Name: Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metodę orbitalnego śledzenia 3D pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego. Technika ta umożliwia obserwację szybkich ruchów lizosomów i ich interakcji z innymi organellami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez granty NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 i P50-GM076516

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki CHOK1 w kolbach do hodowli tkankowych za pomocą DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 I.U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny. Inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz, a następnie umieść komórki CHOK1 w mikrodołku o średnicy 14 mm i grubości powierzchni 0,16 mm. Komórki nasienne dla optymalnej gęstości do obrazowania, około 60-70% konfluencji.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie w HBSS (Hank Buffered Saline Solution) i inkubuj komórki w roztworze zawierającym 50 nM Lysotracker DND26 green i 150 nM tubuliny tracker green. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Etap opcjonalny: Przed inkubacją należy wykonać dodatkowe barwienie barwnikiem barwiącym macierz mitochondrialną (25 nM).</li>
	<li>Umyj komórki trzy razy w HBSS, aby usunąć niezwiązany barwnik. Dodaj świeżą pożywkę wzrostową DMEM przed obrazowaniem komórek.</li>
</ol>
2. Konfiguracje mikroskopów
Mikroskop do śledzenia cząstek opisany w protokole wideo jest zamontowany na ramie dostępnego na rynku mikroskopu odwróconego (Rysunek 4). Jednak komercyjne moduły do śledzenia cząstek orbitalnych 3D są już dostępne.
<ol>
	<li>Użyj źródła światła wzbudzenia laserem femtosekundowym Coherent Chameleon-Ultra II Ti:Sa o regulowanej długości fali wyjściowej w zakresie od 690 nm do 1,040 nm.</li>
	<li>Upewnij się, że wiązka laserowa jest wyrównana w tylnym porcie mikroskopu za pomocą luster pokrytych podczerwienią. Wiązka laserowa jest tłumiona za pomocą obracającej się płytki półfalowej, po której następuje kalcytowy polaryzator liniowy. Osłabij wiązkę tak, aby średnia moc na próbce wynosiła od 0,5 do 2 mW. 
	UWAGA: Wiązka laserowa jest odbijana przez parę luster uruchamianych silnikiem galwanometrycznym, które umożliwiają kontrolę położenia i trajektorii skupionej wiązki w płaszczyźnie próbki. W typowej konfiguracji skolimowana wiązka laserowa wychodząca ze zwierciadeł galwanometru jest rozszerzana (10X) przechodząc przez ekspander wiązki, zanim wejdzie do tylnej części obiektywu mikroskopu po odbiciu od krótkoprzepustowego zwierciadła dichroicznego.</li>
	<li>Zbierz światło fluorescencyjne z próbki, umieszczając obiektyw wodny o dużej aperturze numerycznej (60X, NA 1,2) na ścieżce światła. Wybierz kostkę filtra fluorescencyjnego zgodnie z żądanymi długościami fal emisji w konfiguracji jedno- lub dwukanałowej. Zastosuj filtry pasmowoprzepustowe emisji, aby dodatkowo wybrać zakres widmowy emitowanej fluorescencji.</li>
	<li>Umieść próbkę na zmotoryzowanym stoliku i wyreguluj precyzyjny ruch obiektywu mikroskopu za pomocą piezokontrolera obiektywu.</li>
	<li>Skieruj światło z kostki filtrującej do fotopowielaczy, gdzie sygnał jest rozróżniany i wysyłany do cyfrowej karty akwizycji danych I/O. 
	UWAGA: Przebiegi generowane komputerowo są wyjściem analogowym karty I/O i są dostarczane do elektroniki sterującej skanera. Sygnał wejściowy zliczający fotony z fotopowielaczy oraz sygnał wyjściowy do skanerów są mierzone i kontrolowane za pomocą karty I/O przez oprogramowanie Laboratorium Dynamiki Fluorescencji SimFCS.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść komórki na stole montażowym i ustaw ostrość za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym.</li>
	<li>Przełącz się na obrazowanie rastrowe, aby zidentyfikować komórki, które włączyły barwnik, i uwidocznić leżące pod nimi mikrotubule. Zidentyfikuj początkowy obszar, w którym występuje ruch pęcherzyków.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu izolowanego pęcherzyka ustaw następujące parametry śledzenia orbitalnego:
	<ol>
		<li>Wybierz promień orbity, aby zdefiniować rozmiar okrągłego skanowania w zależności od rozmiaru śledzonej cząstki. W przypadku emitera punktowego ustaw promień orbity równy talii funkcji rozproszenia punktów (PSF) wiązki wzbudzenia, aby zmaksymalizować czułość i odpowiedź.</li>
		<li>Ustaw odległość osiową, aby zdefiniować odległość między dwiema orbitami, które są wykonywane w celu zlokalizowania położenia cząstek wzdłuż kierunku osiowego. Ustaw odległość osiową na 1,5-3 razy talię PSF.</li>
		<li>Zdefiniuj czas przebywania zgodnie z jasnością cząstki, aby ustawić czas spędzony w każdym punkcie orbity, który określi również szybkość fotowybielania. Czas przebywania wynosi od 10 do 100 μs.</li>
		<li>Ustaw liczbę punktów na każdej orbicie na 64 lub 128, aby uzyskać okresy orbity rzędu 4-32 ms i zapewnić wysoką rozdzielczość czasową do określania położenia cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień sygnał przesunięcia prądu stałego wysyłany do luster w celu wyśrodkowania wiązki na cząstce za pomocą graficznego interfejsu użytkownika za pomocą wyboru kursora na zeskanowanym obrazie rastrowym.</li>
	<li>Rozpocznij śledzenie, przełączając tryb mikroskopu z obrazowania rastrowego na skanowanie orbitalne.</li>
	<li>Aktywuj zbieranie informacji zwrotnych i danych.</li>
</ol>
4. Analiza trajektorii
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania, aby wyświetlić fluorescencję zebraną w każdym punkcie na orbicie i w każdym punkcie czasowym w postaci "dywanu intensywności". Intensywność zebrana wzdłuż dywanu dostarcza informacji na temat interakcji cząstki z innymi jasnymi obiektami. Użyj oprogramowania, aby wyświetlić zarówno informacje o trajektorii (tj. przemieszczenie prądu stałego w czasie skanerów x,y i z-piezo), jak i intensywność fluorescencji zebraną z lampy fotopowielacza w czasie w postaci szeregów czasowych.</li>
	<li>Użyj reprezentacji szeregów czasowych i informacji o "dywanie intensywności", aby wybrać tylko obszar zainteresowania na trajektorii.</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby wyświetlić projekcję 2D wybranej części trajektorii cząstek. Wybierz odpowiednie elementy sterujące, aby oznaczyć kolorami trajektorię zgodnie z intensywnością fluorescencji cząstek.</li>
	<li>Wybierz opcję, aby wyświetlić trajektorię cząstek w 3D i oznaczyć ją kolorami zgodnie z intensywnością fluorescencji. Obróć trajektorię w 3D za pomocą elementów sterujących, aby zobrazować cechy ruchu lizosomu wzdłuż mikrotubul</li>.
</ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo ogromnego postępu w technikach i oprzyrządowaniu mikroskopii fluorescencyjnej w ciągu ostatnich lat, osiągnięcie trajektorii cząstek fluorescencyjnych w trzech wymiarach z wysoką rozdzielczością czasową pozostało wyzwaniem w tej dziedzinie. Jeśli osiągnięto wysoką rozdzielczość czasową śledzącą cząstki w dwóch wymiarach, rozszerzenie do kierunku osiowego zwykle powoduje drastyczne zmniejszenie charakterystyki częstotliwościowej systemu10.
W tym protokole wideo skupiliśmy się ...

Do tej pory opracowano wiele podejść do śledzenia cząstek fluorescencyjnych w trzech wymiarach za pomocą mikroskopu. Większość podejść opiera się na użyciu szybkich kamer, idealnie nadających się do śledzenia w dwóch wymiarach, zwykle w połączeniu z niestandardowymi modyfikacjami optyki emisyjnej mikroskopu w celu uzyskania śledzenia w kierunku osiowym. Laserowe mikroskopy skaningowe (konfokalne lub dwufotonowe) mogą konwencjonalnie śledzić cząstkę fluorescencyjną, wykonując sekwencję czasową stosów z, chociaż proces ten jest zwykle czasochłonny i daje rozsądną rozdzielczość czasową (10 Hz) tylko wtedy, gdy śledzona cząstka jest utrzymywana w środku małego obszaru obrazowania rastrowego przez aktywny mechanizm sprzężenia zwrotnego2.
Idea unieruchomienia cząstki jest podstawą metody śledzenia orbitalnego. Zamiast skanowania rastrowego wykonywana jest kołowa orbita wokół cząstki fluorescencyjnej. Intensywność fluorescencji wzdłuż orbity precyzyjnie lokalizuje położenie cząstki4.
Zlokalizowana pozycja cząstki może być następnie wykorzystana do uruchomienia skanerów mikroskopowych i ponownego wyśrodkowania orbity na pozycji cząstki. Skanery galwanometryczne mikroskopu są napędzane napięciem analogowym. Składowa prądu przemiennego tego napięcia pozwala na wykonanie orbity za pomocą skupionej wiązki laserowej, tzn. fala sinusoidalna i cosinusoidalna przyłożone do zwierciadeł skanujących X i Y pozwoli na wykonanie orbity kołowej. Przesunięcie sygnału DC ułatwia zmianę położenia środka orbity. Po określeniu okresu orbitalnego i skonfigurowaniu kształtu fali dla sygnału AC, system sprzężenia zwrotnego musi zaktualizować tylko składową DC sygnału.
Oprogramowanie zdolne do odczytu sygnału fluorescencyjnego zebranego z detektorów jest wymagane do sterowania skanerami i detektorami, do obliczania pozycji cząstki i aktualizowania przesunięcia DC. Aby obrazowanie ze sprzężeniem zwrotnym zakończyło się sukcesem, wymagany jest staranny dobór parametrów orbity (rozmiar i czas), a parametry te muszą być dostosowane w oparciu o charakterystykę cząstek fluorescencyjnych, które należy śledzić.
Fizyczne i matematyczne podstawy tej techniki zostały opisane w ostatnich4,5 zarówno dla zastosowań 2D, jak i 3D. W tym protokole pokrótce opisujemy główne komponenty sprzętowe układu, a bardziej szczegółowo wybór parametrów i przygotowanie próbki wymagane do typowego eksperymentu, co pozwala nam śledzić przemieszczenie lizosomu w wysokiej rozdzielczości czasowej w żywej komórce.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Lokalizator rurowy Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Koherentny melon- ultra II TI</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Kalcytowy polaryzator</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Lustro z silnikiem galwanometrycznym</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Stopień zmotoryzowany</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Lampa fotopowielacza</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Karta akwizycji danych</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>LFD</td><td>Global dla obrazów-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie orbitalne 3d w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Celem tego protokołu wideo jest omówienie sposobu przeprowadzenia i analizy trójwymiarowego eksperymentu z fluorescencyjnym śledzeniem cząstek orbitalnych przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego1. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść (skanowanie rastrowe lub szerokie pole oparte na stosie klatek), śledzenie orbitalne 3D pozwala zlokalizować i śledzić z wysoką rozdzielczością przestrzenną (10 nm) i czasową (pasmo przenoszenia 50 Hz) przemieszczenie 3D poruszającej się cząstki fluorescencyjnej w skali długości setekmikronów2. Metoda opiera się na algorytmie sprzężenia zwrotnego, który steruje sprzętem dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego w celu wykonania kołowej orbity wokół śledzonego obiektu: mechanizm sprzężenia zwrotnego utrzyma obiekt fluorescencyjny w środku, kontrolując przemieszczenie wiązki skanującej3-5. Aby zademonstrować zalety tej techniki, obserwowaliśmy szybko poruszającą się organellę, lizosom, w żywej komórce6,7. Komórki posiano zgodnie ze standardowymi protokołami i barwiono przy użyciu dostępnego na rynku barwnika lizosomowego. Omówimy pokrótce konfigurację sprzętową i bardziej szczegółowo oprogramowanie sterujące, aby przeprowadzić eksperyment śledzenia orbitalnego 3D wewnątrz żywych komórek. Szczegółowo omawiamy parametry wymagane do sterowania mikroskopem skaningowym i umożliwienia ruchu wiązki w zamkniętej orbicie wokół cząstki. Kończymy, pokazując, w jaki sposób ta metoda może być skutecznie wykorzystana do śledzenia szybkiego ruchu znakowanego lizosomu wzdłuż mikrotubul w 3D w żywej komórce. Lizosomy mogą poruszać się z prędkościami w zakresie 0,4-0,5 μm/s, zwykle wykazując skierowany ruch wzdłuż sieci mikrotubul8.

Zgodnie z niniejszym protokołem, szybkie śledzenie pojedynczych cząstek w 3D można przeprowadzić wewnątrz żywych komórek przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego, aby śledzić przemieszczanie się znakowanych fluorescencyjnie lizosomów. Wykonany eksperyment polega na śledzeniu odizolowanego lizosomu poruszającego się wewnątrz komórki po procesie dojrzewania endosomów9. Lizosomy zabarwiono zielonym barwnikiem fluorescencyjnym i wzbudzono przy 930 nm, wykorzystując wzbudzenie dwufotonowe. Nasze dane wy...

W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ogólnym celem tej procedury jest zilustrowanie, w jaki sposób śledzić szybko poruszające się organelle, takie jak lizosomy, poruszające się w 3D w żywej komórce. Osiąga się to poprzez pierwsze barwienie lizosomów i mikrotubul przy użyciu określonych barwników komercyjnych wewnątrz hodowanych żywych komórek. Drugim krokiem jest użycie laserowego mikroskopu skaningowego i zastosowanie metody śledzenia orbitalnego w celu śledzenia ruchu lizosomów z dużą prędkością, rozmiar orbity i inne parametry, takie jak odpowiedź częstotliwościowa systemu, są następnie wybierane do wykonywania eksperymentów śledzących.Ostatecznie wyniki pokazują, że możliwe jest śledzenie szybko poruszających się lizosomów w trzech wymiarach i wykrywanie interakcji z innymi fluorescencyjnie barwionymi organellami napotkanymi wzdłuż orbity lasera podczas śledzenia. Główną przewagą metody śledzenia 3D nad innymi istniejącymi metodami, które opierają się na przykład na Astigmatach, jest to, że metoda śledzenia 3D w asfalcie pozwala nam śledzić bardzo duży zakres demencji. Ta metoda może pomóc w zadaniu kluczowego pytania w dziedzinie transportu pęcherzykowego, takiego jak sposób pęcherzyki poruszają się wzdłuż mikrorurek.Chociaż ta metoda może być stosowana do badania dynamiki endosomalnej. Może być również stosowany w innych systemach, w których możliwe jest fluorescencyjne znakowanie izolowanych cząstek, takich jak nanocząstki go, receptory błonowe, zagregowane kompleksy portów jądrowych lub loci genetyczne Utrzymywane komórki jajnika chomika chińskiego lub komórki CH K one, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zebraniu komórek umieść je na średnicy 14 milimetrów.Mikro studzienka o grubości powierzchni 0,16 milimetra Komórki nasienne dla optymalnej gęstości do obrazowania około 60 do 70% płynności Co inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 następnego dnia, umyć komórki trzykrotnie w buforowanym roztworze soli Hanka lub H-B-S-S-H-B-SS służy do usunięcia martwych komórek lub zanieczyszczeń z płytki hodowlanej i przygotowania komórek do etapu barwienia. Następnie inkubować komórki w roztworze HBSS zawierającym końcowe stężenie 50 anomolowców lyo tracker i 150 anomolowców tubuliny green przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji. Umyj komórki trzy razy w HBSS, aby usunąć niezwiązany barwnik.Dodaj świeżą pożywkę wzrostową DMEM przed obrazowaniem komórek. Mikroskop do śledzenia cząstek opisany w protokole wideo jest zamontowany na ramie dostępnego na rynku mikroskopu odwróconego. Zastosowano koherentne źródło światła wzbudzenia laserem femtosekundowym kameleon ultra dwa tytanowo-szafirowe z dostrajanym wyjściem Zakres długości fali od 690 nanometrów do 1040 nanometrów.Upewnij się, że wiązka laserowa jest wyrównana w tylnym porcie mikroskopu. Za pomocą luster pokrytych podczerwienią wiązka laserowa jest tłumiona za pomocą obracającej się płytki półfalowej umieszczonej przed polaryzatorem kalcytowym, tłumi wiązkę tak, aby średnia moc na próbce wynosiła od 0,5 do dwóch miliwatów. Zebrać światło fluorescencyjne z próbki, umieszczając obiektyw wodny o dużej aperturze numerycznej na ścieżce światła.Następnie umieść próbkę na zmotoryzowanym stoliku i wyreguluj precyzyjny ruch obiektywu mikroskopu. Korzystanie z obiektywnego kontrolera pizo. Wybierz kostkę filtra fluorescencyjnego zgodnie z żądanymi długościami fal emisji w konfiguracji jedno- lub dwukanałowej.Zastosuj filtry pasma emisji. Aby dodatkowo wybrać zakres spektralny emitowanej fluorescencji, skieruj światło z kostki filtrującej do lamp powielacza zdjęć, w których sygnał jest wzmacniany i dyskryminowany, a następnie wysyłany do cyfrowej karty akwizycji danych wejściowych w celu zobrazowania komórek, umieszczenia ich na stoliku i ustawienia ostrości za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym. Przełącz się na obrazowanie rastrowe, aby zidentyfikować komórki, które włączyły barwnik, a aby uwidocznić leżące pod spodem mikrotubule, zidentyfikuj początkowy obszar, w którym występuje ruch pęcherzyków.Po zidentyfikowaniu izolowanego pęcherzyka ustaw parametry śledzenia orbitalnego. Najpierw wybierz promień orbity, aby zdefiniować rozmiar okrągłego skanu w zależności od wielkości śledzonej cząstki. W przypadku emitera punktowego należy ustawić promień orbity równy pasowi funkcji rozproszenia punktów lub PSF wiązki wzbudzenia.Aby zmaksymalizować czułość i reakcję. Ustaw odległość osiową, aby zdefiniować odległość między dwiema orbitami, które są wykonywane w celu zlokalizowania położenia cząstek wzdłuż kierunku osiowego. Ustaw odległość osiową na 1,5 do trzech razy większą niż ilość odpadów PSF.Zdefiniuj czas przebywania zgodnie z jasnością cząstki, aby ustawić czas spędzony w każdym punkcie orbity, który określi również szybkość wybielania zdjęć. Użyj czasu zatrzymania od 10 do 100 mikrosekund. Ustaw liczbę punktów na każdej orbicie na 64 lub 128, aby uzyskać okresy orbity rzędu od czterech do 32 milisekund i zapewnić wysoką rozdzielczość czasową do określania położenia cząstek.Zmień sygnał przesunięcia DC wysyłany do luster w celu wyśrodkowania wiązki na cząstce za pomocą graficznego interfejsu użytkownika poprzez wybór kursora na zeskanowanym obrazie rastrowym. Rozpocznij śledzenie, przełączając tryb mikroskopu z obrazowania rastrowego na skanowanie orbitalne. Aktywuj informacje zwrotne i zbieranie danych w celu analizy trajektorii.Użyj oprogramowania, aby wyświetlić fluorescencję zebraną w każdym punkcie na orbicie i w każdym punkcie czasowym w postaci dywanu o intensywności. Intensywność zebrana wzdłuż dywanu dostarcza informacji na temat interakcji cząstki z innymi jasnymi obiektami. Wyświetlaj zarówno informacje o trajektorii, jak i intensywność fluorescencji zebrane z rurki powielacza zdjęć w czasie w postaci szeregów czasowych.Użyj reprezentacji szeregów czasowych i informacji o intensywności dywanu, aby wybrać tylko obszar zainteresowania na trajektorii. Następnie wyświetl rzut 2D wybranej części trajektorii cząstki. Wybierz odpowiednie elementy sterujące, aby oznaczyć kolorami trajektorię zgodnie z intensywnością fluorescencji cząstek.Wybierz opcję, aby wyświetlić trajektorię cząstek w 3D i oznaczyć ją kolorami zgodnie z intensywnością fluorescencji. Obróć trajektorię w 3D za pomocą elementów sterujących, aby zobrazować cechy ruchu lizosomu wzdłuż mikrotubul. Za pomocą barwienia lizosomów i mikrotubul fluorescencyjnym zielonym barwnikiem możliwe jest zobrazowanie ruchu pęcherzyków z dużą prędkością wzdłuż mikrotubuli za pomocą dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego.Jednak obrazowanie rastrowe nie ma rozdzielczości czasowej niezbędnej do dokładnego śledzenia ruchu szybszych endosomów, jeśli stosuje się śledzenie orbitalne. Zamiast tego dane pokazują, że możliwe jest uzyskanie trajektorii przemieszczeń x, y, Z z rozdzielczością czasową 32 milisekund. W tych trajektoriach przemieszczenia w funkcji czasu analiza dywanu wyświetla intensywność zarejestrowaną wzdłuż każdej orbity.Z biegiem czasu trajektoria intensywności dostarcza informacji o fluorescencyjnym otoczeniu cząstki. Obszar pudełkowy odpowiada części trajektorii pomiędzy dwoma skokami. Jasne plamy poza obszarem pudełkowym odpowiadają oddziaływaniom cząstki z innymi jasnymi obiektami i są związane ze skokami trajektorii, gdy orbity ponownie centrują się na najjaśniejszym źródle fluorescencyjnym.Podczas śledzenia można zarejestrować zintegrowaną intensywność emitowanej fluorescencji. Zrekonstruowana trajektoria 3D wykazuje ukierunkowany ruch, jakiego można oczekiwać od pęcherzyka poruszającego się w sieci mikrotubul. Dodatkowo możliwe jest skorelowanie trajektorii 3D z RA lub skanowaniem obrazu otaczającego obszaru.Potwierdza to ruch cząstki w kierunku wiązki mikrokanalików. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin, jeśli działa prawidłowo podczas próby. W tej procedurze należy pamiętać, aby używać poziomu mocy lasera, który nie jest szkodliwy dla próbki, podczas korzystania z cytowania fotonicznego, jak pokazano w tym protokole, należy utrzymać poziomy mocy około dwóch miliwoltów po obiektywach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak skonfigurować eksperyment przy użyciu metody śledzenia orbitalnego 3D, która pozwala na śledzenie obiektów o bardzo dużym zasięgu Z.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Ten protokół szczegółowo opisuje budowę i działanie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, zdolnego do śledzenia nanoskalowych sond fluorescencyjnych przy wysokich prędkościach dyfuzyjnych i niskich szybkościach zliczania fotonów.

Protokół do śledzenia pojedynczych cząstek 3D w czasie rzeczywistym

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę orbitalnego śledzenia 3D pęcherzyków wewnątrzkomórkowych w żywych komórkach przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego. Technika ta umożliwia obserwację szybkich ruchów lizosomów i ich interakcji z innymi organellami.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów