Name: Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę PNA-FISH do analizy aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B. Ta technika umożliwia ilościowe określenie niestabilności genomowej i identyfikację genów utrzymujących stabilność genomową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez grant NIH R00 CA160574 (SFB) oraz przez stypendium Rutgers Biotechnology Training Program (dla SMM).

Ta procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Rutgers, State University of New Jersey. Myszy leczono zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Naukowcy powinni skonsultować się z krajowymi i instytucjonalnymi organizacjami zajmującymi się zwierzętami w celu uzyskania ustalonych i zatwierdzonych wytycznych.
Zanim zaczniesz, przygotuj rozwiązania wymienione w Tabeli 1.
1. Izolacja i aktywacja komórek B
Uśpij mysz za pomocą CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Ustaw mysz tak, aby lewa strona ciała była podniesiona i spryskaj mysz 70% etanolem, aż futro będzie wilgotne. Rozciąć śledzionę i umieścić w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm z 2 ml buforu do przemywania. W kapturze z przepływem laminarnym delikatnie rozdrobnij śledzionę w naczyniu do hodowli tkankowej za pomocą płaskiego końca strzykawki o pojemności 5 ml.
<ol>
	<li>Włożyć siatkę nylonową o grubości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml i przenieść próbkę śledziony w 2 ml buforu do płukania do siatki nylonowej. Delikatnie rozbić śledzionę w siatce za pomocą płaskiego końca strzykawki.</li>
	<li>Przepłukać tylną część strzykawki i płytkę 35 mm 8 ml buforu do przemywania i przefiltrować przez siatkę nylonową o grubości 70 μm. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać i odrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy ACK. Pipetować w górę i w dół, aby rozbić grudki i inkubować przez 5 minut. Dodać 10 ml buforu do przemywania i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, stukając w dno probówki, a następnie pipetując 1 ml buforu do przemywania wodą. Dodać 50 μl mikrokulek anty-CD43 MACS i inkubować na lodzie przez 30 minut. Dodać 10 ml buforu do płukania, delikatnie wymieszać i odwirować w stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 10 ml buforu do płukania, delikatnie wymieszać i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Skonfiguruj kolumnę Mini-MACS, umieszczając kolumnę na magnesie MACS. Umieść oznakowaną stożkową probówkę o pojemności 15 ml poniżej kolumny. Dodać 1 ml buforu do przemywania do kolumny i pozostawić do przepuszczenia do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu do przemywania wodą. Załadować próbkę do kolumny po przejściu buforu myjącego.</li>
	<li>Po przejściu próbki przez kolumnę dodać 1 ml buforu do płukania, aby przepłukać kolumnę. Dodać 7 ml buforu do przemywania bezpośrednio do pobranej próbki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Przenieść wymaganą objętość komórek potrzebną do 5 000 000 komórek/studzienkę do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Uzupełnić pożywkę z komórek B LPS 1:500 i IL4 1:1,000.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać odpowiednią objętość uzupełnionej pożywki z komórek B, potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 1 000 000 komórek/ml.</li>
	<li>Umieścić komórki w 6-dołkowych płytkach z 5 ml komórek w stężeniu 1 000 000 komórek/ml i umieścić w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Utrwalenie komórek B
<ol>
	<li>Dodać 50 μl colcemidu do studzienki zawierającej 5 ml limfocytów B (dla końcowego stężenia 100 ng/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Ogrzać 75 mM roztwór KCl w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś limfocyty B do oznakowanej probówki o pojemności 15 ml. Przykryć etykietę taśmą i odwirować przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie. Dodaj 5 ml podgrzanego KCl kropla po kropli, stukając lub pulsując na wirze.</li>
	<li>Dodać 10 ml KCl i wymieszać przez odwrócenie. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodaj 5 kropli świeżego utrwalacza i wymieszaj, odwracając. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie w górę i w dół.</li>
	<li>Dodawać kropla po kropli 5 ml świeżego utrwalacza, stukając lub pulsując na wirze. Dodać dodatkowe 10 ml utrwalacza i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant pozostawiając 1 ml w probówce i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Dodać 14 ml świeżego utrwalacza i odwirować w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 2.7 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 14 ml świeżego utrwalacza. Uszczelnić nakrętki preparatem Parafilm i przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rozprzestrzeniania się chromosomów metafazowych
<ol>
	<li>Ustaw regulowaną komorę środowiskową na 22.9 °C i 52% wilgotności.</li>
	<li>Odwirować utrwalone komórki B o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać utrwalacz, pozostawiając 70 μl w probówce i ponownie zawiesić przez pipetowanie.</li>
	<li>Umieść oznaczone szkiełka w komorze wilgotnościowej pod kątem 35°. Upuść 35 μl zawieszonych limfocytów B na szkiełko podstawowe i upuść dwie szkiełka na próbkę. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w komorze wilgotnościowej na 30 minut, a następnie przechowuj je w pudełku na szkiełka w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Telomery PNA RYBA
<ol>
	<li>Przygotowanie sondy
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzać dejonizowany formamid do temperatury 37 °C. Zmieszać 2 μl telomerowej sondy PNA z 7 μl dejonizowanego, wstępnie ogrzanego formamidu i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wstępnie ogrzać FISH master mix do temperatury 37 °C. Dodać 7 μl wstępnie podgrzanej mieszanki FISH master do mieszaniny z kroku 4.1.1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-3 godziny.</li>
		<li>Denaturować mieszaninę sondy przez 8 minut w temperaturze 80 °C. Wstępnie wyżarzać sondę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna obróbka preparatów chromosomowych
	<ol>
		<li>Podgrzać szklany słoik do barwienia szkiełka zawierającego 50 ml 0,01 M HCl do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Umieść szkiełka w innym szklanym słoiku do barwienia szkiełek zawierającym 2x SSC na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 2 μl bulionu pepsyny do wstępnie podgrzanego szklanego słoika do barwienia szkiełek i wymieszaj, odwracając do nowa. Przenieść szkiełka do słoika do barwienia szkiełek i inkubować przez 90 sekund w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj szkiełka 2x w innym szklanym słoiku do barwienia szkiełek zawierających 1x PBS przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej, wstrząsając. Następnie myj szkiełka przez 5 minut w 1x PBS/MgCl2 w temperaturze pokojowej, wstrząsając.</li>
		<li>Przenieść szkiełka do szklanego słoika do barwienia szkiełek zawierających świeżo przygotowany 1% formaldehyd/1x PBS/MgCl2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myj szkiełka przez 5 minut w innym szklanym słoiku do barwienia zawierającym 1x PBS w temperaturze pokojowej, wstrząsając.</li>
		<li>Przygotuj serię odwadniania etanolu, mając oddzielne szklane słoiki do barwienia szkiełek zawierające 70%, 90% i 100% etanolu.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do każdego słoika na 3 minuty, zaczynając od 70% etanolu, następnie 90% etanolu, a następnie 100% etanolu. Po zakończeniu umieść słoiki z etanolem w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, stukając nadmiar etanolu w ręcznik papierowy i podpierając szkiełka pod kątem 35°. Po wyschnięciu zaznacz obszar o wymiarach 18 x 18 mm do hybrydyzacji na odwrocie szkiełek za pomocą pisaka diamentowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Denaturacja szkiełek dla FISH
	<ol>
		<li>Nałożyć 120 μl 70% dejonizowanego formamidu/2X SSC na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm. Przyłóż szkiełko do szkiełka nakrywkowego. denaturować szkiełko w temperaturze 80 °C na płycie grzejnej przez 90 sekund.</li>
		<li>Szybko i ostrożnie zsuń szkiełko nakrywkowe i umieść szkiełko w lodowatym 70% etanolu na 3 minuty, a następnie 90% etanolu i 100% etanolu na 3 minuty. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Przygotuj wilgotną komorę, wykładając plastikowe pudełko szczelną pokrywką i mokrą bibułą. Papier powinien być wilgotny, ale nie nasycony wodą.</li>
		<li>W wilgotnej komorze nanieść wstępnie wyżarzoną mieszankę sondy z kroku 4.1.3 na zaznaczony obszar na szkiełku, przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie po inkubacji
	<ol>
		<li>Podgrzej 50% formamidu/2x SSC, 1x SSC i 4x SSC/0,1% Tween-20 w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.</li>
		<li>Ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywkowe i umyć je w podgrzanym 50% formamidzie/2x SSC 3xprzez 5 minut każdy w ciemności i potrząsając. Umyj szkiełka we wstępnie podgrzanym 1x SSC 3x przez 5 min każdy, wstrząsając. Na koniec umyj szkiełka we wstępnie podgrzanym 4x SSC/0,1% Tween-20 3x przez 5 minut każda.</li>
		<li>Szkiełka należy barwić przez 3 minuty w DAPI w światło, zabezpieczonym szklanym słoikiem do barwienia szkiełek.</li>
		<li>Myć szkiełka przez 5 minut w 2x SSC, wstrząsając. Nałożyć 35 μl podłoża montażowego Mowiol, przykryć szkiełkami nakrywkowymi o wymiarach 24 x 60 mm i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mikroskopowa analiza chromosomów
<ol>
	<li>Analizuj szkiełka metafazowe za pomocą standardowego mikroskopu epi-fluorescencyjnego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy skorzystać z platformy obrazowania ze zautomatyzowanym stolikiem, takiej jak platforma MetaSystems Metafer. Dla każdego rozprzestrzeniania się metafazy zbierz jeden obraz dla fluorescencji DAPI, aby uwidocznić chromosomy, i jeden obraz dla sygnału fluorescencyjnego z sondy telomerowej. (Np. Cy3- inne fluory są dostępne i działają równie dobrze.)</li>
	<li>Nałóż obrazy za pomocą programu do analizy obrazu i przeanalizuj.</li>
</ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podczas gdy aktywowane limfocyty B są szczególnie odpowiednie do przygotowania mitotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów, można również wykorzystać inne typy komórek. Limfocyty T mają wiele zalet limfocytów B, ponieważ mogą być oczyszczane ze śledziony lub węzłów chłonnych i mają wysoki indeks mitotyczny, gdy są stymulowane przez wzrost w pożywce zawierającej odpowiednie mitogeny8. Embrionalne komórki macierzyste (komórki ES) są również przystosowane do analizy chromosomów metafazy9. Jeśli nie...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Rak jest spowodowany przez nagromadzenie mutacji wpływających na geny, które regulują normalny wzrost komórek. Mutacja jest konsekwencją zmian w strukturze i sekwencji genomu spowodowanych uszkodzeniem DNA. Uszkodzenie DNA może nastąpić w wyniku różnych procesów, w tym czynników egzogennych, takich jak promieniowanie jonizujące, oraz jako produkt uboczny normalnego metabolizmu komórkowego, takiego jak spontaniczna deaminacja zasad nukleotydowych lub uszkodzenie powstałe w wyniku kontaktu z reaktywnymi formami tlenu1.
Chociaż komórki ssaków posiadają szereg czynności naprawczych, które mogą odwrócić uszkodzenia DNA lub przywrócić sekwencję w miejscach przerwania, mutacje kumulują się przez cały okres życia komórki. Uszkodzenie DNA może ponadto przyczyniać się do starzenia się i utraty siły działania komórek macierzystych, dwóch procesów związanych z chorobami związanymi ze starzeniemsię 2. Zrozumienie procesu naprawy uszkodzeń DNA ma zatem zasadnicze znaczenie dla rozwiązania dwóch istotnych problemów w dziedzinie zdrowia publicznego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że szlaki naprawy DNA ssaków mogą przyczyniać się do ewolucji genomu komórek nowotworowych3,4, co sprawia, że jeszcze ważniejsze staje się zrozumienie procesów związanych z tłumieniem mutacji na poziomie molekularnym.
Bezpośrednia wizualizacja aberracji chromosomowych jest potężnym i ilościowym sposobem określania stopnia niestabilności genomu w określonym typie komórki. Skondensowane chromosomy z komórek w metafazie można wyizolować i sprawdzić za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Takie podejścia cytogenetyczne są stosowane w praktyce od kilkudziesięciu lat i mogą być wykorzystywane do wykazania pojawienia się translokacji lub określonych typów aberracji chromosomowych związanych z utratą czynności naprawy DNA. Protokół ten nadaje się do kilku potencjalnych rozszerzeń: chromosomy mogą być znakowane za pomocą sond do kariotypowania spektralnego (SKY) lub wielokolorowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) w celu identyfikacji translokacji5,6. Techniki te umożliwiają również określenie częstotliwości translokacji chromosomowych i struktury złożonych translokacji chromosomowych, co dostarcza dodatkowych informacji wykraczających poza to, co jest możliwe w przypadku tego protokołu. Alternatywnie, można wygenerować sondy specyficzne dla sekwencji, które można wykorzystać do zbadania częstotliwości pękania DNA w wybranych miejscach genomu7.
W tym protokole opisujemy przygotowanie rozprzestrzeniania się chromosomów metafazowych z limfocytów B. Stosowana jest znakowana fluorescencyjnie sonda peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) do powtórzeń telomerowych, która skutecznie oznacza telomery w rozprzestrzenianiu się chromosomów metafazowych Ten protokół ma kilka zalet. Limfocyty B można skłonić do wzrostu przy wysokim indeksie mitotycznym, dzięki czemu można konsekwentnie wytwarzać wysokiej jakości rozprzestrzenianie się. Limfocyty B od genetycznie zmodyfikowanych myszy są również znacznie mniej podatne na wtórne mutacje genetyczne, które mogą zakłócić analizę udziału określonych genów w integralności genomu. Podejście PNA-FISH można ukończyć w ciągu jednego dnia i pozwala to na dokładniejszą ocenę pęknięć chromosomów. Dzięki zastosowaniu tego podejścia, szczególnie w połączeniu ze specyficznym sprzętem opisanym w tym protokole, możliwe jest uzyskanie bardzo spójnych, wysokiej jakości spreadów i szybka analiza szybkości i rodzaju niestabilności genomu.

<table><tbody><tr><td>50% siarczan dekstranu</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; g)</td> <td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Sonda telomerowa</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td> <td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr> <tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) mikrokulki</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Suszarka cytogenetyczna</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach b przez pna-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Wadliwa naprawa DNA prowadzi do zwiększonej niestabilności genomu, co jest główną przyczyną mutacji prowadzących do nowotworzenia. Analiza częstości występowania i rodzaju aberracji chromosomowych w różnych typach komórek pozwala na wyjaśnienie defektów w szlakach naprawy DNA. Zrozumienie biologii naprawy DNA ssaków było znacznie pomocne dzięki produkcji myszy z nokautami w określonych genach. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu w mysich limfocytach B. Znakowanie telomerów za pomocą sond PNA-FISH (peptide nucleic acid - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) ułatwia szybką analizę niestabilności genomu w rozprzestrzenianiu się chromosomów metafazy. Limfocyty B mają specyficzne zalety w stosunku do fibroblastów, ponieważ mają normalną ploidalność i wyższy indeks mitotyczny. Krótkoterminowa hodowla limfocytów B umożliwia zatem precyzyjny pomiar niestabilności genomu w pierwotnej populacji komórek, która prawdopodobnie będzie miała mniej wtórnych mutacji genetycznych niż te, które zwykle występują w przekształconych fibroblastach lub liniach komórkowych pacjentów.

Chromosomy w fazie metafazy pochodzące z jednej komórki powinny tworzyć oddzielną grupę zawierającą 40 chromosomów (w przypadku użycia komórek myszy) (Rysunek 1A). Każdy chromosom posiada centromer na jednym z końców, widoczny jako jasnoniebieska sfera. W normalnych chromosomach widoczne są dwa sygnały telomerów na końcach chromatyd oraz dwa sygnały przy każdym centromerze. Na preparacie obecne będą również jądra w fazie interfazy. Będą one widoczne jako niebieskie sfery z czerwonymi sygnałami telomerów,...

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie niestabilności genomu w mysich limfocytach B. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie komórek B do pierwotnej hodowli komórek. Następnie komórki są utrwalane, co ułatwia przygotowanie rozprzestrzeniania się metafazy.Na koniec wykonuje się telomery PNA w celu wizualizacji telomerów znakowanych fluorescencyjnie. Ostatecznie poziom różnego rodzaju aberracji chromosomowych można określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Implikacje tej techniki mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat szlaków naprawy DNA, ponieważ może pomóc w identyfikacji genów, które promują stabilność genomu w naszych docelowych modelach mysich.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pęknięcia chromosomów i inne duże rearanżacje chromosomowe, można ją również dostosować do pomiaru innych form niestabilności genomu, takich jak translokacje. Aby wyizolować limfocyty B, zacznij od umieszczenia świeżo wyizolowanej śledziony w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym dwa mililitry buforu do płukania w okapie z przepływem laminarnym. Następnie użyj tylnej części tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, aby delikatnie zmacerowa

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten protokół opisuje techniki kwantyfikacji i charakterystyki aberracji chromosomowych in vitro w makrofagach myszy RAW264.7 po leczeniu cząstkami powietrza atmosferycznego.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę PNA-FISH do analizy aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B. Ta technika umożliwia ilościowe określenie niestabilności genomowej i identyfikację genów utrzymujących stabilność genomową.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Przeglądaj więcej filmów