Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja wpływu zdarzeń hybrydyzacji DNA na widma impedancyjne za pomocą mikroprzepływowego urządzenia elektrochemicznego. W tym celu wytwarzany jest chip elektrochemiczny, który umożliwia zainstalowanie szeregu czujników elektrodowych, a także wytwarzany jest mikroprzepływowy układ PDMS. Aby ułatwić wprowadzanie próbek o mikroobjętości, oba chipy są ze sobą połączone i funkcjonalizowane za pomocą jednoniciowych sond DNA.

Docelowy jednoniciowy DNA jest następnie dodawany po hybrydyzacji DNA, silniejsza siła odpychania między ujemnie naładowanym dwuniciowym DNA a ujemnie naładowanymi cząsteczkami cyjanku cyjanku żelaza powoduje wyższą rezystancję przenoszenia ładunku. Ostatecznie zdarzenia hybrydyzacji DNA można wykryć, mierząc zmiany w widmach impedancji elektrochemicznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak użycie czytnika płytek lub testu z przesunięciem J, jest to, że urządzenia mogą wykonywać tę samą technikę przy małej objętości próbki i za ułamek kosztów, bez poświęcania czułości lub swoistości.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem, wykrywaniu grypy i inżynierii genetycznej, umożliwiając szybkie badanie przesiewowe specyficznych sekwencji DNA i badanie binarnej kinetyki jednoniciowych sekwencji DNA. Ponieważ ta szybka, wysokoprzepustowa metoda analizy hybrydyzacji DNA może być wykonywana przy małej objętości próbki i bez skomplikowanych etapów przygotowania próbki, implikacje tej techniki rozciągają się na naszą diagnostykę zaburzeń genetycznych, różnych form raka lub chorób ze specyficznymi markerami DNA, takich jak grypa. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ rozwój mikrourządzeń wymaga parametrów przetwarzania kontrolnego i iteracyjnego podejścia do rozwiązywania problemów, takich jak wyciek roztworu.

Po zmontowaniu urządzenia Aby ułożyć złote elektrody na chipie elektrochemicznym, przytrzymaj pęsetą pustą czterocalową płytkę krzemową najwyższej jakości i użyj butelki do mycia, aby spłukać powierzchnię po obu stronach płytki acetonem, metanolem, a następnie izopropanolem. Proces ten jest dalej określany jako czyszczenie A MI pod strumieniem wody dejonizowanej. Opłucz izopropanol z wafla, a następnie użyj pistoletu do azotu, aby wysuszyć wafel.

Załaduj wafel do urządzenia do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionego plazmą lub P-E-C-V-D. Wprowadź parametry, aby uzyskać warstwę dwutlenku krzemu o grubości jednego mikrometra, a następnie rozpocznij zautomatyzowany proces, używając narzędzia do rozpylania prądem stałym, nałóż warstwę chromu o grubości 200 angstremów na płytkę, a następnie nałóż warstwę złota o grubości 2000 stromów. Załaduj wafel na wirówkę, odkurz powierzchnię pistoletem do azotu i za pomocą pipety do pasty nałóż spin PR jeden dodatni spin fotoresist, aby uzyskać jednolitą warstwę o grubości około 1,6 mikrometra.

Następnie piecz wafelek przez minutę w temperaturze 100 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Załaduj wafel z fotorezystem do wyrównywania maski. Następnie rozpocznij ekspozycję 190 milidżuli na centymetr kwadratowy przy 405 nanometrach, w której nakładka maski otworzy migawkę i wystawi rezystor fotograficzny na działanie światła przez maskę o zaprojektowanych funkcjach.

Po ekspozycji zanurzyć wafel w szklanym naczyniu zawierającym wywoływacz 3 5 2 i inkubować przez 30 sekund, delikatnie wstrząsając. Następnie opłucz wafel pod strumieniem wody i osusz pistoletem do azotu jak poprzednio. Następnie zanurz wafel w szklanym naczyniu zawierającym roztwór do wytrawiania złota i inkubuj przez 1,5 minuty, delikatnie wstrząsając.

Następnie przenieś wafel do szklanego naczynia zawierającego wspomniany chrom i inkubuj, delikatnie potrząsając, aż ślady chromu na płytce znikną. Powinno to zająć około 30 sekund. Opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu, trzymając wafel pęsetą.

Usuń rezystancję fotograficzną za pomocą procedury czyszczenia MI. Następnie spłucz wodą DI i osusz pistoletem do azotu w dwóch warstwach rękawiczek. Zanurz wafel w naczyniu teflonowym z czystym roztworem piranii na jedną minutę.

Następnie opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Obok ułożenia elektrod platynowych załaduj wafel na wirówkę. Odkurz powierzchnię za pomocą pistoletu do azotu i za pomocą pastery, pipety, dozuj PR dwa dodatnie fotorezystu na wirowaniu powierzchni, aby utworzyć jednolitą warstwę o grubości około 1,4 mikrometra.

Ułóż wafel na gorącym talerzu w temperaturze 100 stopni Celsjusza i piecz przez minutę. Po wstępnym upieczeniu naświetl wafel na 30 milidżuli na centymetr kwadratowy 405 nanometrów przez maskę fotograficzną. Następnie ułóż wafelek na gorącym talerzu w temperaturze 125 stopni Celsjusza i piecz przez 45 sekund.

Zdejmij maskę z maski, nakładki i zalej. Naświetl płytkę o proporcji 1000 milidżuli na centymetr kwadratowy przy długości fali 405 nanometrów bez maski fotograficznej. Po ekspozycji wywołaj płytkę, zanurzając ją w szklanym naczyniu zawierającym sześć do jednego roztworu wywoływacza Z 400 K.

Inkubować przez dwie minuty, delikatnie potrząsając. Następnie opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Za pomocą systemu odparowywania wiązką elektronów nałóż warstwę tytanu o grubości 400 angstremów, a następnie warstwę platyny o grubości 1600 angstremów na płytkę.

Umieść wafel w szklanym naczyniu wypełnionym acetonem i umieść naczynie w łaźni ultradźwiękowej na pięć minut, aby zdjąć zdjęcie. Oprzyj się następnie trzymaniu wafla pęsetą. Za pomocą butelki do mycia spłucz obie powierzchnie wafla acetonem, a następnie izopropanolem.

Opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Aby przygotować formę do kanałów testowych, wypłucz pustą czterocalową płytkę silikonową o jakości testowej za pomocą procedury czyszczenia MI. Tak jak poprzednio, wypłucz izopropanol z płytki wodą di, a następnie wysusz pistoletem do azotu.

Załaduj wafel na wirówkę, odkurz powierzchnię płytki pistoletem do azotu i za pomocą pipety pasti dozuj PR trzy ujemne fotorezystu na powierzchnię, aby utworzyć jednolitą warstwę o grubości około 100 mikrometrów. Umieść wafel na gorącym talerzu, aby wstępnie go upiec w dwuetapowej procedurze pieczenia. Najpierw zwiększ temperaturę z temperatury pokojowej do 65 stopni Celsjusza przy 300 stopniach Celsjusza na godzinę.

Następnie trzymaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Zwiększ do 95 stopni Celsjusza w temperaturze 300 stopni Celsjusza na godzinę, a następnie przytrzymaj przez 30 minut. Naświetl płytkę o proporcji 2 500 milidżuli na centymetr kwadratowy przy długości fali 405 nanometrów przez maskę fotograficzną.

Następnie umieść wafel na gorącym talerzu i upiecz wafel, zwiększając temperaturę z pokojowej do 95 stopni Celsjusza przy 300 stopniach Celsjusza na godzinę. Trzymaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Zanurz wafel w szklanym naczyniu zawierającym glikol propylenowy, octan eteru monometylowego lub wywoływacz P-G-M-E-A i pozwól mu się rozwinąć przez 10 minut.

Opłucz wafel izopropanolem i wysusz pistoletem do azotu, aby wytworzyć kanały testowe, aby znaleźć obudowę wokół płytki formy za pomocą folii aluminiowej i powoli wlej nieutwardzony polidimetylossukonan lub PDMS na formę. Upiecz formę z PDMS w piecu skrzynkowym, stosując dwuetapową procedurę pieczenia, w której temperatura wzrasta z temperatury pokojowej do 80 stopni Celsjusza w ciągu pięciu minut i utrzymuje się na poziomie 80 stopni Celsjusza przez 17 minut. Po ostygnięciu formy oderwij PDMS od formy i umieść na folii aluminiowej.

Wytnij wióry testowe nożem chirurgicznym i określ otwory za pomocą narzędzia do wykrawania biopsji, jak pokazano tutaj. Ręcznie wyrównaj kanały testowe PDMS z elektrodami roboczymi na chipie elektrochemicznym. PDMS dobrze przylega do układu elektrochemicznego, uszczelniając kanały i zapobiegając wyciekom.

Podłącz elastyczną rurkę do plastikowego kolanka lub prostego łącznika za pomocą krótkiej elastycznej rurki jako adaptera do funkcjonalnej pionowych mikrokanałów. Podłączyć strzykawkę zawierającą jednoniciową sondę DNA do rurki i umieścić ją w pompie strzykawkowej. Przymocuj złącza do każdego z całych dziurkowanych wlotów w urządzeniu.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest przepływ roztworu przez mikrokanały bez generowania pęcherzyków. Aby zapewnić sukces, płyn roztworem bardzo powoli Aby uzyskać jednorodne wypełnienie kanału, zainicjuj pompę z natężeniem przepływu 200 mikrolitrów na godzinę, aby powoli napełniać każdy z trzech oddzielnych mikrokanałów innym roztworem do inkubacji jednoniciowej sondy DNA. Po inkubacji przez godzinę wymienić rurkę strzykawki i łącznik, aby przepłukać mikrokanaliki PBS Następnie wymienić rurkę strzykawki i łączniki, aby napełnić mikrokanał roztworem składającym się z jednego milimolowego sześciomerowego CAPTO jednego H etanolu MCH w 10-milimolowym PBS 100-milimolowym chlorku sodu i 1,395 milimolowym TCEP inkubować przez jedną godzinę.

Następnie spłucz PBS jak przed użyciem pęsety. Podnieś PDMS obrócony o 90 stopni do orientacji poziomej i odłóż w dół. Spowoduje to odsłonięcie oddzielnych rzędów komór reakcyjnych, z których każdy będzie zawierał unikalny licznik i elektrodę referencyjną do analizy hybrydyzacji DNA.

Wymień, rurki strzykawki i łączniki do wypełnienia mikrokanałów kontrolnym roztworem pomiarowym stężonego buforu SSC z soli fizjologicznej stężonego cytrynianu sodu Forex, inkubować przez 20 minut po inkubacji, wymienić strzykawkę, aby napełnić mikrokanały pięciomilimolowym cyjankiem Ferrisa, pięciomilimolowym cyjankiem Faraona w roztworze PBS. Następnie, aby zarejestrować wartości impedancji tła układu elektrochemicznego dla różnych częstotliwości za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej lub EIS, podłącz statystykę potencjału do licznika roboczego i elektrod referencyjnych za pomocą końcówek sondy. Wprowadź parametry pomiaru EIS do oprogramowania komputerowego, a następnie rozpocznij pomiar.

Powtórz ten pomiar dla każdej elektrody roboczej w mikrokanałach, aby zmierzyć hybrydyzację DNA dla każdej niekomplementarnej i komplementarnej wymiany docelowego jednoniciowego DNA. Rurka strzykawki i złącze. Wypełnić mikrokanały czterokrotnie skoncentrowanym buforem SSC zawierającym jeden mikromol docelowego jednoniciowego DNA i inkubować przez 20 minut.

Wykonuj pomiary, inicjując pomiar EIS za pomocą oprogramowania na komputerze dla każdego docelowego roztworu jednoniciowego DNA w celu walidacji aktywności elektrochemicznej cyklicznego vol bio chipp. Pomiary telemetryczne wykonano w mikrokanałach wypełnionych elektroaktywnym redoks Para cyjanku cyjanku pokazana tutaj to cykliczne telegramy objętościowe dziewięciu elektrod roboczych. Podobny kształt, wysokości pików i separacja pików dla wszystkich elektrod wykazują wysoką odtwarzalność, aby zademonstrować zdolność biochipów do wykrywania zdarzeń hybrydyzacji DNA.

Zmierzono zmiany impedancji elektrochemicznej dla zdarzeń hybrydyzacji między trzema jednoniciowymi sondami DNA a ich uzupełniającymi i niekomplementarnymi jednoniciowymi celami DNA, zaobserwowano wyższe zmiany rezystancji przenoszenia ładunku, gdy wprowadzono uzupełniający jednoniciowy cel DNA i zhybrydyzowano go z sondą, w porównaniu z wprowadzeniem nieuzupełniających jednoniciowych celów DNA w celu wykazania czułości bioczujnika. Do sondy detekcyjnej wprowadzono różne stężenia komplementarnego celu jednoniciowego DNA, pokazany tutaj jest wykres nyquista pomiarów elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej po wprowadzeniu rosnących docelowych stężeń jednoniciowego DNA wskazanych strzałką na wykresie. Zwiększone wartości impedancji zaobserwowano przy niskich częstotliwościach około 15 Hz dla wyższych docelowych, jednoniciowych stężeń DNA ze względu na silniejsze siły odpychające między dwuniciowym DNA a cząsteczkami cyjanku żelazocyjanku.

Ogólnie rzecz biorąc, projekt BIOCHIPS wykazuje zdolność do szybkiego wykrywania obecności zdarzeń hybrydyzacji DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować i wyprodukować mikroprzepływowe urządzenie elektrochemiczne i używać go do wykrywania zdarzeń hybrydyzacji DNA. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji różnych parametrów bios, takich jak stosunek sygnału do pielęgniarki, stabilność i czułość Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak wprowadzanie jednoniciowych celów DNA z nieco innymi sekwencjami kwasów nukleinowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak kombinacja mutacji DNA i konkurencja. Nie zapominaj, że praca z rozwiązaniami procesowymi mikroprodukcji może być niezwykle niebezpieczna, a ochrona ciała, oczu i rąk powinna zawsze ostrzegać podczas wykonywania tej procedury.