Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych
29 września 2014
Poziomy aktywności w otwartym polu są używane do oceny poziomu aktywności lokomotywy i zachowania. Protokół ten zapewnia dobrze zaprojektowany, ustandaryzowany protokół do stosowania w badaniach przedklinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar lokomocji i aktywności behawioralnej myszy w środowisku otwartym. Pierwszym krokiem jest aklimatyzacja myszy w komorze polowej przez cztery kolejne dni. Po aklimatyzacji aktywność behawioralna jest rejestrowana za pomocą specjalistycznego oprogramowania.
Każdego dnia dane są eksportowane i przeglądane w celu kontroli jakości. Po przetestowaniu dane są analizowane pod kątem wielu parametrów behawioralnych. Ostatecznie aktywność w terenie otwartym służy do pokazania różnic między zwierzętami kontrolnymi i doświadczalnymi w sposób nieinwazyjny.
Zaletą tej nieinwazyjnej metody jest to, że zapewnia całościową ocenę ogólnej jakości życia w sposób podłużny. Naśladuje to sześciominutowy test chodu stosowany jako miara wyniku klinicznego i zapewnia wgląd w potencjalne skutki leków niedocelowych w celu uzyskania najlepszych wyników. Upewnij się, że wszystkie zwierzęta są odpowiednio zaaklimatyzowane i że testy są wykonywane o tej samej porze każdego dnia, a pomieszczenie jest ciche i ma kontrolowaną temperaturę i wilgotność z równomiernym oświetleniem.
Na początek przynieś myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się przez około 10 minut. W tym czasie opuść pokój. Następnie wróć do pokoju i włącz komory aktywności.
Mimo że dane nie są obecnie zbierane, będzie to naśladować środowisko testowe. Komora aktywności używana w tym protokole zawiera centralną przegrodę, która dzieli komorę na ćwiartki. Upewnij się, że przegroda jest prawidłowo wyrównana wewnątrz komory.
Następnie delikatnie wyjmij każdą mysz z klatki domowej i natychmiast umieść ją w pustym kwadrancie. Gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane, umieść pokrywę na górze i opuść pomieszczenie. Pozwolić zwierzętom zaaklimatyzować się w komorze badawczej przez 60 minut po okresie aklimatyzacji.
Wróć do pokoju i zdejmij pokrywę. Delikatnie umieść każdą mysz z powrotem w klatce domowej. Dokładnie wyczyść każdą komorę środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi między każdą sesją.
Powtarzaj te kroki przez cztery kolejne dni na tydzień przed początkowym zbieraniem danych. Zadbaj o to, aby losowo przypisać zwierzęta do nowego pudełka podczas każdej sesji, aby uniknąć przyzwyczajenia i śledź przypisania do pudełek przez cały czas trwania badania. Aby zmierzyć aktywność na otwartym polu, przynieś myszy do pomieszczenia testowego, aby zaaklimatyzowały się przez 10 do 30 minut.
W tym czasie opuść pokój. Po tym czasie wróć do pomieszczenia i włącz komory aktywności. Następnie otwórz dołączone oprogramowanie komputerowe, które będzie rejestrować ruch zwierzęcia.
Ustaw podstawowe parametry zbierania danych w oprogramowaniu komputerowym, aby zebrać sześć, 10-minutowe bloki danych, a następnie wprowadź odpowiednią datę, nazwę pliku i numery identyfikacyjne myszy. Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom kontrolę wiązki wstępnej, aby sprawdzić, czy wszystkie wiązki podczerwieni działają prawidłowo. Jeśli komora nie przejdzie kontroli belki wstępnej, najprawdopodobniej jest to spowodowane złym ustawieniem środkowej przegrody.
Jeśli tak się stanie, wyrównaj rozdzielacz, aż czujniki zostaną odblokowane, a system będzie gotowy. Gdy wszystkie komory testowe będą gotowe, delikatnie wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją w komorze testowej. Podczas zbierania danych w komorze testowej można umieścić dwa zwierzęta w tym samym czasie.
Na przykład jedno zwierzę można umieścić w lewym przednim kwadrancie, a drugie w tylnym prawym kwadrancie. Umieść pokrywę na górze komór, gdy wszystkie zwierzęta zostaną załadowane, a następnie uruchom program, aby rozpocząć zbieranie danych. Program rozpocznie rejestrowanie poziomów aktywności zgodnie z ustawionymi wcześniej parametrami zbierania danych.
Opuść pomieszczenie testowe na czas trwania okresu testowego. Wróć do pokoju po zakończeniu zbierania danych. Zapisz dane, a następnie przywróć każde zwierzę do odpowiedniej klatki domowej.
Wyczyść wszystkie jednostki środkiem dezynfekującym i ręcznikami papierowymi przed testowaniem innej grupy zwierząt. Po przetestowaniu wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Oprogramowanie komputerowe oblicza wiele parametrów w okresie zbierania danych.
Dla każdej myszy przejrzyj wszystkie dane w celu kontroli jakości. Powtarzaj te kroki przez cztery kolejne dni. Zadbaj o to, aby losowo przypisać zwierzęta do nowego pudełka podczas każdej sesji i śledź przypisania pudełek przez cały czas trwania badania.
Na koniec oblicz średnią aktywność poziomą. Aktywność pionowa, całkowity przebyty dystans, całkowity czas ruchu i całkowity czas odpoczynku z czterech dni zbierania danych. Wyniki te pokazują typowe poziomy aktywności w otwartym polu samców i samic ddy two J laminat alfa dwa wrodzona dystrofia mięśniowa, myszy i myszy kontrolne z biegiem czasu, aktywność pozioma była wyższa u myszy kontrolnych, podobnie jak aktywność pionowa i całkowita przebyta odległość.
Dwie myszy J wykazały również całkowitą utratę aktywności pionowej w wieku 19 tygodni, co odzwierciedla ich paraliż kończyn tylnych, a co za tym idzie, niezdolność do wstania w wieku sześciu tygodni podczas szczytowej fazy martwiczej. W zwierzęcym modelu dystrofii mięśniowej Duchenne'a myszy MDX wykazują niższy poziom aktywności poziomej, aktywności pionowej i całkowitej przebytej odległości. Wykazano również różnice w aktywności w otwartym polu między myszami różnych szczepów.
Myszy BL 10 miały wyższą aktywność poziomą, aktywność pionową i całkowitą przebytą odległość w porównaniu z myszami L six. Ponieważ aktywność behawioralna jest podatna na duże wahania, aktywność w otwartym polu może nie być odpowiednią miarą pierwszorzędowego punktu końcowego. Jednak może być bardzo cenną miarą drugorzędnego wyniku w badaniach przedklinicznych, gdy jest prowadzona z dodatkowymi funkcjonalnymi testami histologicznymi i molekularnymi.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje zstandaryzowany protokół pomiaru aktywności lokomotorycznej i behawioralnej u myszy z wykorzystaniem systemu monitorowania aktywności w otwartym polu. Metoda ta jest szczególnie wartościowa przy ocenie zaburzeń lokomocyjnych w modelach zwierzęcych chorób nerwowo-mięśniowych oraz przy ewaluacji skuteczności interwencji terapeutycznych. Protokół kładzie nacisk na procedury aklimatyzacji, gromadzenia danych oraz analizy, aby zapewnić wiarygodne i powtarzalne wyniki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka behawioralna
- Przedkliniczne badania nad chorobami nerwowo-mięśniowymi
- Fenotypowanie modeli zwierzęcych
Wprowadzenie
- Monitorowanie aktywności w otwartej przestrzeni służy do oceny ogólnej aktywności lokomotorycznej i behawioralnej u myszy.
- Zapewnia ono nieinwazyjny pomiar ogólnej jakości życia oraz upośledzenia czynnościowego.
- Metoda ta uzupełnia inne oceny, takie jak siła chwytu, i odzwierciedla testy kliniczne, na przykład test sześciominutowego marszu.
- Wyniki mogą zależeć od szczepu zwierząt, wieku, płci, rytmu okołodobowego oraz czynników środowiskowych.
Cel badania
- Dostarczenie zestandaryzowanego protokołu pomiaru aktywności w otwartym polu w badaniach przedklinicznych.
- Omówienie kluczowych kwestii, analizy danych oraz interpretacji wyników testu otwartego pola.
- Przedstawienie zalet, ograniczeń oraz zaleceń dotyczących optymalnego projektu badania.
Zastosowane metody
- Aklimatyzacja myszy w komorze otwartego pola przez cztery kolejne dni.
- Rejestracja aktywności behawioralnej przy użyciu specjalistycznego oprogramowania i komór wyposażonych w wiązki podczerwone.
- Losowe przydzielanie zwierząt do różnych komór w celu uniknięcia habituacji.
- Zbieranie danych w sześciu 10-minutowych blokach, a następnie eksport i weryfikacja kontroli jakości.
- Obliczanie parametrów, takich jak aktywność pozioma, aktywność pionowa, całkowity przebyty dystans, czas ruchu oraz czas spoczynku.
Główne wyniki
- Myszy kontrolne wykazały wyższą aktywność horyzontalną i wertykalną oraz większy całkowity dystans pokonany w porównaniu z modelami chorób nerwowo-mięśniowych.
- U myszy DY2J stwierdzono całkowity zanik aktywności wertykalnej do 19. tygodnia, co odzwierciedla paraliż kończyn tylnych.
- Myszy MDX (model dystrofii mięśniowej Duchenne'a) wykazały obniżony poziom aktywności w porównaniu z grupą kontrolną.
- Zaobserwowano istotne, zależne od szczepu różnice w aktywności w otwartym polu (np. myszy BL10 vs. L6).
Wnioski
- Monitorowanie aktywności w otwartym polu jest wartościowym wtórnym punktem końcowym w przedklinicznych badaniach nerwowo-mięśniowych.
- Jest ono czułe zarówno na postęp choroby, jak i na efekty interwencji terapeutycznych.
- Ze względu na zmienność wyników, powinno być stosowane wraz z innymi analizami funkcjonalnymi, histologicznymi i molekularnymi w celu przeprowadzenia kompleksowej oceny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Monitorowanie aktywności w otwartej przestrzeni zapewnia standaryzowaną, nieinwazyjną metodę ilościowego określania deficytów lokomocyjnych i behawioralnych w przedklinicznych modelach chorób neuromięśniowych. Podejście to umożliwia obiektywną ocenę skuteczności terapeutycznej oraz efektów pozacelowych, wspierając ciągłość translacyjną między badaniami na zwierzętach a punktami końcowymi w badaniach klinicznych. Jego wdrożenie jako drugorzędowej miary efektu zwiększa pewność prognostyczną i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną ocenę fenotypów istotnych dla danej choroby w modelach genetycznych i farmakologicznych.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację zaburzeń lokomocyjnych i zmian behawioralnych.
- Ułatwia porównawczą ocenę potencjalnych celów terapeutycznych za pomocą standaryzowanych parametrów behawioralnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane modele zwierzęce do późniejszych badań nad skutecznością i bezpieczeństwem.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki, takie jak całkowity dystans przebyty oraz wzorce aktywności.
- Umożliwia standaryzację testów i porównywalność międzybadawczą w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowuje przedkliniczne punkty końcowe behawioralne do miar klinicznych, takich jak test sześciominutowego marszu.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie progresji choroby i odpowiedzi terapeutycznej.
- Wspiera integrację z badaniami histologicznymi i molekularnymi w celu kompleksowej oceny translacyjnej.
Integracja potoków i przepływu pracy
Monitorowanie aktywności w otwartym polu wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, łącząc funkcjonalne fenotypowanie z rozwojem biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie fenotypów behawioralnych i lokomozyjnych w celu testowania hipotez terapeutycznych i wyjaśniania mechanizmów chorobowych.
- Przesiewy: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych odczytów behawioralnych do oceny efektów interwencji.
- Analityka: Dostarczanie danych wieloparametrycznych (np. aktywność pozioma/pionowa, czas ruchu/odpoczynku) dla wiarygodnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Odzwierciedlanie klinicznych miar wyników, co zwiększa wartość prognostyczną dla badań na ludziach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowana procedura SOP umożliwia szerokie zastosowanie w modelach chorób nerwowo-mięśniowych i programach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Sprzyja powtarzalności, standaryzacji i skalowalności w fenotypowaniu behawioralnym.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i optymalizuje alokację zasobów poprzez dostarczanie wczesnych sygnałów dotyczących skuteczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuronauki behawioralnej oraz obsługi modeli zwierzęcych.
- Wymaga specjalistycznych komór do monitorowania aktywności, oprogramowania oraz kontroli warunków środowiskowych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Należy uwzględnić linię, wiek, płeć oraz zmienne środowiskowe, aby zapewnić integralność danych.
- Najlepiej stosować jako drugorzędny miernik efektów wraz z analizami funkcjonalnymi, histologicznymi i molekularnymi.
