Name: Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj hodowlę Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych CeHR bez bakterii E. coli. Ta metoda umożliwia synchronizację populacji robaków i precyzyjne badanie potrzeb odżywczych bez zakłócających produktów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of HealthGrants DK85035 i DK074797 (I.H).

1. Szczepy robaków
<ol>
	<li>Otrzymaj szczepy C. elegans Bristol N2 typu dzikiego z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) i utrzymuj je na płytkach NGM wysianych szczepem E. coli OP507. Uwaga: Wykorzystano transgeniczne szczepy robaków IQ6011 (Phrg-1::GFP) w sposób opisany wcześniej11. IQ6011 można zamówić u autora korespondencyjnego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zmodyfikowanego podłoża do siedliska i rozmnażania C. elegans (mCeHR)
Przygotuj płynne media mCeHR zgodnie z opisem poniżej12. To akseniczne płynne podłoże pozwala robakom rosnąć bez żadnych dodatkowych źródeł pożywienia. Wszystkie manipulacje płynnymi mediami aksenicznymi i robakami aksenicznymi należy wykonywać w ściśle sterylnych warunkach, takich jak okap z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Zdobądź ultra pasteryzowane mleko beztłuszczowe ze sklepu spożywczego. Używaj produktu schłodzonego, a nie produktu o temperaturze pokojowej. Przed użyciem w pożywce mCeHR rozpylić mleko na płytkach agarowych Brain Heart Infusion (BHI) i inkubować przez 3 dni w temperaturze 30 °C i 37 °C, aby sprawdzić sterylność. Przenieść mleko do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C</li>
	<li>Przygotować każdy z następujących składników i połączyć w podanej kolejności i ilościach w celu przygotowania 1 l mCeHR (tabela 1A): 10 ml 2 mM cytrynianu dwukwasowego choliny, 10 ml mieszanki witamin i czynników wzrostu (patrz przepis w tabeli 1B), 10 ml 2,4 mM mio-inozytolu, 10 ml 2 mM chlorku heminy, 250 ml wody dejonizowanej. Zastosuj odsysanie i przefiltruj przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.</li>
	<li>Dodać 20 ml mieszaniny kwasów nukleinowych (przepis w tabeli 1C), 100 ml mieszanki mineralnej (przepis w tabeli 1D), 20 ml 170 mg/ml hydrolizatu laktoalbuminy, 20 ml aminokwasów egzogennych, 10 ml aminokwasów endogennych, 20 ml 450 mM KH2PO4, 50 ml 1,45 M D-glukozy, 10 ml 1 M HEPES, sól sodowa, 250 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Zastosuj ssanie do filtra, wysterylizuj elementy. Wyjmij filtr i dodaj 1 ml 5 mg/ml cholesterolu. Upewnij się, że pH podłoża wynosi około 6-6,5. Uwaga: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.</li>
	<li>Przed użyciem dodać 20% (v/v) ultra pasteryzowanego ekologicznego mleka odtłuszczonego do podłoża mCeHR. Stosuj skrupulatnie sterylną technikę (na przykład w okapie z przepływem laminarnym) podczas otwierania i porcjowania mleka. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie C. elegans do hodowli w płynnym podłożu Axenic mCeHR
<ol>
	<li>Hoduj robaki na dziesięciu 60-milimetrowych płytkach NGM, aż na płytkach pojawi się wiele grawitacyjnych robaków i minimalna ilość OP50 E. coli.</li>
	<li>Usunąć robaki z każdej płytki, przepłukując ją 5 ml buforu M9 (przepis w tabeli 1F) i połączyć w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Pozwól robakom się uspokoić, pozostawiając probówkę na 5 do 10 minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant zawierający E. coli.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2 i 3.3 2x, aby usunąć jak najwięcej resztek bakterii przed kontynuowaniem procedury.</li>
	<li>Zawiesić robaki w 0,1 N NaCl w objętości będącej wielokrotnością trzech, na przykład 1,5 ml, 3 ml lub 6 ml, w której w probówce można zobaczyć pojedyncze robaki.</li>
	<li>Wybielać robaki, dodając 5 N NaOH i 5% roztwór podchlorynu sodu (wybielacza) w stosunku 1:2:6 do zawiesiny robaków. Na przykład 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% podchlorynu sodu: 6 ml zawiesiny robaków. Wymieszaj NaOH i wybielacz przed dodaniem do zawiesiny robaków.</li>
	<li>Energicznie mieszać roztwór, aż robaki ciężarne rozpuszczą się i w zawiesinie widoczne będą tylko jaja (około 5 do 10 minut). Monitoruj proces za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10X.</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu robaków, natychmiast zagnieździć jaja w granulkach o masie 800 x g przez 45 sekund w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dwukrotnie przepłukać osad 10 ml sterylnej wody, odwirowując osad o sile 800 x g przez 45 sekund w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po wybieleniu przenieść osad jajowy do kolby do hodowli tkankowych o średnicy 25cm2 zawierającej 10 ml pożywki mCeHR uzupełnionej 100 μg/ml tetracykliny. Przeprowadź tę procedurę przy użyciu sterylnych technik. W razie potrzeby dodać dodatkowe antybiotyki, w tym 250 μg/ml kwasu nalidyksowego, aby zapobiec rozwojowi bakterii w płynnych kulturach aksenu.</li>
	<li>Inkubować płynne kultury w temperaturze 20 °C w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością około 70 obr./min.</li>
	<li>Sprawdzaj robaki codziennie, aby zanotować etap rozwoju i tempo wzrostu. 
	Uwaga: Robaki początkowo rosną powoli i potrzebują od 7 do 10 dni, aby stać się ciężarne. Jednak w miarę jak robaki aklimatyzują się do płynnego podłoża, czas generacji skróci się do około 4 dni w przypadku robaków typu dzikiego (N2).</li>
	<li>Po tym, jak robaki osiągną stan ciężaru w płynnym podłożu, przenieść kulturę robaków do stożkowej rurki i granulować robaki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wahadłowego wirnika kubełkowego.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad robaka w równej objętości 0,1 M NaCl. Na przykład należy użyć 10 ml 0,1 M NaCl dla robaków hodowanych w 10 ml mCeHR. Pozwól robakom osiąść na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić procedurę bielenia opisaną powyżej w krokach 3.5-3.8 i pozwolić robakom rosnąć na drugie pokolenie w płynnym podłożu aksenicznym. W razie potrzeby ponownie dodaj antybiotyk, aby zahamować rozwój bakterii.</li>
	<li>Ponownie pozwól, aby robaki stały się ciężarne, a następnie osadź i ponownie zawieś robaki w 0,1 M NaCl, jak opisano w krokach 3.12 i 3.13, a następnie ponownie wybiel, jak opisano w krokach 3.5-3.8, aby uzyskać zsynchronizowaną populację. Od teraz hoduj larwy robaków L1 w płynnych pożywkach bez antybiotyków.</li>
</ol>
4. Synchronizacja robaków z płynnej kultury
<ol>
	<li>Osadzać i ponownie zawiesić robaki w 0,1 M NaCl, jak opisano powyżej w krokach 3.12 i 3.13. Wybielacz zgodnie z powyższym opisem w krokach 3.5-3.8.</li>
	<li>Zawiesić osad jaj w 10 ml bufora M9 i pozwolić larwom wykluć się O/N w temperaturze 20 °C na wytrząsarce na platformie obrotowej. Uwaga: Z jaj wykluwają się larwy L1, ale nie będą się dalej rozwijać, synchronizując robaki na etapie L1.</li>
	<li>Aby utrzymać i subkulturować robaki, larwy L1 należy otulić granulkami w ilości 800 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić larwy w 10 ml mCeHR i przenieść do kolby o średnicy25 cm2. Pozwól robakom rosnąć w temperaturze 20 °C na obrotowej platformie. Utrzymuj maksymalną gęstość 3,000 robaków/ml/cm2, aby zapewnić odpowiednie odżywianie robaków. 
	Uwaga: Na tym etapie antybiotyki nie są wymagane do utrzymania warunków aksenicznych, gdy zabiegi są przeprowadzane przy użyciu technik sterylnych w okapie z przepływem laminarnym. Robaki należy sprawdzać codziennie, aby monitorować wzrost.</li>
</ol>
5. Zamrażanie i rozmrażanie robaków w średnich kulturach aksenicznych
<ol>
	<li>Zamrozić akseniczne asynchroniczne kultury robaków lub zsynchronizowane larwy L1 w ciekłym azocie. Robaki w granulkach w ilości 800 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zamieszać w buforze S (6,45 mM KHPO4, 43,55 mM KHPO4, 146,25 mM NaCl), używając 0,5 ml na każdą fiolkę. Dodać równą objętość buforu S z 30% v/v glicerolem do każdej fiolki i przenieść robaki do temperatury -80 °C przed długotrwałym przechowywaniem w płynieN2. Zamrozić około 1 x 106 robaków na ml w każdej fiolce.</li>
	<li>Rozmrażać robaki, inkubując fiolki w temperaturze 37 °C przez około 2 minuty, aż prawie cały lód się rozpuści. W okapie z przepływem laminarnym przenieść robaki do sterylnej kolby zawierającej mCeHR i umieścić je w temperaturze 20 °C.</li>
</ol>
6. Określ wpływ stężenia heminy na wzrost i reprodukcję w mCeHR
<ol>
	<li>Użyj pożywki axenic mCeHR do oznaczenia wzrostu C. elegans zależnego od składników odżywczych. Aby określić wpływ stężenia heminy na wzrost i rozwój robaków, użyj zsynchronizowanych aksenowych robaków N2 lub innych interesujących szczepów. Zsynchronizować larwy L1 zgodnie z powyższym opisem w sekcji 4.</li>
	<li>Następnego dnia osadzać i liczyć zsynchronizowane larwy L1 i rozcieńczać do 1 robaka na μl pożywki aksenowej. Zrobić 10 mM chlorku heminy w 0,3 M NH4OH i dostosować do pH 8 za pomocą skoncentrowanego HCl.</li>
	<li>Dodać 800 μl pożywki mCeHR do płytki 24-dołkowej. Dodać 100 robaków do każdej studzienki w 100 μl pożywki. Do każdej studzienki dodać chlorek heminy w stężeniach od 0 μM, 1,5 μM do 1 000 μM w trzech powtórzeniach. Upewnij się, że wszystkie studzienki zawierają takie samo stężenie 0,3 M NH4OH. Delikatnie zawiesić robaki przed pipetowaniem, aby upewnić się, że do każdej studzienki dodano 100 larw L1.</li>
	<li>Codziennie badaj robaki i zwracaj uwagę na wzrost każdego stężenia w każdej studzience. Policz liczbę robaków po 9 dniach inkubacji i wykreśl liczbę robaków/ml odpowiadającą każdemu stężeniu hemu (rysunek 1).</li>
</ol>
7. Wpływ stężenia heminy na robaki z czujnikiem hemu
<ol>
	<li>Inkubuj zsynchronizowane robaki czujnika hemu L1 (Phrg-1::gfp) w mCeHR zawierające 4 μM, 8 μM, 10 μM i 20 μM hemin.</li>
	<li>Zobrazuj robaki za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej, 48 godzin po inkubacji (ryc. 2).</li>
</ol>
8. Wykorzystanie mCeHR do generowania transgenicznych C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami
Uwaga: Procedura generowania i przeprowadzania bombardowania mikrocząsteczkami za pomocą robaków unc-119(ed3) hodowanych w mCeHR jest opisana na rysunku 313.
<ol>
	<li>Przygotowanie robaka
	<ol>
		<li>Przenieść około 1 x 106 asynchronicznych robaków unc-119(ed3) w 90 ml pożywki mCeHR w kolbie o średnicy 175cm2 na tydzień przed bombardowaniem. Pozwól robakom rosnąć w temperaturze 20 °C na platformie wytrząsającej z prędkością ~70 obr./min (Rysunek 3-1). 
		Uwaga: Tydzień później zagęszczenie robaków powinno być znacznie większe u wielu dorosłych robaków grawitacyjnych. Do bombardowania mikrocząsteczkami potrzebne będą około 3 x 107 robaków.</li>
		<li>Chill JM109 E. coli wysiał 10 cm płytki NGM na lodzie.</li>
		<li>Przenieść robaki akseniczne do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować robaki przy 800 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić robaki w każdej probówce w 50 ml buforu M9 (ryc. 3-2).</li>
		<li>Pozwól dorosłym robakom osadzać się grawitacyjnie na lodzie przez 10 do 15 minut. 
		Uwaga: Granulka o pojemności 2 ml powinna teraz zawierać >90% dorosłych robaków. Ten 2 ml granulek powinien zawierać około 5 x 106 robaków i jest wystarczający do jednego bombardowania mikrocząsteczkami.</li>
		<li>Pokryj całą powierzchnię schłodzonej płytki NGM z nasionami JM109 2 ml granulki robaków. Poczekaj, aż płyn całkowicie się wchłonie, a następnie pozostaw płytkę na 30 minut na lodzie przed kontynuowaniem (Rysunek 3-3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie cząsteczek złota
	<ol>
		<li>Odważyć 30 mg cząsteczek złota w silikonowanej probówce do mikrowirówki. Dodać 1 ml 70% etanolu i wirować w probówce przez 5 minut.</li>
		<li>Pozostaw probówkę na 15 minut, a następnie odwiruj przy 6 000 x g przez 10 sekund, aby osadzać cząsteczki złota. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety, ostrożnie dotykając końcówki po stronie probówki przeciwnej do cząstek złota.</li>
		<li>Umyj cząsteczki złota 1 ml sterylnej wody, wiruj przez 1 minutę i krótko odwiruj probówkę o sile 6 000 x g przez 10 sekund. Powtórz etap płukania dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś cząsteczki złota w 0,5 ml sterylnego 50% glicerolu. 
		Uwaga: Końcowe stężenie cząsteczek złota wynosi 60 mg/ml i można je przechowywać przez 1 do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę cząsteczek DNA i złota
	<ol>
		<li>Połącz 10 μg pożądanego plazmidowego DNA z 10 μg plazmidu ratunkowego unc-119 w silikonowanej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl wody demineralizowanej i 100 μl dobrze zawieszonego roztworu cząstek złota, a następnie wirować przez 1 minutę.</li>
		<li>Dodać 150 μl 2,5 M CaCl2 i ponownie wirować roztwór przez 1 minutę. Do tego roztworu dodać 60 μl 0,1 M spermidyny i wirować przez 3 do 5 minut.</li>
		<li>Pulsacyjnie odwirować roztwór o stężeniu 6 000 x g przez 10 sekund, usunąć supernatant i dodać 300 μl 70% etanolu. Wirować przez 1 minutę, wirować pulsacyjnie przy 6 000 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 170 μl 100% etanolu. Energicznie wirować roztwór przez 5 do 10 minut, a następnie odwirować pulsacyjnie i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bombardowanie (Rysunek 3-3) 
	Uwaga: Protokół ten jest przeprowadzany przy użyciu systemu dostarczania cząstek określonych w Tabeli materiałów/wyposażenia. Postępuj zgodnie z instrukcjami dostępnymi przyrządów do dostarczania cząstek.
	<ol>
		<li>Umieść arkusz bibuły na talerzu o średnicy 15 cm. Za pomocą pęsety zanurz siedem makronośników pojedynczo w 100% etanolu i połóż je na tkance do wyschnięcia.</li>
		<li>Dokładnie wyczyść komorę biolistyczną, uchwyt makronośnika i płytkę celowniczą 70% etanolem. Oczyść i autoklawuj sita zatrzymujące przed każdym zabiegiem bombardowania.</li>
		<li>Załaduj makrocarrriers do uchwytu za pomocą pęsety i wciśnij w uchwyt za pomocą narzędzia do osadzania.</li>
		<li>Równomiernie rozprowadź 20 μl cząstek złota pokrytych DNA w środku każdego makronośnika, a następnie pozwól roztworowi całkowicie wyschnąć.</li>
		<li>Oczyść dwie części rozdzielacza ciśnienia etanolem i zmontuj z oczyszczonymi z etanolu płytkami bezpieczeństwa. Przykręcić zmontowany dzielnik ciśnienia i płytki bezpieczeństwa do komory bombardowania.</li>
		<li>Zamontuj autoklawowany ekran zatrzymujący z uchwytem makronośnika i umieść urządzenie na wymaganej metalowej półce i zablokuj na miejscu.</li>
		<li>Włóż zmontowaną aparaturę makronośnika do komory biolistycznej w przeznaczonej do tego szczelinie poniżej dzielnika ciśnienia i wyrównaj z dzielnikiem ciśnienia.</li>
		<li>Przyklej otwartą płytkę NGM ze ślimakami do półki na płytę celowniczą i zamknij drzwiczki komory.</li>
		<li>Aby bombardować robaki, dostosuj ciśnienie do ciśnienia potrzebnego do złamania krążków bezpieczeństwa. Włącz podciśnienie do 28 cali ciśnienia Hg, a następnie naciśnij przycisk ognia, aż dyski pękną.</li>
		<li>Zwolnij podciśnienie i wyjmij płytkę NGM z aparatu. Umyj robaki z płytki i rozprowadź ponownie na dwudziestu 10-centymetrowych płytkach NGM wysianych JM109 E. coli (ryc. 3-4).</li>
		<li>Pozwól robakom rosnąć przez 10 do 14 dni w temperaturze 25 °C i zagłodzić płytki. Robaki uratowane z defektu unc-119 będą miały normalny ruch i można je zidentyfikować w tym czasie. Wybierz co najmniej 10 robaków "dzikiego" z oddzielnych płytek do dalszej analizy, ponieważ reprezentują one niezależne linie transgeniczne (ryc. 3-5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system%3A+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pharmacology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li>
<li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism+TEM%22%5BJournal%5D)">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li>
<li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li>
<li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+disease%22%5BJournal%5D)">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li>
<li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).</li>
<li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044(2010).</li>
<li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li>
<li>Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNass%2C+R+%22The+nematode+C.+elegans+as+an+animal+model+to+explore+toxicology+in+vivo%3A+solid+and+axenic+growth+culture+conditions+and+compound+exposure+parameters.+Current+protocols+in+toxicology+editorial+board%2C+Mahin+D.+Maines%22">The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines</a>. , (2007).</li>
<li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li>
<li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li>
<li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19(2003).</li>
<li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li>
<li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li>
<li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40(2004).</li>
<li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów finansowych ani konfliktu interesów.

W niniejszym protokole przedstawiamy zmodyfikowane akseniczne podłoże ciekłe mCeHR, które pozwala na szybkie wytwarzanie C. elegans przy produkcji dużej liczby robaków. Pożywka ta ma kilka zalet, ponieważ robaki są hodowane bez zanieczyszczania E. coli lub bakteryjnych produktów ubocznych i mogą być wykorzystywane w badaniach żywieniowych i toksykologicznych. Stosowanie E. coli lub innych bakterii w takich badaniach ma kilka wad. Na przykład wzrost bakterii może się zmieniać w różnych warunkach...

Nicień glebowy, Caenorhabditis elegans, jest potężnym organizmem modelowym, wykorzystywanym w licznych badaniach, od genetyki po toksykologię. Ze względu na rozmiar 1 mm, szybki czas generacji wynoszący cztery dni, łatwość uprawy i dużą liczbę potomstwa, nicienie te zostały wykorzystane w wielu genetycznych i farmakologicznych badaniach przesiewowych 1,2. Naukowcy wykorzystują tego robaka do identyfikacji cząsteczek i szlaków zachowanych w systemach kręgowców. Szlaki te obejmują sygnały śmierci komórki, szlaki starzenia się i metabolizmu oraz układ nerwowy3-6. Dodatkowo, przezroczystość C. elegans pozwala na generowanie linii transgenicznych za pomocą fluorescencyjnych reporterów białkowych, które mogą być bezpośrednio wizualizowane w celu analizy wzorców ekspresji genów i lokalizacji białek.
W wielu badaniach ten nicień jest hodowany na powierzchni na bazie agaru przy użyciu płytek z pożywką dla nicieni (NGM) lub w płynnych kulturach wysiewanych z Escherichia coli jako źródłem pożywienia7,8. Te bakteryjne źródła pożywienia mogą mylić badania biochemiczne i toksykologiczne z zakłóceniami powodowanymi przez bakteryjne produkty uboczne wpływające na interpretację wyników. Aby uniknąć tych narastających efektów, C. elegans można hodować w płynnym pożywce aksenowej, która jest pozbawiona bakterii jako źródła pożywienia. Korzystając z tej pożywki, z powodzeniem wyhodowaliśmy miliony wysoce zsynchronizowanych robaków dla wielu standardowych protokołów C. elegans, w tym analizy mikromacierzy różnie regulowanych genów u C. elegans wystawionych na różne stężenia hemu oraz produkcji transgenicznych robaków za pomocą bombardowania genów. Pożywka ta jest chemicznie zdefiniowana i zmodyfikowana na podstawie oryginalnej receptury opracowanej przez dr Erica Clegga9. Korzystając z tej pożywki mCeHR, udało nam się zidentyfikować geny zaangażowane w homeostazę hemu, określane jako geny reagujące na hem (hrgs)10, co nie byłoby możliwe w normalnych warunkach wzrostu, które wykorzystują płytki agarowe NGM wysiane E. coli.
W tym protokole opisujemy procedurę wprowadzania i utrzymywania C. elegans wyhodowanych na E. coli do aksonicznego mCeHR i wykorzystujemy tę metodę do uzyskania dużej liczby robaków do produkcji transgenicznych linii C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami. Przedstawiamy również badania, które pokazują przydatność stosowania pożywek aksenicznych do określania zapotrzebowania żywieniowego C. elegans na przykładzie hemu. Badania te pokazują, że stosowanie pożywek mCeHR pozwala na szybki wzrost dużej liczby C. elegans w wielu dalszych zastosowaniach wykorzystywanych przez badaczy robaków.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat cytrynianu potasu</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226; 4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>5-monofosforan adenozyny, sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>5-fosforan cytydyny</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr> 2'- <tr><td>i 3'-monofosforan guanozyny</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>5-fosforan urydyny, sól disodowa</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Tymina</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyloglukozamina</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanina</td><td>Fisher</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas p-aminobenzoesowy</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanokobalamina (B-12)</td> <td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinian (Ca)</td> <td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacyna</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacynamid</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Panteteina</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenian (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pteroiloglutaminowy (kwas foliowy)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>5'-fosforan pirydoksalu</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksamina 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Ryboflawina 5-PO4(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-kwas tioktowy</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian dwukwasowy choliny</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-inozytol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Hydrolizat enzymatyczny laktoalbuminy</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Napar z serca mózgu</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek heminy</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu nalidyksowego</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistyczny system dostarczania</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczki złota (Au Powder)&nbsp;</td><td>&nbsp; Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>lub</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cząstki złota 1.0 i mu; m</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

W tym protokole przedstawiamy wymagane materiały oraz procedurę tworzenia zmodyfikowanego C. elegans Pożywki habituacyjne i rozrodcze (mCeHR). Dodatkowo opisano etapy wystawiania i aklimatyzacji C. elegans hodowanych na E. coli do aksenicznego płynnego podłoża. Wreszcie, dalsze eksperymenty, które wykorzystują akseniczny C. elegans, ilustrują korzyści płynące z tej procedury. Zdolność do analizy i określenia zapotrzebowania C. elegans na składniki pokarmowe zilustrowano hodowlą robaków N2 typu dzikiego w płynnych pożywkach aksenowych o różnych stężeniach hemu. Procedurę tę można powtórzyć z innymi składnikami odżywczymi w celu określenia optymalnego stężenia dla wzrostu i rozwoju robaków lub w celu określenia skutków toksykologicznych leczenia farmakologicznego. Wpływ różnych stężeń hemu na wzrost robaków typu dzikiego określono za pomocą jakościowej obserwacji mikroskopowej i ilościowego określenia liczby robaków, które rosły w każdym stężeniu hemu. Ponadto wpływ różnych stężeń składników odżywczych można oznaczyć, wykorzystując robaki z ekspresją czujników fluorescencyjnych, które reagują na zmiany w interesującym składniku odżywczym. Co więcej, z łatwością wyprodukowano dużą liczbę robaków do wytworzenia transgenicznego C. elegans za pomocą bombardowania mikrocząsteczkami.

Hodowla C. elegans w aksenicznym medium płynnym ułatwia określenie składników odżywczych niezbędnych dla nicieni, bez zakłóceń wywołanych przez metabolity wtórne produkowane przez E. coli. Nicienie typu dzikiego N2 aklimatyzują się do pożywki mCeHR w ciągu trzech pokoleń i wykazują wzrost porównywalny z nicieniami hodowanymi na bakteriowych płytkach NGM. W rzeczywistości nicienie te stają się zapłodnione w ciągu 4 dni, w porównaniu do 3,5 dnia w przypadku nicieni hodowanych na bakteriach OP50.
<p cl...

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie i wyhodowanie morskiej elegancji w płynnych podłożach CENIC do wielu dalszych zastosowań. Osiąga się to poprzez pierwsze wybielanie robaków grobowych z wygłodzonych płytek agarowych. Drugim etapem procedury jest przeniesienie uwolnionych komórek jajowych do M-C-E-H-R z antybiotykami i umożliwienie im rozwoju do etapu grobowego, co może potrwać od siedmiu do 10 dni.Trzecim krokiem jest wybielenie grobów i umożliwienie im rozwoju po raz drugi do etapu grobu bez dodatkowych antybiotyków. Ostatnim krokiem jest zsynchronizowanie robaków Axe i wykorzystanie ich do badań żywieniowych badających wzrost i rozwój robaków. Ostatecznie wyniki pokazują, że dzika elegancja typu C dobrze rośnie w pożywkach Axe Liquid, a podłoża M-C-E-H-R można wykorzystać do zbadania potrzeb żywieniowych robaków bez bakteryjnych produktów ubocznych.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak hodowla robaków na płytkach agarowych lub w płynnych pożywkach z bakteriami, jest to, że można testować działanie składników odżywczych lub toksyn bez mylenia bakteryjnych produktów ubocznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Ten film opisuje zasady leczenia RNAi u C. elegans i demonstruje protokół do eliminacji lin-35 w transgenicznym szczepie robaków.

Posiewanie RNAi dla karmienia C. elegans: technika indukowania docelowej ekspresji dsRNA w E. coli

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.<br...

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Poznaj hodowlę Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych CeHR bez bakterii E. coli. Ta metoda umożliwia synchronizację populacji robaków i precyzyjne badanie potrzeb odżywczych bez zakłócających produktów bakteryjnych.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Przeglądaj więcej filmów