążą: przeciwciało PECAM-1 użyte w tym badaniu jest skierowane przeciwko drugiej domenie zewnątrzkomórkowej. Komórki śródbłonka, które zostały posiane w obecności przeciwciała, nie wykazywały żadnych wad w rozprzestrzenianiu się lub tworzeniu monowarstwy, co sugeruje, że przeciwciało przynajmniej nie zakłócało homotypowych interakcji między komórkami śródbłonka. Ponadto oba przeciwciała nie upośledzają zdolności neutrofili do migracji przez monowarstwę śródbłonka. Ponadto liczba neutrofili, które migrują przez monowarstwę śródbłonka pod nieobecność lub obecność przeciwciał, nie ulega zmianie (dane nie pokazane). Co ważne, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa daje nam możliwość jednoczesnej rejestracji różnych kanałów fluorescencyjnych i DIC.
Tak więc test ten pozwala na badanie dynamiki kadheryny VE i PECAM-1 w tym samym czasie, gdy neutrofile przecinają połączenie komórka-komórka śródbłonka i pomoże zrozumieć, dlaczego leukocyty wybierają jedną drogę zamiast drugiej, tj. parakomórkową w porównaniu z transkomórkową.

Efektywna i ściśle kontrolowana transśródbłonkowa migracja leukocytów (TEM) ma kluczowe znaczenie w procesach fizjologicznych, takich jak nadzór immunologiczny i ostre stany zapalne. Jednak w pewnych stanach patofizjologicznych obserwuje się niekontrolowane i nadmierne TEM skutkujące przewlekłymi chorobami zapalnymi (np. reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca, astma). Również podczas przerzutów do komórek nowotworowych proces migracji przezśródbłonkowej ma zasadnicze znaczenie dla komórek nowotworowych, które opuszczają krążenie w celu uzyskania przerzutów1-3. Aby specyficznie ingerować w nadmierną ilość leukocytów lub komórek nowotworowych TEM, wymagane jest szczegółowe zrozumienie regulacji tego procesu.
Uważa się, że proces TEM przebiega w różnych etapach. Przełomowe badania, zrecenzowane dwie dekady temu przez Butchera i Springera, doprowadziły do powstania wieloetapowego modelu opisującego proces TEM4,5. Ten model jest nadal aktualny, chociaż uwzględniono kilka dodatkowych kroków6. Alon i wsp.opisywał potrzebę obecności unieruchomionych chemokin na powierzchni śródbłonka7. Ostatnio wykazali, że śródbłonek sam wytwarza chemokiny, które są prezentowane na powierzchni wierzchołkowej śródbłonka8. Co więcej, ta sama grupa zwróciła uwagę na znaczenie warunków przepływu podczas TEM7. Ostatnio pojawiło się kilka publikacji poświęconych dwóm różnym drogom, jakie mogą przebyć leukocyty na końcowym etapie diapedezy TEM. Mogą one przechodzić przez połączenia komórka-komórka, tj. Drogę migracji parakomórkowej, lub przechodzić przez ciało komórki śródbłonka, znane jako droga migracji międzykomórkowej9. Carman i współpracownicy szczegółowo zbadali te szlaki i doszli do wniosku, że leukocyty preferencyjnie wybierają drogę migracji parakomórkowej (90%) nad drogą transkomórkową (10%) podczas przekraczania monowarstwy śródbłonka żyły pępowinowej10. Jednak, gdy wykorzystano komórki śródbłonka o innym pochodzeniu, np. mózgu lub mikrokrążenia, więcej leukocytów korzystało z drogi transkomórkowej (30%)11. Grupa Vestweber wykazała niedawno, że gdy połączenia komórka-komórka nie były w stanie oddzielić się od siebie za pomocą modelu zwierzęcego typu knock-in, zastępując endogenną VE-kadherynę chimerą VE-kadheryna-alfa-katenina, TEM leukocytów był całkowicie zablokowany12. Co zaskakujące, autorzy zauważyli, że TEM był zablokowany w kilku, ale nie we wszystkich tkankach. Ogólnie rzecz biorąc, te eleganckie eksperymenty wykazały, że leukocyty preferowały drogę parakomórkową nad drogą transkomórkową, chociaż sygnały regulacyjne, które wywołują tę decyzję, są nadal nieznane.
Mimo że większość leukocytów preferuje drogę migracji parakomórkowej, nadal trudno jest rozróżnić obie te ścieżki. Ponadto, pomimo kilku badań koncentrujących się na roli połączeń komórka-komórka śródbłonka, dynamika tych połączeń, w szczególności białek połączeniowych VE-kadheryna i PECAM-1, podczas krzyżowania leukocytów jest nadal przedmiotem dyskusji. Opracowaliśmy stosunkowo prosty test, w którym te cząsteczki połączeniowe mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym podczas diapedezy leukocytów w fizjologicznych warunkach przepływu przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Przeciwciała te nie zakłócały ani nie blokowały integralności połączeń lub ruchliwości docelowych białek. Ten test pozwala nam śledzić dynamikę białek połączeniowych podczas procesu parakomórkowego TEM. Dodatkowo test ten pozwala również na rozróżnienie między szlakami migracji para- i transkomórkowej.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Slide VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Komora przepływowa</td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtr M&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml&nbsp;</td>Strzykawka <td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml&nbsp;</td><td>Igła BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 G&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Czynniki wzrostu</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>media EDTA (Titriplex III)</td><td>Probówki Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Port do wstrzykiwania Luer w linii&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4&bull; 7H2O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>klon WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuwodny trójwodny (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy wąż Tygon 3350</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>rurka</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>Numer modelu aparatu Harvard</td><td>55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>czynnik martwicy nowotworu</td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Niemcy</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>Klon 560411 BD Pharmingen</td><td></td><td>55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Podczas stanu zapalnego, leukocyty opuszczają krążenie i przechodzą przez śródbłonek, aby zwalczać atakujące patogeny w leżących poniżej tkankach. Proces ten jest znany jako migracja przezśródbłonkowa leukocytów. Opisano dwie drogi przenikania leukocytów przez monowarstwę śródbłonka: drogę parakomórkową, tj. przez połączenia komórka-komórka oraz drogę transkomórkową, tj. przez ciało komórki śródbłonka. Jednak z technicznego punktu widzenia trudno było rozróżnić drogę para- i transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test in vitro do badania rozkładu endogennej kadheryny VE i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu. Przed perfuzją neutrofili komórki śródbłonka krótko potraktowano znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko VE-kadherynie i PECAM-1. Przeciwciała te nie zakłócały funkcji obu białek, co stwierdzono za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu i pomiarów FRAP. Korzystając z tego testu, byliśmy w stanie śledzić rozkład endogennej kadheryny VE i PECAM-1 podczas migracji przezśródbłonkowej w warunkach przepływu i rozróżnić para- i transkomórkowe drogi migracji leukocytów przez śródbłonek.

W pierwszej kolejności sprawdzono, czy przeciwciała nie zakłócają funkcji barierowej endotelium. Opór monowarstw endotelialnych zmierzono przy użyciu elektrycznej spektroskopii impedancyjnej (ECIS). Szczegóły opisano w pracy Van Buul et al.13 Nie zaobserwowano zmian oporu po dodaniu do komórek przeciwciała anty-VE-cadherin znakowanego fluorescencyjnie (Ryc. 2A). Przeciwciało anty-VE-cadherin, powszechnie uznane za blokujące funkcję VE-cadherin, doprowadziło do gwałtownego spadku oporu (Ryc. 2A). Ponadto przeciwciała wykorzystane do obrazowania nie zmieniają dynamiki VE-cadherin, co oceniono poprzez pomiar fluorescencyjnego powrotu po fotowybieleniu (FRAP) VE-cadherin-GFP (Ryc. 2B).
Po 1-2 min neutrofile przylgnęły do aktywowanej warstwy endotelialnej, co można było zwizualizować w kanale DIC (Rysunek 3A). Po pełzaniu przez 5-30 s zdecydowana większość neutrofili transmigrowała przez warstwę endotelialną poprzez połączenia międzykomórkowe, które zostały znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko PECAM-1 i VE-cadherin. W procesie diapeksji monitorowano w czasie rzeczywistym rozkład VE-cadherin i PECAM-1 (Rysunek 3B). W miejscach diapeksji neutrofili VE-cadherin ulegał lokalnej dezorganizacji, a PECAM-1 przybrał strukturę bardziej pierścieniowatą. Po zakończeniu diapeksji połączenia zamykają się, a VE-cadherin i PECAM-1 wyraźnie relokalizują się w miejscach diapeksji (Rysunek 3C). Należy zauważyć, że fragmenty przeciwciała anty-PECAM-1 zostały wykryte na powierzchni neutrofila w momencie, gdy dotarł on do strony bazolateralnej endotelium. Nie zapobiegło to jednak neutrofilom przekroczeniu endotelium. Obserwowana dynamika VE-cadherin w czasie rzeczywistym podczas transendotelialnej migracji neutrofili była zgodna z pracą Shawa i współpracowników, którzy wykazali przy użyciu mikroskopii konfokalnej i komórek endotelialnych transfekowanych VE-cadherin-GFP, że VE-cadherin-GFP dyfunduje lateralnie podczas przekraczania połączeń międzykomórkowych endotelium przez leukocyty14. Praca Su i współpracowników potwierdziła również nasze obserwacje dotyczące PECAM-1. Wykazali oni, że obok lateralnej dyfuzji VE-cadherin podczas przejścia leukocytów, PECAM-1 ulega lokalnej redystrybucji w pierścień wokół transmigrującego neutrofila15.
<img alt="Wielokanałowa pipeta w użyciu, mikroskop i układ rurek do analizy przepływu w środowisku laboratoryjnym." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. In vitro komora przepływowa. (A) Strzałka wskazuje zbiornik, z którego należy odświeżyć medium. (B) Rurka silikonowa łącząca komorę przepływową z liniowym portem wtryskowym Luer, służącym do wstrzykiwania PMN bez odłączania rurek (grot strzałki). (C) Podłączenie pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 °C (grot strzałki). (D) Podłączenie komory przepływowej z HUVEC traktowanymi TNF-α do rurek zawierających bufor przepływowy i umieszczenie jej na stoliku mikroskopu (grot strzałki).
<img alt="Wykresy analizy oporności i FRAP; impedancja w funkcji czasu oraz krzywe powrotu fluorescencji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przeciwciała przeciwko VE-kadherynie nie zakłócają dynamiki ani funkcji połączeń.**(A) Impedancję monowarstwy komórek śródbłonka zmierzono za pomocą ECIS. Oś Y przedstawia impedancję w omach, a oś X reprezentuje czas w godzinach. Klon przeciwciała przeciwko VE-kadherynie 55-7H1, znakowany ALEXA647 (linia niebieska), lub kontrola izotypowa IgG-ALEXA647 (linia czerwona) nie zmieniają impedancji monowarstwy komórek śródbłonka, podczas gdy blokujące przeciwciało przeciwko VE-kadherynie cl75 (linia czarna) obniżyło impedancję. (B) W komórkach HUVEC wykazano ekspresję VE-cadherin-GFP, a analiza FRAP z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej nie wykazała zmian w powrocie fluorescencji w obecności lub w nieobecności przeciwciała 55-7H1 przeciwko VE-kadherynie.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna: PECAM-1 Alexa 647, VE-kadheryna FITC, DIC, merge; badanie interakcji komórkowych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rozkład VE-kadheryny i PECAM-1 podczas TEM neutrofili w czasie rzeczywistym. (A) Neutrofil (zaznaczony białą linią) przylegający do śródbłonka i przekraczający połączenie międzykomórkowe bez wpływu na rozkład VE-kadheryny i PECAM-1. (B) Neutrofil przekraczający monowarstwę śródbłonka poprzez połączenia międzykomórkowe. Lokalna dyspersja VE-kadheryny i PECAM-1 jest obserwowalna, gdy neutrofil przebija się przez połączenia międzykomórkowe. Biała linia ilustruje obecność neutrofila wciąż nad śródbłonkiem. Żółta linia wskazuje błonę neutrofila, która znajduje się już pod śródbłonkiem. (C) Neutrofil w pełni przekroczył monowarstwę śródbłonka. VE-kadheryna i PECAM-1 uległy relokacji w miejscach diapedazy. Żółta linia ilustruje granice transmigrowanego neutrofila. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie rozkładu endogennego łącznika, teryny i pcam podczas migracji trans śródbłonka leukocytów w warunkach przepływu fizjologicznego. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw leukocytów wielojądrzastych lub PMN z pełnej krwi zdrowych ochotników za pomocą gradientu proco. Drugim krokiem jest dodanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał do monowarstwy ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej stymulowanej TNF alfa, hodowanej na szkiełkach przepływowych 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu przepływowego.Umożliwi to wizualizację dynamiki połączeń komórek śródbłonka podczas migracji neutrofili w fizjologicznych warunkach przepływu. Następnie szkiełko przepływowe zawierające znakowane fluorescencyjnie komórki śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej stymulowane TNF alfa podłącza się do systemu przepływu i umieszcza na stoliku mikroskopowym. Pompa wciągnie bufor przepływu ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki.Ostatnim krokiem jest powolne wstrzykiwanie PMN do systemu przepływowego przez port iniekcyjny. Ostatecznie PMN są wizualizowane za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i transmigrują.Eksperyment można przerwać w dowolnym momencie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak statyczne testy transmigracji, jest to, że dzięki niej można badać adhezję i transmigrację w prawdziwym życiu w fizjologicznych warunkach przepływu. Pomoże nam to zrozumieć, dlaczego leukocyty wybierają jeden korzeń zamiast drugiego, a więc PGA kontra migracja międzykomórkowa.Robimy to, wizualizując połączenia komórkowe komórek z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HU X w tym eksperymencie są hodowane zgodnie z instrukcjami producenta na naczyniach pokrytych fibronektyną przy użyciu pożywki uzupełnionej wzrostem śródbłonka. Średni. Hodowlę komórkową stosuje się od czterech do ośmiu pasaży, gdy komórki osiągną 80 do 90%Confluence, ostrożnie umyj je PBS o temperaturze pokojowej o pH 7,4, a następnie trypsyna to komórki po trypsyny i odwirowaniu.Zawieszamy na poziomie 800 000 komórek na mililitr za pomocą pożywki. W eksperymencie wykorzystuje się komory przepływowe, które zostały pokryte fibronektyną na płytce z poprzedniego dnia. 80 000 komórek w każdym kanale komór przepływowych kodowanych fibronektyną i delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla następnego dnia.Odśwież media w szkiełku komory przepływowej, delikatnie przechylając suwak pod kątem 45 stopni. Zaleca się usuwanie mediów tylko ze zbiorników, a nie z samego kanału. Usunięcie pożywki z kanałów może spowodować utratę komórek śródbłonka i śmierć z powodu siły ciągnięcia pożywki spowodowanej pipetowaniem.Sprawdź za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, czy komórki śródbłonka utworzyły monowarstwę. Jeśli komórki nie są w 100% zbieżne, zmieniaj pożywkę dwa razy dziennie, aż osiągną 100% zbieżności. Gdy komórki osiągną 100% płynności CO, stymuluj komórki pożywką zawierającą mediator stanu zapalnego.TNF alfa stymulujący uix przez noc z TNF alfa powoduje zapalny fenotyp śródbłonka IE regulację w górę cząsteczek adhezyjnych komórek, takich jak ICAM one i VA M1. Przed wyizolowaniem leukocytów wielojądrzastych lub PMN. Przygotować bufor przepływowy do przemywania izolowanych PMN i do użycia w teście przepływu do 100 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu podstawowego. Na 100 mikrolitrów świeżego jednomolowego chlorku wapnia, 2,5 mililitra albuminy ludzkiej ze stężenia 200 gramów na litr i 0,1 grama glukozy.Przefiltruj bufor przepływu za pomocą filtra 0,45 mikrona. 10% roztwór cytrynianu trisodowego lub TNC w PBS o pH 7,4 jest również przygotowywany przed izolacją PMN. PMN zostaną wyizolowane z 20 mililitrów pełnej krwi pobranej w heparynie sodowej od zdrowego ochotnika.Najpierw rozcieńczyć krew pełną jeden do jednego 10% PBST NNC w 15-mililitrowej probówce. Następnie użyj chłopca do pipetowania na najwolniejszym ustawieniu, aby ostrożnie pipetować 20 mililitrów rozcieńczonej krwi na 12,5 mililitra roztworu koloidalnego na 12,5 mililitra na co roztwór koloidalny w wodzie o gęstości 1,130 grama na mililitr w nowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Probówka zawierająca per coll powinna być przechylona pod kątem 45 stopni podczas dodawania krwi.Ostrożnie umieścić probówki w wirówce i wirować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy sile 800 G przy niskim przyspieszeniu i z wyłączonymi hamulcami po zakończeniu wirowania. Usuń cały płyn i napełnij każdą probówkę lodowatym buforem do lizy erytrocytów, aby ługować erytrocyty. Pozostaw probówki na lodzie, od czasu do czasu odwracając je, aż zawiesina zmieni kolor na ciemnoczerwony, wiruj w temperaturze 500 GS przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy włączonych hamulcach.Powstała frakcja osadu zawiera PMN Wraz z erytrocytami usunąć supernatant i dwukrotnie umyć osad w lodzie. Bufor do lizy na zimno o stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu z drugiego przemycia, ponownie zawiesić osad z buforem przepływowym w temperaturze pokojowej i określić stężenie PMN za pomocą automatycznego licznika komórek.Na koniec zawiesić PMN w buforze przepływowym jednorazowo od 10 do sześciu komórek na mililitr i utrzymywać w temperaturze pokojowej, aby oznaczyć śródbłonkową złącze VA kadheryny i pcam jeden. Dodać przeciwciało pcam LOR 6 47 w rozcieńczeniu jeden do 100 i niezależne od wapnia przeciwciało kadheryny FE ZI w rozcieńczeniu jeden do 50 do hodowli VE, pożywkę w komorze przepływowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować PMN do testu, umieść je w łaźni wodnej na 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem do systemu przepływowego.Podłącz rurkę do pustej komory przepływowej i napełnij ją buforem ciepłego przepływu, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Podczas ustawiania systemu przepływu. Za pomocą silikonowej rurki podłącz jedną stronę pustej komory przepływowej do systemu przepływu pompy strzykawkowej zawierającego strzykawkę o pojemności 20 mililitrów.Umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu. Test zostanie przeprowadzony przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektyw olejowy 63 x oraz komorę klimatyczną ustawioną na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Podłącz drugą stronę pustej komory przepływowej do kolby zbiornika wypełnionej buforem przepływowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza i uruchom pompę strzykawkową w celu napełnienia wszystkich przewodów buforem przepływowym, pompa wciągnie bufor przepływu ze zbiornika przez komorę przepływową do strzykawki.Ta rurka zawiera również wbudowany port do wstrzykiwania przynęty, który umożliwia wstrzykiwanie PMN za pomocą igły do działającego eksperymentu bez zatrzymywania przepływu i tworzenia pęcherzyków powietrza. Następnie wymień pustą komorę przepływową na komorę przepływową zawierającą VE poddane działaniu TNF alfa ściśnij rurki przed odłączeniem i ponownym podłączeniem ich do komory zawierającej VE.To uniknąć pęcherzyków powietrza w układzie, bardzo ważne jest, aby ścisnąć i zacisnąć rurki. Podczas łączenia szkiełka zawierającego komórki.Umieść komorę przepływową na stoliku mikroskopu, dostosuj prędkość przepływu do jednego centymetra kwadratowego zgodnie z fizjologiczną prędkością przepływu w kapilarnach zamkniętych, która wynosi od jednego do pięciu dines na centymetr kwadratowy rekordowy kontrast interferencyjny różnicowy lub DIC fite LOR 6 47. Jednocześnie, za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra, powoli wstrzykuj PMN do systemu przepływu przez port do wstrzykiwania przynęty w linii. Po kilku minutach pojawiają się leukocyty, przylegają i transmigrują, zatrzymując eksperyment w dowolnym momencie.Odłączając rurkę od komory przepływowej i pipetując utrwalacz af fixative do komory przepływowej, zmierzono oporność monowarstw śródbłonka w celu zbadania, czy przeciwciała zakłócają funkcję barierową śródbłonka. Nie zaobserwowano żadnej zmiany w oporności, gdy VE mógł usłyszeć klon przeciwciała 55 7 H jeden lub kontrolny izotyp został dodany do komórek. W przeciwieństwie do tego, przeciwciało blokujące słuch VE CL 75 znacznie zmniejszyło oporność.Analiza RAP nie wykazała zmian w odzyskiwaniu fluorescencji w obecności lub braku VE CADHERIN 55 7 H jednego przeciwciała, co wskazuje, że przeciwciało nie zmieniło dynamiki dystrybucji kadheryny VE, kadheryny VE i pcam one podczas migracji trans śródbłonka neutrofili lub TEM w czasie rzeczywistym. Górny panel pokazuje neutrofile obrysowany na biało, przylegający do śródbłonka i przecinający połączenie komórka z komórką bez szkody dla dystrybucji koherentu VE i pcam jeden. Podczas diapedezy można zaobserwować miejscową dyspersję koherentu VE i P chem jeden, gdy neutrofile wystają przez komórkę do połączeń komórkowych zaznaczonych na biało, to neutrofile na szczycie śródbłonka.Żółty kontur pokazuje błonę neutrofili, która znajduje się już pod śródbłonkiem. Po zakończeniu diapedezy połączenia zamykają się i są koherentne, a pcam jeden jest przenoszony w miejscach diapedozy. Granice migrujących neutrofili trans są zaznaczone na żółto.Po tej procedurze można przeprowadzić migrację trans śródbłonka leukocytów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy leukocyty przekraczają śródbłonek za pomocą baggi czy korzenia transkomórkowego.

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Jest to metoda wizualizacji adhezji leukocytów do śródbłonka w pobranych naczyniach poddanym ciśnieniu. Technika ta umożliwia badanie adhezji naczyniowej w warunkach przepływu ścinającego przy różnych ciśnieniach wewnątrzświatłowych do 200 mmHg, co pozwala na naśladowanie patofizjologicznych warunków nadciśnienia tętniczego.

Obrazowanie adhezji leukocytów do śródbłonka naczyniowego przy wysokim ciśnieniu wewnątrzświatłowym

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Poznaj metodę obrazowania w czasie rzeczywistym transmigracji neutrofili przez śródbłonek pod wpływem przepływu fizjologicznego. Technika umożliwia wizualizację dynamiki białek VE-cadherin i PECAM-1 w komórkach endotelialnych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Przeglądaj więcej filmów