Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie niestabilności genomu w mysich limfocytach B. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie komórek B do pierwotnej hodowli komórek. Następnie komórki są utrwalane, co ułatwia przygotowanie rozprzestrzeniania się metafazy.

Na koniec wykonuje się telomery PNA w celu wizualizacji telomerów znakowanych fluorescencyjnie. Ostatecznie poziom różnego rodzaju aberracji chromosomowych można określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Implikacje tej techniki mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat szlaków naprawy DNA, ponieważ może pomóc w identyfikacji genów, które promują stabilność genomu w naszych docelowych modelach mysich.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pęknięcia chromosomów i inne duże rearanżacje chromosomowe, można ją również dostosować do pomiaru innych form niestabilności genomu, takich jak translokacje. Aby wyizolować limfocyty B, zacznij od umieszczenia świeżo wyizolowanej śledziony w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym dwa mililitry buforu do płukania w okapie z przepływem laminarnym. Następnie użyj tylnej części tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, aby delikatnie zmacerować śledzionę.

Następnie przefiltruj zawiesinę tkanek przez sitko z nylonową siatką o grubości 70 mikrometrów do 50-mililitrowej rurki za pomocą tłoka, aby delikatnie przecisnąć większe kawałki tkanki przez sitko. Opłucz płytkę i strzykawkę ośmioma mililitrami buforu do płukania i przefiltruj płyn przez sitko. Następnie, po odwirowaniu komórek, odpipetuj granulkę w górę iw dół kilka razy w trzech mililitrach buforu do lizy CK.

Po pięciu minutach przerwij reakcję za pomocą 10 mililitrów buforu do mycia. Następnie, po ponownym odwirowaniu komórek, postukaj w dolną część rurki, aby ponownie zawiesić granulkę i dodaj jeden mililitr buforu do płukania komórek. Następnie inkubuj komórki z 50 mikrolitrami mikrokulek anty CD 43 max na lodzie.

Po 30 minutach delikatnie umyj komórki w 10 mililitrach buforu do mycia. Podczas wirowania umieść kolumnę minimax na magnesie i oznaczoną stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod kolumną. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do kolumny, zbierając EIT w probówce.

Ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze buforu do płukania, a następnie załadować komórki do kolumny Po przejściu próbki przepłukać kolumnę jednym mililitrem buforu do przemywania i dodać siedem mililitrów buforu do przemywania bezpośrednio do pobranej próbki. Po policzeniu zebranych komórek przenieś je do 50-mililitrowej probówki w celu odwirowania. Następnie, aby aktywować komórki B, ponownie zawiesić osad jeden razy 10 z sześciu komórek na mililitr w uzupełnionej pożywce z komórek B i inkubować komórki na sześciu płytkach dołkowych po pięciu mililitrach komórek na studzienkę W wilgotnym inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby utrwalić komórki B.

Następnie po 50 mikrolitrach smidu do każdego z dołków. Po godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przenieś komórki B do oznakowanej probówki o pojemności 15 mililitrów. Przykryj etykietę taśmą i odkręć komórki.

Następnie odessać wszystkie z wyjątkiem około jednego mililitra supernatantu i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie. Dodaj pięć mililitrów chlorku potasu o temperaturze 37 stopni Celsjusza, kropla po kropli, pulsując w wirze. Następnie dodaj dodatkowe 10 mililitrów chlorku potasu i wymieszaj roztwór komórkowy przez inwersję.

Następnie inkubuj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie ponownie dodaj pięć kropli świeżego utrwalacza, mieszając go ponownie, odwracając. Następnie odwiruj komórki po resusie, zawieszając osad w jednym mililitrze supernatantu, dodaj pięć mililitrów świeżego utrwalacza, kropla po kropli, pulsując na wirze i inkubuj komórki i dodatkowe 10 mililitrów utrwalacza w temperaturze pokojowej.

Po 30 minutach otoczkę komórki i usunąć wszystkie oprócz jednego mililitra utrwalacza. Następnie po umyciu komórek, jeszcze dwa razy w 15 mililitrach utrwalacza, ponownie zawiesić osad w ostatnich 70 mikrolitrach supernatantu. Teraz umieść oznaczone szkiełka pod kątem 35 stopni w komorze wilgotnościowej ustawionej na 22,9 stopni Celsjusza i 52% wilgotności.

Upuść 35 mikrolitrów zawieszonych komórek B na każde szkiełko, przygotowując dwa szkiełka na próbkę. Następnie, po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia w komorze wilgotnościowej przez 30 minut, przechowuj szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza do całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu użyj pisaka diamentowego, aby zaznaczyć obszar o wymiarach 18 na 18 milimetrów do hybrydyzacji z tyłu każdego szkiełka, aby denaturować szkiełka dla ryb.

Następnie nałóż 120 mikrolitrów 70% dejonizowanego amidu formy na szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 milimetry na 60 milimetrów, a następnie przyłóż każde szkiełko do szkiełka nakrywkowego. Denaturuj szkiełka na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie szybko i ostrożnie zsuń szkiełka nakrywkowe i kolejno. Umieść szkiełka w lodowatym 70, 90 i 100% etanolu każda na trzy minuty Po wyschnięciu szkiełek umieść szkiełka w wilgotnej komorze i nałóż wstępnie potrzebną sondę Mix na zaznaczone obszary na szkiełkach.

Przykryj mieszankę sondy szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj szkiełka w uprzednio ostrzeżonych dwóch XSSC z potrząsaniem. Po pięciu minutach nałóż 35 mikrolitrów moyal na szkiełka.

Przykryj podłoże szkiełkami nakrywkowymi o wymiarach 24 milimetry na 60 milimetrów i przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec przeanalizuj szkiełka metafazowe za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego epi. Chromosomy metafazowe pochodzące z jednej komórki myszy powinny tworzyć dyskretny klaster zawierający 40 chromosomów.

Każdy chromosom ma centromer na jednym końcu, blisko dwóch sygnałów telomerowych, a także dwa dodatkowe sygnały telomerowe na drugim końcu chromosomu. Przerwy chromatydy to przerwy w jednej z dwóch chromatyd siostrzanych, które tworzą każdy chromosom metafazy. W niektórych przypadkach uszkodzony koniec chromosomu można zaobserwować jako fragment z sygnałami telomerowymi w tym samym rozprzestrzenianiu się metafazy.

Chromosomy radiowe to złożone przegrupowania obejmujące dwa chromosomy. Chromosomy mogą również zostać połączone, tworząc chromosomy dicentryczne, które pojawiają się jako fuzje chromosomów typu end-to-end z centromerami na obu końcach. Translokacje Robertsona to rodzaj translokacji między centromerami dwóch chromosomów, które pojawiają się jako cztery siostrzane ramiona chromatyczne przyłączone do pojedynczego centromeru.

Na tym ostatnim zdjęciu pokazana jest metafaza, w której nie ma sygnałów telomerowych. Brak sygnałów telomerowych może wynikać z błędów w przygotowaniu sondy lub z pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym podczas hybrydyzacji. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza cyklu komórkowego i informacje o okrężnicy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zwiększona niestabilność genomu wpływa na żywotność komórki.