Kurczliwość paska mięśni gładkich pęcherza moczowego jako metoda oceny farmakologii dolnych dróg moczowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena fizjologicznych i farmakologicznych właściwości tkanki mięśni gładkich pęcherza moczowego. Osiąga się to poprzez wypreparowanie pęcherza szczura, otwarcie go na płaski arkusz i przecięcie pasków zawierających nabłonek dróg moczowych, mięśnie gładkie i nerwy. W drugim kroku tkanka jest podłączana do przetwornika siły podłączonego do wzmacniaczy i stymulatorów do pomiaru kurczliwości mięśni.

W kolejnym kroku ustala się ton wyjściowy i żywotność tkanek, a następnie paski poddaje się stymulacji farmakologicznej i/lub elektrycznej. Ostatecznie można zmierzyć wpływ bodźców na kurczliwość tkanki mięśni gładkich pęcherza moczowego. Metoda ta służy do scharakteryzowania wpływu związków patologicznych i farmakologicznych na cały pęcherz moczowy, a także na określone składniki tkanki pęcherza moczowego, takie jak nerwy mięśni gładkich w nabłonku dróg moczowych, u ludzi i zwierząt.

Technika ta jest szeroko stosowana podczas opracowywania terapii różnych dysfunkcji pęcherza moczowego, ponieważ stanowi szybką, łatwą i powtarzalną metodę badań przesiewowych pod kątem środków farmakologicznych w dobrze zdefiniowanym i kontrolowanym środowisku. Po potwierdzeniu znieczulenia przez utratę kończyny tylnej, należy wycofać odruch, ogolić brzuch zwierzęcia, a następnie odsłonić narządy miednicy przez nacięcie brzucha w linii środkowej. Następnie zidentyfikuj pęcherz moczowy i cewkę moczową, a następnie przeciąć szyję pęcherza moczowego w pobliżu bliższej cewki moczowej.

Aby usunąć pęcherz, natychmiast umieść chusteczkę w naczyniu pokrytym osłoną parapetu wypełnionym napowietrzonym roztworem Creb. Następnie, po złożeniu zwierzęcia w ofierze, należy wprowadzić szpilki do wypreparowania tkanek przez kopułę pęcherza, szyję i moczowody, aby ustabilizować tkankę do dalszej sekcji bez rozciągania tkanki. Przytnij pęcherz z obcej tkanki, a następnie otwórz tkankę od podstawy do kopuły, aby utworzyć płaską marskość wątroby stroną do dołu i świetlistą stroną do góry.

Umieść szpilki preparacyjne w każdym rogu tkanki, a następnie usuń tkankę pęcherza moczowego, szyi i kopuły. Następnie przetnij tkankę wzdłuż od podstawy do kopuły na paski o wymiarach około dwóch na osiem milimetrów, mocując klips do tkanek na obu końcach każdego paska. Przenieś paski do komór doświadczalnych, mocując jeden koniec każdego paska do przetwornika siły, a drugi do nieruchomego pręta.

Teraz delikatnie rozciągnij tkanki, aż napięcie wyjściowe osiągnie jeden gram. Początkowo tkanka ma tendencję do rozluźniania się, co rejestruje się jako spadek napięcia wyjściowego. Myj paski mniej więcej co 15 minut ciepłymi, napowietrzonymi naleśnikami i dostosuj napięcie podstawowe do jednego grama.

Po każdym myciu pozwól chusteczkom zrównoważyć się przez około jedną do dwóch godzin, aż przestaną się rozluźniać. Gdy napięcie podstawowe się ustabilizuje, dodaj chlorek potasu bezpośrednio do kąpieli na pięć minut lub do momentu osiągnięcia plateau w celu zbadania żywotności tkanek. Następnie umyj chusteczki trzy do pięciu razy ciepłymi, napowietrzonymi krebami, aby umożliwić tkance powrót do stanu sprzed zabiegu.

W celu farmakologicznej stymulacji mięśni gładkich należy dodawać leki ze stężonych roztworów bezpośrednio do kąpieli. Na przykład w przypadku stymulacji karbaholem dodaj 10 mikrolitrów każdego ze stężeń bodźca do każdej 10-mililitrowej kąpieli tkankowej. Gdy tylko reakcja z poprzedniego stężenia osiągnie plateau.

W równoległych paskach dodaj równe ilości nośnika do stymulacji neuronalnej mięśni gładkich lub stymulacji pola elektrycznego. Ustaw czas trwania pociągu na trzy do 10 sekund, a interwał między trenacjami na co najmniej jedną minutę. Po ustaleniu częstotliwości bodźców pociągu uruchom krzywą odpowiedzi częstotliwościowej w zakresie od 0,5 do 50 Hz, aby ustalić intensywność bodźca.

Systematycznie zwiększaj napięcie, aż amplituda skurczów osiągnie plateau, utrzymując stałą częstotliwość. Po ustaleniu parametrów stymulacji należy odczekać około 20 do 30 minut, aby stymulacja polem elektrycznym, wywołane skurcze, ustabilizowały się przed testami narkotykowymi. Następnie, aby przetestować wpływ alfa beta metylenu a TP i atropiny na stymulację pola elektrycznego, na przykład, należy wykonać dwie kontrolne krzywe odpowiedzi częstotliwościowej, a następnie dodać 10 mikrolitrów alfa beta metylenu a TP do paska testowego i 10 mikrolitrów nośnika do pasków kontrolnych.

Alfa beta metylen A TP bezpośrednio stymuluje receptory puryczne w mięśniach gładkich i znieczula te receptory, powodując początkowy skurcz linii podstawowej. Gdy odpowiedź powróci do linii bazowej, powtórz krzywe odpowiedzi częstotliwościowej we wszystkich paskach. Dodaj 10 mikrolitrów atropiny do paska testowego i 10 mikrolitrów nośnika do pasków kontrolnych i powtórz krzywe odpowiedzi częstotliwościowej na końcu stymulacji polem elektrycznym.

Sprawdź selektywność stymulacji pola elektrycznego poprzez blokowanie transmisji nerwowej za pomocą blokera kanału sodowego tetra do toksyny. Na koniec odepnij paski. Delikatnie zablokuj je na kawałku bibuły, aby wyeliminować nadmiar płynu i zmierz wagę każdego paska na wadze, aby określić wpływ na napięcie mięśni gładkich.

Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby wybrać okno co najmniej 10 do 30 sekund przed i w szczytowym momencie odpowiedzi indukowanej lekiem i zmierz amplitudę skurczu, aby określić wpływ eksperymentalnych terapii na skurcze wywołane przez nerwy. Zmierz amplitudę, czas trwania i obszar pod krzywą co najmniej trzech skurczów przed i w szczycie odpowiedzi indukowanej lekiem. Na koniec znormalizuj dane, aby porównać wyniki między paskami i leczeniem farmakologicznym.

Spontaniczna aktywność miogenna to cecha mięśni gładkich, która zmienia się podczas rozwoju poporodowego i patologii. W tym reprezentatywnym eksperymencie paski od nowonarodzonych szczurów wykazują rytmiczne skurcze o dużej amplitudzie i niskiej częstotliwości, podczas gdy paski od dorosłych szczurów wykazują aktywność o małej amplitudzie wysokiej częstotliwości po urazie rdzenia kręgowego. Wzorzec noworodkowy ponownie pojawia się otin, otwieracz kanałów A-K-C-N-Q zmniejsza amplitudę spontanicznej aktywności w paskach od dorosłego szczura napięcie mięśni gładkich i właściwości kurczliwości, na które może wpływać nabłonek dróg moczowych i błona śluzowa, są ważnymi czynnikami dla prawidłowego funkcjonowania pęcherza podczas przechowywania moczu i oddawania moczu.

Na przykład na tym wykresie zależny od stężenia wzrost napięcia mięśni gładkich. Zilustrowano aktywację receptorów muskarynowych w paskach pęcherza moczowego świni. Zmniejszenie kurczliwości mięśni w odpowiedzi na leczenie karbaholem obserwuje się w obecności błony śluzowej.

Jak pokazano na tym wykresie, pięć receptorów HT four ulega ekspresji w nerwach przywspółczulnych, a ich aktywacja zwiększa poziom acetylocholiny. Wykresy te ilustrują różną skuteczność i siłę pobudzającego działania pięciu agonistów receptora HT czterech, cyzaprydu na ludzki pęcherz moczowy w porównaniu z paskami jelita krętego. Różnice gatunkowe, które istnieją w wielu receptorach, można ocenić za pomocą tej metody paskowania pęcherza moczowego.

Na przykład dane te pokazują, że antagoniści receptora bombezyny działają pobudzająco na pęcherz szczura, ale nie mają wpływu na paski pęcherza myszy lub świni. W przypadku stymulacji farmakologicznej ważne jest, aby zwrócić uwagę na stężenie, czas i czas stosowania leku. Aby uniknąć niespecyficznego wpływu na inne receptory lub odczulania docelowych receptorów do stymulacji neuronalnej, ważne jest, aby wybrać odpowiednie parametry stymulacji pola elektrycznego zgodnie z celem eksperymentu i upewnić się, że bodziec nie aktywuje bezpośrednio mięśni gładkich.