Name: Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji dynamiki pojedynczych jam klatrynowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom C. Szalinski, H. Tengowi i M. Bruchezowi za pomoc w Imaris, R. Visteinowi i D. Shiwarskiemu za pomoc techniczną i porady, a także dr M. von Zastrow, dr T Kirchhausen, dr D Drubina i dr W Almersowi za odczynniki i pomocną dyskusję. Finansowanie z grantu T32 NS007433 SLB i NIH DA024698 oraz DA036086 MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy zastosowanie TIRFM do wizualizacji endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME) na poziomie poszczególnych CCP w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. CME jest gwałtownym i wysoce dynamicznym zdarzeniem, w którym pośredniczy skumulowany efekt wielu przestrzennie i czasowo odrębnych pojedynczych zdarzeń. Większość obecnie stosowanych testów, takich jak biochemiczne pomiary internalizacji za pomocą biotynylacji powierzchniowej lub wiązania ligandów, cytometria przepływowa lub testy komórek stałych m...

Proces endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME) zależy od nadejścia w odpowiednim momencie wielu składników maszynerii endocytarnej za pośrednictwem klatryny, które zbierają ładunek i manipulują błoną plazmatyczną do pęcherzyków1-3. CME jest inicjowany przez deformację błony i białka adaptorowe ładunku, które łączą się w powstających miejscach endocytozy1. Białka te rekrutują białko płaszcza, klatrynę, które gromadzi się w strukturę przypominającą klatkę, która tworzy jamę pokrytą klatryną (CCP)4. Gdy CCP jest w pełni złożony w kulisty kształt, rozszczepienie błony, głównie poprzez działanie dużej GTPazy, dynaminy, generuje wolne pęcherzyki pokryte klatryną (CCV)5,6. Ta internalizacja powoduje szybki demontaż powłoki klatryny, co pozwala na ponowne użycie komponentów w wielu rundach CME.
Odkrycie i charakterystyka białek związanych z CME jest zakorzenione w tradycyjnych technikach biochemicznych, genetycznych i mikroskopowych4-6,8. Testy te wyjaśniły role i punkty interakcji tych składników endocytarnych. Chociaż testy te są bardzo przydatne do definiowania podstawowych komponentów maszyn do transportu, są one bardzo ograniczone w uchwyceniu dynamicznego zachowania składników CME lub koncentracji ładunku. Jest to krytyczne ograniczenie, ponieważ CME jest napędzany przez choreograficzny montaż zestawów modułów białkowych w określonych krokach, a także ponieważ niewielkie zmiany w dynamice poszczególnych zdarzeń endocytarnych mogą mieć duże skumulowane konsekwencje dla endocytozy. Co więcej, ostatnie dane wskazują, że poszczególne CCP mogą różnić się zarówno składem, jak i zachowaniem, co sugeruje, że fizjologiczna regulacja tego procesu jest wysoce ograniczona przestrzennie iczasowo9-14. Wizualizacja poszczególnych zdarzeń endocytarnych jest zatem niezbędna, aby zrozumieć, dlaczego w CME zaangażowanych jest wiele nadmiarowych białek i w jaki sposób białka te mogą być kontrolowane przez sygnały fizjologiczne w celu regulacji internalizacji ładunku.
Tutaj opisujemy użycie Mikroskopii Fluorescencyjnej Całkowitego Wewnętrznego Odbicia (TIRFM) do obserwacji CME na poziomie dynamiki poszczególnych CCP w żywych komórkach. TIRFM opiera się na różnicy w współczynniku załamania światła między szkiełkiem nakrywkowym szkła a płynnym środowiskiem komórek15,16. Gdy światło wzbudzenia jest kierowane w stronę komórek pod kątem większym niż krytyczny, jest ono odbijane wewnętrznie, tworząc ulotną falę, która utrzymuje cienkie pole oświetlenia rozciągające się około 100 nm nad szkiełkiem nakrywkowym. Gwarantuje to, że wzbudzane są tylko cząsteczki fluorescencyjne w tym wąskim polu. W praktyce pozwala to na wzbudzenie cząsteczek fluorescencyjnych na błonie plazmatycznej lub w jej pobliżu i minimalizuje fluorescencję z wewnętrznych części komórki. Zapewnia to znacznie wyższy stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość osi z w celu wizualizacji zdarzeń na błonie plazmatycznej, w porównaniu z częściej stosowanymi trybami, takimi jak konwencjonalna epifluorescencja lub konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Opisujemy również, na poziomie wstępnym i praktycznym, wykorzystanie powszechnie używanej platformy analizy obrazu do analizy i kwantyfikacji prostych cech morfologicznych i dynamiki poszczególnych zdarzeń endocytarnych ładunku.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Wysoka Glukoza z L-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco, firmy Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas wolny od EDTA</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu, firmy Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco, firmy Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, firmy Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE firmy Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>25 mm szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Kolby poddane działaniu hodowli komórek Corning, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One, firmy VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG[</td><td></td></tr><tr><td>D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sól octanu enkefaliny (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Zestaw</td> <td>do znakowania białekLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, do automatycznej analizy</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti i wymagane akcesoria, w tym kostki filtracyjne i filtry</td><td>Ramię Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF z wymaganymi adapterami do Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Do regulacji kąta padania</td></tr><tr><td>aparatu iXon+ EMCCD i adapterów</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem g za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii tirf

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Wiele ważnych receptorów sygnałowych jest internalizowanych przez dobrze zbadany proces endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME). Tradycyjne testy biologiczne komórek, mierzące globalne zmiany w endocytozie, zidentyfikowały ponad 30 znanych składników uczestniczących w CME, a badania biochemiczne wygenerowały mapę interakcji wielu z tych składników. Staje się jednak coraz bardziej oczywiste, że CME jest bardzo dynamicznym procesem, którego regulacja jest złożona i delikatna. W tym manuskrypcie opisujemy zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do bezpośredniej wizualizacji dynamiki składników maszynerii endocytarnej za pośrednictwem klatryny, w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, na poziomie poszczególnych zdarzeń, które pośredniczą w tym procesie. Takie podejście jest niezbędne do wyjaśnienia subtelnych zmian, które mogą zmienić endocytozę bez jej globalnego blokowania, jak to widać w przypadku regulacji fizjologicznej. Skupimy się na wykorzystaniu tej techniki do analizy obszaru pojawiającego się zainteresowania, jakim jest rola składu ładunku w modulowaniu dynamiki odrębnych dołów pokrytych klatryną (CCP). Protokół ten jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi sondami fluorescencyjnymi i może być stosowany do wizualizacji dynamiki wielu cząsteczek ładunku, które są internalizowane z powierzchni komórki.

Wykorzystując mikroskopię TIRF na żywych komórkach, zarejestrowaliśmy dynamikę endocytozy receptora opioidowego µ (MOR), który jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), oraz jego białka adaptacyjnego endocytozy β-arrestyny. Konstrukt β-arrestyny został przejściowo przetransfekowany do linii komórkowej stabilnie ekspresującej MOR zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1, a obrazowanie przeprowadzono 96 h później. Receptor MOR w stabilnej linii komórkowej jest oznakowany na N-końcu białkiem G...

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamiki poszczególnych dołów pokrytych klatryną w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję znakowanych fluorescencyjnie białek endocytarnych i cargo do linii komórek adherencji. Kolejnym krokiem jest zobrazowanie komórek za pomocą całkowitego odbicia wewnętrznego, fluorescencji lub mikroskopii darniowej.Żywotność małych zestawów wgłębień pokrytych klatryną jest następnie oznaczana ilościowo ręcznie za pomocą programu do przetwarzania i analizy obrazu. Ostatnim krokiem jest ilościowe określenie czasu życia dołów pokrytych klatryną poprzez obiektywne automatyczne wykrywanie i analizę. Ostatecznie mikroskopia murawy służy do ilościowego określenia dynamiki poszczególnych dołów pokrytych klatryną w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia w celu zbadania endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu błonowego, takie jak to, w jaki sposób składanie i dynamika endocytozy mogą się zmieniać w zależności od obecnych różnych białek endocytarnych i białek ładunkowych. Aby rozpocząć, transfekcja HEC 2 93 komórki z plazmidami kodującymi znacznik G receptory sprzężone z białkiem G lub GPCR i/lub składniki maszynerii Claro. Na płytce 12-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym, dzień po transfekcji dodać 0,5 mililitra soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS z jednym milimolowym EDTA do każdej.Cóż, następnie umieść trzy rundy sterylnej 25-milimetrowej pokrywy w oddzielnych dołkach po sześć. Talerz studzienkowy Napełnij każdą studzienkę dwoma mililitrami pożywki. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do dna studzienki, aby zapobiec wzrostowi komórek na spodniej stronie szkiełka nakrywkowego.Następnie ręcznie zamieszaj studzienkę na płytce 12-dołkowej, aby podnieść komórki z dna studzienki. Dodaj jeden mililitr DM EM z 10% FBS, aby wysłać ponownie. Następnie rozprowadź podniesione komórki z jednego dołka równomiernie między trzema szkiełkami nakrywkowymi.Pozwól komórkom rosnąć na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 48 godzin przed obrazowaniem. Upewnij się również, że komórki są rozłożone i płaskie, aby zobrazować dynamikę dołu pokrytego klatryną i ładunku. Najpierw należy wstępnie inkubować komórki z przeciwciałami, jak opisano w protokole tekstowym.Następnie przygotuj się do przeniesienia szkiełka nakrywkowego do komory obrazowania żywych komórek za pomocą kleszczy i igły o rozmiarze 25 wygiętej na końcówce w haczyk. Trzymaj parę kleszczy w dominującej ręce. Przytrzymaj wygiętą igłę w drugiej.Obróć igłę, aż haczyk wygina się w dół w kierunku szkła. Delikatnie przeciągnij haczykiem igły w dół po dnie płytki sześciodołkowej, aż zaczepi się o szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni szkiełka nakrywkowego, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek.Delikatnie podnieś szkiełko pokrywy z dna studzienki. Zrównoważyć szkiełko nakrywkowe przy ścianie studni, aby uzyskać podparcie. Za pomocą kleszczyków chwycić w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesunąć stronę z komórką szkiełka nakrywkowego do góry do komory obrazowania.Zmontuj komorę i dodaj 700 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do obrazowania. Po przeniesieniu komory do mikroskopu, ustaw komórki w ostrości za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju darniowym, obrazując komórki w konwencjonalnych trybach oświetlenia epi, fluorescencji lub konfokalnej, aby zidentyfikować komórki wyrażające odpowiednie konstrukty jako ważny środek ostrożności. Zawsze zwracaj uwagę na kąt wiązki laserowej i zawsze kieruj ją z dala od obserwatora.Następnie skup się na dolnej powierzchni komórki wykazującej ekspresję, aż zniknie zarys błony plazmatycznej wokół komórki i pojawi się dolna powierzchnia komórki. Jest to najbardziej widoczne w przypadku zlokalizowanego białka ładunkowego błony plazmatycznej, takiego jak receptor opioidowy mu. Jeśli używasz tych samych laserów do obrazowania w konwencjonalnej fluorescencji epi, zwiększ kąt padania lasera aż do wyjścia z ostrości.Fluorescencja we wnętrzu komórki zanika i nie widać zarysu błony plazmatycznej wokół komórki. Po znalezieniu się na murawie upewnij się, że laser wzbudzający odbija się z powrotem przez obiektyw i nie jest widoczny nad obiektywem. Sprawdzając, czy plamka lasera jest widoczna, popraw ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz.Po zidentyfikowaniu komórek pobieraj obrazy co najmniej co trzy sekundy przez 10 minut. Powtórz wszystkie kroki, aby zobrazować dodatkowe komórki. Aby rozpocząć analizę dynamiki endocytarnej, otwórz plik na obrazie J.Obrazy są przechowywane jako pojedynczy stos plików TIFF.Z kanałami międzywarstwowymi. Przekonwertuj obrazy na hiperstosy, wybierając pozycję hiperstosy obrazów i stos do hiperstosu w oknie podręcznym. Wprowadź liczbę pobranych kanałów.Wprowadź jedną dla Zacka i wprowadź liczbę klatek filmu. Format hyper stack daje okno z dwoma paskami przewijania. Użyj górnego paska, aby poruszać się po kanałach, a dolnego paska, aby poruszać się w czasie.Przewiń do kanału białka, którego czas życia zostanie oznaczony. Wyjdź poza pierwszą klatkę filmu, aby zmniejszyć włączenie istniejących wcześniej dołów pokrytych klatryną lub CCP, których cały czas trwania nie jest widoczny. Narysuj obszar zainteresowania lub ROI wokół losowo wybranego miejsca.Policz liczbę klatek, w których widoczny jest spot. Aby rozpocząć analizę z rozpoznawaniem obiektów, otwórz plik z obrazem RAW Oprogramowanie do analizy obrazu pojawiło się domyślnie. Pojawi się kolorowy obraz.Użyj okna regulacji wyświetlacza, aby dostosować jasność kanału. Kliknij nazwę kanału, aby zmienić wyświetlany kolor. Odznacz pole obok kanału, aby zapobiec jego wyświetlaniu.Twórz spoty, klikając ikonę z pomarańczowymi plamkami. Wybierz obszar ROI wokół komórki, używając go, aby wykluczyć obszary, które będą nieprawidłowo wykrywać jasne krawędzie natarcia i płytki. Zmierz średnicę plamki, aby zapewnić wstępne oszacowania dla algorytmu.Przełącz się na tryb plasterków i kliknij biegunowe końce plamki, aby zmierzyć jej średnicę. Zrób to dla czterech lub pięciu okrągłych plamek, które wyglądają wskazując na CCP na wysokości swojej stabilności po uformowaniu się przed cesją, użyj tych pomiarów do obliczenia średniej średnicy z dokładnością do najbliższej 10 mikrona. Aby wykryć plamy i powrócić do trybu przekraczania, wybierz odpowiedni kanał do wykrywania.Wprowadź średnią zmierzoną średnicę, zwykle 0,3 lub 0,4 mikrona. Kliknij niebieską strzałkę do przodu, aby określić ilościowo plamy. Filtruj miejsca według jakości, dostosowując filtr, aby uchwycić jak najwięcej miejsc bez tła.Filtr jakości jest zaznaczony domyślnie. Użyj krzywej jakości jako przewodnika, aby ustawić odpowiedni próg. Przesuń dolny próg filtra lewym przyciskiem myszy do tego pierwszego zanurzenia krzywej.To dobry punkt wyjścia dla filtra. Ponieważ ta pozycja zwykle zawęża detekcję tylko do widocznych punktów. Usuń plamy arant w miejscu edycji Przełącznik ekranu, aby wybrać tryb i kliknąć miejsce Po zmianie koloru na żółty kliknij usuń.Następnie kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować tworzenie algorytmu. Mierz ścieżki, ustawiając ścieżki do brownie w ruchu. CCP nie powinien wykazywać żadnego ukierunkowanego ruchu, a jedynie minimalne dryfowanie po błonie plazmatycznej.Ten algorytm jest najbardziej odpowiedni dla tego ruchu. Następnie ustaw maksymalną odległość na małą wartość, taką jak 0,7 mikrona. Ustawienie małej odległości minimalizuje połączenie sąsiednich punktów i nadal pozwala na ciągłe śledzenie plamki komórki za pomocą CCP lub ruchu komórki.Następnie ustaw maksymalny rozmiar odstępu na jeden. Dzięki temu ścieżka może być kontynuowana, jeśli brakuje tylko jednej klatki. W przypadku następujących po sobie przerw o rozmiarach większych niż trzy powoduje, że różne ścieżki są ze sobą nieprawidłowo połączone.Następnym krokiem jest przełączenie widoku ścieżki na smoczy ogon. Przewiń film, obserwując jakość wykrywania. Jeśli łączone są sąsiednie miejsca, zmniejsz maksymalną odległość poniżej 0,7 mikrona.Jeśli plamy są zbyt łatwo rozbijane, zwiększ maksymalny rozmiar szczeliny. Kliknij niebieską strzałkę, aby utworzyć ścieżki. Prowadzi to do ekranu filtrowania ścieżek w celu filtrowania ścieżek.Użyj filtra intensywności, aby usunąć dodatkowe jasne płytki nazębne. Następnie użyj filtra przemieszczeniowego, aby usunąć endosomy, które dostają się do pola murawy. Zachowaj ostrożność, ponieważ dłuższe miejsca również będą miały większe przemieszczenie.Kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć protokół. W celu wyeksportowania danych należy przejść do zakładki statystyki. Kliknij na ikonę pojedynczej dyskietki, aby wyeksportować wybrane statystyki.Kliknij na ikonę, która wygląda jak seria dyskietek, aby wyeksportować wszystkie statystyki. Skupienie się na przylegającej do A błonie plazmatycznej i trybie konfokalnym ujawnia komórkę wypełnioną słabą fluorescencją. W przeciwieństwie do tego, skupienie się na środku komórki ujawnia błonę plazmatyczną jako pierścień fluorescencji wokół komórki.Fluorescencja poza ostrością staje się widoczna po przełączeniu na konwencjonalny epi, fluorescencję lub murawę pod niewłaściwym kątem. Gdy kąt murawy jest prawidłowy, błona plazmatyczna jest bardzo wyraźna, wyraźna i jasna oraz nieostra. Fluorescencja nie zakłóca już obrazu.Kiedy beta-aresztyna znajduje się w puli cytozolowej, bardzo mało jej znajduje się w polu murawy i wydaje się zamglona i zewnętrzna. Gdy MOR jest aktywowany przez agonistę, beta, aresztyna jest rekrutowana do błony plazmatycznej i zarówno beta aresztyna, jak i receptor redystrybuują do CCP. Okresy istnienia tych klastrów są określane ilościowo ręcznie.Korzystając z trzech parametrów zakończonej endocytozy, plamki oznaczające CCP mogą całkowicie zniknąć, włączać się i wyłączać lub szczypać większą strukturę. Pokazano tutaj CCP wykryte za pomocą MA Po przefiltrowaniu w celu usunięcia niedynamicznych struktur płytki nazębnej, nałożone białe kule oznaczają wykryte plamy, ciemniejsze plamy, których nie można było wykryć przez cały okres ich życia, zostały również wykluczone za pomocą filtra jakości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć naprawdę dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować poszczególne wgłębienia kodowane cewnikiem za pomocą mikroskopii darniowej.

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę...

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych 

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę wizualizacji dynamiki pojedynczych jam klatrynowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Przeglądaj więcej filmów