Name: Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj standardizowany protokół pomiaru aktywności behawioralnej myszy w otwartym polu dla badań nad chorobami mięśni szkieletowych. Ta metoda pozwala ocenić postęp choroby i skuteczność terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta publikacja jest finansowana przez Cure CMD, Francuskie Stowarzyszenie Dystrofii Mięśniowej (AFM), grant na badania translacyjne od Muscular Dystrophy Association, The National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), Departament Obrony (W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) oraz grant pilotażowy od Parent Project Muscular Distrophy (PPMD).
Ten artykuł jest jednym z kilku z serii SOP dla rutynowo stosowanych metodologii w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni. Odzwierciedla on wysiłki omówione i podjęte przez ponad 20 ekspertów w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni podczas niedawnych warsztatów Congenital Muscle Disease Consortium Workshop, które odbyły się w kwietniu 2013 r. w Waszyngtonie.

UWAGA: System monitorowania aktywności w otwartym polu wykorzystuje komorę z pleksiglasu z emiterami fotokomórek i receptorami równomiernie rozmieszczonymi wzdłuż obwodu komory (Rysunek 1). Te emitery i receptory fotokomórek tworzą siatkę x-y niewidocznych wiązek podczerwieni. Kiedy zwierzę jest umieszczane w komorze, porusza się, powodując pęknięcia belki. Czujniki pionowe są również obecne do oceny poziomów aktywności pionowej (tj. zachowania hodowlanego). Analizator rejestruje informacje o przerwaniu wiązki i szybko je analizuje. Następnie oprogramowanie komputerowe oblicza wiele miar aktywności w ustalonym okresie czasu. Miary te obejmują: aktywność poziomą (jednostki), aktywność pionową (jednostki), całkowitą przebytą odległość (cm), czas ruchu (s) i czas odpoczynku (s)5.
UWAGA: Generalnie pomieszczenie testowe powinno być kontrolowane pod kątem temperatury i wilgotności, z równomiernym oświetleniem. Komory testowe powinny być równomiernie rozmieszczone w pomieszczeniu i nie powinny być umieszczane w bezpośrednim świetle, ciemnych rogach lub zacienionych miejscach. Wszystkie czynności związane z aklimatyzacją i testowaniem przyrządów powinny być wykonywane codziennie o tej samej porze (np. rano) i przez te same osoby. Osoby te powinny być zaślepione na grupę leczoną i genotyp, jeśli to możliwe.
Poniższy protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i za zgodą Children's National Medical Center IACUC.
1. Aklimatyzacja instrumentów
<ol>
	<li>Umieść myszy w pomieszczeniu testowym w ich domowych klatkach na około 10 minut, aby się zaaklimatyzowały. Opuść pomieszczenie w okresie aklimatyzacji.</li>
	<li>Wróć do pokoju testowego i włącz komory aktywności. Mimo że dane nie są obecnie zbierane, będzie to jeszcze bardziej naśladować środowisko testowe.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij każdą mysz z klatki domowej i natychmiast umieść ją w komorach testowych. Jeśli komora aktywności zawiera środkową przegrodę, która dzieli komorę na ćwiartki (Rysunek 1), umieść jedną mysz w każdej pustej ćwiartce.</li>
	<li>Gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane do komór testowych, umieść pokrywę na każdej komorze testowej. Opuść pomieszczenie w tym czasie aklimatyzacji.</li>
	<li>Po upływie 60 minut wróć do pokoju. Zdejmij pokrywę z każdej komory testowej i delikatnie umieść każdą mysz z powrotem w odpowiedniej klatce domowej.</li>
	<li>Wyczyść każdą komorę środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi. Upewnij się, że w komorze nie pozostały żadne cząsteczki brudu. 
	UWAGA: Jeśli każdego dnia przeprowadzanych jest wiele sesji, dokładnie wyczyść każdą komorę testową pomiędzy każdą sesją.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1-6 przez 4 kolejne dni. 
	UWAGA: Przeprowadź aklimatyzację na tydzień przed początkowym zbieraniem danych. Jeśli zwierzęta są testowane wiele razy w trakcie badania, należy przeprowadzić aklimatyzację tylko przed pierwszą rundą testów, aby uniknąć przyzwyczajenia. Ponadto w każdej sesji losowo przypisuj zwierzęta do nowego pudełka. Śledź przypisania pól przez cały czas trwania badania.</li>
</ol>
2. Gromadzenie danych
<ol>
	<li>Umieść myszy w pomieszczeniu testowym w ich domowych klatkach na 10-30 minut, aby się zaaklimatyzowały. W tym czasie opuść pokój.</li>
	<li>Po upływie 10-30 minut wróć do pokoju testowego. Włącz komory aktywności i otwórz dołączone oprogramowanie komputerowe na komputerze podłączonym do komór. Jeśli komora zawiera przegrodę kwadrantową, włóż w tym momencie przegrodę. 
	UWAGA: Jeśli komora testowa zawiera rozdzielacz kwadrantowy, podczas zbierania danych można umieścić w niej dwa zwierzęta. Jedno zwierzę można umieścić w kwadrancie z przodu po lewej stronie, a drugie w kwadrancie z tyłu po prawej stronie (Rysunek 1). 
	UWAGA: Nie umieszczaj zwierząt we wszystkich czterech kwadrantach podczas zbierania danych ani w tym samym wierszu lub kolumnie. Umieszczenie zwierząt w tych orientacjach będzie kolidować z siatką x-y wiązek podczerwieni, a ruch zwierzęcia będzie niedokładnie mierzony.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie komputerowe, aby przeprowadzić kontrolę przed belką. Taka konfiguracja pozwoli na przeprowadzenie kontroli przed badaniem wiązki po układzie doświadczalnym i przed umieszczeniem zwierząt w komorach badawczych (patrz poniżej). 
	UWAGA: Po uruchomieniu kontroli wiązki wstępnej oprogramowanie komputerowe ocenia działanie wiązek podczerwieni x-y. Na przykład może określić, czy emitery i receptory fotokomórek są zablokowane i nie są w stanie odpowiednio wykryć ruchu w komorze.</li>
	<li>Ustaw podstawowe parametry zbierania danych w oprogramowaniu komputerowym, aby zebrać sześć 10-minutowych bloków danych (tj. zbieraj dane łącznie przez 60 minut), a następnie wprowadź odpowiednią datę, nazwę pliku i numery identyfikatora myszy.</li>
	<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom kontrolę belki wstępnej. Jeśli komora nie przejdzie kontroli belki wstępnej, najprawdopodobniej jest to spowodowane złym ustawieniem środkowego kwadrantu, dzielnika lub komory testowej. Jeśli tak się stanie, wyrównaj środkowy rozdzielacz kwadrantowy i komorę testową, aż czujniki przestaną być zablokowane, a system stwierdzi, że komora testowa jest gotowa. Jeśli to nie rozwiąże problemu, zapoznaj się z instrukcją obsługi przyrządu.</li>
	<li>Gdy wszystkie komory testowe będą gotowe, delikatnie wyjmij mysz z jej domowej klatki i natychmiast umieść ją w komorze testowej. Zanotuj identyfikator myszy i upewnij się, że jest zgodny z tym wprowadzonym do komputera.</li>
	<li>Gdy wszystkie zwierzęta zostaną odpowiednio załadowane do komór testowych, umieść pokrywę na górze każdej komory. Następnie wybierz odpowiednie polecenie w oprogramowaniu komputerowym, aby rozpocząć zbieranie danych. W tym czasie analizator i oprogramowanie komputerowe rozpoczną rejestrowanie poziomów aktywności zgodnie z parametrami zbierania danych.</li>
	<li>Opuść pomieszczenie testowe na pozostałą część okresu testowego.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu testowania (tj. 60 minut później) należy niezwłocznie wrócić do pomieszczenia testowego. Zapisz dane, a następnie przywróć każde zwierzę do odpowiedniej klatki domowej.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie jednostki środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi. 
	UWAGA: Jeśli każdego dnia przeprowadzanych jest wiele sesji, dokładnie wyczyść każdą komorę testową pomiędzy każdą sesją.</li>
	<li>Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, a następnie zamknij oprogramowanie.</li>
	<li>Sprawdź dane, aby upewnić się, że zostały zarejestrowane. Jeśli dane nie zostały zarejestrowane lub zwierzęta spały przez cały okres zbierania danych, należy przeznaczyć dodatkowy dzień na gromadzenie danych. 
	UWAGA: Zwierzę uważa się za "śpiące", jeśli nie porusza się przez cały 60-minutowy czas trwania badania.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.1-2.12 przez 4 kolejne dni. 
	UWAGA: Jeśli zwierzęta są badane w wielu punktach czasowych przez cały czas trwania badania, nie należy wykonywać pomiarów aktywności w terenie otwartym częściej niż raz w miesiącu, aby uniknąć przyzwyczajenia. Ponadto w każdej sesji losowo przypisuj zwierzęta do nowego pudełka. Śledź przypisania pól przez cały czas trwania badania.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz średnią aktywność poziomą (jednostki), aktywność pionową (jednostki), całkowitą przebytą odległość (cm), czas ruchu (s) i czas odpoczynku (s) na mysz i grupę. Oprogramowanie komputerowe oblicza i raportuje całkowitą aktywność poziomą (jednostki), aktywność pionową (jednostki), całkowitą przebytą odległość (cm), czas ruchu (s) i czas odpoczynku (s) w okresie zbierania danych (tj. 60 minut) dla każdej myszy. Oblicz średnią dla każdego z wyżej wymienionych parametrów z 4 dni zbierania danych.</li>
	<li>Przed wykonaniem jakichkolwiek analiz statystycznych należy ocenić normalność danych za pomocą testu Shapiro-Wilka i sprawdzić wartości odstające za pomocą testu Grubba. Usuń wszelkie znaczące wartości odstające (p <0,05).</li>
	<li>W przypadku danych o rozkładzie normalnym należy porównać średnie między grupami za pomocą testu t dla próby niezależnej lub jednoczynnikowego testu ANOVA i testu post-hoc z wartościami p dostosowanymi do wielokrotnych porównań w zależności od całkowitej liczby badanych grup.</li>
	<li>W przypadku danych o rozkładzie innym niż normalnie należy porównać mediany wartości między grupami za pomocą testu sumy rang Wilcoxona lub testu Kruskala-Wallisa i testu sumy rang z wynikowymi wartościami p dostosowanymi do wielokrotnych porównań w zależności od całkowitej liczby badanych grup.</li>
</ol>

<ol><li>Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorp%2C+HB+%22PLoS+Med%22">PLoS Med</a>. 7 (3), 1000245-10 (2010).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Spurney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+drug+trials+in+the+mdx+mouse%3A+Assessment+of+reliable+and+sensitive+outcome+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures.</a> Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).</li>
<li>Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+locomotor+measurements+using+open+field+animal+activity+monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD+SOP+Number+M2.1.002%22%5BJournal%5D)">Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system.</a> TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omigapil+treatment+decreases+fibrosis+and+improves+respiratory+rate+in+dy%282J%29+mouse+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy.</a> PLoS One. 8 (6), e65468(2013).</li>
<li>Sali, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-treated+mice+are+an+inappropriate+positive+control+for+long-term+preclinical+studies+in+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse.</a> PLoS One. 7 (4), e34204(2012).</li>
<li>Belzung, C., Griebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+normal+and+pathological+anxiety-like+behaviour+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review.</a> Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).</li>
<li>Prut, L., Belzung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+open+field+as+a+paradigm+to+measure+the+effects+of+drugs+on+anxiety-like+behaviors%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review.</a> Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).</li>
<li>Walsh, R. N., Cummings, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+open-field+test%3A+A+critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Psychological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The open-field test: A critical Review.</a> Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).</li>
<li>Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+disease+severity+in+mice+with+targeted+disruption+of+the+acid+alpha-glucosidase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene.</a> Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).</li>
<li>Nagaraju, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+up-regulation+of+MHC+call+I+in+skeletal+muscle+leads+to+self-sustaining+autoimmune+myositis+and+myositis-specific+autoimmune+myositis+and+myositis-specific+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).</li>
<li>Erb, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omigapil+ameliorates+the+pathology+of+muscle+dystrophy+caused+by+laminin-alpha2+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency.</a> J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).</li>
<li>Malerba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+systemic+therapy+with+low-dose+morpholino+oligomers+ameliorates+the+pathology+and+normalizes+locomotor+behavior+inmdxmice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+1%22%5BJournal%5D)">Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice.</a> Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).</li>
<li>Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+developing+standard+operating+procedures+for+pre-clinical+testing+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).</li>
<li>Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Dysferlin+Deficient+SJL%2FJ+Mice+to+Assess+Preclinical+Drug+Efficacy%3A+Fasudil+Exacerbates+Muscle+Disease+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSOne%22%5BJournal%5D)">Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype.</a> PLoSOne. 5 (9), e12981(2010).</li>
<li>Valle, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strain%2C+sex%2C+and+illumination+on+open-field+behavior+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychol%22%5BJournal%5D)">Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats.</a> Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Lewis+and+SHR+rat+strains+as+a+genetic+model+for+the+study+of+anxiety+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain.</a> Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).</li>
<li>Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+rats%3A+sex+differences+and+responses+to+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aged rats: sex differences and responses to chronic stress.</a> Brain Res. 1126, 156-166 (2006).</li>
<li>Sakai, K., Crochet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+presumed+serotonergic+dorsal+raphe+neurons+in+relation+to+behavior+and+wake-sleep+states%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states.</a> Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar aktywności w otwartym polu jest testem in vivo , który może być korzystny w ocenie postępu choroby i skuteczności leków w zwierzęcych modelach choroby nerwowo-mięśniowej 6,7,11-14. Jak pokazano na rysunku 2, przedstawiono w nim ocenę poziomów aktywności, które zasadniczo odzwierciedlają funkcję lokomotywy. Jest to inna miara niż siła mięśni, co czyni ją idealną drugorzędną lub pomocniczą miarą wyniku do wykonania w przedklinicznym badaniu leku. Ponadto jest to klinicznie istotny15, nieinwazyjny pomiar, który może być wykonywany wielokrotnie w czasie trwania badania. Jednak na aktywność behawioralną i lokomotywową wpływają również dodatkowe czynniki (tj. obsługa eksperymentatora, warunki środowiskowe i funkcje poznawcze), które powodują różnice w danych dotyczących aktywności w otwartym polu. Celem tego artykułu jest dostarczenie dobrze przetestowanego i ustandaryzowanego protokołu, który zmniejsza zmienność i umożliwia porównywanie wyników w wielu laboratoriach, w nadziei na poprawę tłumaczenia w naszej dziedzinie.
Główną wadą tego środka jest to, że jest on bardzo zmienny i wpływa na niego wiele czynników zewnętrznych. Wzięliśmy to jednak pod uwagę przy opracowywaniu protokołu. Oceniliśmy różne protokoły testowe, których czas trwania wynosił od 1 do 5 dni zbierania danych. Ostatecznie ustaliliśmy, że przeprowadzenie aklimatyzacji przyrządów przed zebraniem danych w celu zapoznania zwierząt ze środowiskiem komory testowej i przeprowadzenie 4-dniowego zbierania danych znacznie zmniejszyło ilość różnic w danych wynikowych5. Protokół ten został pierwotnie zaprojektowany do oceny poziomu aktywności behawioralnej i lokomocyjnej w modelu myszy mdx; jednak protokół ten został niedawno zweryfikowany również w modelu zwierzęcym Dy2J6. Sugeruje się, aby protokół został ustandaryzowany w laboratorium dla każdego modelu zwierzęcego przed użyciem go w badaniu przedklinicznym.
Aktywność na otwartym polu różni się w zależności od tła genetycznego17, płci18-20, wieku18 lat i rytmu okołodobowego21. Wymaga to, aby zwierzęta w tym samym wieku, tej samej płci i o tym samym pochodzeniu genetycznym były oceniane w tym samym czasie. Na etapie planowania należy dokładnie przemyśleć decyzję o tym, w jakim wieku lub w jakim wieku będą oceniane poziomy aktywności na otwartym polu. Każdy model zwierzęcy ma swój własny, odrębny postęp choroby oraz fenotyp lokomocji i zachowania, które różnią się nasileniem i wiekiem6,15 (ryc. 2 i ryc. 3). Dlatego ważne jest, aby określić klinicznie i patologicznie istotne punkty czasowe w celu oceny miar aktywności w otwartym polu. Całkowita liczba zwierząt potrzebnych w każdej grupie badanej do wykrycia statystycznie istotnych różnic różni się w zależności od modelu zwierzęcego, wieku i płci. W związku z tym na etapach planowania należy również przeprowadzić odpowiednie obliczenia wielkości próby w celu określenia całkowitej liczby zwierząt potrzebnych w każdej grupie poddanej działaniu substancji w celu wykrycia statystycznie istotnych różnic. W obliczeniach tych należy również uwzględnić dodatkowe miary wyników wykorzystane w badaniu (np. pomiary siły chwytu lub analizy histologiczne). Opierając się na naszych obliczeniach mocy, zazwyczaj używamy 10-12 zwierząt na grupę badaną. Ponadto należy zwrócić szczególną uwagę na to, jaki szczep kontrolny jest używany w badaniu. Istnieje tendencja do stosowania w badaniach przedklinicznych niewłaściwych szczepów kontrolnych. Na przykład myszy BL6 są często używane jako szczep kontrolny dla myszy mdx; jednak mysz MDX znajduje się na tle BL10. Jak widać na rysunku 3, myszy BL10 są znacznie bardziej aktywne niż myszy BL6, co uniemożliwia porównanie danych mdx i BL6. Podczas prowadzenia badań przedklinicznych na myszach mdx, myszy BL10 powinny być używane jako szczep kontrolny. Ponadto, jeśli badanie jest prowadzone na myszach Dy2J, myszy BL6 powinny być używane jako szczep kontrolny.
Niewielkie zmiany w środowisku mogą również znacząco wpłynąć na poziom aktywności. Należą do nich oświetlenie, temperatura, wilgotność, zapach, hałas i działalność człowieka4,15. Dlatego bardzo ważne jest, aby badania były wykonywane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z niebezpośrednim oświetleniem o tej samej porze każdego dnia5. Komory testowe powinny być równomiernie rozmieszczone w całym pomieszczeniu i nie powinny być umieszczane w bezpośrednim oświetleniu ani w zacienionych lub ciemnych kątach5. Zwierzęta powinny być losowo przydzielane do swoich komór badawczych każdego dnia, aby zmniejszyć skutki różnych warunków środowiskowych w całym pomieszczeniu, i powinny mieć możliwość zaaklimatyzowania się w pomieszczeniu testowym przez 10-30 minut przed zebraniem danych. Należy upewnić się, że śledzisz przypisanie pudełka każdemu zwierzęciu przez cały czas trwania badania, aby upewnić się, że wszelki wpływ boksu/środowiska jest równomiernie rozłożony między różnymi grupami leczenia. Osoby ładujące zwierzęta do komór badawczych i zajmujące się zwierzętami przez cały czas trwania badania powinny być zaślepione na grupę badaną i, jeśli to możliwe, na obciążenie zwierząt. W wielu przypadkach genotypy dotknięte chorobą znacznie różnią się od pokrewnych grup kontrolnych i zaślepienie nie jest możliwe. Jednak osoby powinny być zawsze zaślepione między grupami leczonymi i nieleczonymi. Ponadto wszystkie osoby powinny opuścić pomieszczenie podczas zbierania danych, aby zmniejszyć hałas i rozproszenie uwagi w pomieszczeniu, a wszystkie komory powinny być dokładnie posprzątane po każdej sesji zbierania danych. Działania te znacznie zmniejszą zmienność danych. Należy zauważyć, że zwierzęta są również bardzo podatne na adaptację15. W związku z tym sugeruje się, aby zwierzęta były usuwane z komory badawczej bezpośrednio po 60 minutach zbierania danych każdego dnia oraz aby poziomy aktywności na otwartym polu były oceniane nie częściej niż raz w miesiącu.
Pomiary całkowitej przebytej odległości i całkowitego czasu ruchu są zwykle najbardziej czułymi pomiarami aktywności w terenie otwartym5. W modelu Dy2J pomiar aktywności pionowej wydaje się być najbardziej czułą miarą aktywności w polu otwartym (rysunek 3); Jednak uchwycenie dokładnych pomiarów aktywności pionowej u mniejszych zwierząt może być trudne. Na przykład możliwe jest, że mniejsze zwierzę będzie wykazywać zachowania hodowlane, a czujnik nie uchwyci go ze względu na wysokość czujnika pionowego. W związku z tym zalecamy testowanie zwierząt nie wcześniej niż w wieku 5 tygodni. Możliwe jest również, że zwierzę będzie spać przez cały czas trwania sesji zbierania danych. W takim przypadku należy dodać dodatkowy dzień zbierania danych. Wreszcie, złe ustawienie dzielnika kwadrantowego lub zablokowanie czujników w pudełku może również skutkować niedokładnymi danymi. Dlatego bardzo ważne jest, aby przed testowaniem przeprowadzić wstępną kontrolę czujnika i przejrzeć wszystkie dane po zakończeniu każdej sesji zbierania danych.
Należy również zachować ostrożność podczas analizowania danych dotyczących aktywności w otwartym polu. Dane o aktywności w terenie otwartym mają tendencję do rozkładu nienormalnego i mają wartości odstające4. Przed wykonaniem jakichkolwiek analiz statystycznych nasi biostatystycy zdecydowanie zalecają sprawdzenie danych pod kątem normalności i wartości odstających. Jeśli dane nie mają rozkładu normalnego, należy rozważyć użycie testu nieparametrycznego podczas porównywania średnich. Ponadto wszystkie dane powinny być analizowane przez osobę ślepą na to, jakie są grupy leczenia.
Ogólnie rzecz biorąc, miara aktywności w terenie otwartym ma główne zalety: a) jest to kompleksowa ocena zarówno aktywności lokomotorycznej, jak i behawioralnej, która jest silnie, ale nie zawsze skorelowana z funkcją lokomotywy; b) jest to środek łatwy do wykonania; c) nie wymaga obchodzenia się ze zwierzętami podczas badań; d) jest to zabieg nieinwazyjny, który może być wykonany więcej niż jeden raz w czasie trwania badania; e) do przeprowadzenia testu nie jest wymagane żadne specjalne szkolenie; f) wiele zwierząt może być badanych w tym samym czasie; oraz g) jest to klinicznie istotna miara wyniku5,16. Jednak podczas testowania środków terapeutycznych należy pamiętać, że inne czynniki mogą wpływać na zachowanie zwierzęcia, a co za tym idzie, na pomiary aktywności w terenie otwartym. Leki mogą mieć wpływ na OUN i/lub inne skutki dla całego organizmu, a na zachowanie może również wpływać stresujące środowisko. W rezultacie, może być trudno odróżnić, czy zmiany w poziomie aktywności lokomotorycznej lub behawioralnej są związane ze zmianami w funkcjonowaniu mięśni, sile mięśni, czy też są wynikiem skutków ubocznych leku. W związku z tym należy również przeprowadzić dodatkowe testy funkcjonalne, histologiczne i/lub molekularne. Ten ustandaryzowany protokół został również z powodzeniem wykorzystany w innych chorobach mięśni4,17; jednakże, jak widać na rysunku 3, początkowo należy przeprowadzić badania pilotażowe w celu oceny wrażliwości miary w modelu zwierzęcym.

Modele zwierzęce były przydatne do poznawania mechanizmów choroby, ale ich przydatność w przewidywaniu skuteczności leczenia w badaniach klinicznych była często kwestionowana1-3. Każdego roku publikowane są liczne "obiecujące" badania przedkliniczne; Jednak bardzo niewiele z proponowanych interwencji wykazuje pozytywne wyniki po przeniesieniu do badania klinicznego. Rozbieżności te są często przypisywane stronniczości publikacji, zbyt optymistycznym wnioskom oraz źle zaprojektowanym i przeprowadzonym badaniom przedklinicznym, które prowadzą do niepowtarzalnych wyników1-3.
Przy obecnym postępie w opracowywaniu leków na zaburzenia nerwowo-mięśniowe, rośnie zapotrzebowanie na dobrze zaprojektowane badania przedkliniczne. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na rygorystyczne metodologie, które mogą być realizowane w sposób ustandaryzowany i zaślepiony, z walidowanymi, odtwarzalnymi i przekładalnymi miarami wyników. Jako członek Konsorcjum Wrodzonych Chorób Mięśni, z pragnieniem prowadzenia bardziej rygorystycznych badań przedklinicznych, dzielimy się tutaj naszą Standardową Procedurą Operacyjną (SOP) dla Aktywności w Otwartym Terenie. Ten SOP został wcześniej zwalidowany4 i opublikowany jako część SOP TREAT-NMD dla modeli zwierzęcych dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD)5. Zastosowaliśmy tę metodologię do fenotypu i przetestowania skuteczności terapeutycznej wielu leków w różnych modelach zwierzęcych choroby nerwowo-mięśniowej, w tym myszy Lama2dy-2J/J (Dy2J), zwierzęcym modelu wrodzonej dystrofii mięśniowej (CMD)6,7. Z kolei ten artykuł jest adaptacją naszego wcześniej opublikowanego TREAT-NMD SOP5.
System monitorowania aktywności w otwartym polu kompleksowo ocenia poziom aktywności lokomotorycznej i behawioralnej myszy, który może być skorelowany z funkcją lokomotywy. Test jest również szeroko stosowany do oceny zachowań lękowych i eksploracyjnych 8-10. W szczególności otwarte pole jest użytecznym narzędziem do oceny upośledzenia ruchu w zwierzęcych modelach choroby nerwowo-mięśniowej11,12 oraz skuteczności leków terapeutycznych, które mogą poprawić lokomocję i/lub funkcje motoryczne 6,7,13,14. Ocena aktywności w terenie otwartym dostarcza innej miary niż siła mięśni, która jest zwykle mierzona za pomocą siły chwytu, i pokazuje, w jaki sposób leki mogą wpływać na inne układy organizmu (tj. ośrodkowy układ nerwowy)również 5. Ponadto miara aktywności w terenie otwartym, całkowity przebyty dystans, odzwierciedla 6-minutowy test marszu, miarę wyników badania klinicznego, która koncentruje się na submaksymalnej wydajności ćwiczeń i jakości życia15,16. Ogólnie rzecz biorąc, sprawia to, że test aktywności w terenie otwartym jest korzystną drugorzędną lub pomocniczą miarą wyniku do wykorzystania w badaniach przedklinicznych. Jednak system monitorowania aktywności w terenie otwartym wiąże się również z istotnymi wyzwaniami. Test ma charakter behawioralny i może być dość zmienny, ponieważ wpływa na niego wiele czynników zewnętrznych. Na przykład na to zachowanie może mieć wpływ popęd eksploracyjny (tj. poznanie), lęk, choroba, rytm okołodobowy, czynniki środowiskowe, podłoże genetyczne, a także moc motoryczna10. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie tego działania w sposób ustandaryzowany, w kontrolowanym środowisku. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje nasze SOP dla działań w terenie otwartym. Zawiera procedury krok po kroku i dalsze omówienie ważnych kwestii związanych z kontrolą warunków środowiskowych i pomaga zmniejszyć zmienność, typowe wyniki, analizę danych oraz mocne i słabe strony oceny w bardziej szczegółowy sposób.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>VersaMax Open Field Activity Monitoring System z akrylowymi komorami testowymi i czujnikami osi X, Y, Z</td><td>AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA</td><td></td><td>Wycofany</td></tr><tr><td>system monitorowania aktywności w otwartym polu Fusion z akrylowymi komorami testowymi i czujnikami osi X, Y, Z</td><td>Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA</td><td></td><td>Sugerowany system obecnie dostępny na rynku</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Virkon-S Środek dezynfekujący o szerokim spektrum działania (nadoksymonosiarczan potasu / chlorek sodu)</td><td>Pharmacal Research Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Myszy</td></tr><tr><td>B6. WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J)</td><td>Jackson Lab</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (BL6)</td><td>Jackson Lab</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>SJL/J (SJL)Jackson</td> <td>Lab</td><td>000686</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx)</td><td>Jackson Lab</td><td>001801</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/10ScSnJ (BL10)</td><td>Jackson Lab</td><td>000476</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych

Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases

System monitorowania aktywności w otwartym polu kompleksowo ocenia poziom aktywności lokomotorycznej i behawioralnej myszy. Jest to przydatne narzędzie do oceny upośledzenia ruchu w zwierzęcych modelach choroby nerwowo-mięśniowej oraz skuteczności leków terapeutycznych, które mogą poprawić lokomocję i/lub funkcję mięśni. Pomiar aktywności w terenie otwartym zapewnia inną miarę niż siła mięśni, która jest zwykle oceniana za pomocą pomiarów siły chwytu. Może również pokazać, w jaki sposób leki mogą wpływać na inne układy organizmu, a także wtedy, gdy są stosowane z dodatkowymi pomiarami wyników. Ponadto miary takie jak całkowity przebyty dystans odzwierciedlają test 6-minutowego marszu, który jest miarą wyników badania klinicznego. Jednak monitorowanie aktywności na otwartym polu wiąże się również z poważnymi wyzwaniami: pomiary aktywności na otwartym polu różnią się w zależności od szczepu zwierząt, wieku, płci i rytmu dobowego. Ponadto temperatura w pomieszczeniu, wilgotność, oświetlenie, hałas, a nawet zapach mogą wpływać na wyniki oceny. Ogólnie rzecz biorąc, manuskrypt ten zawiera dobrze przetestowany i ustandaryzowany SOP dotyczący aktywności w terenie do badań przedklinicznych na zwierzęcych modelach chorób nerwowo-mięśniowych. Omawiamy ważne kwestie, typowe wyniki, analizę danych oraz szczegółowo omawiamy mocne i słabe strony testów w terenie. Ponadto przedstawiamy zalecenia dotyczące optymalnego projektu badania w przypadku wykorzystania aktywności w terenie otwartym w badaniu przedklinicznym.

Podczas analizy danych dotyczących aktywności w polu otwartym skupiamy się na kilku wybranych pomiarach, które pozwalają ocenić poziomy aktywności odzwierciedlające ogólną sprawność lokomotoryczną. Parametry te obejmują: aktywność poziomą, aktywność pionową, czas ruchu, czas spoczynku oraz całkowity dystans. Zazwyczaj zwierzęta z upośledzoną funkcją mięśni wykazują mniejszą aktywność oraz niższą aktywność ambitoryczną. Jest to zazwyczaj związane ze zmniejszoną aktywnością poziomą, aktywnością pionową, całkowitym dystansem i czasem ruchu, a także z wydłużonym czasem spoczynku5,6,12,17. Z kolei zwierzęta z niezakłóconą funkcją mięśni lub te leczone preparatami hamującymi progresję patologii mięśniowej częściej wykazują wyższe poziomy aktywności6,7,14,17.
Aby przedstawić przykład typowych wyników uzyskanych przy zastosowaniu tego protokołu w modelach zwierzęcych chorób nerwowo-mięśniowych, przedstawiliśmy dane z prowadzonego wcześniej przez nas badania podłużnego w modelu zwierzęcym wrodzonej dystrofii mięśniowej (CMD) Dy2J6. W skrócie, model Dy2J zawiera skróconą formę genu LAMA2, co skutkuje paraliżem kończyn tylnych, demielinizacją oraz dystroficznymi zmianami w mięśniach szkieletowych. U tych myszy obserwuje się wpływ tej patologii mięśni na poziomy aktywności. Na przykład myszy Dy2J w badaniu wykazywały tendencję do niższych poziomów aktywności poziomej oraz mniejszego przebytego dystansu w porównaniu z grupami kontrolnymi typu dzikiego BL/6, dopasowanymi pod względem wieku i płci, przez cały czas trwania badania (Rysunek 2); jednak różnice te nie zawsze były istotne. Brak istotności wynika najprawdopodobniej z małej wielkości próby oraz wysokiej zmienności wewnątrzgrupowej w danych BL6. Zmienność jest typowa dla danych aktywności w polu otwartym; jednak te konkretne dane nie posiadają wystarczającej mocy, aby określić, czy grupy te różnią się od siebie statystycznie. Zazwyczaj w celu wykrycia statystycznie istotnych różnic należy przyjąć n = 10-125,17. Na przykład, gdy zastosowano większą próbę, jak miało to miejsce w badaniu SJL (patrz drugi słupek BL6 na Rysunkach 3B, 3D oraz 3E), można zaobserwować istotne różnice między grupami. Zwierzęta Dy2J wykazały również całkowitą utratę poziomów aktywności pionowej, co odzwierciedlało paraliż kończyn tylnych, a w konsekwencji niezdolność do stania na tylnych łapach (Rysunek 2B)6. Na koniec warto zwrócić uwagę na różnice płciowe w poziomach aktywności. Na przykład samice wykazywały tendencję do większej aktywności niż samce, wykazując wyższe poziomy aktywności poziomej, pionowej oraz całkowity dystans przebyty (Rysunek 2); jednak różnice te nie były statystycznie istotne.
Dostarczyliśmy również dane z kilku poprzednich badań przeprowadzonych na innych modelach zwierzęcych chorób nerwowo-mięśniowych, a także wskazaliśmy kilka dodatkowych czynników wpływających na poziom aktywności (Rysunek 3). Na przykład poziom aktywności różni się w zależności od tła genetycznego10. Myszy typu dzikiego BL10 wykazują większą aktywność horyzontalną, aktywność wertykalną oraz większy całkowity dystans w porównaniu z myszami typu dzikiego BL6 w tym samym wieku i o tej samej płci (Rysunek 3). Jest to istotna obserwacja, ponieważ zastosowanie niewłaściwych szczepów kontrolnych w badaniu może sprawić, że dane będą bezużyteczne. Po drugie, poziom aktywności różni się w zależności od modelu choroby i fenotypu (Rysunek 3). Na przykład mysz SJL, model zwierzęcy obręczowo- kończynowej dystrofii mięśniowej typu 2B (LGMD-2B), wykazuje najniższy poziom aktywności horyzontalnej i najmniejszy całkowity dystans, następnie mysz Dy2J oraz mysz mdx, będąca modelem zwierzęcym dystrofii mięśniowej Duchenne'a (Rysunki 3A, 3C). Jednakże myszy Dy2J, ze względu na porażenie kończyn tylnych, wykazują najniższy poziom aktywności wertykalnej (Rysunek 3B). Należy również zauważyć, że wyższy poziom aktywności w fenotypie mdx najprawdopodobniej wynika ze zwiększonego poziomu aktywności szczepu tła BL10. Wreszcie, rysunek ten podkreśla znaczenie wieku zwierząt/patologii choroby w momencie testowania. Na przykład w wieku 30 tygodni nie można wykryć różnic w poziomach aktywności między myszami mdx a kontrolnymi myszami typu dzikiego BL10 w tym samym wieku i o tej samej płci (Rysunek 3). Jednak w wieku 6 tygodni, w okresie szczytowej fazy martwicy w modelu myszy mdx, myszy mdx wykazują znaczący spadek aktywności wertykalnej oraz horyzontalnej. Obserwuje się również spadek całkowitego przebytego dystansu, ale różnica ta nie jest istotna (Rysunek 3)4.
<img alt="Ustawienie komory elektroforetycznej dla eksperymentu rozdziału DNA; widoczne cztery ponumerowane sekcje." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51785/51785fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Aparaty do testu otwartej przestrzeni. Dwa aparaty do testu otwartej przestrzeni z przegrodami kwadrantu centralnego i pokrywami. W przypadku obecności wyjmowanych przegród kwadrantu centralnego, w celu uzyskania prawidłowych wyników, podczas testów zwierzęta powinny być umieszczane wyłącznie w przedniej lewej (1, 3) oraz tylnej prawej komorze (2, 4) każdego pudełka.
<img alt="Wykresy analizy aktywności dla samców i samic, wiek względem aktywności, wyniki eksperymentu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51785/51785fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Dane dotyczące aktywności w otwartym polu. Typowe dane dotyczące aktywności w otwartym polu dla myszy Dy2J (szara linia, n = 3) oraz dopasowanej pod względem wieku i płci linii kontrolnej BL6 (czarna linia, n = 3) w wieku 14, 19, 23, 25 i 30 tygodni (A - F). A) Aktywność pozioma (jednostki arbitralne) samce, B) Aktywność pozioma (jednostki arbitralne) samice, C) Aktywność pionowa (jednostki arbitralne) samce, D) Aktywność pionowa (jednostki arbitralne) samice E) Całkowity dystans (cm) samce, E) Całkowity dystans (cm) samice. Dane zbierano przez 4 kolejne dni i uśredniano dla każdej myszy oraz grupy. Te same myszy były badane w każdym punkcie czasowym. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Dane opublikowane wcześniej6. Myszy Dy2J i BL6 porównywano za pomocą testu t dla prób niezależnych w każdym punkcie czasowym. Wartość p &lt;0,05 uznano za istotną. * p &lt;0,05, **p &lt;0,01, ***p &lt;0,001.
<img alt="Wykresy słupkowe aktywności i dystansu u myszy, pokazujące wpływ wieku i genotypu na zachowanie ruchowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51785/51785fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Dane aktywności w otwartym polu dla wielu szczepów. Typowe dane dotyczące aktywności behawioralnej samców myszy BL10 (wiek 6 tygodni, n = 8; wiek 25-30 tygodni, n = 10), mdx (wiek 6 tygodni, n = 9; wiek 25-30 tygodni, n = 15), BL6 (grupa kontrolna dla myszy Dy2J, n = 3; grupa kontrolna dla myszy SJL, n = 13), Dy2J (n = 3) oraz SJL (n = 13) w różnym wieku. A) Dane aktywności poziomej (jednostki dowolne) dla myszy BL10 i mdx w wieku 6 i 25-30 tygodni, B) Dane aktywności poziomej (jednostki dowolne) dla myszy BL6, Dy2J i SJL w wieku 25-30 tygodni, C) Dane aktywności pionowej (jednostki dowolne) dla myszy BL10 i Mdx w wieku 6 i 25-30 tygodni, D) Dane aktywności pionowej (jednostki dowolne) dla myszy BL6, Dy2J i SJL w wieku 25-30 tygodni, E) Dane całkowitego przebytego dystansu (cm) dla myszy BL10 i mdx w wieku 6 i 25-30 tygodni oraz F) Dane całkowitego przebytego dystansu (cm) dla myszy BL6, Dy2J i SJL w wieku 25-30 tygodni. Dy2J: model zwierzęcy CMD z mutacją genu laminin α2 na tle BL6; SJL: model zwierzęcy dystrofii mięśni obręczy kończyn-2B (LGMD-2B); mdx: model zwierzęcy DMD na tle BL10. Brak kontroli SJL z wystarczającą ilością dysferliny. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. Panele B, C i D zawierają dane opublikowane wcześniej6,17. Dane nie miały rozkładu normalnego; dlatego porównano je za pomocą testu sum rang Wilcoxona. Wartość p &lt;0,05 uznano za istotną. Dla każdego parametru przeprowadzono następujące porównania: a) myszy BL10 i mdx w wieku 6 tygodni, p &lt;0,05; b) myszy BL10 i mdx w wieku 25-30 tygodni, brak istotności; c) myszy Dy2J i dopasowane kontrolne myszy szczepu BL6 w wieku 25-30 tygodni, p &lt;0,05; d) myszy SJL i dopasowany szczep kontrolny BL6 w wieku 25-30 tygodni, p &lt;0,001; e) myszy BL10 w wieku 25-30 tygodni i myszy BL6 (grupa kontrolna dla myszy Dy2J) w wieku 25 tygodni, p &lt;0,01; f) myszy BL10 w wieku 25-30 tygodni i myszy BL6 (grupa kontrolna dla myszy SJL) w wieku 25-30 tygodni, p &lt;0,001.

Poziomy aktywności w otwartym polu są używane do oceny poziomu aktywności lokomotywy i zachowania. Protokół ten zapewnia dobrze zaprojektowany, ustandaryzowany protokół do stosowania w badaniach przedklinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych

The open field activity monitoring system comprehensively assesses locomotor and behavioral activity levels of mice. It is a useful tool for assessing ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar lokomocji i aktywności behawioralnej myszy w środowisku otwartym. Pierwszym krokiem jest aklimatyzacja myszy w komorze polowej przez cztery kolejne dni. Po aklimatyzacji aktywność behawioralna jest rejestrowana za pomocą specjalistycznego oprogramowania.Każdego dnia dane są eksportowane i przeglądane w celu kontroli jakości. Po przetestowaniu dane są analizowane pod kątem wielu parametrów behawioralnych. Ostatecznie aktywność w terenie otwartym służy do pokazania różnic między zwierzętami kontrolnymi i doświadczalnymi w sposób nieinwazyjny.Zaletą tej nieinwazyjnej metody jest to, że zapewnia całościową ocenę ogólnej jakości życia w sposób podłużny. Naśladuje to sześciominutowy test chodu stosowany jako miara wyniku klinicznego i zapewnia wgląd w potencjalne skutki leków niedocelowych w celu uzyskania najlepszych wyników. Upewnij się, że wszystkie zwierzęta są odpowiednio zaaklimatyzowane i że testy są wykonywane o tej samej porze każdego dnia, a pomieszczenie jest ciche i ma kontrolowaną temperaturę i wilgotność z równomiernym oświetleniem.Na początek przynieś myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się przez około 10 minut. W tym czasie opuść pokój. Następnie wróć do pokoju i włącz komory aktywności.Mimo że dane nie są obecnie zbierane, będzie to naśladować środowisko testowe. Komora aktywności używana w tym protokole zawiera centralną przegrodę, która dzieli komorę na ćwiartki. Upewnij się, że przegroda jest prawidłowo wyrównana wewnątrz komory.Następnie delikatnie wyjmij każdą mysz z klatki domowej i natychmiast umieść ją w pustym kwadrancie. Gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane, umieść pokrywę na górze i opuść pomieszczenie. Pozwolić zwierzętom zaaklimatyzować się w komorze badawczej przez 60 minut po okresie aklimatyzacji.Wróć do pokoju i zdejmij pokrywę. Delikatnie umieść każdą mysz z powrotem w klatce domowej. Dokładnie wyczyść każdą komorę środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi między każdą sesją.Powtarzaj te kroki przez cztery kolejne dni na tydzień przed początkowym zbieraniem danych. Zadbaj o to, aby losowo przypisać zwierzęta do nowego pudełka podczas każdej sesji, aby uniknąć przyzwyczajenia i śledź przypisania do pudełek przez cały czas trwania badania. Aby zmierzyć aktywność na otwartym polu, przynieś myszy do pomieszczenia testowego, aby zaaklimatyzowały się przez 10 do 30 minut.W tym czasie opuść pokój. Po tym czasie wróć do pomieszczenia i włącz komory aktywności. Następnie otwórz dołączone oprogramowanie komputerowe, które będzie rejestrować ruch zwierzęcia.Ustaw podstawowe parametry zbierania danych w oprogramowaniu komputerowym, aby zebrać sześć, 10-minutowe bloki danych, a następnie wprowadź odpowiednią datę, nazwę pliku i numery identyfikacyjne myszy. Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom kontrolę wiązki wstępnej, aby sprawdzić, czy wszystkie wiązki podczerwieni działają prawidłowo. Jeśli komora nie przejdzie kontroli belki wstępnej, najprawdopodobniej jest to spowodowane złym ustawieniem środkowej przegrody.Jeśli tak się stanie, wyrównaj rozdzielacz, aż czujniki zostaną odblokowane, a system będzie gotowy. Gdy wszystkie komory testowe będą gotowe, delikatnie wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją w komorze testowej. Podczas zbierania danych w komorze testowej można umieścić dwa zwierzęta w tym samym czasie.Na przykład jedno zwierzę można umieścić w lewym przednim kwadrancie, a drugie w tylnym prawym kwadrancie. Umieść pokrywę na górze komór, gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane, a następnie uruchom program, aby rozpocząć zbieranie danych. Program rozpocznie rejestrowanie poziomów aktywności zgodnie z ustawionymi wcześniej parametrami zbierania danych.Opuść pomieszczenie testowe na czas trwania okresu testowego. Wróć do pokoju po zakończeniu zbierania danych. Zapisz dane, a następnie przywróć każde zwierzę do odpowiedniej klatki domowej.Wyczyść wszystkie jednostki środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi przed testowaniem innej grupy zwierząt. Po przetestowaniu wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Oprogramowanie komputerowe oblicza wiele parametrów w okresie zbierania danych.Dla każdej myszy przejrzyj wszystkie dane w celu kontroli jakości. Powtarzaj te kroki przez cztery kolejne dni. Zadbaj o to, aby losowo przypisać zwierzęta do nowego pudełka podczas każdej sesji i śledź przypisania pudełek przez cały czas trwania badania.Na koniec oblicz średnią aktywność poziomą. Aktywność pionowa, całkowity przebyty dystans, całkowity czas ruchu i całkowity czas odpoczynku z czterech dni zbierania danych. Wyniki te pokazują typowe poziomy aktywności w otwartym polu samców i samic ddy two J laminat alfa dwa wrodzona dystrofia mięśniowa, myszy i myszy kontrolne z biegiem czasu, aktywność pozioma była wyższa u myszy kontrolnych, podobnie jak aktywność pionowa i całkowita przebyta odległość.Dwie myszy J wykazały również całkowitą utratę aktywności pionowej w wieku 19 tygodni, co odzwierciedla ich paraliż kończyn tylnych, a co za tym idzie, niezdolność do wstania w wieku sześciu tygodni podczas szczytowej fazy martwiczej. W zwierzęcym modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a myszy MDX wykazują niższy poziom aktywności poziomej, aktywności pionowej i całkowitej przebytej odległości. Wykazano również różnice w aktywności w otwartym polu między myszami różnych szczepów.Myszy BL 10 miały wyższą aktywność poziomą, aktywność pionową i całkowitą przebytą odległość w porównaniu z myszami L six. Ponieważ aktywność behawioralna jest podatna na duże wahania, aktywność w otwartym polu może nie być odpowiednią miarą pierwszorzędowego punktu końcowego. Jednak może być bardzo cenną miarą drugorzędnego wyniku w badaniach przedklinicznych, gdy jest prowadzona z dodatkowymi funkcjonalnymi testami histologicznymi i molekularnymi.

behavioral-locomotor-measurements-using-an-open-field-activity

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Lokomocja jest często badana jako wynik behawioralny w różnych modelach chorób w dziedzinach takich jak neuronauka i ortopedia. Niniejszy artykuł wideo ma na celu opisanie metody pomiaru sił reakcji podłoża oraz kinematyki u szczurów podczas swobodnej lokomocji.

Wyznaczanie kinematyki i siły reakcji podłoża: demonstracja ilościowej oceny zdolności lokomocyjnych szczurów młodych, dorosłych w średnim wieku oraz geriatrycznych

W niniejszym filmie przedstawiono modulację aktywności odruchowej, siły wolicjonalnej oraz zdolności do poruszania się, ocenianych za pomocą pomiarów klinicznych i ilościowych u osób z niepełnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego (SCI) w obrębie funkcji motorycznych, po ostrym podaniu doustnym inhibitora wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI).

Metody ilościowego pomiaru farmakologicznie indukowanych zmian w funkcji motorycznej u ludzi z niepełnym uszkodzeniem rdzenia kręgowego

Ten film opisuje test zachowania w otwartym polu, używany do badania ogólnych nawyków lokomocyjnych i eksploracyjnych u gryzoni.

Test zachowania w otwartym terenie: metoda oceny ogólnych nawyków lokomocyjnych i eksploracyjnych

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni.

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

Obiektywny pomiar funkcji mięśni jest wyzwaniem, szczególnie u dzieci. W oparciu o dostępny na rynku cyfrowy czujnik 3D, opracowano przyjazny dla dzieci test do gier, aby ocenić funkcję kończyny górnej na potrzeby badań klinicznych.

Obiektywna i przyjazna dla dziecka ocena funkcji ramienia za pomocą czujnika 3D

Celem tego badania jest przedstawienie najbardziej wiarygodnych miar wyników klinicznych i ich korelacji z ilościowym MRI mięśni u ambulatoryjnych pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a.

Pomiary funkcji motorycznych i innych parametrów klinicznych u dzieci ambulatoryjnych z dystrofią mięśniową Duchenne'a

To innowacyjne urządzenie wykorzystuje czujniki magneto-inercyjne, aby umożliwić analizę chodu i aktywności w niekontrolowanych środowiskach. Obecnie w procesie kwalifikacji jako miernik wyniku w Europejskiej Agencji Medycznej, jednym z wniosków będzie pełnienie funkcji klinicznego punktu końcowego w badaniach klinicznych w chorobach nerwowo-mięśniowych.

Domowy monitor do analizy chodu i aktywności

Analiza śladów to tania alternatywa dla cyfrowych programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny idealnie nadaje się do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.

Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej

Przedstawiono protokół instalacji i przygotowania elektrod domięśniowych, wraz z montowanym na zwierzętach, zminiaturyzowanym urządzeniem pomiarowym do analizy elektromiografii (EMG) w badaniach lokomocji. System ten umożliwia bezprzewodową transmisję danych EMG w czasie rzeczywistym w celu zbadania regeneracji lokomocji u szczurów po udarze.

Przenośny system pomiarowy elektromiograficzny dla małych zwierząt w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy niskonakładowy, bezznacznikowy proces za pomocą DeepLabCut do ilościowego określania spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie. Ten protokół integruje nagranie wideo z jedną kamerą, bezznacznikowe śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnianie parametrów lokomocji przestrzenno-czasowych, zapewniając nieinwazyjne i dostępne narzędzie do analizy zachowań motorycznych bez specjalistycznego sprzętu.

Tani niskokosztowy proces bez markerów oparty na DeepLabCut do analizy spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie

Poznaj standardizowany protokół pomiaru aktywności behawioralnej myszy w otwartym polu dla badań nad chorobami mięśni szkieletowych. Ta metoda pozwala ocenić postęp choroby i skuteczność terapii.

Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów