In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

Celem tej procedury jest wykonanie mikroiniekcji konstruktów genetycznych do jądra myszy, a następnie elektroporacja InVivo. Pozwala to na przeprowadzenie kompleksowej analizy genów z naciskiem na spermatogenezę i funkcję jąder. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie dostępu do jądra przez nacięcie brzucha bezpośrednio nad gruczołami PrepU.

Drugim krokiem jest przygotowanie przewodu odprowadzającego z jądrem do mikroiniekcji poprzez uwolnienie naczynia z jego tkanki tłuszczowej. Następnie przewód laryngologiczny nakłuwa się załadowaną pipetą do mikroiniekcji, a roztwór konstruktu genetycznego barwienia podaje się do kanalików żelaznych jąder. Ostatnim krokiem jest wielostronna transfekcja elektroporacji jądra.

Ostatecznie transfekowane jądro jest ekstrahowane po trzech dniach w celu oceny transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub pomiarów luminometru, w zależności od wykorzystanych zgłoszonych konstruktów genów. To połączenie techniki mikroiniekcyjnej techniki operacyjnej intelektu dla jąder myszy jako przejściowych metod transfekcji z pewnością zapewni wiele zalet w porównaniu z istniejącymi podejściami, takimi jak zwierzęta transgeniczne lub myszy z nokautem. Zapewnia szybką wydajność, niski koszt i potrzebę umiarkowanych umiejętności technicznych.

Miejmy nadzieję, że to podejście metodologiczne może przyczynić się do rozwoju dostępnych technik w dziedzinie badań nad płodnością męską. Może to być zasadniczo pomocne w rozwiązywaniu szerokiego spektrum problemów dotyczących eksperymentalnych narządów płciowych i procesów płodności. Byłoby to szczególnie możliwe w przypadku zastosowania tej metody do analizy genetycznej w postaci eksperymentów z uzyskaniem wszystkich utraconych funkcji.

Przypuszczalnie będzie on również bardzo przydatny do badania elementów regulatorowych, np. genów specyficznych dla spermatogenezy. Aby rozpocząć procedurę, znieczulij sześcio- do ośmiotygodniowego samca myszy mieszanką 10% ketaminy i 2% ksylazyny podskórnie jeden do jednego. Następnie upewnij się, że mysz jest w głębokim znieczuleniu poprzez szczypanie palców u stóp.

Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie usuń włosy na brzuchu za pomocą golarki elektrycznej, a następnie zdezynfekuj obszar operacyjny. Wykonaj nacięcie brzuszne bezpośrednio nad gruczołami PrepU w środku obszaru brzucha.

W tym celu pociągnij skórę i przeprowadź małe poprzeczne cięcie skóry. Następnie kontynuuj wzdłuż warstwy mięśniowej brzucha. Ostrożnie podciągnij poduszeczki tłuszczowe w jamie brzusznej, aby odsłonić przyczepione jądro i umieść je na sterylnym papierze na brzuchu.

Następnie użyj mikroskopu stereoskopowego, aby znaleźć kanał laryngologiczny do mikroiniekcji. Jest to cienkie połączenie naczyniowe między jądrem a najądrzem i znajduje się w sąsiedztwie tętnicy jądra. Usuń tkankę tłuszczową pokrywającą przewód laryngologiczny za pomocą cienkich kleszczyków.

Następnie umieść przewód spustowy na sterylnym pasku papieru, upewniając się, że przewód jest dobrze widoczny bez uszczerbku dla otoczenia. Następnie podłącz pipetę do mikroiniekcji, która została wcześniej załadowana kolorowym roztworem plazmidu, do zespołu iniektora mikromanipulatora. Następnie umieść igłę do mikroiniekcji równolegle do kanału EENT z końcówką skierowaną w stronę jądra REIT.

Następnie za pomocą cienkiej pęsety zdejmij rurkę z pipety do mikroiniekcji. Upewnij się, że pipeta jest trzymana równolegle do kanału podczas przeciągania jej. Ostrożnie skieruj igłę w stronę jądra i zatrzymaj się w momencie, gdy wniknie ona w jądro REIT bezpośrednio pod osłonką białawą.

Następnie ustaw parametry mikrowtryskiwacza. Następnie należy rozpocząć wstrzykiwanie roztworu konstruktu genu. Monitoruj cały proces wstrzykiwania, obserwując stan wypełnienia jądra.

Za pomocą kolorowego roztworu plazmidu zbuduj jądro tylko do dwóch trzecich jego objętości. Aby umożliwić skuteczną elektroporację. Zanurz elektrody pęsety w jednorazowym PBS, aby zapewnić odpowiednią przewodność.

Następnie ściśnij test lekko między mokrymi elektrodami i zmierz opór elektryczny za pomocą elektro parata. Następnie ustaw elektryczność odpowiednio, upewniając się, że prąd może być doprowadzony do jądra o łącznej liczbie ośmiu impulsów kwadratowych. W czterech różnych miejscach jąder wykonaj elektroporację kompleksowo wokół całego jądra.

Po zakończeniu elektroporacji umieść jądro z powrotem w jamie brzusznej jak najbliżej jego pierwotnego położenia. Tak więc wewnętrzna warstwa mięśniowa była wchłanialnym szwem chirurgicznym. Następnie zamknij skórę klipsami do szwów.

Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu. W sterylnym pudełku podgrzanym na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, przygotowanym z papierowymi ręcznikami. Podkładka powinna zapewniać ogrzanie tylko jednej połowy klatki, tworząc gradient ciepła.

Dodatkowo przykryj mysz kolejnym arkuszem ręcznika papierowego, aby jeszcze bardziej zmniejszyć stres. Po całkowitym obudzeniu zwierzęcia przenieś je do nowej, czystej, w pełni wyposażonej klatki. Ale dalej rekonwalescencja, monitoruj proces odzyskiwania, aż w końcu zwrócisz mysz do obiektu dla zwierząt.

Ten rysunek pokazuje całe jądra Mount trzy dni po elektroporacji in vivo przez detekcję fluorescencyjną, transfekowane jądra myszy C 57 black six wykazują wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub czerwone białko fluorescencyjne. Oto wycinki histologiczne jądra. Trzy dni po jednostronnej elektroporacji PE eeg, FPC one, transfekowane komórki jajowodów seminiferalnych są zilustrowane zieloną fluorescencją, wraz z ich typową sferycznie zorganizowaną strukturą.

Ich jądra były przeciwbarwione dwoma pro trzema w kolorze niebieskim. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że procesy identyfikacji przewodu laryngologicznego i uwalniania przez niego tkanki tłuszczowej są dość wyrafinowane. Dlatego możesz najpierw ćwiczyć na martwym zwierzęciu, zanim osiągniesz prawdziwe doświadczenie in vivo.

Po przeprowadzeniu elektroporacji mikroiniekcyjnej i końcowym zbiorze testowym, możliwe jest wykonanie wielu technik, takich jak statek Q-R-T-P-C-R i Western blotting. W związku z tym xining genu testowego to wzorce ekspresji białek, a także modyfikacje potranslacyjne są oczywiste. Tak więc za pomocą tych narzędzi można zaatakować wiele różnych tematów, takich jak na przykład spermatogeneza wraz z jej podstawowymi złożonymi mechanizmami i regulacjami.