Name: Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej detekcji hybrydyzacji DNA. Urządzenie wykrywa cele DNA z granicą detekcji 3,8 nM poprzez pomiar zmian impedancji elektrochemicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Fundacji Roberta W. Deutscha, Agencji Redukcji Zagrożeń Obronnych (DTRA) oraz Narodowej Fundacji Nauki Emerging Frontiers in Research and Innovation (EFRI) za wsparcie finansowe. Autorzy dziękują również Maryland Nanocenter i jego Fablabowi za wsparcie w zakresie pomieszczeń czystych.

1. Mikrofabrykacja chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Przygotuj chip elektrochemiczny
	<ol>
		<li>Wzór złotych elektrod
		<ol>
			<li>Opłucz pustą 4-calową płytkę silikonową (najwyższej jakości) acetonem, metanolem i izopropanolem ("AMI" czysty). Wypłucz izopropanol z płytki wodą dejonizowaną (DI), a następnie wysusz pistoletemN2.</li>
			<li>Wyhoduj warstwę pasywacyjną SiO2 o grubości 1 μm za pomocą narzędzia do chemicznego osadzania z fazy gazowej wspomaganej plazmą (PECVD). Umieść warstwę chromu o grubości 200 A, a następnie warstwę złota o grubości 2 000 A za pomocą narzędzia do napylania prądem stałym.</li>
			<li>Fotorezystor dodatni "PR1" wirować (parametry wirowania: 3 000 obr./min, 1 000 obr./s, 30 s) w celu uzyskania jednolitej warstwy o grubości ~1,6 μm. Piecz wafel przez 1 minutę w temperaturze 100 °C na gorącej płycie.</li>
			<li>Naświetl płytkę z ciśnieniem 190 mJ/cm2 przy długości fali 405 nm przez fotomaskę. Rozwijaj wafel przez 30 sekund w wywoływaczu 352 i opłucz wafel za pomocą DI i wysusz pistoletem N2.</li>
			<li>Wytrawiaj złoto wytrawiaczem do złota przez 1,5 min. Wytrawiaj chrom wytrawiaczem chromowym przez ~30 sek. Opłucz wafel za pomocą DI i wysusz pistoletem N2.</li>
			<li>Usuń fotorezystor za pomocą procedury czyszczenia "AMI". 
			UWAGA: SILNY UTLENIACZ I POTENCJALNIE WYBUCHOWY.</li>
			<li>Wyczyść wafel mieszanką 4:1 H2SO4:H2O2 ("Piranha" czysta) przez 1 min. Opłucz wafel za pomocą DI i osusz pistoletem N2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wzór Elektrody platynowe
		<ol>
			<li>Fotorezystor dodatni "PR2" o parametrach wirowania: 3 000 obr./min, 1 000 obr./min, 30 sek.) w celu uzyskania jednolitej warstwy o grubości ~1,4 μm. Piecz wafel przez 1 minutę w temperaturze 100 °C na gorącej płycie.</li>
			<li>Naświetlić płytkę o ciśnieniu 30 mJ/cm2 przy długości fali 405 nm przez fotomaskę. Piecz wafelek przez 45 sekund w temperaturze 125 °C na gorącej płycie. Powódź naświetlić płytkę z 1,000 mJ/cm2 przy długości fali 405 nm bez fotomaski. Rozwijaj wafel przez 2 minuty w wywoływaczu 6:1 AZ400K i opłucz wafel za pomocą DI i wysusz pistoletemN2.</li>
			<li>Umieść warstwę tytanu o grubości 400 A, a następnie warstwę platyny o grubości 1 600 A za pomocą systemu odparowywania wiązki elektronów.</li>
			<li>Zdjąć fotorezystor w ultradźwiękowej kąpieli acetonowej na 5 minut, a następnie spłukać acetonem i izopropanolem. Opłucz wafel za pomocą DI i osusz pistoletemN2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kanałów testowych
	<ol>
		<li>Przygotuj formę do kanałów testowych
		<ol>
			<li>Wypłucz pustą 4-calową płytkę silikonową (jakość testowa) za pomocą procedury czyszczenia "AMI". Wypłucz izopropanol z wafla za pomocą DI, a następnie wysusz pistoletemN2.</li>
			<li>Fotorezystor ujemny "PR3" (2-stopniowe parametry wirowania: krok pierwszy - 600 obr./min, 120 obr./min, 10 sek. Krok drugi – 1 150 obr./min, 383 obr./min, 27 sek.), aby uzyskać jednolitą powłokę o grubości ~100 μm. Wstępnie upiecz wafel na gorącej płycie (2-stopniowe parametry pieczenia: krok pierwszy – zwiększenie temperatury pokojowej do 65 °C przy 300 °C/h i utrzymanie temperatury przez 10 minut. Krok 2 – zwiększenie do 95 °C przy 300 °C/h i utrzymanie temperatury przez 30 min).</li>
			<li>Naświetlić płytkę z ciśnieniem 2,500 mJ/cm2 przy długości fali 405 nm przez fotomaskę. Po upieczeniu wafla rozgrzej do 95 °C przy 300 °C/h i utrzymuj temperaturę przez 10 minut na gorącej płycie. Rozwijaj wafel przez 10 minut w wywoływaczu octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA). Opłucz wafel izopropanolem i osusz pistoletemN2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wytwarzanie kanałów testowych
		<ol>
			<li>Przygotować mieszaninę polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku 10:1 (20 g elastomeru, 2 g utwardzacza) i całkowicie odgazować w komorze próżniowej przez 20 minut.</li>
			<li>Zdefiniuj obudowę wokół płytki formy folią aluminiową i powoli wylej nieutwardzony PDMS na formę.</li>
			<li>Upiecz formę z PDMS w piecu skrzynkowym (2-stopniowe parametry pieczenia: krok pierwszy – 5 minut zwiększanie temperatury pokojowej do 80 °C. Krok 2 – utrzymywanie w temperaturze 80 °C przez 17 minut).</li>
			<li>Oderwij PDMS od formy i umieść na folii aluminiowej. Wytnij wióry testowe nożem chirurgicznym, nakreśl otwory za pomocą narzędzia do wykrawania biopsji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Złóż urządzenie
<ol>
	<li>Ręcznie wyrównaj kanały testowe PDMS z elektrodami roboczymi na chipie elektrochemicznym. PDMS dobrze przylega do układu elektrochemicznego, uszczelniając kanały i zapobiegając wyciekom.</li>
	<li>Podłącz elastyczną rurkę (OD 0,087 '' i ID 0,015 '') do plastikowego kolanka lub prostego łącznika za pomocą krótkiej elastycznej rurki jako adaptera (OD 0,1875 '' i ID 0,0625 ''). Podłącz złącza do każdego z otworów wlotowych w urządzeniu.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę na drugim końcu rurki i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej. Na przemian zmieniać zestaw strzykawki, rurki i łącznika zgodnie z wymaganym krokiem procedury w sekcji 3 i odpowiadającym mu roztworem.</li>
</ol>
3. Analizuj hybrydyzację DNA
UWAGA: Wprowadzaj każdy roztwór powoli do kanału z prędkością przepływu 200 μl/h, aż cały kanał zostanie wypełniony.
<ol>
	<li>Funkcjonalizuj każdy pionowy mikrokanał za pomocą innej sekwencji sondy ssDNA (wykonaj równolegle do 3 oddzielnych pionowych mikrokanałów):
	<ol>
		<li>Napełnij każdy mikrokanał innym roztworem do inkubacji sondy ssDNA (10 mM bufor fosforanowy, 100 mM NaCl, 10 μM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) i 1 μM sonda ssDNA) i inkubuj przez 1 godzinę, a następnie przepłucz mikrokanał PBS.</li>
		<li>Napełnij mikrokanał roztworem zawierającym 1 mM 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) w buforze 10 mM PBS, 100 mM NaCl i 1,395 mM TCEP i inkubuj przez 1 godzinę, a następnie przepłucz mikrokanał PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdejmij PDMS, obróć o 90° do orientacji poziomej i ułóż w dół, aby odsłonić oddzielne rzędy komór reakcyjnych, z których każdy zawiera unikalną elektrodę licznikową i referencyjną (rysunek S1).</li>
	<li>Napełnić mikrokanaliki kontrolnym roztworem pomiarowym 4x stężonego buforu soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC) i inkubować przez 20 minut.</li>
	<li>Pomiar tła: Wypełnić mikrokanaliki żelazocyjankiem 5 mM / żelazocyjankiem 5 mM w roztworze PBS i zapisać wartości impedancji układu elektrochemicznego dla różnych częstotliwości (elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna; EIS) za pomocą potencjostatu połączonego z elektrodą roboczą, licznikową i referencyjną (parametry EIS: zakres częstotliwości od 1 MHz do 0,1 Hz, 10 punktów danych częstotliwości na dekadę, amplituda 25 mV, polaryzacja 5 mV w stosunku do elektrody odniesienia). Powtórz ten pomiar dla każdej elektrody roboczej w mikrokanałach.</li>
	<li>Zmierz hybrydyzację DNA (wykonaj dla każdego niekomplementarnego i komplementarnego celu ssDNA).
	<ol>
		<li>Wypełnić mikrokanaliki docelowym roztworem pomiarowym ssDNA składającym się z 4x stężonego buforu SSC zawierającego 1 μM docelowego ssDNA i inkubować przez 20 minut. Zmierzyć DNA zgodnie z krokiem 3.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hong, J., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanofluidic+systems+for+high-throughput+biological+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanofluidic systems for high-throughput biological screening.</a> Drug Discov. Today. 14, 134-146 (2009).</li>
<li>Sun, Y., Kwok, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microfluidic+system+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Polymeric microfluidic system for DNA analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 556, 80-96 (2006).</li>
<li>Xu, Y., Yang, X., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+aptamers+in+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Review: aptamers in microfluidic chips.</a> Anal. Chim. Acta. 683, 12-20 (2010).</li>
<li>Yang, W., Woolley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiprocess+microfluidic+systems+for+automating+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Automat%22%5BJournal%5D)">Integrated multiprocess microfluidic systems for automating analysis.</a> J. Lab. Automat. 15, 198-209 (2010).</li>
<li>Gervais, T., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+and+surface+reactions+in+micro%EF%AC%82uidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass transport and surface reactions in microﬂuidic systems.</a> Chem. Eng. Sci. 61, 1102-1121 (2006).</li>
<li>Song, H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+kinetics+on+a+microfluidic+chip+using+nanoliters+of+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Millisecond kinetics on a microfluidic chip using nanoliters of reagents.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14613-14619 (2003).</li>
<li>Jiang, H., Weng, X. A., Li, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+whole-blood+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microfluidic whole-blood immunoassays.</a> Microfluid. Nanofluid. 10, 941-964 (2011).</li>
<li>Dutse, S. W., Yusof, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+lab-on-chip+systems+in+DNA-based+biosensing%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: an overview.</a> Sensors. 11, 5754-5768 (2011).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip%3A+microfluidics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5, 210-218 (2006).</li>
<li>Craighead, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+lab-on-a-chip+technologies+for+interrogating+individual+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Future lab-on-a-chip technologies for interrogating individual molecules.</a> Nature. 442, 387-393 (2006).</li>
<li>Hunt, H. K., Armani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biological+and+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Label-free biological and chemical sensors.</a> Nanoscale. 2, 1544-1559 (2010).</li>
<li>Dukkipati, V. R., Pang, S. W. Integrated microfluidic system for DNA analysis. IEEE-NANO 2006. Sixth IEEE Conference on Nanotechnology. 1, 162-165 (2006).</li>
<li>Fang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+microfluidic+devices+with+concurrent+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR microfluidic devices with concurrent electrochemical detection.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2131-2136 (2009).</li>
<li>Pavlovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+architecture+for+electrochemical+patterning+and+detection+of+multiple+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device architecture for electrochemical patterning and detection of multiple DNA sequences.</a> Langmuir. 24, 1102-1107 (2008).</li>
<li>Xu, X., Zhang, S., Chen, H., Kong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+electrochemistry+in+micro-total+analysis+systems+for+biochemical+assays%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Integration of electrochemistry in micro-total analysis systems for biochemical assays: recent developments.</a> Talanta. 80, 8-18 (2009).</li>
<li>Cai, H., Lee, T. M. -H., Hsing, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+protein+recognition+using+an+aptamer-based+impedance+measurement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free protein recognition using an aptamer-based impedance measurement assay.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 433-437 (2006).</li>
<li>Iliescu, C., Poenar, D. P., Carp, M., Loe, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+device+for+impedance+spectroscopy+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic device for impedance spectroscopy analysis of biological samples.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 123, 168-176 (2007).</li>
<li>Prakash, S. B., Abshire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cancer+cell+proliferation+on+a+CMOS+capacitance+sensor+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Tracking cancer cell proliferation on a CMOS capacitance sensor chip.</a> Biosens. Bioelectron. 23, 1449-1457 (2008).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+electrochemical+enzyme+sensor+chip+using+polydimethylsiloxane+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of electrochemical enzyme sensor chip using polydimethylsiloxane microfluidic channel.</a> Anal. Chim. Acta. 468, 143-152 (2002).</li>
<li>Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physics+and+applications+of+microfluidics+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Physics and applications of microfluidics in biology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261-286 (2002).</li>
<li>Mariella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%3A+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Sample preparation: the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomed. Microdevices. 10, 777-784 (2008).</li>
<li>Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBhushan%2C+B+%22Springer+handbook+of+nanotechnology%22">Springer handbook of nanotechnology</a>. , 3rd ed, Springer. (2010).</li>
<li>Ghallab, Y. H., Badawy, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhallab%2C+YH+%22Lab-on-a-chip%3A+Techniques%2C+circuits%2C+and+biomedical+applications%22">Lab-on-a-chip: Techniques, circuits, and biomedical applications</a>. , Artech House. (2010).</li>
<li>Chee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+genetic+information+with+high-density+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Accessing genetic information with high-density DNA arrays.</a> Science. 25, 610-614 (1996).</li>
<li>Ma, K. -S., Zhou, H., Zoval, J., Madou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hybridization+detection+by+label+free+versus+impedance+amplifying+label+with+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">DNA hybridization detection by label free versus impedance amplifying label with impedance spectroscopy.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 114, 58-64 (2006).</li>
<li>Ito, T., Hosokawa, K., Maeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-base+mismatch+at+distal+end+of+DNA+duplex+by+electrochemical+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of single-base mismatch at distal end of DNA duplex by electrochemical impedance spectroscopy.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1816-1819 (2007).</li>
<li>Kao, L. T. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+detection+and+differentiation+of+the+DNA+strains+for+influenza+A+%28H1N1+2009%29+using+a+silicon-based+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Multiplexed detection and differentiation of the DNA strains for influenza A (H1N1 2009) using a silicon-based microfluidic system.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2006-2011 (2011).</li>
<li>Li, J., Chen, S., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+and+subtyping+influenza+virus+using+DNA+microarrays+and+multiplex+reverse+transcriptase+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 696-704 (2001).</li>
<li>Gautier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization-induced+interfacial+changes+detected+by+non-faradaic+impedimetric+measurements+compared+to+faradaic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electroanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hybridization-induced interfacial changes detected by non-faradaic impedimetric measurements compared to faradaic approach.</a> J. Electroanal. Chem. 610, 227-233 (2007).</li>
<li>Ma, Y., Jiao, K., Yang, T., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+PAT+gene+sequence+detection+by+nano-SiO2%2Fp-aminothiophenol+self-assembled+films+DNA+electrochemical+biosensor+based+on+impedance+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive PAT gene sequence detection by nano-SiO2/p-aminothiophenol self-assembled films DNA electrochemical biosensor based on impedance measurement.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 131, 565-571 (2008).</li>
<li>Kim, J. H. -S., Marafie, A., Jia, X. -Y., Zoval, J. V., Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+DNA+hybridization+kinetics+in+a+microfluidic+flow+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of DNA hybridization kinetics in a microfluidic flow channel.</a> Sensor. Actuat. B-Chem. 113, 281-289 (2006).</li>
<li>Dykstra, P. H., Roy, V., Byrd, C., Bentley, W. E., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electrochemical+sensor+array+for+characterizing+protein+interactions+with+various+functionalized+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electrochemical sensor array for characterizing protein interactions with various functionalized surfaces.</a> Anal. Chem. 83, 5920-5927 (2011).</li>
<li>Ben-Yoav, H., Dykstra, P. H., Bentley, W. E., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic-based+electrochemical+biochip+for+label-free+diffusion-restricted+DNA+hybridization+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic-based electrochemical biochip for label-free diffusion-restricted DNA hybridization analysis.</a> Biosens. Bioelectron. 38, 114-120 (2012).</li>
<li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+for+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43R-50R (1997).</li>
<li>McEwen, G. D., Chen, F., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization%2C+hybridization%2C+and+oxidation+of+synthetic+DNA+on+gold+surface%3A+Electron+transfer+investigated+by+electrochemistry+and+scanning+tunneling+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Immobilization, hybridization, and oxidation of synthetic DNA on gold surface: Electron transfer investigated by electrochemistry and scanning tunneling microscopy.</a> Anal. Chim. Acta. 643, 26-37 (2009).</li>
<li>Arinaga, K., Rant, U., Tornow, M., Fujita, S., Abstreiter, G., Yokoyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+surface+charging+during+the+coadsorption+of+mercaptohexanol+to+DNA+layers+on+gold%3A+Direct+observation+of+desorption+and+layer+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">The role of surface charging during the coadsorption of mercaptohexanol to DNA layers on gold: Direct observation of desorption and layer reorientation.</a> Langmuir. 22, 5560-5562 (2006).</li>
<li>Katz, E., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+biomolecular+interactions+at+conductive+and+semiconductive+surfaces+by+impedance+spectroscopy%3A+Routes+to+impedimetric+immunosensors%2C+DNA-sensors%2C+and+enzyme+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Probing biomolecular interactions at conductive and semiconductive surfaces by impedance spectroscopy: Routes to impedimetric immunosensors, DNA-sensors, and enzyme biosensors.</a> Electroanalysis. 15, 913-947 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasze procedury demonstrują produkcję biochipa elektrochemicznego opartego na mikroprzepływach i jego wykorzystanie do analizy zdarzeń hybrydyzacji DNA. Dzięki wysokowydajnemu, kontrolowanemu procesowi mikroprodukcji opracowujemy urządzenie składające się z mikrokanałów zintegrowanych z szeregiem przetworników elektrochemicznych. Opracowaliśmy kontrolowane parametry przetwarzania dla procedury fotolitograficznej chipa elektrochemicznego i formy kanału mikroprzepływowego za pomocą podejścia iteracyjnego. Kroki te stanowią...

Mikroprzepływowe urządzenia lab-on-a-chip (LOC) zapewniają liczne korzyści w diagnostyce klinicznej, monitorowaniu środowiska i badaniach biomedycznych. Urządzenia te wykorzystują kanały mikroprzepływowe do kontrolowania przepływu płynu do obszarów chipa, w których mogą odbywać się różne procedury, w tym mieszanie odczynników, wiązanie oparte na powinowactwie, transdukcja sygnału i hodowla komórek1-4. Mikrofluidyka zapewnia wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi klinicznymi narzędziami diagnostycznymi, takimi jak czytniki płytek mikrodołkowych lub elektroforetyczne testy przesunięcia żelu. Urządzenia mikroprzepływowe wymagają od 2 do 3 rzędów wielkości (nanolitrów w przeciwieństwie do mikrolitrów) mniej odczynników do wykonania podobnych testów. Urządzenia te mogą również zwiększyć szybkość, o jaką zachodzą niektóre zdarzenia biologiczne ze względu na mniejsze ograniczenie gatunków w kanałach5,6. Po trzecie, czujniki można zintegrować z urządzeniami mikroprzepływowymi przy użyciu technik litografii i trawienia, które mogą zapewnić wykrywanie bez etykiet. Wreszcie, urządzenia te są niedrogie w produkcji i wymagają niewielkiego nakładu pracy ze strony technika do obsługi7-10.
Wykrywanie bez etykiet zazwyczaj odbywa się za pomocą przetwornika optycznego lub elektrycznego. Urządzenia optyczne mogą charakteryzować się lepszą wydajnością wykrywania ze względu na mniejsze zakłócenia z analitami w próbce. Niemniej jednak ich wydajność jest zagrożona w przypadkach, gdy tło próbki ma taką samą długość fali rezonansowej jak czujnik11. Wykorzystanie sygnałów elektrycznych do detekcji biologicznej i chemicznej w układach mikroprzepływowych ma wiele zalet. Produkcja jest z natury mniej skomplikowana, ponieważ czujniki te zazwyczaj wymagają do działania tylko elektrod wzorzystych. Ponadto sygnały elektryczne mogą być bezpośrednio połączone z większością urządzeń pomiarowych, podczas gdy inne modalności sygnału mogą wymagać przetwornika do konwersji sygnału12-15. Czujniki elektryczne zwykle mierzą zmiany impedancji16,17, pojemności18 lub aktywności redoks19. Jednak wraz z miniaturyzacją tych systemów pojawiają się nowe wyzwania. Do najważniejszych wyzwań, które należy pokonać, należą: przygotowanie próbki i mieszanie płynów (ze względu na małą objętość próbki i liczbę Reynoldsa), skutki fizyczne i chemiczne (w tym siły kapilarne, chropowatość powierzchni, interakcje chemiczne między materiałami konstrukcyjnymi a analitami), niski stosunek sygnału do szumu (wytwarzany przez zmniejszoną powierzchnię i objętość)20-23 oraz potencjalna interferencja ze strony analitów elektroaktywnych w złożonych próbkach biologicznych (np., krew i ślina). Dalsze badania nad tymi efektami zaowocują wytycznymi dotyczącymi dokładnej produkcji i obsługi tych urządzeń w powtarzalny sposób, który poprawi ich ogólną wydajność.
Wykrywanie hybrydyzacji DNA jest szeroko stosowane do diagnozowania zaburzeń genetycznych24,25 i różnych form raka26. Każdego roku u pacjentów identyfikuje się wiele szczepów grypy na podstawie wyników technik hybrydyzacji DNA27. Sam wirus grypy odpowiada za 36 000 zgonów każdego roku w Stanach Zjednoczonych28. Takim przykładom może przynieść korzyści laboratoryjne urządzenie mikroprzepływowe, które może wykonywać te same techniki testowania, co czytnik płytek lub test z przesunięciem żelowym, przy małej objętości próbki i za ułamek kosztów bez poświęcania czułości lub swoistości. Ze względu na wiele zalet bezznacznikowego wykrywania elektrochemicznego, jest ono szeroko stosowane do wykrywania zdarzeń hybrydyzacji DNA29,30. Konfiguracja, w której elektrody w skali makro (w zakresie milimetrów) są zanurzane w zlewkach z roztworem będącym przedmiotem zainteresowania, może być wykorzystana do dostarczenia bardzo czułych danych dotyczących kinetyki wiązania jednoniciowych sekwencji DNA z ich pasującymi sekwencjami komplementarnymi. Ostatnio poczyniono kilka postępów we włączaniu detekcji elektrochemicznej do mikrofluidyki do hybrydyzacji DNA. Przeprowadzono badania dotyczące kinetyki hybrydyzacji31 i integracji czujników do detekcji15 w kanałach mikroprzepływowych. Jednak nadal istnieje zapotrzebowanie na szybkie, wysokowydajne urządzenie mikroprzepływowe, które może analizować zdarzenia hybrydyzacji DNA równolegle bez skomplikowanych etapów przygotowania próbki.
Urządzenie przedstawione w tej pracy dostarcza platformę, która pozwala na równoległe badanie wielu interakcji bez skomplikowanych etapów przygotowania próbki. Nasz protokół pokazuje, w jaki sposób biochipy elektrochemiczne oparte na mikroprzepływach są mikrowytwarzane za pomocą technologii systemów mikroelektromechanicznych (MEMS)32,33. Opisujemy proces wytwarzania zarówno chipa mikroprzepływowego, wykonanego z polidimetylosiloksanu (PDMS), jak i chipa elektrochemicznego, składającego się z szeregu elektrod. Zajęto się również funkcjonalizacją chemiczną biochipa za pomocą sond ssDNA. Na koniec zademonstrowano zdolność biosensora do specyficznego wykrywania i analizowania celów ssDNA. Ogólnie rzecz biorąc, biochip elektrochemiczny oparty na mikroprzepływach jest szybką i wysokowydajną techniką analizy. Może być używany do badania interakcji między cząsteczkami biologicznymi a przetwornikami przewodzącymi i może być wykorzystywany w różnych zastosowaniach typu lab-on-a-chip.

<table><tbody><tr><td>4-calowy wafel silikonowy</td><td>Ultrasil</td><td>4-5664</td><td>Jednostronnie polerowany; Typ P; Domieszkowany borem; Orientacja 1-0-0; Grubość 500 mikronów; Rezystancja 10-20 omów i middot; cm</td></tr><tr><td>Fotorezystor Shipley 1813 ("PR1")</td><td>Fotorezystor mikrochemiczny</td><td></td><td></td> dodatni</tr><tr><td>AZ5214 fotorezystor ("PR2")</td><td>Fotorezystor</td> <td>Hoechst Celanse</td><td></td> dodatni</tr><tr><td>SU-8 50 fotorezystu ("PR3")</td><td>Fotorezystor ujemny</td> <td>mikrochemiczny</td><td></td></tr><tr><td>Złoty wytrawiacz</td><td>Transen</td><td>TFA</td><td>Bez rozcieńczenia</td></tr><tr><td>Wytrawiacz chromu</td><td>Transene</td><td>1020AC</td><td>Bez rozcieńczenia</td></tr><tr><td>elastomer PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097366 1004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS utwardzacz</td><td>Dow Corning</td><td>3097358 1004</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do wykrawania biopsji</td><td>Healthlink</td><td>BP20</td><td></td></tr><tr><td>Tygon elastyczna rurka</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>Adapter elastyczny R 3603</td><td>0,015"</td></tr><tr><td>Tygon</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>06417-41</td> Strzykawka <td>0,0625"</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Fluka</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Sigma</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>tris(2-karboksyetylo)fosfina</td><td>Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>6-merkapto-1-heksanol</td><td>Aldrich</td><td>451088</td><td></td></tr><tr><td>20x skoncentrowany bufor solno-sodowy cytrynianu</td> sodu <td>Sigma</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(III)</td><td>Aldrich</td><td>455946</td><td></td></tr><tr><td>Komplementarne ssDNA #1</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3'</td></tr><tr><td>Docelowe ssDNA #2</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3'</td></tr><tr><td>Komplementarne ssDNA #2</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3'</td></tr><tr><td>Target ssDNA #3</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3'</td></tr><tr><td>Komplementarne ssDNA #3</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3'</td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)</td><td>Oxford Instruments</td><td>PlasmaLab System 100</td><td>Ciśnienie w komorze 1,000 mTorr, Tempreture 200 &#176; C, moc RF 20 W, Gazy: a) Natężenie przepływu N2O 710 sccm; b) skład 5% SiH4 i 95% N2 natężenie przepływu gazów 170 sccm, szybkość wzrostu SiO2 690 &#197;/min.</td></tr><tr><td>Napylacz prądu stałego</td><td>AJA International</td><td>ATC 1800-V</td><td>Do chromu: Ciśnienie w komorze 10 mTorr, Natężenie przepływu argonu 20 sccm, Zasilanie prądem stałym 200 W, Szybkość napylania 10 nm/min. Dla złota: Ciśnienie w komorze 10 mTorr, Natężenie przepływu argonu 20 sccm, Dostarczana moc prądu stałego 200 W, Szybkość napylania 36 nm/min.</td></tr><tr><td>System odparowywania wiązką elektroniczna</td><td>Denton</td><td>Zbudowany na zamówienie</td><td>Dla tytanu: Ciśnienie w komorze < 2 x 10-6 Torr, Moc dostarczana do pistoletu elektrycznego 7,5 kW, Prąd żarnika 150-200 mA, Szybkość parowania 6-10 &#197;/sek. Dla platyny: Ciśnienie w komorze < 2 x 10-6 Torr, Zasilanie pistoletu elektrycznego 7,5 kW, Prąd żarzenia 150-200 mA, Szybkość parowania 2-3 &#197;/sek.</td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>CH Instruments</td><td>660D</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS230</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji dna

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturyzacja procedur analitycznych do mikroskali zapewnia znaczące korzyści w odniesieniu do czasu reakcji, kosztów i integracji etapów wstępnego przetwarzania. Wykorzystanie tych urządzeń do analizy zdarzeń hybrydyzacji DNA jest ważne, ponieważ oferuje technologię oceny biomarkerów w czasie rzeczywistym w miejscu opieki nad pacjentem w przypadku różnych chorób. Jednak wraz ze zmniejszaniem się powierzchni zajmowanej przez urządzenie zwiększa się dominacja różnych zjawisk fizycznych. Zjawiska te wpływają na precyzję wykonania i niezawodność działania urządzenia. Dlatego istnieje ogromna potrzeba dokładnego wytwarzania i obsługi tych urządzeń w powtarzalny sposób, aby poprawić ogólną wydajność. W tym miejscu opisujemy protokoły i metody stosowane do wytwarzania i działania biochipa elektrochemicznego opartego na mikroprzepływach do dokładnej analizy zdarzeń hybrydyzacji DNA. Biochip składa się z dwóch części: mikroprzepływowego chipa z trzema równoległymi mikrokanałami wykonanymi z polidimetylosiloksanu (PDMS) oraz mikrochipa elektrochemicznego o wymiarach 3 x 3. Zdarzenia hybrydyzacji DNA są wykrywane za pomocą analizy elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS). Analiza EIS umożliwia monitorowanie zmian właściwości układu elektrochemicznego, które są dominujące w tych skalach długości. Dzięki możliwości monitorowania zmian zarówno przenoszenia ładunku, jak i oporu dyfuzyjnego za pomocą biosensora, wykazujemy selektywność w stosunku do komplementarnych celów ssDNA, obliczoną granicę wykrywalności 3,8 nM i 13% reaktywność krzyżową z innymi niekomplementarnymi ssDNA po 20 minutach inkubacji. Metodologia ta może poprawić wydajność zminiaturyzowanych urządzeń poprzez wyjaśnienie zachowania dyfuzji w reżimie mikroskali oraz umożliwienie badania zdarzeń hybrydyzacji DNA.

Kontrolowany i precyzyjny proces wytwarzania urządzenia eksperymentalnego jest niezbędny w badaniach. Pozwala on badaczom na uzyskanie powtarzalnych wyników i przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości. W niniejszej pracy zaprezentowano proces mikrofabrykacji biochipu elektrochemicznego opartego na mikroprzepływach, charakteryzujący się wysoką wydajnością i powtarzalnością (Rycina 1). Dzięki niskiej częstotliwości występowania błędów, jedynie w niewielu urządzeniach zaobserwowano problemy z ...

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja wpływu zdarzeń hybrydyzacji DNA na widma impedancyjne za pomocą mikroprzepływowego urządzenia elektrochemicznego. W tym celu wytwarzany jest chip elektrochemiczny, który umożliwia zainstalowanie szeregu czujników elektrodowych, a także wytwarzany jest mikroprzepływowy układ PDMS. Aby ułatwić wprowadzanie próbek o mikroobjętości, oba chipy są ze sobą połączone i funkcjonalizowane za pomocą jednoniciowych sond DNA.Docelowy jednoniciowy DNA jest następnie dodawany po hybrydyzacji DNA, silniejsza siła odpychania między ujemnie naładowanym dwuniciowym DNA a ujemnie naładowanymi cząsteczkami cyjanku cyjanku żelaza powoduje wyższą rezystancję przenoszenia ładunku. Ostatecznie zdarzenia hybrydyzacji DNA można wykryć, mierząc zmiany w widmach impedancji elektrochemicznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak użycie czytnika płytek lub testu z przesunięciem J, jest to, że urządzenia mogą wykonywać tę samą technikę przy małej objętości próbki i za ułamek kosztów, bez poświęcania czułości lub swoistości.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem, wykrywaniu grypy i inżynierii genetycznej, umożliwiając szybkie badanie przesiewowe specyficznych sekwencji DNA i badanie binarnej kinetyki jednoniciowych sekwencji DNA. Ponieważ ta szybka, wysokoprzepustowa metoda analizy hybrydyzacji DNA może być wykonywana przy małej objętości próbki i bez skomplikowanych etapów przygotowania próbki, implikacje tej techniki rozciągają się na naszą diagnostykę zaburzeń genetycznych, różnych form raka lub chorób ze specyficznymi markerami DNA, takich jak grypa. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ rozwój mikrourządzeń wymaga parametrów przetwarzania kontrolnego i iteracyjnego podejścia do rozwiązywania problemów, takich jak wyciek roztworu.Po zmontowaniu urządzenia Aby ułożyć złote elektrody na chipie elektrochemicznym, przytrzymaj pęsetą pustą czterocalową płytkę krzemową najwyższej jakości i użyj butelki do mycia, aby spłukać powierzchnię po obu stronach płytki acetonem, metanolem, a następnie izopropanolem. Proces ten jest dalej określany jako czyszczenie A MI pod strumieniem wody dejonizowanej. Opłucz izopropanol z wafla, a następnie użyj pistoletu do azotu, aby wysuszyć wafel.Załaduj wafel do urządzenia do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionego plazmą lub P-E-C-V-D. Wprowadź parametry, aby uzyskać warstwę dwutlenku krzemu o grubości jednego mikrometra, a następnie rozpocznij zautomatyzowany proces, używając narzędzia do rozpylania prądem stałym, nałóż warstwę chromu o grubości 200 angstremów na płytkę, a następnie nałóż warstwę złota o grubości 2000 stromów. Załaduj wafel na wirówkę, odkurz powierzchnię pistoletem do azotu i za pomocą pipety do pasty nałóż spin PR jeden dodatni spin fotoresist, aby uzyskać jednolitą warstwę o grubości około 1,6 mikrometra.Następnie piecz wafelek przez minutę w temperaturze 100 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Załaduj wafel z fotorezystem do wyrównywania maski. Następnie rozpocznij ekspozycję 190 milidżuli na centymetr kwadratowy przy 405 nanometrach, w której nakładka maski otworzy migawkę i wystawi rezystor fotograficzny na działanie światła przez maskę o zaprojektowanych funkcjach.Po ekspozycji zanurzyć wafel w szklanym naczyniu zawierającym wywoływacz 3 5 2 i inkubować przez 30 sekund, delikatnie wstrząsając. Następnie opłucz wafel pod strumieniem wody i osusz pistoletem do azotu jak poprzednio. Następnie zanurz wafel w szklanym naczyniu zawierającym roztwór do wytrawiania złota i inkubuj przez 1,5 minuty, delikatnie wstrząsając.Następnie przenieś wafel do szklanego naczynia zawierającego wspomniany chrom i inkubuj, delikatnie potrząsając, aż ślady chromu na płytce znikną. Powinno to zająć około 30 sekund. Opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu, trzymając wafel pęsetą.Usuń rezystancję fotograficzną za pomocą procedury czyszczenia MI. Następnie spłucz wodą DI i osusz pistoletem do azotu w dwóch warstwach rękawiczek. Zanurz wafel w naczyniu teflonowym z czystym roztworem piranii na jedną minutę.Następnie opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Obok ułożenia elektrod platynowych załaduj wafel na wirówkę. Odkurz powierzchnię za pomocą pistoletu do azotu i za pomocą pastery, pipety, dozuj PR dwa dodatnie fotorezystu na wirowaniu powierzchni, aby utworzyć jednolitą warstwę o grubości około 1,4 mikrometra.Ułóż wafel na gorącym talerzu w temperaturze 100 stopni Celsjusza i piecz przez minutę. Po wstępnym upieczeniu naświetl wafel na 30 milidżuli na centymetr kwadratowy 405 nanometrów przez maskę fotograficzną. Następnie ułóż wafelek na gorącym talerzu w temperaturze 125 stopni Celsjusza i piecz przez 45 sekund.Zdejmij maskę z maski, nakładki i zalej. Naświetl płytkę o proporcji 1000 milidżuli na centymetr kwadratowy przy długości fali 405 nanometrów bez maski fotograficznej. Po ekspozycji wywołaj płytkę, zanurzając ją w szklanym naczyniu zawierającym sześć do jednego roztworu wywoływacza Z 400 K.Inkubować przez dwie minuty, delikatnie potrząsając. Następnie opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Za pomocą systemu odparowywania wiązką elektronów nałóż warstwę tytanu o grubości 400 angstremów, a następnie warstwę platyny o grubości 1600 angstremów na płytkę.Umieść wafel w szklanym naczyniu wypełnionym acetonem i umieść naczynie w łaźni ultradźwiękowej na pięć minut, aby zdjąć zdjęcie. Oprzyj się następnie trzymaniu wafla pęsetą. Za pomocą butelki do mycia spłucz obie powierzchnie wafla acetonem, a następnie izopropanolem.Opłucz wafel wodą i osusz pistoletem do azotu. Aby przygotować formę do kanałów testowych, wypłucz pustą czterocalową płytkę silikonową o jakości testowej za pomocą procedury czyszczenia MI. Tak jak poprzednio, wypłucz izopropanol z płytki wodą di, a następnie wysusz pistoletem do azotu.Załaduj wafel na wirówkę, odkurz powierzchnię płytki pistoletem do azotu i za pomocą pipety pasti dozuj PR trzy ujemne fotorezystu na powierzchnię, aby utworzyć jednolitą warstwę o grubości około 100 mikrometrów. Umieść wafel na gorącym talerzu, aby wstępnie go upiec w dwuetapowej procedurze pieczenia. Najpierw zwiększ temperaturę z temperatury pokojowej do 65 stopni Celsjusza przy 300 stopniach Celsjusza na godzinę.Następnie trzymaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Zwiększ do 95 stopni Celsjusza w temperaturze 300 stopni Celsjusza na godzinę, a następnie przytrzymaj przez 30 minut. Naświetl płytkę o proporcji 2 500 milidżuli na centymetr kwadratowy przy długości fali 405 nanometrów przez maskę fotograficzną.Następnie umieść wafel na gorącym talerzu i upiecz wafel, zwiększając temperaturę z pokojowej do 95 stopni Celsjusza przy 300 stopniach Celsjusza na godzinę. Trzymaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Zanurz wafel w szklanym naczyniu zawierającym glikol propylenowy, octan eteru monometylowego lub wywoływacz P-G-M-E-A i pozwól mu się rozwinąć przez 10 minut.Opłucz wafel izopropanolem i wysusz pistoletem do azotu, aby wytworzyć kanały testowe, aby znaleźć obudowę wokół płytki formy za pomocą folii aluminiowej i powoli wlej nieutwardzony polidimetylossukonan lub PDMS na formę. Upiecz formę z PDMS w piecu skrzynkowym, stosując dwuetapową procedurę pieczenia, w której temperatura wzrasta z temperatury pokojowej do 80 stopni Celsjusza w ciągu pięciu minut i utrzymuje się na poziomie 80 stopni Celsjusza przez 17 minut. Po ostygnięciu formy oderwij PDMS od formy i umieść na folii aluminiowej.Wytnij wióry testowe nożem chirurgicznym i określ otwory za pomocą narzędzia do wykrawania biopsji, jak pokazano tutaj. Ręcznie wyrównaj kanały testowe PDMS z elektrodami roboczymi na chipie elektrochemicznym. PDMS dobrze przylega do układu elektrochemicznego, uszczelniając kanały i zapobiegając wyciekom.Podłącz elastyczną rurkę do plastikowego kolanka lub prostego łącznika za pomocą krótkiej elastycznej rurki jako adaptera do funkcjonalnej pionowych mikrokanałów. Podłączyć strzykawkę zawierającą jednoniciową sondę DNA do rurki i umieścić ją w pompie strzykawkowej. Przymocuj złącza do każdego z całych dziurkowanych wlotów w urządzeniu.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest przepływ roztworu przez mikrokanały bez generowania pęcherzyków. Aby zapewnić sukces, płyn roztworem bardzo powoli Aby uzyskać jednorodne wypełnienie kanału, zainicjuj pompę z natężeniem przepływu 200 mikrolitrów na godzinę, aby powoli napełniać każdy z trzech oddzielnych mikrokanałów innym roztworem do inkubacji jednoniciowej sondy DNA. Po inkubacji przez godzinę wymienić rurkę strzykawki i łącznik, aby przepłukać mikrokanaliki PBS Następnie wymienić rurkę strzykawki i łączniki, aby napełnić mikrokanał roztworem składającym się z jednego milimolowego sześciomerowego CAPTO jednego H etanolu MCH w 10-milimolowym PBS 100-milimolowym chlorku sodu i 1,395 milimolowym TCEP inkubować przez jedną godzinę.Następnie spłucz PBS jak przed użyciem pęsety. Podnieś PDMS obrócony o 90 stopni do orientacji poziomej i odłóż w dół. Spowoduje to odsłonięcie oddzielnych rzędów komór reakcyjnych, z których każdy będzie zawierał unikalny licznik i elektrodę referencyjną do analizy hybrydyzacji DNA.Wymień, rurki strzykawki i łączniki do wypełnienia mikrokanałów kontrolnym roztworem pomiarowym stężonego buforu SSC z soli fizjologicznej stężonego cytrynianu sodu Forex, inkubować przez 20 minut po inkubacji, wymienić strzykawkę, aby napełnić mikrokanały pięciomilimolowym cyjankiem Ferrisa, pięciomilimolowym cyjankiem Faraona w roztworze PBS. Następnie, aby zarejestrować wartości impedancji tła układu elektrochemicznego dla różnych częstotliwości za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej lub EIS, podłącz statystykę potencjału do licznika roboczego i elektrod referencyjnych za pomocą końcówek sondy. Wprowadź parametry pomiaru EIS do oprogramowania komputerowego, a następnie rozpocznij pomiar.Powtórz ten pomiar dla każdej elektrody roboczej w mikrokanałach, aby zmierzyć hybrydyzację DNA dla każdej niekomplementarnej i komplementarnej wymiany docelowego jednoniciowego DNA. Rurka strzykawki i złącze. Wypełnić mikrokanały czterokrotnie skoncentrowanym buforem SSC zawierającym jeden mikromol docelowego jednoniciowego DNA i inkubować przez 20 minut.Wykonuj pomiary, inicjując pomiar EIS za pomocą oprogramowania na komputerze dla każdego docelowego roztworu jednoniciowego DNA w celu walidacji aktywności elektrochemicznej cyklicznego vol bio chipp. Pomiary telemetryczne wykonano w mikrokanałach wypełnionych elektroaktywnym redoks Para cyjanku cyjanku pokazana tutaj to cykliczne telegramy objętościowe dziewięciu elektrod roboczych. Podobny kształt, wysokości pików i separacja pików dla wszystkich elektrod wykazują wysoką odtwarzalność, aby zademonstrować zdolność biochipów do wykrywania zdarzeń hybrydyzacji DNA.Zmierzono zmiany impedancji elektrochemicznej dla zdarzeń hybrydyzacji między trzema jednoniciowymi sondami DNA a ich uzupełniającymi i niekomplementarnymi jednoniciowymi celami DNA, zaobserwowano wyższe zmiany rezystancji przenoszenia ładunku, gdy wprowadzono uzupełniający jednoniciowy cel DNA i zhybrydyzowano go z sondą, w porównaniu z wprowadzeniem nieuzupełniających jednoniciowych celów DNA w celu wykazania czułości bioczujnika. Do sondy detekcyjnej wprowadzono różne stężenia komplementarnego celu jednoniciowego DNA, pokazany tutaj jest wykres nyquista pomiarów elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej po wprowadzeniu rosnących docelowych stężeń jednoniciowego DNA wskazanych strzałką na wykresie. Zwiększone wartości impedancji zaobserwowano przy niskich częstotliwościach około 15 Hz dla wyższych docelowych, jednoniciowych stężeń DNA ze względu na silniejsze siły odpychające między dwuniciowym DNA a cząsteczkami cyjanku żelazocyjanku.Ogólnie rzecz biorąc, projekt BIOCHIPS wykazuje zdolność do szybkiego wykrywania obecności zdarzeń hybrydyzacji DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować i wyprodukować mikroprzepływowe urządzenie elektrochemiczne i używać go do wykrywania zdarzeń hybrydyzacji DNA. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji różnych parametrów bios, takich jak stosunek sygnału do pielęgniarki, stabilność i czułość Zgodnie z tą procedurą.Inne metody, takie jak wprowadzanie jednoniciowych celów DNA z nieco innymi sekwencjami kwasów nukleinowych, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak kombinacja mutacji DNA i konkurencja. Nie zapominaj, że praca z rozwiązaniami procesowymi mikroprodukcji może być niezwykle niebezpieczna, a ochrona ciała, oczu i rąk powinna zawsze ostrzegać podczas wykonywania tej procedury.

a-microfluidic-based-electrochemical-biochip-for-label-free-dna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

W tym filmie analizujemy rozkład wielkości bezkomórkowego DNA lub fragmentów cfDNA za pomocą automatycznej elektroforezy kapilarnej. Technika ta pomaga uzyskać wgląd w profil fragmentów DNA uwalnianych przez komórki nowotworowe podczas apoptozy.

Zautomatyzowana analiza rozkładu wielkości fragmentów cfDNA oparta na elektroforezie kapilarnej: metoda oparta na mikroprocesorze DNA do badania rozkładu wielkości fragmentów DNA wyizolowanych z płynów biologicznych

Ten film demonstruje cyfrowy PCR oparty na chipie — odmianę techniki cyfrowego PCR, która jest przydatna w wykrywaniu rzadkich wariantów transkryptu. Reakcja PCR jest podzielona na komory nanofluidycznego chipa, z których każdy działa jak niezależna reakcja. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych z komór ze wzmocnionymi celami potwierdza obecność w próbce rzadkich wariantów transkryptu.

Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Poznaj mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej detekcji hybrydyzacji DNA. Urządzenie wykrywa cele DNA z granicą detekcji 3,8 nM poprzez pomiar zmian impedancji elektrochemicznej.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Przeglądaj więcej filmów