Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych
19 sierpnia 2014
Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przerwanie torebki węzła chłonnego. W drugim etapie fragmenty węzłów chłonnych są trawione kolagenazą czwartą i D nasą pierwszą.
Enzymy są następnie zastępowane kolagenazą D i D nasą, a fragmenty są mechanicznie dezagregowane za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. Ostatecznie ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki izolowanych komórek węzłów chłonnych można scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącą metodą jest to, że dzięki tej metodzie komórki SHR węzłów chłonnych są trawione przy użyciu standaryzowanej procedury enzymatycznej uzupełnionej mechaniczną dezagregacją, która zachowuje żywotność i ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórek.
Zacznij od umieszczenia wypreparowanych węzłów chłonnych na sterylnej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry lodowatego podłoża. Następnie użyj dwóch jednomililitrowych strzykawek wyposażonych w igły o rozmiarze 25, aby rozbić kapsułki węzłów chłonnych. Następnie przenieś przerwaną tkankę do pięciomililitrowej stożkowej probówki zawierającej 750 mikrolitrów pożywki, uzupełnionej kolagenazą czwartą i DNA jeden oraz mieszaniem magnetycznym.
Następnie umieść probówkę w zlewce zawierającej podgrzaną wodę o temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym i mieszaj zawiesiny komórek z prędkością jednej rundy na sekundę przez 30 minut. Po wymieszaniu pozwól fragmentowi węzłów chłonnych osiąść, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Teraz wzbogacony o komórki niezrębowe przenieś do fragmentów węzłów chłonnych 750 mikrolitrów świeżej pożywki, uzupełnionej kolagenazą D i D nasa jeden, a następnie mieszaj tkankę przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej zdezagreguj fragmenty tkanki węzła chłonnego w objętości 700 mikrolitrów przez 10 cykli z maksymalną prędkością, a następnie ponownie wymieszaj fragmenty tkanki po 10 minutach. Następnie należy zdezagregować grudki tkanek za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej przez 99 cykli z maksymalną prędkością. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 0,5 molowego EDTA do probówki i mieszaj zawiesinę tkankową przez kolejne 99 cykli za pomocą automatycznej pipety.
Po ostatnim cyklu dezagregacji dodaj 750 mikrolitrów pożywki do roztworu komórkowego i przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 70 mikrometrów. Następnie granuluj komórki przez pięć minut w temperaturze 1500 g i czterech stopniach Celsjusza. Aby uwidocznić populacje komórek zrębu węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej, wybarwić odpowiednie próbki komórek żywym martwym trackerem i interesującymi przeciwciałami w 100 mikrolitrach HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.
Następnie umyj komórki w 500 mikrolitrach HBSS za pomocą FCS i ponownie zawiesij. Granulki w 100 mikrolitrach HBSS i FCS uruchamiają komórki na cytometrze przepływowym, bramkując komórki dodatnie CD 45, aby wykluczyć komórki krwiotwórcze, a następnie chód na żywej populacji singletów. Na koniec wykreśl GP 38 w porównaniu z CD 31, aby uwidocznić komórki siatkowate strefy T, komórki śródbłonka limfatycznego, komórki śródbłonka krwi i komórki podwójnie ujemne.
Populacje komórek. Całkowita liczba komórek odzyskanych po trawieniu podzbiorów komórek zrębu węzłów chłonnych była nieco wyższa w właśnie zademonstrowanym protokole w porównaniu z protokołami link i Fletcher, co pokazuje, że żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych po izolacji za pomocą tego protokołu jest podobna do tej odzyskanej przy użyciu opublikowanych protokołów. Komórki siatkowate strefy T i komórki śródbłonka limfatycznego wyizolowane za pomocą tego oraz protokołu Link i Fletchera porównano pod kątem ekspresji IAB CD 1 40, CD 80, PD L one i CD 40.
Ekspresja wszystkich pięciu cząsteczek powierzchniowych była wyższa po trawieniu z właśnie zademonstrowanym protokołem i protokołem łączenia dla obu podzbiorów komórek zrębu, co sugeruje, że degradacja niektórych cząsteczek powierzchniowych przez kolagenazę cztery i D jest mniej odporna niż w przypadku kolagenazy p i przestrzeni DYS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wyizolować cztery główne subpopulacje komórek zrębu węzłów chłonnych, zachowując jednocześnie ekspresję kilku cząsteczek powierzchniowych przydatnych do ich dalszej charakterystyki i analizy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza procedura opisuje izolację komórek zrębowych węzłów chłonnych za pomocą kombinacji trawienia enzymatycznego i dezagregacji mechanicznej. Metoda ta ma na celu zachowanie żywotności oraz ekspresji markerów powierzchniowych izolowanych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Badania nad komórkami zrębowymi
Wstęp
- Stromalne komórki węzłów chłonnych odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania tych komórek.
- Istniejące metody mogą negatywnie wpływać na żywotność komórek oraz integralność markerów powierzchniowych.
- Niniejsze badanie przedstawia udoskonaloną technikę pozwalającą rozwiązać te problemy.
Cel badania
- Aby skutecznie wyizolować żywe komórki zrębu węzłów chłonnych.
- Aby zachować ekspresję cząsteczek powierzchniowych podczas procesu izolacji.
- Aby udoskonalić istniejące metody izolacji.
Zastosowane metody
- Rozbicie torebki węzła chłonnego.
- Trawienie za pomocą kolagenazy i DNazy.
- Mechaniczna dysagregacja z użyciem automatycznej pipety wielokanałowej.
- Charakterystyka cząsteczek powierzchniowych komórek metodą cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie izoluje komórki zrębu węzłów chłonnych.
- Żywotność komórek oraz ekspresja markerów powierzchniowych zostają zachowane.
- Cytometria przepływowa potwierdza integralność izolowanych komórek.
- Technika ta wykazuje przewagi nad metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Ta udoskonalona technika izolacji usprawnia badanie komórek zrębu węzłów chłonnych.
- Oferuje ona zestandaryzowane podejście do izolacji komórek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w ramach studiów immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja żywych komórek zrębu węzłów chłonnych z zachowaną ekspresją markerów powierzchniowych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów immunomodulacyjnych. Metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez zachowanie wierności interakcji między zrębem a układem odpornościowym. Rozwiązuje ona kluczowy problem na etapie odkrywania leków, w którym integralność komórek zrębu wpływa na spójność biomarkerów translacyjnych oraz decyzje dotyczące selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań między stromą a układem odpornościowym w regulacji odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Zachowuje ekspresję cząsteczek powierzchniowych CD31 i gp38 w celu dokładnej identyfikacji subpopulacji.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów stromalnych w szlakach homeostazy tkanki limfatycznej.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia otrzymywanie zestandaryzowanych zawiesin pojedynczych komórek do powtarzalnych analiz opartych na cytometrii przepływowej.
- Wartość operacyjna: Łączy trawienie enzymatyczne z automatyczną dysagregacją mechaniczną w celu zwiększenia wydajności i żywotności komórek.
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych wskaźników odzysku komórek zrębu w celu standaryzacji testów i zapewnienia powtarzalności między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje funkcjonalność komórek zrębu do dalszych analiz aktywacji i różnicowania limfocytów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia spójną izolację komórek siateczkowych strefy T, komórek śródbłonka limfatycznego, komórek śródbłonka naczyniowego oraz subpopulacji podwójnie negatywnych.
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez zachowanie cząsteczek powierzchniowych istotnych dla interakcji między zrębem a układem odpornościowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania, w których żywotność komórek zrębu oraz zachowanie markerów są kluczowe dla weryfikacji hipotez i wyjaśnienia szlaków w badaniach nad immunomodulacją.
- Biologia odkrywcza: Wspiera izolację komórek zrębu w celu walidacji funkcjonalnej celów w mikrośrodowisku tkanki limfatycznej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych zawiesin jednokomórkowych, umożliwiających standaryzowane testy oparte na komórkach zrębu.
- Analityka: Generuje próbki przygotowane do cytometrii przepływowej w celu ilościowej analizy markerów powierzchniowych i różnicowania podzbiorów.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność interfejsu między zrębem a układem odpornościowym dla zapewnienia ciągłości przedklinicznej w modelach tkanki limfatycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany protokół enzymatyczno-mechaniczny, możliwy do adaptacji w różnych procesach izolacji komórek zrębu z tkanki limfatycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wiarygodność predykcyjna walidacji celów stromalnych dzięki zachowaniu ekspresji cząsteczek powierzchniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół redukuje zmienność w izolacji komórek stromalnych pomiędzy poszczególnymi eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach interakcji między komórkami stromalnymi a układem odpornościowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów stromalnych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wiarygodne przedkliniczne dane dotyczące komórek stromalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w protokołach enzymatycznego trawienia tkanek oraz barwienia w cytometrii przepływowej.
- Zależne od zastosowania automatycznej pipety wielokanałowej do dezagregacji mechanicznej oraz dostępności enzymów kolagenazy i DNazy.
- Wymaga standaryzacji czasu trawienia i liczby cykli mechanicznych pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Wymaga dostosowania stężeń enzymów do różnych źródeł tkanek limfatycznych lub subpopulacji stromalnych.
- Ograniczone przez wrażliwość komórek stromalnych na przedłużoną ekspozycję enzymatyczną, co wymaga precyzyjnego określenia czasu etapów rozbijania tkanki.
