Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek zrębu węzłów chłonnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przerwanie torebki węzła chłonnego. W drugim etapie fragmenty węzłów chłonnych są trawione kolagenazą czwartą i D nasą pierwszą.

Enzymy są następnie zastępowane kolagenazą D i D nasą, a fragmenty są mechanicznie dezagregowane za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. Ostatecznie ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki izolowanych komórek węzłów chłonnych można scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącą metodą jest to, że dzięki tej metodzie komórki SHR węzłów chłonnych są trawione przy użyciu standaryzowanej procedury enzymatycznej uzupełnionej mechaniczną dezagregacją, która zachowuje żywotność i ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórek.

Zacznij od umieszczenia wypreparowanych węzłów chłonnych na sterylnej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry lodowatego podłoża. Następnie użyj dwóch jednomililitrowych strzykawek wyposażonych w igły o rozmiarze 25, aby rozbić kapsułki węzłów chłonnych. Następnie przenieś przerwaną tkankę do pięciomililitrowej stożkowej probówki zawierającej 750 mikrolitrów pożywki, uzupełnionej kolagenazą czwartą i DNA jeden oraz mieszaniem magnetycznym.

Następnie umieść probówkę w zlewce zawierającej podgrzaną wodę o temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszadle magnetycznym i mieszaj zawiesiny komórek z prędkością jednej rundy na sekundę przez 30 minut. Po wymieszaniu pozwól fragmentowi węzłów chłonnych osiąść, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Teraz wzbogacony o komórki niezrębowe przenieś do fragmentów węzłów chłonnych 750 mikrolitrów świeżej pożywki, uzupełnionej kolagenazą D i D nasa jeden, a następnie mieszaj tkankę przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej zdezagreguj fragmenty tkanki węzła chłonnego w objętości 700 mikrolitrów przez 10 cykli z maksymalną prędkością, a następnie ponownie wymieszaj fragmenty tkanki po 10 minutach. Następnie należy zdezagregować grudki tkanek za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej przez 99 cykli z maksymalną prędkością. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 0,5 molowego EDTA do probówki i mieszaj zawiesinę tkankową przez kolejne 99 cykli za pomocą automatycznej pipety.

Po ostatnim cyklu dezagregacji dodaj 750 mikrolitrów pożywki do roztworu komórkowego i przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 70 mikrometrów. Następnie granuluj komórki przez pięć minut w temperaturze 1500 g i czterech stopniach Celsjusza. Aby uwidocznić populacje komórek zrębu węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej, wybarwić odpowiednie próbki komórek żywym martwym trackerem i interesującymi przeciwciałami w 100 mikrolitrach HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie umyj komórki w 500 mikrolitrach HBSS za pomocą FCS i ponownie zawiesij. Granulki w 100 mikrolitrach HBSS i FCS uruchamiają komórki na cytometrze przepływowym, bramkując komórki dodatnie CD 45, aby wykluczyć komórki krwiotwórcze, a następnie chód na żywej populacji singletów. Na koniec wykreśl GP 38 w porównaniu z CD 31, aby uwidocznić komórki siatkowate strefy T, komórki śródbłonka limfatycznego, komórki śródbłonka krwi i komórki podwójnie ujemne.

Populacje komórek. Całkowita liczba komórek odzyskanych po trawieniu podzbiorów komórek zrębu węzłów chłonnych była nieco wyższa w właśnie zademonstrowanym protokole w porównaniu z protokołami link i Fletcher, co pokazuje, że żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych po izolacji za pomocą tego protokołu jest podobna do tej odzyskanej przy użyciu opublikowanych protokołów. Komórki siatkowate strefy T i komórki śródbłonka limfatycznego wyizolowane za pomocą tego oraz protokołu Link i Fletchera porównano pod kątem ekspresji IAB CD 1 40, CD 80, PD L one i CD 40.

Ekspresja wszystkich pięciu cząsteczek powierzchniowych była wyższa po trawieniu z właśnie zademonstrowanym protokołem i protokołem łączenia dla obu podzbiorów komórek zrębu, co sugeruje, że degradacja niektórych cząsteczek powierzchniowych przez kolagenazę cztery i D jest mniej odporna niż w przypadku kolagenazy p i przestrzeni DYS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie wyizolować cztery główne subpopulacje komórek zrębu węzłów chłonnych, zachowując jednocześnie ekspresję kilku cząsteczek powierzchniowych przydatnych do ich dalszej charakterystyki i analizy.