Name: Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Naucz się izolować komórki zrębu węzłów chłonnych myszy przy użyciu trawienia enzymatycznego i dysagregacji mechanicznej. Ta metoda zachowuje żywotność komórek i ekspresję markerów powierzchniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sanjiv Lutherowi i kolegom za pomocne dyskusje w ustaleniu obecnego protokołu trawienia węzłów chłonnych. Prace te były wspierane przez granty SNF PPOOA-_119204 oraz PPOOP3_144918 dla S.W.R.

W tej publikacji wideo i protokole, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Urząd Kantonalny Bazylea-Miasto, Szwajcaria.
1. Przygotowanie i trawienie węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Podgrzej wodę w zlewce do temperatury 37 °C na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zasadową w następujący sposób: pożywka DMEM (bez pirogronianu) uzupełniona 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 i Pen/Strep (100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny).</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne przed użyciem.</li>
	<li>Poddaj eutanazji myszy dawcy węzłów chłonnych po uduszeniu CO2 i aseptyczne wypreparowanie węzłów chłonnych. Nie rozcinaj otaczającego tłuszczu. UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem obwodowych węzłów chłonnych drenujących skórę (pachwinowych, ramiennych, pachowych).</li>
	<li>Umieść węzły chłonne na sterylnej szalce Petriego zawierającej 2 ml lodowatego podłoża zasadowego.</li>
	<li>Rozbić kapsułkę węzłów chłonnych za pomocą dwóch igieł 25 G przymocowanych do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przenieść przerwaną tkankę węzłów chłonnych w 5 ml polipropylenowej probówce okrągłodennej zawierającej 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 1 mg/ml kolagenazy IV i 40 μg/ml DNAzy I.</li>
	<li>Dodaj jedno sterylne mieszadło magnetyczne do każdej probówki.</li>
	<li>Umieścić probówkę w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C i mieszać probówki powoli (1 runda/sek.) przez 30 minut.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z mieszadła magnetycznego z płytą grzewczą i pozwól, aby fragmenty węzłów chłonnych osiadły.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant wzbogacony w "komórkę niezrębową". UWAGA: Jeśli przewiduje się analizę T, B, komórek dendrytycznych i CD45-gp38-CD31-, należy zachować frakcję "komórek niezrębowych".</li>
	<li>Pozostałą tkankę węzłów chłonnych przepłukać jednorazowo 750 μl podłoża zasadowego. UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko w przypadku pracy z myszami kompetentnymi immunologicznie.</li>
	<li>Niech fragmenty węzłów chłonnych osiądą.</li>
	<li>Usuń frakcję pływającą w komórkach niezrębowych.</li>
	<li>Dodać do fragmentów węzłów chłonnych 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 3,5 mg/ml kolagenazy D i 40 μg/ml DNazy I.</li>
	<li>Umieścić probówkę z powrotem w zlewce zawierającej wodę podgrzaną do 37 °C.</li>
	<li>Trawić tkankę węzłów chłonnych przez 5 minut, powoli mieszając.</li>
	<li>Zdezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie 700 μl przez 10 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. UWAGA: To zaburza tkankę węzłów chłonnych, aby poprawić trawienie.</li>
	<li>Umieścić probówkę z powrotem w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Trawić fragmenty tkanki węzłów chłonnych przez kolejne 10 minut, powoli mieszając.</li>
	<li>Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dodać 7,5 μl 0,5 M EDTA, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dodać 750 μl podłoża zasadowego i przepuścić komórki przez siatkę nylonową o grubości 70 μm.</li>
	<li>Zawiesina komórek wirówki 5 min przy 1 500 x g, 4 °C.</li>
	<li>Komórki zrębu można teraz wykorzystać do dalszej analizy.</li>
</ol>
2. Barwienie komórek zrębu węzłów chłonnych
<ol>
	<li>Użyj kombinacji przeciwciał anty-CD45, anty-podoplaniny (gp38), anty-CD31, aby skutecznie rozpoznać komórki TRC, LEC, BEC i DN.</li>
	<li>Inkubować strawioną tkankę węzłów chłonnych za pomocą Live/Dead tracker, anty-CD45-FITC (1:200), anty-gp38-PE (1:200), anty-CD31-APC (1:200) w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut, 4 °C, w ciemności.</li>
	<li>Umyć komórki, dodając 500 l HBSS zawierającego 2% FCS</li>
	<li>Zawiesina komórek wirówki 3 min przy 1500 x g, 4°C.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS.</li>
	<li>Wybarwione komórki należy uruchomić w cytometrze przepływowym wyposażonym w następujący układ optyczny: źródło wzbudzenia z maksymalnie trzema laserami: niebieskim (488 nm, chłodzony powietrzem, półprzewodnikowym 20 mW), czerwonym (633 nm, 17 mW HeNe) i fioletowym (405 nm, 30 mW półprzewodnikowym).</li>
	<li>Bramka CD45- komórki w celu wykluczenia komórek krwiotwórczych.</li>
	<li>Pojedyncze bramki (FSC-W) i żywe komórki (tracker LIVE/DEAD) w celu wykluczenia dubletów i martwych komórek.</li>
	<li>Wykreśl komórki gp38 w porównaniu z CD31, aby uwidocznić komórki TRC (gp38+CD31-), LEC (gp38+CD31+), BEC (gp38-CD31+) i DN (gp38-CD31-) (patrz rysunek 1).</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badanie komórek zrębu węzłów chłonnych stało się ostatnio przedmiotem badań ze względu na opracowanie dwóch opublikowanych protokołów trawienia6,13. Oba protokoły są wystarczające do uzyskania pojedynczych komórek zrębu węzłów chłonnych, ale różnią się wykorzystaniem enzymów trawiennych i czasem trawienia. Ponieważ komórki zrębu i ich markery powierzchniowe są wrażliwe na trawienie enzymatyczne i stres mechaniczny, wymagany jest zoptymalizowany protokół.
Izolacja żywotnych komórek z...

Węzły chłonne to wyspecjalizowane przedziały, w których inicjowane i koordynowane są adaptacyjne reakcje immunologiczne przeciwko obcym i własnym antygenom. Przedstawiona tutaj procedura opisuje krótkie trawienie enzymatyczne połączone z automatycznym pipetowaniem mechanicznym w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki węzła chłonnego i uzyskania dostępu do żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych, które utrzymują powierzchniową ekspresję kilku cząsteczek.
Komórka zrębu węzła chłonnego tworzy rusztowanie węzła chłonnego i spełnia trzy główne funkcje: najpierw filtruje płyny ustrojowe, aby pobrać próbki antygenów, patogenów i ich wzorca molekularnego związanego z patogenami (PAMP), a także cytokin i wzorca molekularnego związanego z niebezpieczeństwem (DAMPs) obecnego w organizmie. Po drugie, przyciągają i instruują komórki prezentujące antygen (APC) i limfocyty, aby oddziaływały i inicjowały adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne; i po trzecie, zapewniają środowisko strukturalne dla homeostazy i różnicowania limfocytów1-3. Podczas stanu zapalnego komórki zrębu węzłów chłonnych wytwarzają czynniki wzrostu, cytokiny i chemokiny, przystosowują się do obrzęku, organizując w ten sposób interakcję między komórkami dendrytycznymi (DC), limfocytami T i B. Orkiestracja odpowiedzi immunologicznych jest możliwa tylko dzięki złożonej architekturze strukturalnej utworzonej przez różne populacje komórek zrębu.
Komórki zrębu węzłów chłonnych są komórkami ujemnymi CD45 i można je odróżnić po ekspresji CD31 lub gp38 w komórkach fibroblastów i śródbłonka 1-6. Gp38 + CD31 - definiuje komórki siatkowate strefy T (TRC, znane również jako FRC: fibroblastyczne komórki siatkowate), gp38 + CD31 + definiuje komórki śródbłonka limfatycznego (LEC), gp38-CD31 + definiuje komórki śródbłonka krwi (BEC). Ponadto charakterystyka subpopulacji ujawniła istnienie innych komórek zrębu węzłów chłonnych. Rzeczywiście, w populacji gp38-CD31- scharakteryzowano małą populację komórek podobnych do perycytów7. W związku z tym adaptacja procedury izolacji jest korzystna dla identyfikacji i charakterystyki właściwości funkcjonalnych różnych komórek zrębu węzłów chłonnych.
Przed opracowaniem protokołów trawienia komórek zrębu węzłów chłonnych, badanie komórek zrębu węzłów chłonnych ograniczało się do obserwacji in situ za pomocą przekroju tkanki i mikroskopii. Niemniej jednak badania strukturalne i funkcjonalne wykazały ważne cechy komórek zrębu węzłów chłonnych. Komórki zrębu węzłów chłonnych są związane z podoplaniną, kolagenem i białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc złożoną trójwymiarową strukturę zwaną systemem przewodów, która transportuje limfę i związane z nią białka o niskiej masie cząsteczkowej z zatoki podtorebkowej węzła chłonnego do żyłek o wysokim śródbłonku w strefie8 limfocytów T. DC są w bliskim kontakcie z komórkami zrębu i można je zaobserwować wystające w strukturę przewodu rurowego w celu pobrania próbki płynu i wykrycia antygenów8. Interakcja komórek zrębu węzłów chłonnych (TRC i LEC) z DC odbywa się za pośrednictwem uwalniania i prezentacji chemokin CCL21 i CCL199,10. CCL19 i CCL21 są rozpoznawane przez receptor CCR7 ułatwiający limfocytom DC i T migrację do strefy komórek T węzła chłonnego4,11. Pomimo stosowania podobnych chemokin, limfocyty DC i T mają różne drogi migracji do węzłów chłonnych12. Następnie, stosując trawienie enzymatyczne węzła chłonnego i izolację czystych komórek zrębu węzłów chłonnych, przeprowadzono badania funkcjonalne nad rolą różnych komórek zrębu węzłów chłonnych i ich zdolnością do interakcji z komórkami DC i T / B6,13. Po pierwsze, przesłuch między efektorowymi limfocytami T wytwarzającymi IFN-γ a komórkami zrębu węzłów chłonnych indukuje produkcję metabolitu tlenku azotu, który wykazuje tłumienie odpowiedzi komórek T i proliferację w wtórnych narządach limfatycznych14-16. Po drugie, doniesiono, że komórki zrębu węzłów chłonnych wspierają różnicowanie podzbiorów regulatorowych DC poprzez produkcję IL-1017 i modulują homeostazę naiwnych limfocytów T poprzez produkcję IL-76,18. Po trzecie, ekspresja TLR w komórkach zrębu węzłów chłonnych sugeruje, że komórki zrębu są podatne na sygnał pochodzący z infekcji lub własne cząsteczki uwalniane podczas uszkodzenia tkanki. Rzeczywiście, traktowanie komórek zrębu węzłów chłonnych ligandem poli(I:C) TLR3 indukuje umiarkowaną regulację w górę ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i regulację w górę cząsteczki kohamującej PD-L1, ale nie cząsteczek kostymulujących, co powoduje dramatyczne zmiany w ekspresji antygenów tkanek obwodowych19. Kilka grup wykazało, że komórki zrębu węzłów chłonnych wyrażają antygeny tkanek obwodowych i indukują tolerancję samoreaktywnych limfocytów T19,21-27. Dlatego zrozumienie interakcji między komórkami zrębu węzłów chłonnych a innymi migrującymi i rezydentnymi komórkami węzłów chłonnych pomoże znaleźć nowe cząsteczki docelowe, które umożliwią aktywację lub supresję odpowiedzi immunologicznych podczas stanu zapalnego. W związku z tym konieczne jest wdrożenie opublikowanego enzymatycznego oddzielenia węzła chłonnego.
Poprzednio opublikowane protokoły wykorzystują różne kombinacje trawienia enzymatycznego opartego na kolagenazie z niskim obciążeniem mechanicznym6,19,20. Jednak długie inkubacje z enzymami trawiącymi lub różnymi kombinacjami enzymów trawiennych mogą degradować różne cząsteczki powierzchniowe wymagane do analizy stanu aktywacji i identyfikacji nowych komórek zrębu węzłów chłonnych. W zależności od rodzaju analizy komórek zrębu, bardziej odpowiedni może być protokół Link lub protokół Fletchera. W opisanej procedurze nieco krótsze trawienie enzymatyczne jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych. Procedura ta umożliwia wysoce powtarzalną izolację i rozróżnienie populacji komórek zrębu węzłów chłonnych o niskiej zmienności i ponad 95% żywotności. Świeżo wyizolowane komórki zrębu węzłów chłonnych mogą być bezpośrednio wykorzystane do ekspresji markerów powierzchniowych, analizy białek i badań transkrypcyjnych, a także do tworzenia linii komórek zrębu do wykonywania testów funkcjonalnych in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Stężenie końcowe 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma 499609</td><td></td><td>Stężenie końcowe 1,2 mM</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td> <td>>160 jednostek na mg suchej masy, stosować w końcowym stężeniu 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>stosować w dawce 3,5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAzy I</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11284932001</td><td>użyciu przy 40 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Magnesy mieszające</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm dł.-2 mm & oslash;</td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z funkcją grzania</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 100 mm, sterylne</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>igły 25 G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti mouse CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti mouse CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>przeciw myszy Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>przeciw myszy CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, wielokanałowy</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &micro; l maksymalna głośność</td></tr><tr><td>anty myszy CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anty myszy CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anty myszy CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anty myszy I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anty myszy CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Naprawialny Zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Wtórne narządy limfoidalne, w tym węzły chłonne, składają się z komórek zrębu, które zapewniają strukturalne środowisko dla homeostazy, aktywacji i różnicowania limfocytów. Różne podzbiory komórek zrębu zostały zidentyfikowane na podstawie ekspresji cząsteczki adhezyjnej CD31 i glikoproteiny podoplaniny (gp38), komórek siatkowatych strefy T lub fibroblastycznych komórek siatkowatych, komórek śródbłonka limfatycznego, komórek śródbłonka krwi i perycytów podobnych do FRC w populacji komórek podwójnie ujemnych. Dla wszystkich populacji opisano różne funkcje, w tym separację i wyściełanie różnych przedziałów, przyciąganie i interakcję z różnymi typami komórek, filtrację płynów drenujących i kurczenie się naczyń limfatycznych. W ostatnich latach różne grupy opisywały dodatkową rolę komórek zrębu w organizowaniu i regulowaniu odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T potencjalnie niebezpiecznych dla gospodarza. 
Węzły chłonne są złożonymi strukturami z wieloma różnymi typami komórek i dlatego wymagają odpowiedniej procedury izolacji pożądanych populacji komórek. Obecnie protokoły izolacji komórek zrębu węzłów chłonnych opierają się na trawieniu enzymatycznym o różnym czasie inkubacji; Jednak komórki zrębu i ich cząsteczki powierzchniowe są wrażliwe na te enzymy, co powoduje utratę ekspresji markerów powierzchniowych i śmierć komórki. W tym przypadku zaproponowano krótki protokół trawienia enzymatycznego w połączeniu z automatycznym rozrywaniem mechanicznym w celu uzyskania żywotnej zawiesiny pojedynczych komórek komórek zrębu węzłów chłonnych przy zachowaniu ekspresji cząsteczek powierzchniowych.

Niniejszy protokół jest zmodyfikowanym protokołem trawienia opublikowanym przez Linka i wsp.., 20076 z krótszym czasem trawienia (maksymalnie 45 min) dzięki mechanicznemu rozdrabnianiu z użyciem zautomatyzowanej pipety wielokanałowej. Ponadto procedura ta jest bardziej ustandaryzowana, minimalizuje degradację markerów powierzchniowych na różnych komórkach zrębu węzłów chłonnych i pozwala na jednoczesną obróbkę więcej niż jednej próbki.
Kolagenaza IV i kolagenaza D w protoko...

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przerwanie torebki węzła chłonnego. W drugim etapie fragmenty węzłów chłonnych są trawione kolagenazą czwartą i D nasą pierwszą.Enzymy są następnie zastępowane kolagenazą D i D nasą, a fragmenty są mechanicznie dezagregowane za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. Ostatecznie ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki izolowanych komórek węzłów chłonnych można scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącą metodą jest to, że dzięki tej metodzie komórki SHR węzłów chłonnych są trawione przy użyciu standaryzowanej procedury enzymatycznej uzupełnionej mechaniczną dezagregacją, która zachowuje żywotność i ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórek.Zacznij od umieszczenia wypreparowanych węzłów chłonnych na sterylnej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry lodowatego podłoża. Następnie użyj dwóch jednomililitrowych strzykawek wyposażonych w igły o rozmiarze 25, aby rozbić kapsułki węzłów chłonnych. Następnie przenieś przerwaną tkankę do pięciomililitrowej stożkowej probówki zawierającej 750 mikrolitrów pożywki, uzupełnionej kolagenazą czwartą i DNA jeden oraz mieszaniem magnetycznym.Następnie umieść probówkę w zlewce zawierającej podgrzaną wodę o temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym i mieszaj zawiesiny komórek z prędkością jednej rundy na sekundę przez 30 minut. Po wymieszaniu pozwól fragmentowi węzłów chłonnych osiąść, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Teraz wzbogacony o komórki niezrębowe przenieś do fragmentów węzłów chłonnych 750 mikrolitrów świeżej pożywki, uzupełnionej kolagenazą D i D nasa jeden, a następnie mieszaj tkankę przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej zdezagreguj fragmenty tkanki węzła chłonnego w objętości 700 mikrolitrów przez 10 cykli z maksymalną prędkością, a następnie ponownie wymieszaj fragmenty tkanki po 10 minutach. Następnie należy zdezagregować grudki tkanek za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej przez 99 cykli z maksymalną prędkością. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 0,5 molowego EDTA do probówki i mieszaj zawiesinę tkankową przez kolejne 99 cykli za pomocą automatycznej pipety.Po ostatnim cyklu dezagregacji dodaj 750 mikrolitrów pożywki do roztworu komórkowego i przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 70 mikrometrów. Następnie granuluj komórki przez pięć minut w temperaturze 1500 g i czterech stopniach Celsjusza. Aby uwidocznić populacje komórek zrębu węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej, wybarwić odpowiednie próbki komórek żywym martwym trackerem i interesującymi przeciwciałami w 100 mikrolitrach HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Następnie umyj komórki w 500 mikrolitrach HBSS za pomocą FCS i ponownie zawiesij. Granulki w 100 mikrolitrach HBSS i FCS uruchamiają komórki na cytometrze przepływowym, bramkując komórki dodatnie CD 45, aby wykluczyć komórki krwiotwórcze, a następnie chód na żywej populacji singletów. Na koniec wykreśl GP 38 w porównaniu z CD 31, aby uwidocznić komórki siatkowate strefy T, komórki śródbłonka limfatycznego, komórki śródbłonka krwi i komórki podwójnie ujemne.Populacje komórek. Całkowita liczba komórek odzyskanych po trawieniu podzbiorów komórek zrębu węzłów chłonnych była nieco wyższa w właśnie zademonstrowanym protokole w porównaniu z protokołami link i Fletcher, co pokazuje, że żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych po izolacji za pomocą tego protokołu jest podobna do tej odzyskanej przy użyciu opublikowanych protokołów. Komórki siatkowate strefy T i komórki śródbłonka limfatycznego wyizolowane za pomocą tego oraz protokołu Link i Fletchera porównano pod kątem ekspresji IAB CD 1 40, CD 80, PD L one i CD 40.Ekspresja wszystkich pięciu cząsteczek powierzchniowych była wyższa po trawieniu z właśnie zademonstrowanym protokołem i protokołem łączenia dla obu podzbiorów komórek zrębu, co sugeruje, że degradacja niektórych cząsteczek powierzchniowych przez kolagenazę cztery i D jest mniej odporna niż w przypadku kolagenazy p i przestrzeni DYS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wyizolować cztery główne subpopulacje komórek zrębu węzłów chłonnych, zachowując jednocześnie ekspresję kilku cząsteczek powierzchniowych przydatnych do ich dalszej charakterystyki i analizy.

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Opisano wytwarzanie chimer węzłów chłonnych/poduszeczek tłuszczowych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych. Metoda polega na izolacji węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i embrionalnych poduszeczek tłuszczowych, wytworzeniu chimerycznych poduszek tłuszczowych węzłów chłonnych i ich przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza.

Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Naucz się izolować komórki zrębu węzłów chłonnych myszy przy użyciu trawienia enzymatycznego i dysagregacji mechanicznej. Ta metoda zachowuje żywotność komórek i ekspresję markerów powierzchniowych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Przeglądaj więcej filmów