Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest zilustrowanie, w jaki sposób śledzić szybko poruszające się organelle, takie jak lizosomy, poruszające się w 3D w żywej komórce. Osiąga się to poprzez pierwsze barwienie lizosomów i mikrotubul przy użyciu określonych barwników komercyjnych wewnątrz hodowanych żywych komórek. Drugim krokiem jest użycie laserowego mikroskopu skaningowego i zastosowanie metody śledzenia orbitalnego w celu śledzenia ruchu lizosomów z dużą prędkością, rozmiar orbity i inne parametry, takie jak odpowiedź częstotliwościowa systemu, są następnie wybierane do wykonywania eksperymentów śledzących.

Ostatecznie wyniki pokazują, że możliwe jest śledzenie szybko poruszających się lizosomów w trzech wymiarach i wykrywanie interakcji z innymi fluorescencyjnie barwionymi organellami napotkanymi wzdłuż orbity lasera podczas śledzenia. Główną przewagą metody śledzenia 3D nad innymi istniejącymi metodami, które opierają się na przykład na Astigmatach, jest to, że metoda śledzenia 3D w asfalcie pozwala nam śledzić bardzo duży zakres demencji. Ta metoda może pomóc w zadaniu kluczowego pytania w dziedzinie transportu pęcherzykowego, takiego jak sposób pęcherzyki poruszają się wzdłuż mikrorurek.

Chociaż ta metoda może być stosowana do badania dynamiki endosomalnej. Może być również stosowany w innych systemach, w których możliwe jest fluorescencyjne znakowanie izolowanych cząstek, takich jak nanocząstki go, receptory błonowe, zagregowane kompleksy portów jądrowych lub loci genetyczne Utrzymywane komórki jajnika chomika chińskiego lub komórki CH K one, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zebraniu komórek umieść je na średnicy 14 milimetrów.

Mikro studzienka o grubości powierzchni 0,16 milimetra Komórki nasienne dla optymalnej gęstości do obrazowania około 60 do 70% płynności Co inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 następnego dnia, umyć komórki trzykrotnie w buforowanym roztworze soli Hanka lub H-B-S-S-H-B-SS służy do usunięcia martwych komórek lub zanieczyszczeń z płytki hodowlanej i przygotowania komórek do etapu barwienia. Następnie inkubować komórki w roztworze HBSS zawierającym końcowe stężenie 50 anomolowców lyo tracker i 150 anomolowców tubuliny green przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji. Umyj komórki trzy razy w HBSS, aby usunąć niezwiązany barwnik.

Dodaj świeżą pożywkę wzrostową DMEM przed obrazowaniem komórek. Mikroskop do śledzenia cząstek opisany w protokole wideo jest zamontowany na ramie dostępnego na rynku mikroskopu odwróconego. Zastosowano koherentne źródło światła wzbudzenia laserem femtosekundowym kameleon ultra dwa tytanowo-szafirowe z dostrajanym wyjściem Zakres długości fali od 690 nanometrów do 1040 nanometrów.

Upewnij się, że wiązka laserowa jest wyrównana w tylnym porcie mikroskopu. Za pomocą luster pokrytych podczerwienią wiązka laserowa jest tłumiona za pomocą obracającej się płytki półfalowej umieszczonej przed polaryzatorem kalcytowym, tłumi wiązkę tak, aby średnia moc na próbce wynosiła od 0,5 do dwóch miliwatów. Zebrać światło fluorescencyjne z próbki, umieszczając obiektyw wodny o dużej aperturze numerycznej na ścieżce światła.

Następnie umieść próbkę na zmotoryzowanym stoliku i wyreguluj precyzyjny ruch obiektywu mikroskopu. Korzystanie z obiektywnego kontrolera pizo. Wybierz kostkę filtra fluorescencyjnego zgodnie z żądanymi długościami fal emisji w konfiguracji jedno- lub dwukanałowej.

Zastosuj filtry pasma emisji. Aby dodatkowo wybrać zakres spektralny emitowanej fluorescencji, skieruj światło z kostki filtrującej do lamp powielacza zdjęć, w których sygnał jest wzmacniany i dyskryminowany, a następnie wysyłany do cyfrowej karty akwizycji danych wejściowych w celu zobrazowania komórek, umieszczenia ich na stoliku i ustawienia ostrości za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym. Przełącz się na obrazowanie rastrowe, aby zidentyfikować komórki, które włączyły barwnik, a aby uwidocznić leżące pod spodem mikrotubule, zidentyfikuj początkowy obszar, w którym występuje ruch pęcherzyków.

Po zidentyfikowaniu izolowanego pęcherzyka ustaw parametry śledzenia orbitalnego. Najpierw wybierz promień orbity, aby zdefiniować rozmiar okrągłego skanu w zależności od wielkości śledzonej cząstki. W przypadku emitera punktowego należy ustawić promień orbity równy pasowi funkcji rozproszenia punktów lub PSF wiązki wzbudzenia.

Aby zmaksymalizować czułość i reakcję. Ustaw odległość osiową, aby zdefiniować odległość między dwiema orbitami, które są wykonywane w celu zlokalizowania położenia cząstek wzdłuż kierunku osiowego. Ustaw odległość osiową na 1,5 do trzech razy większą niż ilość odpadów PSF.

Zdefiniuj czas przebywania zgodnie z jasnością cząstki, aby ustawić czas spędzony w każdym punkcie orbity, który określi również szybkość wybielania zdjęć. Użyj czasu zatrzymania od 10 do 100 mikrosekund. Ustaw liczbę punktów na każdej orbicie na 64 lub 128, aby uzyskać okresy orbity rzędu od czterech do 32 milisekund i zapewnić wysoką rozdzielczość czasową do określania położenia cząstek.

Zmień sygnał przesunięcia DC wysyłany do luster w celu wyśrodkowania wiązki na cząstce za pomocą graficznego interfejsu użytkownika poprzez wybór kursora na zeskanowanym obrazie rastrowym. Rozpocznij śledzenie, przełączając tryb mikroskopu z obrazowania rastrowego na skanowanie orbitalne. Aktywuj informacje zwrotne i zbieranie danych w celu analizy trajektorii.

Użyj oprogramowania, aby wyświetlić fluorescencję zebraną w każdym punkcie na orbicie i w każdym punkcie czasowym w postaci dywanu o intensywności. Intensywność zebrana wzdłuż dywanu dostarcza informacji na temat interakcji cząstki z innymi jasnymi obiektami. Wyświetlaj zarówno informacje o trajektorii, jak i intensywność fluorescencji zebrane z rurki powielacza zdjęć w czasie w postaci szeregów czasowych.

Użyj reprezentacji szeregów czasowych i informacji o intensywności dywanu, aby wybrać tylko obszar zainteresowania na trajektorii. Następnie wyświetl rzut 2D wybranej części trajektorii cząstki. Wybierz odpowiednie elementy sterujące, aby oznaczyć kolorami trajektorię zgodnie z intensywnością fluorescencji cząstek.

Wybierz opcję, aby wyświetlić trajektorię cząstek w 3D i oznaczyć ją kolorami zgodnie z intensywnością fluorescencji. Obróć trajektorię w 3D za pomocą elementów sterujących, aby zobrazować cechy ruchu lizosomu wzdłuż mikrotubul. Za pomocą barwienia lizosomów i mikrotubul fluorescencyjnym zielonym barwnikiem możliwe jest zobrazowanie ruchu pęcherzyków z dużą prędkością wzdłuż mikrotubuli za pomocą dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego.

Jednak obrazowanie rastrowe nie ma rozdzielczości czasowej niezbędnej do dokładnego śledzenia ruchu szybszych endosomów, jeśli stosuje się śledzenie orbitalne. Zamiast tego dane pokazują, że możliwe jest uzyskanie trajektorii przemieszczeń x, y, Z z rozdzielczością czasową 32 milisekund. W tych trajektoriach przemieszczenia w funkcji czasu analiza dywanu wyświetla intensywność zarejestrowaną wzdłuż każdej orbity.

Z biegiem czasu trajektoria intensywności dostarcza informacji o fluorescencyjnym otoczeniu cząstki. Obszar pudełkowy odpowiada części trajektorii pomiędzy dwoma skokami. Jasne plamy poza obszarem pudełkowym odpowiadają oddziaływaniom cząstki z innymi jasnymi obiektami i są związane ze skokami trajektorii, gdy orbity ponownie centrują się na najjaśniejszym źródle fluorescencyjnym.

Podczas śledzenia można zarejestrować zintegrowaną intensywność emitowanej fluorescencji. Zrekonstruowana trajektoria 3D wykazuje ukierunkowany ruch, jakiego można oczekiwać od pęcherzyka poruszającego się w sieci mikrotubul. Dodatkowo możliwe jest skorelowanie trajektorii 3D z RA lub skanowaniem obrazu otaczającego obszaru.

Potwierdza to ruch cząstki w kierunku wiązki mikrokanalików. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo podczas próby. W tej procedurze należy pamiętać, aby używać poziomu mocy lasera, który nie jest szkodliwy dla próbki, podczas korzystania z cytowania fotonicznego, jak pokazano w tym protokole, należy utrzymać poziomy mocy około dwóch miliwoltów po obiektywach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak skonfigurować eksperyment przy użyciu metody śledzenia orbitalnego 3D, która pozwala na śledzenie obiektów o bardzo dużym zasięgu Z.