Name: Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Naucz się rozwarstwiania i barwienia immunologicznego dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów i białek w tkankach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Donaldowi Ready'emu i Kevinowi Mosesowi za nauczenie JPK oryginalnej procedury wyimaginowanej sekcji dysku. Dziękujemy również Bonnie Weasner za krążek narządów płciowych na rycinie 1B i dysk oka na rysunku 2A, Brandonowi Weasnerowi za rysunek 3, Bloomington Drosophila Stock Center za plamy much i Developmental Studies Hybridoma Bank za przeciwciała. CMS jest wspierany przez stypendium z National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Research Fellowship oraz Robert Briggs Research Fellowship. JPK jest wspierany przez grant z Narodowego Instytutu Oka (R01 EY014863)

1. Przygotowanie larw
<ol>
	<li>Napełnić szalkę Petriego o średnicy 35 mm buforem do rozwarstwiania.</li>
	<li>Umieść larwy na szalce Petriego i pozwól im pływać przez kilka minut (etap samooczyszczania).</li>
	<li>Przenieść larwy do kałuży buforu do rozwarstwiania na płytce rozwarstwiającej na bazie silikonu. Ta pula powinna znajdować się na jednej krawędzi talerza. Płytka preparcyjna składa się z roztworu silikonu, który został przelany i utwardzony na szklanej szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura umieść większą kałużę buforu do preparowania na środku płytki rozwarstwiającej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy #5 przenieś pojedynczą oczyszczoną larwę z małej puli do większej puli bufora preparacyjnego.</li>
</ol>
2. Grube rozbieranie larw
<ol>
	<li>Podczas gdy larwa znajduje się jeszcze w dużej puli bufora rozwarstwiającego, należy ją chwycić kleszczami. Jedna para kleszczy powinna być używana do chwytania haczyków do pyska, podczas gdy druga para kleszczy służy do przytrzymywania zwierzęcia nieruchomo (delikatnie chwyć larwę na 1/3 długości ciała).</li>
	<li>Trzymaj stabilnie parę kleszczy zawierających naskórek w pobliżu haczyków na usta, jednocześnie szybko odciągając resztę ciała drugą parą kleszczy.</li>
	<li>Kiedy larwa zacznie się rozdzierać, poczujesz lekkie uwolnienie napięcia. Uwolnij larwę z kleszczy i pozwól, aby "wnętrzności" larwy. Pozwala to na zachowanie wyimaginowanych dysków w ich normalnej budowie i zapobiega ich deformacji.</li>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczy ponownie chwyć haczyki ustne, aby utrzymać przedni koniec larwy na miejscu. Za pomocą drugiej pary kleszczy usuń dolne 2/3 larw, w tym wewnętrzne wnętrzności. Uwaga: pozostanie kompleks zawierający haczyki ustne, krążki oczno-czułkowe, półkule mózgu, zwój brzuszny, gruczoły ślinowe, niektóre dyski nóg i leżący nad nimi naskórek.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie usuń naskórek, gruczoły ślinowe, krążki nóg i inne tkanki. Uwaga: jedyna tkanka, która powinna pozostać, to haczyki ustne, krążki oczno-czułkowe, półkule mózgowe i zwój brzuszny (ryc. 3).</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1–2.5 z dodatkowymi larwami przez 15–20 minut. Uwaga: wyimaginowane dyski, które pozostają w buforze preparacyjnym przez dłuższy czas, mają tendencję do degradacji i ostatecznie wydają się być mniej niż idealnymi okazami do sfotografowania. W związku z tym po maksymalnie 20 minutach wszystkie wypreparowane tkanki należy przenieść do utrwalacza PLP (patrz poniżej).</li>
</ol>
3. Utrwalanie i barwienie tkanek przeciwciałami
<ol>
	<li>Za pomocą pipetmana P-200 przenieś wypreparowane tkanki do szkła zegarka zawierającego zimny utrwalacz paraformaldehydu-lizyny-periodynianu (PLP). Ogranicz objętość przenoszonego buforu rozwarstwiającego do 50 μl, aby zminimalizować rozcieńczenie PLP. Pamiętaj, aby przeciąć końcówkę żyletką tak, aby otwór końcówki był wystarczająco duży, aby pomieścić wypreparowane tkanki. Za pomocą kleszczy lub igły wolframowej upewnij się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone, aby nastąpiło prawidłowe utrwalenie. Wypreparowane tkanki inkubować w zimnym utrwalaczu PLP przez 45 minut. Ta inkubacja może odbywać się w RT bez mieszania.</li>
	<li>Za pomocą pipetownika P-200 przenieść wypreparowane tkanki do buforu płuczącego (RT) za pomocą innej żółtej końcówki na 45 minut. Ogranicz objętość przeniesionego PLP do 50 μl, aby zminimalizować rozcieńczenie buforu do przemywania . Uwaga: wszystkie wypreparowane tkanki powinny być całkowicie zanurzone.</li>
	<li>Przenieś 20–30 zestawów wypreparowanych tkanek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Uwaga: jeśli w probówce połączy się większą liczbę kompleksów krążka oczkowo-czułkowego, istnieje możliwość, że tkanka na dnie probówki nie będzie prawidłowo wystawiona na działanie przeciwciał. Aby uzyskać optymalne wyniki, w jednej probówce nie powinno znajdować się więcej niż 20–30 kompleksów krążków oczno-czułkowych. Wypreparowana tkanka osiądzie na dnie rurki do mikrofuge. Dlatego w kolejnych krokach użyj pipetmana, aby usunąć i wymienić bufor do płukania, roztwór blokujący i przeciwciała.</li>
	<li>Usunąć bufor do przemywania i zastąpić go 100 μl roztworu blokującego: 10% normalnej surowicy koziej w buforze do mycia. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym obrotem na rotatorze stołowym przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i zastąpić go 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych, które zostały odpowiednio rozcieńczone w 10% normalnej surowicy koziej. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnymi obrotami przez 16 godzin.</li>
	<li>Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i zastąpić 750 μl buforu do mycia. Umieścić probówki na nutatorze i pozostawić do nutowania w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Uwaga: Przeciwciało pierwotne można zachować (przechowywać w temperaturze 4 °C) i ponownie wykorzystać później. Wielokrotne użycie przeciwciał może pomóc w zmniejszeniu niespecyficznego wiązania.</li>
	<li>Pozwól, aby główki osiadły na dnie probówki, a następnie usuń bufor do przemywania i dodaj 100 μl przeciwciał drugorzędowych, które zostały odpowiednio rozcieńczone w 10% normalnej surowicy. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnymi rotacjami przez 2–4 godziny.</li>
	<li>Usunąć wtórne roztwory przeciwciał z tkanki i zastąpić 500 μl buforu do przemywania wody. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie probówki.</li>
	<li>Za pomocą P-200 i przeciętej żółtej końcówki przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do puli buforu do mycia, która została umieszczona na naczyniu preparacyjnym. Przechodząc do następnego etapu dokładnego rozwarstwienia, tkanka będzie inkubować w buforze do mycia. Pomaga to usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.</li>
</ol>
4. Precyzyjna analiza kompleksów dysku oczno-antenowego i montaż na szkiełkach
<ol>
	<li>Użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić naskórek za haczyki do ust, tak aby brzuszna strona kompleksu była skierowana w dół. Za pomocą drugiej pary kleszczy usuń dwa płaty mózgu, zamykając drugie kleszcze w przestrzeni między mózgiem a dyskami oczu (ryc. 3, czerwona strzałka) i szybko odciągając mózg od haczyków ustnych.</li>
	<li>Kontynuując trzymanie haczyków do ust, ściśnij tkankę jak najbliżej połączenia między częścią czułkową dysku oczka-czułek a haczykami ustnymi (ryc. 3, niebieska strzałka). Uwaga: kompleksy krążka oczkowo-czułkowego powinny być wolne od wszelkich tkanek (ryc. 1A). Kontynuuj, aż cała pożądana tkanka, którą można umieścić na szkiełkach, zostanie wycięta. Protokół ten można dostosować do izolacji dysków wyobrażonych skrzydeł, haltere, nóg i narządów płciowych (ryc. 1B-E).</li>
	<li>Dodaj dwa małe kawałki bibuły (wielkości szkiełek nakrywkowych) w odległości około 3 cali od siebie na naczyniu preparacyjnym. Umieść szklane szkiełko na naczyniu — dwa kawałki bibuły powinny znajdować się pod końcami szkiełka. Zapobiegnie to przywieraniu szkiełka do silikonowej podstawy naczynia preparacyjnego.</li>
	<li>Za pomocą P-20 z nieobciętą końcówką dodaj 9 μl środka wybielającego na środek szklanego szkiełka mikroskopowego. Zapobiega to wybielaniu tkanki podczas oglądania w świetle fluorescencyjnym.</li>
	<li>Używając tej samej nieobciętej końcówki, zbierz wszystkie krążki z antenkami ocznymi i dodaj je do kropli odczynnika wybielającego. Zminimalizuj ilość przenoszonego buforu do mycia. Staraj się ograniczyć ilość buforu do mycia do 10 μl lub mniej.</li>
	<li>Użyj pary kleszczy, aby oddzielić i rozprowadzić krążki anteny ocznej w kropli odczynnika wybielającego. Pozostawić krążki do inkubacji w odczynniku wybielającym przez kilka minut. Uwaga: krążki staną się przezroczyste, gdy tkanka wchłonie odczynnik wybielający.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na próbkę. Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą gotowe do oglądania anteny oka lub innych wyimaginowanych dysków za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż procedura ta w dużej mierze koncentrowała się na izolacji, a następnie leczeniu krążków oczno-czułkowych, można ją wykorzystać do izolacji i analizy krążków skrzydła, haltere, nóg i narządów płciowych (ryc. 4). Jedyną wymaganą modyfikacją protokołu izolacji tych krążków (w przeciwieństwie do krążka oczkowo-czułkowego) jest metoda grubej sekcji (sekcja 2 protokołu). Pierwsza para nóg piersiowych (T1) znajduje się w przedniej części larwy i można ją odzyskać, postępując zgodnie z protokołem izolacj...

Przez ponad sto lat muszka owocowa, Drosophila melanogaster, była głównym systemem do badania rozwoju, zachowania i fizjologii. Rozwój muchy można podzielić na dwa szerokie etapy: embrionalny i postembrionalny, przy czym większość tych ostatnich odbywa się w obrębie nabłonka jednowarstwowego zwanego dyskami imaginalnymi 1-3. Rysunki wyimaginowanych dysków zostały po raz pierwszy opublikowane w 1864 roku przez Augusta Weismanna jako część jego obszernej monografii na temat rozwoju owadów 1. Dyski te rozpoczynają swój rozwój podczas embriogenezy, są wzorowane w stadiach larwalnych, przeżywają masywną histolizę wczesnych stadiów poczwarki i ostatecznie dają początek wysokiemu procentowi dorosłych struktur, które znajdują się w dorosłej muszce 1-14. Podczas rozwoju larwalnego każdy krążek podejmuje kilka krytycznych decyzji dotyczących losu, kształtu i rozmiaru. W obrębie pierwszego i drugiego stadium larwalnego dyski mają za zadanie przyjąć pierwotny los, ustalić granice przedziałów, przyjąć prawidłowy kształt i wygenerować wymaganą liczbę komórek 15-16. W trzecim stadium larwalnym i wczesnym stadium przedpoczwarkowym dyski wyobrażeniowe nadal się dzielą i są wzorowane, gdy komórki przyjmują swój końcowy los 16.
Podczas wczesnej historii biologii rozwojowej Drosophila, wyimaginowane dyski były badane prawie wyłącznie w kontekście normalnego rozwoju i w ograniczonych przypadkach, w których mutacja tracąca lub zyskująca funkcję była możliwa do zrealizowania. Zastosowanie promieni rentgenowskich do wywołania rekombinacji mitotycznej pozwoliło na analizę śmiertelnych mutacji w klonach komórkowych w tkankach larwalnych i dorosłych. Metoda ta została ulepszona poprzez wprowadzenie metod transgenicznych do analizy mutacji utraty i wzmocnienia funkcji zarówno w tkankach larwalnych, jak i dorosłych. Stale rośnie również liczba przeciwciał, reporterów transkrypcyjnych i pułapek białkowych do opisu krajobrazu molekularnego tkanek typu dzikiego i zmutowanego. Wykorzystanie tych markerów molekularnych do analizy klonów zmutowanych komórek utraconych i zyskających funkcję sprawiło, że coraz bardziej możliwe stało się zrozumienie w czasie rzeczywistym, w jaki sposób zmutowane komórki odbiegają od swoich dzikich kuzynów podczas rozwoju. Aby właściwie wykorzystać te narzędzia i odczynniki, kluczowe znaczenie ma posiadanie wysokiej jakości preparatów wyimaginowanych dysków, które można oglądać, fotografować i analizować. Celem tego manuskryptu jest zapewnienie zoptymalizowanego protokołu izolacji i przygotowania kompleksu krążka oczkowo-czułkowego (ryc. 1A). Może być również z powodzeniem stosowany do izolowania szerokiej gamy dodatkowych dysków, w tym tych, które dają początek skrzydłom, przezmiankom, nogom T1-T3 i genitaliom (ryc. 1B-E). Procedura ta, z niewielkimi modyfikacjami, była stosowana do izolowania wyimaginowanych krążków od Drosophila przez prawie osiemdziesiąt lat.
Jak opisano powyżej, ponieważ większość genów ulega ekspresji podczas wielu etapów rozwoju i w wielu tkankach, często niemożliwe jest zbadanie efektów, jakie mutanty zerowe wywierają na całe oko, ponieważ zwierzę umiera na długo przed trzecim stadium larwalnym stadium rozwojowym. Cztery metody sprawiły, że badanie bardziej rozwiniętych tkanek, takich jak siatkówka, jest znacznie łatwiejsze w użyciu. Pierwszą z nich jest metoda Flippase (FLP)/Flippase Recombination Target (FRT) polegająca na generowaniu zmutowanych klonów komórek w tkance typu dzikiego 17-19. W tym przypadku zmutowana tkanka jest identyfikowana przez brak markera wizualnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP) i może być porównana z otaczającą tkanką typu dzikiego, w której występuje GFP (ryc. 2D). Druga to metoda "flp-out", w której transgen ulega ekspresji w populacji komórek 20. W tym przypadku klony komórek są identyfikowane na podstawie obecności GFP i porównywane z otaczającą tkanką typu dzikiego, która nie ma reportera GFP (Figura 2E). Trzecia to analiza mozaiki z techniką represyjnego markera komórkowego (MARCM), która łączy w sobie elementy zmutowanego klonu FLP/FRT i systemów ekspresji flp-out 21. Dzięki tej metodzie transgen może ulegać ekspresji w populacji komórek, które są jednocześnie zmutowane dla pojedynczego locus genetycznego. Podobnie jak klony typu flp-out, klony MARCM są identyfikowane na podstawie obecności GFP i porównywane z otaczającą tkanką typu dzikiego, która nie ma markera GFP (Figura 2F). I wreszcie, geny i konstrukty RNAi mogą ulegać ekspresji w wyimaginowanych tkankach pod kontrolą określonych konstruktów promotora-GAL4. Te cztery metody zwiększyły zainteresowanie badaniem wyimaginowanych dysków, ponieważ zmutowane lub nadmiernie ekspresyjne klony lub wzorce mogą być bezpośrednio porównane z sąsiednimi tkankami typu dzikiego. Metoda opisana w tej procedurze została opracowana tak, aby naukowcy badający rozwój poembrionalny dorosłych tkanek u Drosophila, szczególnie tych pochodzących z tarczy oczno-czułkowej, byli w stanie uzyskać wysokiej jakości tkankę do analizy. Chociaż poszczególni badacze dokonali niewielkich modyfikacji, rdzeń tej procedury (którą opisujemy tutaj) pozostał w dużej mierze niezmieniony. Ponieważ uzyskanie wysokiej jakości tkanki ma kluczowe znaczenie dla badania dysków wyobrażeniowych, mamy nadzieję, że ten pisemny protokół i towarzyszący mu film posłużą jako cenny zasób dydaktyczny.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Służy do stworzenia podstawy pod płytkę preparacyjną</td></tr><tr><td>Pryex Szklana szalka Petriego 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Użyj pokrywy do płytki preparcyjnej</td></tr><tr><td>#5 Kleszcze preparacyjne</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Kleszcze muszą być bardzo ostre</td></tr><tr><td>9-dołkowe szkiełko</td><td></td><td></td> <td>zegarkowe SprzedawcySłuży do utrwalania wyimaginowanych kompleksów krążków</td></tr><tr><td>50 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>Różni sprzedawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mały mieszadło</td><td>Różni sprzedawcy</td><td></td><td>Wystarczająco mały, aby zmieścić się w kolbie Erlenmeyera</td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe</td><td>Różni sprzedawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofug 1,5 ml</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Przezroczyste lub ciemne w zależności od zastosowania</td></tr><tr><td>Stojak</td> <td>na mikrofugeRóżni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator stołowy</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>100 i #956; l objętość nie powinna rozpryskiwać się przy niskim ustawieniu</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Służy jako utrwalacz</td></tr><tr><td>Fosforan sodu Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Służy do wytwarzania do rozwarstwiania i mycia</td></tr><tr><td>Fosforan sodu Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Służy do wytwarzania do rozwarstwiania i mycia</td></tr><tr><td>Lizyna</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Stosowany w roztworze utrwalającym</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Stosowany w roztworze utrwalającym</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Służy do perforacji dysków wyobrażeniowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Służy do rozpuszczania paraformaldehydu</td></tr><tr><td>100% Normalna surowica kozia Jackson</td><td>Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Służy jako roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Rozcieńczyć w 10% surowicy koziej zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Rozcieńczyć w 10% surowicy koziej zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Vectashield</td><td>H-1000</td><td>Zapobiega bieleniu próbek</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Zapobiega przywieraniu szkiełek szklanych do silikonowej podstawy</td></tr><tr><td>Pędzel Panit 000</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Służy do delikatnego opuszczania szkiełka nakrywkowego na próbki</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Znaczna część rozwoju poembrionalnego u muszki owocowej, Drosophila melanogaster, odbywa się w obrębie zestawu struktur przypominających worki, zwanych dyskami imaginalnymi. Dyski te dają początek wysokiemu procentowi dorosłych struktur, które znajdują się w dorosłej muszce. W tym miejscu opisujemy protokół, który został zoptymalizowany w celu odzyskania tych krążków i przygotowania ich do analizy za pomocą przeciwciał, reporterów transkrypcyjnych i pułapek białkowych. Ta procedura najlepiej nadaje się do cienkich tkanek, takich jak dyski wyobrażeniowe, ale można ją łatwo zmodyfikować do stosowania z grubszymi tkankami, takimi jak mózg larwy i dorosły jajnik. Pisemny protokół i towarzyszący mu film poprowadzą czytelnika/widza przez sekcję larw trzeciego stadium rozwojowego, utrwalenie tkanki i leczenie wyimaginowanych dysków przeciwciałami. Protokół może być również wykorzystany do wypreparowania wyimaginowanych krążków z młodszych larw pierwszego i drugiego stadium rozwojowego. Zaletą tego protokołu jest to, że jest stosunkowo krótki i został zoptymalizowany pod kątem wysokiej jakości zachowania wypreparowanej tkanki. Kolejną zaletą jest to, że zastosowana procedura utrwalania działa dobrze w przypadku przytłaczającej liczby przeciwciał, które rozpoznają białka Drosophila. Z naszego doświadczenia wynika, że istnieje bardzo mała liczba wrażliwych przeciwciał, które nie działają dobrze w tej procedurze. W takich sytuacjach wydaje się, że lekarstwem jest użycie alternatywnego koktajlu utrwalającego, przy jednoczesnym przestrzeganiu wytycznych, które ustaliliśmy dla etapów sekcji i inkubacji przeciwciał.

Opisana powyżej metoda pozwala na niezawodne pozyskanie materiału wysokiej jakości do analiz z wykorzystaniem sond in situ, reporterów transkrypcyjnych, pułapek białkowych oraz przeciwciał. Na Rysunku 1 przedstawiono krążki oka-anteny, narządów płciowych, skrzydła, haltery i nóg, które są rutynowo otrzymywane za pomocą tej metody. Krążki te zostały potraktowane fluorochromem sprzężonym z falloidyną, która wiąże się z F-aktyną, co pozwala na wyznaczenie obrysów każdej komórki. Jeśli tkanka został...

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie wyimaginowanych krążków z larw Drosophila W przypadku immunohistochemii osiąga się to poprzez usunięcie z larw kompleksu głowy składającego się z ust, haczyków, oka i krążków ścięgnalnych oraz mózgu. Drugim krokiem jest utrwalenie kompleksu głowy i inkubacja go z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Następnie oko i krążki nerkowe są oddzielane od kompleksu głowy.Ostatnim krokiem jest zamontowanie wyimaginowanych krążków w środku wybielającym na szkiełku podstawowym. Ostatecznie reportery fluorescencyjne lub LAC Z i barwienie przeciwciał mogą ujawnić przestrzenną i czasową ekspresję genów i białek w wyimaginowanych tkankach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż ta technika może być wykorzystana do uzyskania wglądu w lokalizację genów i białek w enten imaginal disc.Może być również stosowany do innych tkanek urojonych, takich jak noga skrzydła i zatrzymanie. Tu. Aby rozpocząć eksperyment, napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego buforem do rozwarstwiania. Umieść od 10 do 20 larw na szalce Petriego i pozwól im pływać przez pięć minut.Aby samooczyścić się ze szkodnika, pipeta tworzy jedną dużą kałużę buforu preparacyjnego w środku płytki preparacyjnej na bazie krzemu. Umieść trzy mniejsze baseny otaczające duży basen i użyj kleszczy, aby przenieść larwy do dolnego basenu. Następnie, za pomocą kleszczy numer pięć, przenieś pojedyncze oczyszczone larwy z małej puli do większej puli bufora preparacyjnego.Aby rozpocząć grubą sekcję, użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić haczyki do ust, a drugiej pary kleszczy, aby delikatnie chwycić larwy. Na jednej trzeciej długości ciała trzyma haczyk na usta stabilnie. Szybko odciągnij resztę ciała za pomocą drugiej pary kleszczy.Uwolnij larwę z kleszczy i pozwól wnętrznościom, umożliwiając wyimaginowanym dyskom pozostanie w normalnym potwierdzeniu. Następnie chwyć haczyki do ust i użyj drugiej pary kleszczy, aby usunąć dolne dwie trzecie larw, w tym wewnętrzne wnętrzności. Następnie delikatnie usuń gruczoły ślinowe, krążki nóg i inne tkanki.Jedyne tkanki, które powinny pozostać, to niewielka ilość pokrywającego ją naskórka. Haczyki w jamie ustnej, krążki oczne i dziesiętne, półkule mózgu i zwój brzuszny. Po maksymalnie 20 minutach przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do paraformowego aldehydu lizyny parias.Utrwalacz daty lub PLP. Nie pozwól, aby wyimaginowane krążki pozostawały w buforze preparacyjnym dłużej niż 20 minut, ponieważ ulegną degradacji po rozbiorze. Przenieś wypreparowane tkanki w odstępach co 100 mikrolitrów do szkła zegarka zawierającego zimny PLP.Użyj kleszczy, aby upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Wypreparowane tkanki inkubować w zimnym utrwalaczu PLP przez 45 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie przenieś 100 mikrolitrów wypreparowanych tkanek z PLP do buforu do mycia.Upewnij się, że tkanki są całkowicie zanurzone i inkubuj je w temperaturze pokojowej bez mieszania przez 45 minut. Następnie przenieś wypreparowane tkanki do 1,5-mililitrowej rurki mikro fuge. Usuń bufor do przemywania i zastąp go 100 mikrolitrami roztworu blokującego.Inkubuj tkanki w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem na rotatorze stołowym przez 10 minut. Po zablokowaniu usuń roztwór i zastąp go 100 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w 10% normalnej surowicy koziej. Inkubować tkanki w temperaturze pokojowej z delikatną rotacją przez 16 godzin, w zależności od siły przeciwciała.Następnie usuń przeciwciało pierwotne i zastąp je 750 mikrolitrami buforu do płukania. Umieścić probówkę na mutatorze w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wyjmij rurkę z mutatora i pozwól, aby głowice opadły na dno tuby.Następnie usuń bufor do przemywania i dodaj 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do 10% normalnej surowicy. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem przez co najmniej dwie godziny, w zależności od siły przeciwciała. Po inkubacji usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała z tkanki.Zastąp go 500 mikrolitrami buforu do przemywania i pozwól, aby chusteczka osiadła na dnie probówki. Umieść trzy kałuże buforu do płukania na silikonowej płytce preparacyjnej. Przenieś wszystkie wypreparowane tkanki do dużej puli buforu do mycia, który został umieszczony na naczyniu preparacyjnym.Pomaga to usunąć nadmiar przeciwciał wtórnych, aby rozpocząć drobną sekcję, umieścić złożony głowę brzuszną stroną do dołu i zacisnąć naskórek za haczyki ustne. Umieść drugą parę kleszczy w przestrzeni między mózgiem a dyskami oczu i szybko odciągnij mózg od haczyków ustnych, aby usunąć dwa płaty mózgu, nadal trzymając haczyki ust. Ściśnij tkankę jak najbliżej połączenia między sekcją anteny tarczy anteny oka a haczykiem na usta.Kontynuuj, aż cała pożądana tkanka zostanie wycięta. Następnie dodaj dwa małe kawałki bibuły wielkości szkiełek nakrywkowych w odległości trzech cali od siebie na naczyniu preparacyjnym. Umieść szklane szkiełko na tych kawałkach papieru, aby zapobiec przyklejaniu się szkiełka do silikonowej podstawy naczynia do preparowania.Używając pipety P 20, dodaj dziewięć mikrolitrów środka przeciwwybielającego na środek szklanego szkiełka mikroskopowego, aby zapobiec wybielaniu tkanki światłem fluorescencyjnym za pomocą tej samej nieobciętej końcówki, zbierz wszystkie krążki I i tenal i dodaj je do kropli odczynnika wybielającego. Następnie użyj kleszczy, aby oddzielić i rozłożyć krążki oka i ścięgienne w kropli odczynnika wybielającego, aż żadne wyimaginowane krążki się nie stykają. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kroplę środka wybielającego, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.Na koniec przechowuj szkiełka w temperaturze ujemnych 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do oglądania i obrazowania krążków jonowych za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Metoda ta niezawodnie pozwala uzyskać wysokiej jakości materiał do analizy, który jest przekazywany przez te konfokalne obrazy dysków wyobrażeniowych. Krążki potraktowano foidem i sprzężonym fluoro czterem, który wiąże się z f aktyną, a tym samym zarysowuje każdą komórkę.Jedną z najbardziej rzucających się w oczy cech krążka entalnego jest bruzda morfogenetyczna, którą można zobaczyć jako wgłębienie w tkance biegnące wzdłuż grzbietowej osi brzusznej. W miarę postępu bruzdy w poprzek pola oka, morze nieuporządkowanych komórek przekształca się w uporządkowany układ okresowo rozmieszczonych oczu jednostkowych lub Oma Tedia. Weryfikacja ekspresji klonalnej i analiza dysku imaginalnego są możliwymi dalszymi zastosowaniami tej metody.Trzy górne panele wyświetlają dyski, które zostały wybarwione różnymi przeciwciałami, takimi jak ilis, A DPP, LAC Z reporterem transkrypcyjnym i markerami specyficznymi dla komórek, takimi jak embrionalne, letalne, nieprawidłowe widzenie lub vy, które koduje białko wiążące RNA w obrębie neuronów. Trzy dolne panele pokazują dyski, w których GFP jest używany do oznaczania populacji komórek. Po opanowaniu kursu izolacja kompleksów głowy od 10 do 20 larw zajmie około 10 minut, a dodatkowo dokładna izolacja krążka jonowego z tych kompleksów również zajmie około 10 minut.

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół przedstawia technikę sekcji stosowaną do izolacji tarcz imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Metody utrwalania tkanki po wycięciu i usunięciu tarcz skrzydłowych, odnóży oraz oka są zaprezentowane bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym w celu ich późniejszej wizualizacji.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Naucz się rozwarstwiania i barwienia immunologicznego dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster. Ta metoda umożliwia wizualizację ekspresji genów i białek w tkankach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów