Name: In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo do transfekcji komórek jądrowych. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę genów w badaniach spermatogenezy i funkcji jądra.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Birgit Westernstroeer z Centrum Medycyny Rozrodu i Andrologii na Uniwersytecie w Münster za nauczanie mikroiniekcji jąder. Poza tym jesteśmy wdzięczni Ursuli Antkewitz i Petrze Reckling za pomoc techniczną. Dziękujemy Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za wsparcie tych prac (WE2458/10-1).

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Meklemburgia-Pomorze Przednie, Niemcy).
1. Przygotowanie plazmidu
<ol>
	<li>Do przygotowania plazmidu należy użyć zestawów do oczyszczania plazmidu (patrz tabela materiałów) lub podobnych metod z buforem do usuwania endotoksyn, aby uniknąć reakcji immunologicznych zwierzęcia. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji. Zastosować ddH2O do rozcieńczenia roztworu plazmidu.</li>
	<li>Wyeliminuj zanieczyszczenia, obracając roztwór DNA z maksymalną prędkością (20 000 x g). Następnie zbierz supernatant.</li>
	<li>Określić stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru (patrz materiały).</li>
	<li>Dostosuj stężenie plazmidu za pomocą ddH2O do 1-3 μg(DNA)/μl. Uwaga: Niższe stężenia zmniejszą wydajność transfekcji, podczas gdy wyższe stężenia mogą spowodować zbyt lepki roztwór do wstrzykiwań. Poza tym skuteczność transfekcji zależy od wielkości plazmidu i musi być testowana indywidualnie.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy przygotować roztwór zawierający np. 40 μl plazmidu wraz z 5 μl PBS (10x) i 5 μl Fast Green (0,5%). Fast Green jest potrzebny do śledzenia procesu wstrzykiwania. Najlepiej używać cienkościennych probówek PCR lub Parafilm. Uwaga: W zależności od wielkości jądra, na każde jądro potrzebna będzie objętość 20-50 μl. </li>
</ol>
2. Przygotowanie pipety do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Do przygotowania pipet do mikroiniekcji należy użyć kapilar borokrzemianowych (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Pociągnij szklane kapilary za pomocą pionowego ściągacza kapilarnego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przełam końcówkę kapilary kleszczami, delikatnie opatrując. Końcówka ma zwykle średnicę 50-80 μm i około 1 cm długości. Staraj się unikać zbyt długich końcówek, ponieważ nie są one wystarczająco sztywne, aby przebić się przez tkankę.</li>
	<li>Na koniec naostrz końcówkę pod kątem od 30° do 45° za pomocą ukosowarki do mikropipet (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Załadować pipetę do mikroiniekcji mieszanką roztworu do wstrzykiwań (patrz Przygotowanie plazmidu). Nanieść roztwór na tylną część szklanej kapilary za pomocą małej strzykawki. Uwaga: Staraj się unikać pęcherzyków powietrza podczas ładowania, w przeciwnym razie zostaną one wstrzyknięte do kanalików nasiennych wraz z roztworem plazmidu, a tym samym zmniejszą przewodność, a także mogą spowodować uszkodzenie tkanek.</li>
</ol>
3. Anestezjologia i chirurgia
<ol>
	<li>Operację należy wykonać w warunkach aseptycznych przy użyciu sterylnego materiału (tj. strzykawki, igły, narzędzi chirurgicznych itp.). Zmniejszy to zakażenie zwierzęcia i zapewni dobre wskaźniki przeżycia.</li>
	<li>Użyj samców myszy do elektroporacji w wieku 6-8 tygodni.</li>
	<li>Aby rozpocząć pooperacyjne leczenie przeciwbólowe, podaj myszce leki przeciwbólowe z dodatkiem wody pitnej w dniu poprzedzającym zabieg. Zapewnia to działanie przeciwbólowe prewencyjne w przypadku wysoce prawdopodobnej hipodypsji pooperacyjnej (zmniejszonego spożycia wody). W tym celu należy naświetlić wodę pitną, na przykład zawiesinę ibuprofenu dla dzieci (20 mg/ml). Woda do picia z lekiem powinna być również dostarczana w pierwszym i drugim dniu rekonwalescencji w identycznym stężeniu. Oznacza to dzienną dawkę 7,5 mg/kg, ważną dla 5 ml/d wody pitnej i masy ciała 25 g dla 8 tygodni w wieku C57BL/6J. Ten schemat przeciwbólowy gwarantuje fundamentalną ulgę w bólu i przyspieszony powrót do zdrowia, a także wysoki poziom dobrostanu26.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu roboczego do znieczulenia w dniu zabiegu należy zmieszać 10% ketaminy i 2% ksylazyny w stosunku 1:1 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Aby znieczulić zwierzę, należy zastosować podskórnie 0,25 ml/100 mg roztworu znieczulającego (Ketamin = 0,125 g/kg; Ksylazyna = 0,025 g/kg). Należy użyć miejsca wstrzyknięcia między miednicą a kończyną, aby zapobiec uszkodzeniom narządów i urazom myszy. Zwykle potrzeba 10 minut, aż mysz zostanie głęboko znieczulona.</li>
	<li>Zakryj oczy myszy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przetestuj zatrzymanie głębokiego znieczulenia, które jest zauważalne przez całkowity brak odpowiedzi. W tym celu wystarczy uszczypnąć palec u nogi zwierzęcia.</li>
	<li>Aby rozpocząć zabieg, usuń włosy z brzucha za pomocą golarki elektrycznej lub podobnego i zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą sterilium lub podobnego narzędzia.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie brzuszne bezpośrednio nad gruczołami napletkowymi w środku okolicy brzucha. W tym miejscu najpierw odciągnij skórę i przeprowadź małe poprzeczne cięcie skóry o długości około 8-14 mm. Następnie kontynuuj wzdłuż warstwy mięśniowej brzucha. 
	Uwaga: Zmiana powinna być jak najmniejsza, aby zmniejszyć szkody dla zwierzęcia.</li>
	<li>Ostrożnie podciągnij poduszeczki tłuszczowe w jamie brzusznej, aby odsłonić przyczepione jądro i umieść je na wcześniej przygotowanej wodoodpornej jednorazowej papierowej serwety tuż obok miejsca nacięcia (ryc. 2A).</li>
	<li>Użyj lornetki, aby znaleźć przewód odprowadzający jako cel wstrzyknięcia. Przewód odprowadzający jest identyfikowany jako cienkie połączenie naczynia między jądrem a najądrzem. Znajduje się w sąsiedztwie wydatnej tętnicy jądra. Przewód biegnie prawie pod kątem 45° do tętnicy i widocznie wchodzi w najądrza najądrza. Uwaga: W zależności od wieku myszy, przewód jest zwykle zakopany w tkance tłuszczowej.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby oczyścić przewód odprowadzający z tej tkanki tłuszczowej. Następnie umieść uwolniony przewód na sterylnym pasku papieru, aby zapewnić wyraźną widoczność przewodu bez pogarszania otoczenia.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja i aplikacja DNA
<ol>
	<li>Podłączyć pipetę do mikroiniekcji, która jest załadowana roztworem plazmidu, do mikromanipulatora/zespołu iniektora.</li>
	<li>Umieścić igłę do mikroiniekcji równolegle do przewodu odprowadzającego z końcówką skierowaną w stronę jądra rete (ryc. 2B).</li>
	<li>Użyj cienkiej pęsety i zdejmij rurkę z pipety do mikroiniekcji. Upewnij się, że kapilar jest trzymany równolegle do kanału, jednocześnie go przeciągając. 
	Uwaga: Ta procedura jest wygodniejsza niż penetracja naczynia poprzez przesuwanie igły za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Ostrożnie skieruj igłę w stronę jądra i zatrzymaj się w momencie, gdy wnika w jądro rete bezpośrednio pod osłonką białawą (ryc. 2C). 
	Uwaga: W przypadku nadmiernego sięgnięcia jądra rete, roztwór plazmidu przecieknie do przestrzeni śródmiąższowej. Prowadzi to często do niepowodzenia transfekcji kanalików nasiennych.</li>
	<li>Do wstrzykiwania roztworu plazmidu należy użyć mikroiniektora o następujących ustawieniach: pi: 100 hPa, ti: 0,2 s i pc: 0 hPa (rysunek 2D).</li>
	<li>Monitoruj cały proces wstrzykiwania, obserwując stan wypełnienia jąder za pomocą zielonego koloru. Uważaj, aby jądro było wypełnione roztworem plazmidu tylko do 2/3 swojej objętości (ryc. 2E). 
	Uwaga: Jeśli objętość wstrzyknięcia zostanie przekroczona, tkanka jądra może zostać uszkodzona.</li>
</ol>
5. Elektroporacja jądra
<ol>
	<li>Aby umożliwić skuteczną elektroporację, zanurz elektrody pęsety w PBS (1x). Zapewnia to odpowiednią przewodność.</li>
	<li>Płynnie ściśnij jądro między mokrymi elektrodami (rysunek 2F). Zmierz rezystancję elektryczną za pomocą elektroporatora.</li>
	<li>Przyłóż prąd do jądra. Wykonaj osiem impulsów kwadratowych 40 V w 4 różnych miejscach jąder o stałym czasie trwania 50 ms czasu impulsu i 950 ms interwału.</li>
</ol>
6. Zamykanie ran i leczenie pooperacyjne
<ol>
	<li>Po zakończeniu elektroporacji umieść jądro z powrotem w pierwotnym miejscu.</li>
	<li>Zszyj wewnętrzną warstwę mięśniową szwem chirurgicznym (patrz materiały).</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą klipsów do szwów (patrz tabela materiałów). Podciągnij skórę pęsetą. Upewnij się, że wykluczyłeś warstwę mięśniową. Umieść klipsy, każdy w odległości nie większej niż 5 mm. 
	Uwaga: Ponieważ szew chirurgiczny może zostać połknięty przez mysz, klipsy do szwów są preferowane do zamykania zmiany skórnej.</li>
	<li>Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu na sterylnych ręcznikach papierowych umieszczonych w sterylnej, pustej klatce dla myszy, która jest hartowana na ciepłej podkładce o temperaturze 37 °C. Podkładka powinna zapewniać ogrzanie jednej połowy klatki, tworząc gradient ciepła. Dla zwierzęcia umożliwia to poszukiwanie indywidualnego, najbardziej komfortowego miejsca ze względu na różnorodność temperatur w klatce. Dodatkowo przykryj mysz arkuszem sterylnego ręcznika papierowego, aby jeszcze bardziej zmniejszyć stres. Uwaga: Ponieważ powierzchnia ciała myszy jest niezwykle wysoka w stosunku do masy ciała, w porównaniu z większymi zwierzętami, wsparcie termiczne ma szczególne znaczenie dla pomyślnej regeneracji gryzoni.</li>
	<li>Gdy operowane zwierzę w pełni się obudzi, przenieś je w celu dalszego powrotu do zdrowia do całkowicie wyposażonej nowej klatki dla myszy. Nie umieszczaj zwierzęcia z powrotem w starej klatce lub w grupie myszy. Upewnij się, że klatka jest tak czysta i sterylna, jak to tylko możliwe, aby zapobiec zakażeniu rany. Monitoruj cały proces odzyskiwania. Aby przenieść mysz z powrotem do placówki opieki nad zwierzętami, poczekaj, aż w pełni wyzdrowieje i zacznie zachowywać się normalnie. 
	Uwaga: Dodatkowe strategie per- i pooperacyjne zostały omówione przez Pritchetta-Corninga KR i wsp.6.</li>
</ol>

<ol><li>Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fact+or+fiction%3A+In+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Fact or fiction: In vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).</li>
<li>Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+in+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Models of in vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).</li>
<li>Zizzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+indicator+of+nonviral+transient+transfection+efficiency+in+endometrial+and+testicular+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).</li>
<li>Williams, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+genes+into+tissues+of+living+mice+by+DNA-coated+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).</li>
<li>Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((statistics%2C+and+energetics+of+lipid+membrane+electroporation+studied+by+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations.</a> Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li>
<li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).</li>
<li>Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+transplantation%3A+an+experimental+approach+with+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective.</a> Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), (2007).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), (2011).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+developing+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of developing mouse retina.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporated+transgene-rescued+spermatogenesis+in+infertile+mutant+mice+with+a+sertoli+cell+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect.</a> Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).</li>
<li>Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrase+facilitates+long-lasting+foreign+gene+expression+in+vivo+in+mouse+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).</li>
<li>Umemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+mouse+testes+by+electroporation+and+its+influence+on+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis.</a> J. Androl. 26, 264-271 (2005).</li>
<li>Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+the+mouse+testis+by+localized+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).</li>
<li>Hibbitt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+by+electroporation+allows+expression+of+a+fluorescent+transgene+in+hamster+testis+and+epididymal+sperm+and+has+no+adverse+effects+upon+testicular+integrity+or+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality.</a> Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).</li>
<li>Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+mouse+spermatogenic+cells+using+green+fluorescent+protein+as+a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a.</a> J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).</li>
<li>Dhup, S., Majumdar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+via+permanent+integration+of+genes+in+repopulating+spermatogonial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+of+testicular+germ+cells+and+transgenesis+by+using+the+mitochondrially+localized+jellyfish+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene.</a> FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).</li>
<li>Majumdar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+generation+of+transgenic+animals+to+evaluate+testis+genes+during+sexual+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation.</a> J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+germinal+stem+cells+by+ectopically+expressed+human+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells.</a> Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).</li>
<li>Ike, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+analysis+of+the+mouse+ornithine+decarboxylase+antizyme+haploid-specific+promoter+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation.</a> FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+RNAi+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29(2008).</li>
<li>Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+lactate+dehydrogenase+C+%28Ldhc%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression.</a> Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).</li>
<li>Yomgogida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+testis%3A+a+target+of+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mammalian testis: a target of in vivo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).</li>
<li>Hayes, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Evaluation+of+Analgesic+Regimens+for+Abdominal+Surgery+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).</li>
</ol>

Marten Michaelis, Alexander Sobczak i Joachim M. Weitzel zatrudnieni w Instytucie Biologii Rozrodu Instytutu Biologii Zwierząt Gospodarskich im. Leibniza (FBN) w Dummerstorf w Niemczech oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badania w dziedzinie biologii rozrodu, szczególnie w dziedzinie płodności męskiej i spermatogenezy, nieuchronnie opierają się na organizmach żywych. W celu zbadania funkcji jąder nie ustalono odpowiedniej hodowli komórkowej/systemu in vitro, który byłby w stanie odzwierciedlić wszystkie istotne zmiany morfologiczne od diploidalnego spermatogonium do haploidalnego dojrzałego plemnika1,2. W związku z tym wytwarzanie genetycznie modyfikowanych zwierząt jest często koniecznym i jako takie...

Spermatogeneza ssaków jest uważana za wyrafinowany proces samoodnawiających się komórek macierzystych, które kolejno przechodzą mitozę, mejozę i różnicowanie, aby przekształcić się w dojrzałe haploidalne plemniki. Te zmiany morfologiczne są koordynowane przez różne typy komórek i pomimo głębokich prób nadal niemożliwe jest naśladowanie tych procesów w hodowli komórkowej1,2. W związku z tym dotychczasowe badania nad spermatogenezą opierają się na organizmach żywych jako modelach in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, badania funkcji genów są zwykle oparte na zwierzętach transgenicznych. Jednak generowanie i utrzymywanie tego rodzaju modelu zwierzęcego jest czasochłonne, kosztowne i dość skomplikowane. Przypisuje się to wymaganemu długiemu procesowi hodowlanemu do wytworzenia i utrzymania transgenu przez pokolenia. Dodatkowo, manipulacja genetyczna całego organizmu za pomocą podejścia transgenicznego lub knockout jest podatna na powodowanie zaburzeń fizjologicznych, gdy celuje w geny o podstawowych funkcjach w wielu regionach, np. poza jądrem lub ogólnoustrojowo.
Ponadto, niektóre metody transfekcji przejściowej wiążą się z pewnymi istotnymi wadami. Na przykład typowymi wadami transferu genów za pośrednictwem wirusa są możliwe prowokowanie reakcji immunologicznych i dodatkowe przepisy bezpieczeństwa, podczas gdy lipofekcja3 i bombardowanie mikrocząsteczkami4 mogą uszkodzić tkankę i są ograniczone do określonej głębokości komórki, aby zapewnić wystarczającą skuteczność transfekcji.
Natomiast elektroporacja (EP) jako kolejny powszechny sposób transfekcji przejściowej, wydaje się stanowić obiecującą technikę umożliwiającą transfekcję in vivo i konsekwentną analizę genów in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, EP jest określany jako zjawisko dynamiczne, które zależy od lokalnego napięcia transbłonowego, w którym w konsekwencji w ciągu nanosekund zapośredniczone są pory. Przerwy te mogą być utrzymywane przez milisekundy, co wystarcza do zapewnienia dostępu do DNA, RNA lub małych cząsteczek5. Gdy przyłożone napięcie jest zbyt wysokie, zwykle przejściowy charakter EP jest niwelowany z powodu wytwarzania ciepła i indukcji zbyt szerokiej przepuszczalności, co w konsekwencji prowadzi do nieodwracalnego uszkodzenia ogniwa5.
Tutaj pokazujemy, że elektroporacja to skuteczny i ekonomiczny system transfekcji, który może być wykorzystany do genetycznej transformacji jąder w celu wyjaśnienia cech genów jąder in vivo. W artykule omówiono preparację plazmidu, mikroiniekcję przez przewód odprowadzający i późniejszą elektroporację jąder myszy. Procedura ta może być sposobem z wyboru w celu uzyskania szybkiej, specyficznej i wydajnej transfekcji kanalików nasiennych jąder myszy in vivo w celu zbadania procesów spermatogenezy.

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>pionowy ściągacz kapilarny</td></tr><tr><td>Kapilary mikroiniekcyjne</td><td>Clark</td><td>GC100-10</td><td>borokrzemian o standardowej ściance</td></tr><tr><td>Ukosowanie do mikropipet</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td> tarcza <td>obrotowa ukosownik</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>elektroporator prostokątny</td></tr><tr><td>Elektrody pęsetowe</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 mm i elektrody tarczowe Oslash;</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>Pompa mikroiniekcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>stół krzyżowy XYZ</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>FST</td><td></td><td>nożyczki, kleszcze, uchwyt na igłę</td></tr><tr><td>Szczypce drobne</td><td>FST</td><td>Dumont #5, #7</td><td>przygotowanie kanałów odprowadzających</td></tr><tr><td>Klips Michela do stosowania zszywacza</td><td>FST</td><td>Michel, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Michel klipsy do szwów</td><td>FST</td><td>Michel, 12040-01</td><td>7,5 x 1,75 mm</td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny</td><td>Catgut, Markneukirchen, Niemcy</td><td>Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą 30 G</td><td>B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>do ładowania mikropipety i do znieczulenia</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidu</td><td>Promega</td><td>Kat. # A2495</td><td>plazmid Midiprep</td></tr><tr><td>Plazmid pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>Kat. #6084-1</td><td>Promotor CMV + EGFP</td></tr><tr><td>Plazmid pDsRed2-N1</td><td>Clontech</td><td>Kat. #6084-1</td><td>Promotor CMV + DsRed2</td></tr><tr><td>Fast Green barwnik</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>do rozcieńczania w ddH2O</td></tr><tr><td>10% Ketamina</td><td>Serum Werk, Bernburg, Niemcy</td><td>Mieszanka urotaminy</td><td>w stosunku 1:1 z ksylazyną</td></tr><tr><td>2% Xylazine</td><td>Serum Werk, Bernburg, Niemcy</td><td>Mieszanka ksylazyny</td><td>w stosunku 1:1 z ketaminą</td></tr><tr><td>Sterilium</td><td>Bode Chemie</td><td>Dezynfekcja Sterillium</td><td></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna</td><td>S& K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%,</td><td>maść okulistyczna Augensalbe zapobiegająca suchości oczu</td></tr><tr><td>Jodek To-Pro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>10x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>1,37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, Dolormin</td><td>Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany</td><td>01094902</td><td>przeciwbólowe rozwiązanie pediatryczne (NLPZ) do łagodzenia bólu pooperacyjnego</td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Ten film i artykuł zawierają wyczerpujący opis mikroiniekcji i elektroporacji jąder myszy in vivo. Ta szczególna technika transfekcji komórek jąder myszy pozwala na badanie unikalnych procesów w spermatogenezie.
Następujący protokół skupia się na transfekcji komórek jąder myszy za pomocą konstruktów plazmidowych. W szczególności użyliśmy wektora reporterowego pEGFP-C1, który wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP), a także wektora pDsRed2-N1 wyrażającego białko czerwonej fluorescencji (DsRed2). Oba kodowane geny reporterowe znajdowały się pod kontrolą ludzkiego promotora wirusa cytomegalii (CMV).
W celu przeprowadzenia transferu genów do jąder myszy, konstrukty plazmidu reporterowego są wstrzykiwane do jąder żywych myszy. W tym celu odsłania się jądro znieczulonego zwierzęcia i przygotowuje miejsce mikroiniekcji. Preferowanym miejscem wstrzyknięcia jest przewód odprowadzający, z ostatecznie połączonym jądrem rete jako anatomiczną drogą transportową plemników między jądrem a najądrzem. W ten sposób wypełnienie kanalików nasiennych po mikroiniekcji jest doskonale zarządzane i kontrolowane dzięki zastosowaniu barwionych roztworów DNA. Po zaobserwowaniu wystarczającego wypełnienia jądra przez jego kolorową strukturę kanalików, narząd jest elektroporowany. Umożliwia to przeniesienie roztworu DNA do komórek jąder. Po 3 dniach inkubacji jądro jest usuwane i badane pod mikroskopem pod kątem zielonej lub czerwonej fluorescencji, co ilustruje sukces transfekcji.
Generalnie, ten protokół może być wykorzystany do dostarczania konstruktów DNA lub RNA do żywych jąder myszy w celu (nadmiernej) ekspresji lub zniszczenia genów, ułatwiając analizę funkcji genów in vivo. Ponadto nadaje się do badania konstruktów reporterowych lub przypuszczalnych elementów regulatorowych genów. Tak więc głównymi zaletami techniki elektroporacji są szybkie działanie w połączeniu z niewielkim wysiłkiem, a także umiarkowany sprzęt techniczny i umiejętności wymagane w porównaniu z technikami alternatywnymi.

Ustawienie eksperymentalne do przeprowadzania mikroiniekcji i elektroporacji jądra myszy in vivo, stosowane zgodnie z protokołem, przedstawiono na Rysunku 1. Pomimo możliwości zakupu przemysłowo produkowanych mikropipet, zdecydowaliśmy się wytwarzać własne pipety poprzez wyciąganie (Rysunek 1A) i szlifowanie (Rysunek 1B) kapilar szklanych, aby były one dostosowane do naszych potrzeb. Wyposażenie do mikroiniekcji i elektroporacji przedstawiono na Rysunku ...

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Celem tej procedury jest wykonanie mikroiniekcji konstruktów genetycznych do jądra myszy, a następnie elektroporacja InVivo. Pozwala to na przeprowadzenie kompleksowej analizy genów z naciskiem na spermatogenezę i funkcję jąder. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie dostępu do jądra przez nacięcie brzucha bezpośrednio nad gruczołami PrepU.Drugim krokiem jest przygotowanie przewodu odprowadzającego z jądrem do mikroiniekcji poprzez uwolnienie naczynia z jego tkanki tłuszczowej. Następnie przewód laryngologiczny nakłuwa się załadowaną pipetą do mikroiniekcji, a roztwór konstruktu genetycznego barwienia podaje się do kanalików żelaznych jąder. Ostatnim krokiem jest wielostronna transfekcja elektroporacji jądra.Ostatecznie transfekowane jądro jest ekstrahowane po trzech dniach w celu oceny transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub pomiarów luminometru, w zależności od wykorzystanych zgłoszonych konstruktów genów. To połączenie techniki mikroiniekcyjnej techniki operacyjnej intelektu dla jąder myszy jako przejściowych metod transfekcji z pewnością zapewni wiele zalet w porównaniu z istniejącymi podejściami, takimi jak zwierzęta transgeniczne lub myszy z nokautem. Zapewni

in-vivo-microinjection-and-electroporation-of-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

Opisujemy szczegółowe procedury wydajnej transfekcji plazmidowego DNA do włókien mięśni stop żywych myszy z wykorzystaniem elektroporacji oraz następującej po niej wizualizacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół oceny integralności bariery krew-jądro poprzez wstrzykiwanie inuliny-FITC do jąder. Jest to skuteczna metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro, która może być zagrożona przez elementy genetyczne i środowiskowe.

Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Poznaj mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo do transfekcji komórek jądrowych. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę genów w badaniach spermatogenezy i funkcji jądra.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Przeglądaj więcej filmów