Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamiki poszczególnych dołów pokrytych klatryną w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję znakowanych fluorescencyjnie białek endocytarnych i cargo do linii komórek adherencji. Kolejnym krokiem jest zobrazowanie komórek za pomocą całkowitego odbicia wewnętrznego, fluorescencji lub mikroskopii darniowej.

Żywotność małych zestawów wgłębień pokrytych klatryną jest następnie oznaczana ilościowo ręcznie za pomocą programu do przetwarzania i analizy obrazu. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie czasu życia dołów pokrytych klatryną poprzez obiektywne automatyczne wykrywanie i analizę. Ostatecznie mikroskopia murawy służy do ilościowego określenia dynamiki poszczególnych dołów pokrytych klatryną w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia w celu zbadania endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu błonowego, takie jak to, w jaki sposób składanie i dynamika endocytozy mogą się zmieniać w zależności od obecnych różnych białek endocytarnych i białek ładunkowych. Aby rozpocząć, transfekcja HEC 2 93 komórki z plazmidami kodującymi znacznik G receptory sprzężone z białkiem G lub GPCR i/lub składniki maszynerii Claro. Na płytce 12-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym, dzień po transfekcji dodać 0,5 mililitra soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS z jednym milimolowym EDTA do każdej.

Cóż, następnie umieść trzy rundy sterylnej 25-milimetrowej pokrywy w oddzielnych dołkach po sześć. Talerz studzienkowy Napełnij każdą studzienkę dwoma mililitrami pożywki. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do dna studzienki, aby zapobiec wzrostowi komórek na spodniej stronie szkiełka nakrywkowego.

Następnie ręcznie zamieszaj studzienkę na płytce 12-dołkowej, aby podnieść komórki z dna studzienki. Dodaj jeden mililitr DM EM z 10% FBS, aby wysłać ponownie. Następnie rozprowadź podniesione komórki z jednego dołka równomiernie między trzema szkiełkami nakrywkowymi.

Pozwól komórkom rosnąć na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 48 godzin przed obrazowaniem. Upewnij się również, że komórki są rozłożone i płaskie, aby zobrazować dynamikę dołu pokrytego klatryną i ładunku. Najpierw należy wstępnie inkubować komórki z przeciwciałami, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie przygotuj się do przeniesienia szkiełka nakrywkowego do komory obrazowania żywych komórek za pomocą kleszczy i igły o rozmiarze 25 wygiętej na końcówce w haczyk. Trzymaj parę kleszczy w dominującej ręce. Przytrzymaj wygiętą igłę w drugiej.

Obróć igłę, aż haczyk wygina się w dół w kierunku szkła. Delikatnie przeciągnij haczykiem igły w dół po dnie płytki sześciodołkowej, aż zaczepi się o szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni szkiełka nakrywkowego, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek.

Delikatnie podnieś szkiełko pokrywy z dna studzienki. Zrównoważyć szkiełko nakrywkowe przy ścianie studni, aby uzyskać podparcie. Za pomocą kleszczyków chwycić w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesunąć stronę z komórką szkiełka nakrywkowego do góry do komory obrazowania.

Zmontuj komorę i dodaj 700 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do obrazowania. Po przeniesieniu komory do mikroskopu, ustaw komórki w ostrości za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju darniowym, obrazując komórki w konwencjonalnych trybach oświetlenia epi, fluorescencji lub konfokalnej, aby zidentyfikować komórki wyrażające odpowiednie konstrukty jako ważny środek ostrożności. Zawsze zwracaj uwagę na kąt wiązki laserowej i zawsze kieruj ją z dala od obserwatora.

Następnie skup się na dolnej powierzchni komórki wykazującej ekspresję, aż zniknie zarys błony plazmatycznej wokół komórki i pojawi się dolna powierzchnia komórki. Jest to najbardziej widoczne w przypadku zlokalizowanego białka ładunkowego błony plazmatycznej, takiego jak receptor opioidowy mu. Jeśli używasz tych samych laserów do obrazowania w konwencjonalnej fluorescencji epi, zwiększ kąt padania lasera aż do wyjścia z ostrości.

Fluorescencja we wnętrzu komórki zanika i nie widać zarysu błony plazmatycznej wokół komórki. Po znalezieniu się na murawie upewnij się, że laser wzbudzający odbija się z powrotem przez obiektyw i nie jest widoczny nad obiektywem. Sprawdzając, czy plamka lasera jest widoczna, popraw ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz.

Po zidentyfikowaniu komórek pobieraj obrazy co najmniej co trzy sekundy przez 10 minut. Powtórz wszystkie kroki, aby zobrazować dodatkowe komórki. Aby rozpocząć analizę dynamiki endocytarnej, otwórz plik na obrazie J.Obrazy są przechowywane jako pojedynczy stos plików TIFF.

Z kanałami międzywarstwowymi. Przekonwertuj obrazy na hiperstosy, wybierając pozycję hiperstosy obrazów i stos do hiperstosu w oknie podręcznym. Wprowadź liczbę pobranych kanałów.

Wprowadź jedną dla Zacka i wprowadź liczbę klatek filmu. Format hyper stack daje okno z dwoma paskami przewijania. Użyj górnego paska, aby poruszać się po kanałach, a dolnego paska, aby poruszać się w czasie.

Przewiń do kanału białka, którego czas życia zostanie oznaczony. Wyjdź poza pierwszą klatkę filmu, aby zmniejszyć włączenie istniejących wcześniej dołów pokrytych klatryną lub CCP, których cały czas trwania nie jest widoczny. Narysuj obszar zainteresowania lub ROI wokół losowo wybranego miejsca.

Policz liczbę klatek, w których widoczny jest spot. Aby rozpocząć analizę z rozpoznawaniem obiektów, otwórz plik z obrazem RAW Oprogramowanie do analizy obrazu pojawiło się domyślnie. Pojawi się kolorowy obraz.

Użyj okna regulacji wyświetlacza, aby dostosować jasność kanału. Kliknij nazwę kanału, aby zmienić wyświetlany kolor. Odznacz pole obok kanału, aby zapobiec jego wyświetlaniu.

Twórz spoty, klikając ikonę z pomarańczowymi plamkami. Wybierz obszar ROI wokół komórki, używając go, aby wykluczyć obszary, które będą nieprawidłowo wykrywać jasne krawędzie natarcia i płytki. Zmierz średnicę plamki, aby zapewnić wstępne oszacowania dla algorytmu.

Przełącz się na tryb plasterków i kliknij biegunowe końce plamki, aby zmierzyć jej średnicę. Zrób to dla czterech lub pięciu okrągłych plamek, które wyglądają wskazując na CCP na wysokości swojej stabilności po uformowaniu się przed cesją, użyj tych pomiarów do obliczenia średniej średnicy z dokładnością do najbliższej 10 mikrona. Aby wykryć plamy i powrócić do trybu przekraczania, wybierz odpowiedni kanał do wykrywania.

Wprowadź średnią zmierzoną średnicę, zwykle 0,3 lub 0,4 mikrona. Kliknij niebieską strzałkę do przodu, aby określić ilościowo plamy. Filtruj miejsca według jakości, dostosowując filtr, aby uchwycić jak najwięcej miejsc bez tła.

Filtr jakości jest zaznaczony domyślnie. Użyj krzywej jakości jako przewodnika, aby ustawić odpowiedni próg. Przesuń dolny próg filtra lewym przyciskiem myszy do tego pierwszego zanurzenia krzywej.

To dobry punkt wyjścia dla filtra. Ponieważ ta pozycja zwykle zawęża detekcję tylko do widocznych punktów. Usuń plamy arant w miejscu edycji Przełącznik ekranu, aby wybrać tryb i kliknąć miejsce Po zmianie koloru na żółty kliknij usuń.

Następnie kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować tworzenie algorytmu. Mierz ścieżki, ustawiając ścieżki do brownie w ruchu. CCP nie powinien wykazywać żadnego ukierunkowanego ruchu, a jedynie minimalne dryfowanie po błonie plazmatycznej.

Ten algorytm jest najbardziej odpowiedni dla tego ruchu. Następnie ustaw maksymalną odległość na małą wartość, taką jak 0,7 mikrona. Ustawienie małej odległości minimalizuje połączenie sąsiednich punktów i nadal pozwala na ciągłe śledzenie plamki komórki za pomocą CCP lub ruchu komórki.

Następnie ustaw maksymalny rozmiar odstępu na jeden. Dzięki temu ścieżka może być kontynuowana, jeśli brakuje tylko jednej klatki. W przypadku następujących po sobie przerw o rozmiarach większych niż trzy powoduje, że różne ścieżki są ze sobą nieprawidłowo połączone.

Następnym krokiem jest przełączenie widoku ścieżki na smoczy ogon. Przewiń film, obserwując jakość wykrywania. Jeśli łączone są sąsiednie miejsca, zmniejsz maksymalną odległość poniżej 0,7 mikrona.

Jeśli plamy są zbyt łatwo rozbijane, zwiększ maksymalny rozmiar szczeliny. Kliknij niebieską strzałkę, aby utworzyć ścieżki. Prowadzi to do ekranu filtrowania ścieżek w celu filtrowania ścieżek.

Użyj filtra intensywności, aby usunąć dodatkowe jasne płytki nazębne. Następnie użyj filtra przemieszczeniowego, aby usunąć endosomy, które dostają się do pola murawy. Zachowaj ostrożność, ponieważ dłuższe miejsca również będą miały większe przemieszczenie.

Kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć protokół. W celu wyeksportowania danych należy przejść do zakładki statystyki. Kliknij na ikonę pojedynczej dyskietki, aby wyeksportować wybrane statystyki.

Kliknij na ikonę, która wygląda jak seria dyskietek, aby wyeksportować wszystkie statystyki. Skupienie się na przylegającej do A błonie plazmatycznej i trybie konfokalnym ujawnia komórkę wypełnioną słabą fluorescencją. W przeciwieństwie do tego, skupienie się na środku komórki ujawnia błonę plazmatyczną jako pierścień fluorescencji wokół komórki.

Fluorescencja poza ostrością staje się widoczna po przełączeniu na konwencjonalny epi, fluorescencję lub murawę pod niewłaściwym kątem. Gdy kąt murawy jest prawidłowy, błona plazmatyczna jest bardzo wyraźna, wyraźna i jasna oraz nieostra. Fluorescencja nie zakłóca już obrazu.

Kiedy beta-aresztyna znajduje się w puli cytozolowej, bardzo mało jej znajduje się w polu murawy i wydaje się zamglona i zewnętrzna. Gdy MOR jest aktywowany przez agonistę, beta, aresztyna jest rekrutowana do błony plazmatycznej i zarówno beta aresztyna, jak i receptor redystrybuują do CCP. Okresy istnienia tych klastrów są określane ilościowo ręcznie.

Korzystając z trzech parametrów zakończonej endocytozy, plamki oznaczające CCP mogą całkowicie zniknąć, włączać się i wyłączać lub szczypać większą strukturę. Pokazano tutaj CCP wykryte za pomocą MA Po przefiltrowaniu w celu usunięcia niedynamicznych struktur płytki nazębnej, nałożone białe kule oznaczają wykryte plamy, ciemniejsze plamy, których nie można było wykryć przez cały okres ich życia, zostały również wykluczone za pomocą filtra jakości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować poszczególne wgłębienia kodowane cewnikiem za pomocą mikroskopii darniowej.