Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster
20 września 2014
Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.
Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie wyimaginowanych krążków z larw Drosophila W przypadku immunohistochemii osiąga się to poprzez usunięcie z larw kompleksu głowy składającego się z ust, haczyków, oka i krążków ścięgnalnych oraz mózgu. Drugim krokiem jest utrwalenie kompleksu głowy i inkubacja go z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Następnie oko i krążki nerkowe są oddzielane od kompleksu głowy.
Ostatnim krokiem jest zamontowanie wyimaginowanych krążków w środku wybielającym na szkiełku podstawowym. Ostatecznie reportery fluorescencyjne lub LAC Z i barwienie przeciwciał mogą ujawnić przestrzenną i czasową ekspresję genów i białek w wyimaginowanych tkankach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż ta technika może być wykorzystana do uzyskania wglądu w lokalizację genów i białek w enten imaginal disc.
Może być również stosowany do innych tkanek urojonych, takich jak noga skrzydła i zatrzymanie. Tu. Aby rozpocząć eksperyment, napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego buforem do rozwarstwiania. Umieść od 10 do 20 larw na szalce Petriego i pozwól im pływać przez pięć minut.
Aby samooczyścić się ze szkodnika, pipeta tworzy jedną dużą kałużę buforu preparacyjnego w środku płytki preparacyjnej na bazie krzemu. Umieść trzy mniejsze baseny otaczające duży basen i użyj kleszczy, aby przenieść larwy do dolnego basenu. Następnie, za pomocą kleszczy numer pięć, przenieś pojedyncze oczyszczone larwy z małej puli do większej puli bufora preparacyjnego.
Aby rozpocząć grubą sekcję, użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić haczyki do ust, a drugiej pary kleszczy, aby delikatnie chwycić larwy. Na jednej trzeciej długości ciała trzyma haczyk na usta stabilnie. Szybko odciągnij resztę ciała za pomocą drugiej pary kleszczy.
Uwolnij larwę z kleszczy i pozwól wnętrznościom, umożliwiając wyimaginowanym dyskom pozostanie w normalnym potwierdzeniu. Następnie chwyć haczyki do ust i użyj drugiej pary kleszczy, aby usunąć dolne dwie trzecie larw, w tym wewnętrzne wnętrzności. Następnie delikatnie usuń gruczoły ślinowe, krążki nóg i inne tkanki.
Jedyne tkanki, które powinny pozostać, to niewielka ilość pokrywającego ją naskórka. Haczyki w jamie ustnej, krążki oczne i dziesiętne, półkule mózgu i zwój brzuszny. Po maksymalnie 20 minutach przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do paraformowego aldehydu lizyny parias.
Utrwalacz daty lub PLP. Nie pozwól, aby wyimaginowane krążki pozostawały w buforze preparacyjnym dłużej niż 20 minut, ponieważ ulegną degradacji po rozbiorze. Przenieś wypreparowane tkanki w odstępach co 100 mikrolitrów do szkła zegarka zawierającego zimny PLP.
Użyj kleszczy, aby upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Wypreparowane tkanki inkubować w zimnym utrwalaczu PLP przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie przenieś 100 mikrolitrów wypreparowanych tkanek z PLP do buforu do mycia.
Upewnij się, że tkanki są całkowicie zanurzone i inkubuj je w temperaturze pokojowej bez mieszania przez 45 minut. Następnie przenieś wypreparowane tkanki do 1,5-mililitrowej rurki mikro fuge. Usuń bufor do przemywania i zastąp go 100 mikrolitrami roztworu blokującego.
Inkubuj tkanki w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem na rotatorze stołowym przez 10 minut. Po zablokowaniu usuń roztwór i zastąp go 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 10% normalnej surowicy koziej. Inkubować tkanki w temperaturze pokojowej z delikatną rotacją przez 16 godzin, w zależności od siły przeciwciała.
Następnie usuń przeciwciało pierwotne i zastąp je 750 mikrolitrami buforu do płukania. Umieścić probówkę na mutatorze w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wyjmij rurkę z mutatora i pozwól, aby głowice opadły na dno tuby.
Następnie usuń bufor do przemywania i dodaj 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do 10% normalnej surowicy. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem przez co najmniej dwie godziny, w zależności od siły przeciwciała. Po inkubacji usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała z tkanki.
Zastąp go 500 mikrolitrami buforu do przemywania i pozwól, aby chusteczka osiadła na dnie probówki. Umieść trzy kałuże buforu do płukania na silikonowej płytce preparacyjnej. Przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do dużej puli buforu do mycia, który został umieszczony na naczyniu preparacyjnym.
Pomaga to usunąć nadmiar przeciwciał wtórnych, aby rozpocząć drobną sekcję, umieścić złożony głowę brzuszną stroną do dołu i zacisnąć naskórek za haczyki ustne. Umieść drugą parę kleszczy w przestrzeni między mózgiem a dyskami oczu i szybko odciągnij mózg od haczyków ustnych, aby usunąć dwa płaty mózgu, nadal trzymając haczyki ust. Ściśnij tkankę jak najbliżej połączenia między sekcją anteny tarczy anteny oka a haczykiem na usta.
Kontynuuj, aż cała pożądana tkanka zostanie wycięta. Następnie dodaj dwa małe kawałki bibuły wielkości szkiełek nakrywkowych w odległości trzech cali od siebie na naczyniu preparacyjnym. Umieść szklane szkiełko na tych kawałkach papieru, aby zapobiec przyklejaniu się szkiełka do silikonowej podstawy naczynia do preparowania.
Używając pipety P 20, dodaj dziewięć mikrolitrów środka przeciwwybielającego na środek szklanego szkiełka mikroskopowego, aby zapobiec wybielaniu tkanki światłem fluorescencyjnym za pomocą tej samej nieobciętej końcówki, zbierz wszystkie krążki I i tenal i dodaj je do kropli odczynnika wybielającego. Następnie użyj kleszczy, aby oddzielić i rozłożyć krążki oka i ścięgienne w kropli odczynnika wybielającego, aż żadne wyimaginowane krążki się nie stykają. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kroplę środka wybielającego, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
Na koniec przechowuj szkiełka w temperaturze ujemnych 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do oglądania i obrazowania krążków jonowych za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Metoda ta niezawodnie pozwala uzyskać wysokiej jakości materiał do analizy, który jest przekazywany przez te konfokalne obrazy dysków wyobrażeniowych. Krążki potraktowano foidem i sprzężonym fluoro czterem, który wiąże się z f aktyną, a tym samym zarysowuje każdą komórkę.
Jedną z najbardziej rzucających się w oczy cech krążka entalnego jest bruzda morfogenetyczna, którą można zobaczyć jako wgłębienie w tkance biegnące wzdłuż grzbietowej osi brzusznej. W miarę postępu bruzdy w poprzek pola oka, morze nieuporządkowanych komórek przekształca się w uporządkowany układ okresowo rozmieszczonych oczu jednostkowych lub Oma Tedia. Weryfikacja ekspresji klonalnej i analiza dysku imaginalnego są możliwymi dalszymi zastosowaniami tej metody.
Trzy górne panele wyświetlają dyski, które zostały wybarwione różnymi przeciwciałami, takimi jak ilis, A DPP, LAC Z reporterem transkrypcyjnym i markerami specyficznymi dla komórek, takimi jak embrionalne, letalne, nieprawidłowe widzenie lub vy, które koduje białko wiążące RNA w obrębie neuronów. Trzy dolne panele pokazują dyski, w których GFP jest używany do oznaczania populacji komórek. Po opanowaniu kursu izolacja kompleksów głowy od 10 do 20 larw zajmie około 10 minut, a dodatkowo dokładna izolacja krążka jonowego z tych kompleksów również zajmie około 10 minut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób wypreparowania tarczek imaginalnych z larw Drosophila do badań immunohistochemicznych. Podkreśla on znaczenie tarczek imaginalnych w zrozumieniu procesów rozwojowych oraz ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Neuronauka
- Biologia komórki
Wstęp
- Tarcze imaginalne są workowatymi strukturami u Drosophila, z których powstają struktury dorosłego organizmu.
- Są one kluczowe dla badania determinacji tkanek i specyfikacji losu komórek.
- Zrozumienie tych procesów może dostarczyć wiedzy na temat szerszych mechanizmów biologicznych.
- Mikroskopia fluorescencyjna jest kluczową techniką wykorzystywaną do wizualizacji ekspresji genów i białek.
Cel badania
- Przeprowadzenie dyssekcji tarczekImaginalnych w celu analizy lokalizacji genów i białek.
- Wykorzystanie immunohistochemii do badania wzorców ekspresji przestrzennej i czasowej.
- Pogłębienie zrozumienia procesów rozwojowych u Drosophila.
Zastosowane metody
- Disekcja larw Drosophila w celu usunięcia kompleksu głowy.
- Fiksacja kompleksu głowy i inkubacja z przeciwciałami.
- Oddzielenie tarczek oka i czułek od kompleksu głowy.
- Montaż tarczek imaginalnych na szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii.
Główne wyniki
- Raporty fluorescencyjne ujawniają ekspresję genów i białek w tkankach imaginalnych.
- Immunohistochemia pozwala na szczególną wizualizację procesów rozwojowych.
- Uzyskane informacje mogą posłużyć do badań nad rozwojem i organizacją tkanek.
- Metodologię można zastosować do różnych krążków imaginalnych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania tarczek imaginalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia biologii rozwoju u Drosophila.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych technikach w celu zgłębienia innych aspektów rozwoju.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wysokiej wierności wizualizację ekspresji genów i białek w krążkach wyobraźnych Drosophila, wspierając walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki zapewnieniu powtarzalnego przygotowania tkanek do immunohistochemii, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad biologią rozwoju istotnych dla modelowania ludzkich chorób. Kompatybilność metody z szerokim zakresem przeciwciał oraz możliwość adaptacji do grubszych tkanek, takich jak mózg larwalny, zwiększa jej użyteczność w różnych procesach badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę przestrzennej i czasowej lokalizacji białek w rozwijających się tkankach.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez zachowanie integralności tkanki dla detekcji szlaków istotnych w przebiegu choroby z wykorzystaniem przeciwciał.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie wizualizacji dynamiki ekspresji genów, która jest kluczowa dla oceny pewności wyboru celu.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez zapewnienie spójnej fiksacji tkanek i zachowania antygenów.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zoptymalizowanym protokołom sekcji i fiksacji.
- Skalowalność: Umożliwia wiarygodną ocenę związków dzięki wysokiej jakości immunobarwieniu kompatybilnemu z odczytami z mikroskopii fluorescencyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób, umożliwiając analizę konserwatywnych szlaków rozwojowych u *Drosophila*.
- Wgląd mechanistyczny: Zapewnia wartość w zakresie predykcyjnego ograniczania ryzyka poprzez analizę ekspresji klonalnej i wizualizację genów reporterowych w tkankach wyobraźnych.
- Zgodność przedkliniczna: Łączy odkrycia z etapu badań podstawowych z walidacją przedkliniczną za pomocą standaryzowanych procedur immunohistochemicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację wiodących struktur, wspierając ograniczanie ryzyka biologicznego oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych przed etapem przesiewania związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez precyzyjną lokalizację genów i białek w rozwijających się tkankach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzenia testów oraz wyniki ilościowe dzięki standaryzacji przygotowania tkanek, kompatybilnej z detekcją przeciwciał i reporterów.
- Analityka: Generuje pomiary ekspresji przestrzennej i czasowej, które umożliwiają analizę porównawczą w różnych warunkach genetycznych lub eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspierają ciągłość przedkliniczną, umożliwiając wizualizację konserwatywnych procesów rozwojowych istotnych dla modeli ludzkich chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnie wykorzystywalna metoda w projektach wymagających obrazowania tkanek o wysokiej rozdzielczości w celu walidacji celu.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ścieżkach rozwojowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procedur immunohistochemicznych w różnych systemach modelowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o ekspresji przestrzennej, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki obiektywnej, opartej na wizualizacji ocenie zaangażowania celu i modulacji szlaków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z Drosophila, technikach sekcjonowania oraz protokołach immunohistochemii.
- Zależność od aparatury, w tym mikroskopów sekcyjnych, mikroskopów fluorescencyjnych oraz urządzeń inkubacyjnych z kontrolą temperatury.
- Konieczność standaryzacji warunków fiksacji, blokowania i inkubacji przeciwciał pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Metoda możliwa do zastosowania w przypadku grubszych tkanek, takich jak mózg larwy i jajnik dorosłego osobnika, po wprowadzeniu modyfikacji protokołu opisanych w źródle.
- Ograniczona czułością przeciwciał na warunki fiksacji; w przypadku przeciwciał wrażliwych zaleca się stosowanie alternatywnych koktajli do fiksacji.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Preparation of Larvae
2:08
Coarse Dissection of Larvae
3:30
Fixation and Staining of Tissue with Antibodies
6:17
Fine Dissection of Eye-Antennal Disc Complexes and Mounting
8:11
Results: Dynamic Images Produced for In-depth Analysis
9:39
Conclusion
