Lateralizowany model uczenia się zapachu u nowonarodzonych szczurów do analizy obwodów neuronalnych leżących u podstaw tworzenia pamięci

Protokół ten wprowadza zlateralizowane wczesne uczenie się preferencji zapachowych u szczurów przy użyciu ostrych pojedynczych nieokluzji. Osiąga się to poprzez skonstruowanie najpierw wyjmowanych zatyczek na nos z polietylenu. Drugim krokiem jest zamknięcie pożądanego Barana przed treningiem behawioralnym.

Następnie przygotuj pachnącą ściółkę, a następnie trenuj zwierzę w pachnącej pościeli, głaszcząc je pędzlem. Ostatnim krokiem jest przetestowanie preferencji zapachowych lateralizowanych za pomocą aparatury testowej do wyboru dwóch wyborów. Ostatecznie immunohistochemia fosforylowanego białka wiążącego element odpowiedzi C amp lub P crib jest wykorzystywana do wykazania jednostronnego wyciszenia aktywności neuronalnej z powodu pojedynczego odosobnienia i odwracalności metody.

Główną zaletą tej techniki naszych istniejących metod kontroli zwierząt jest to, że jesteśmy w stanie zmniejszyć zmienność i liczbę zwierząt dzięki charakterowi naszego projektu eksperymentalnego kontroli wewnątrzzwierzęcej przed warstwą poporodową 11, ze względu na brak projekcji MA dojrzałych przednich węzłów, że dwie półkule węchowe nie są połączone. To pozwala nam manipulować jedną półkulą niezależnie od drugiej poprzez pojedynczą okluzję odżywczą. Okluzyjne półkule służą jako kontrola wewnątrzzwierzęca.

Chociaż technika ta koncentruje się na uczeniu się węchu u nowonarodzonych szczurów, jej implikacje pozwolą nam odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące procesów neuronalnych podczas uczenia się i pamięci, takich jak plastyczność synaptyczna, metaplastyczność i leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne. Wnioski płynące z badań z wykorzystaniem tej metody można uogólnić na podstawowe zasady uczenia się i pamięci oraz ssaki, zwłaszcza w krytycznych okresach poporodowych. Pomoże nam to stworzyć obiecujące podstawy dla potencjalnych terapii utraty pamięci związanej ze stanami patofizjologicznymi.

Metoda ta jest również wysoce odpowiednia dla innych procesów związanych z węchem, takich jak percepcja zapachu i powlekanie zapachowe. Zatyczka do nosa jest wykonana z rurki polietylenowej 20 i trzech zerowych nici do szwów jedwabnych. Najpierw wytnij mały kawałek polietylenu 22 na około 0,8 centymetra.

Następnie przeciągnij jedwabny szew przez przygotowaną rurkę tak, aby po obu stronach odcinka rurki znajdowała się nić. Na jednym końcu nici na zewnątrz wtyczki zawiąż węzeł. Przeciągnij odcinek rurki w dół nad węzłem w gwincie.

Węzeł powinien utkwić w rurce. Przytnij oba końce gwintu tak, aby około dwóch milimetrów gwintu wystawało z jednego końca rurki. Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij szczenię z tamy i umieść je w bezpiecznym naczyniu pokrytym zwykłą ściółką.

Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nanieś galaretkę znieczulającą miejscowo, 2% Xylocaine na Barana, który ma być okludowany. Pozwól szczeniakowi odpocząć w naczyniu przez około trzy minuty. Lucin w szczenię jest najbardziej krytycznym krokiem w tej procedurze.

Lekarstwo powinno być przyjmowane podczas zakładania zatyczki do nosa, aby zapobiec krwawieniu i uszkodzeniu tkanek. Następnie podnieś szczeniaka i delikatnie ale pewnie trzymaj go w ręce niedominującej ręką dominującą, podnieś nos, zatkaj i nałóż tę samą galaretkę znieczulenia miejscowego wokół końcówki, z której nitka nie wystaje. Będzie to działać zarówno jako środek znieczulający na każdy drobny ból związany z włożeniem korka, jak i jako lubrykant wewnątrz nes.

Delikatnie włóż zatyczkę na nos, mocno trzymając szczeniaka i powoli obracając zatyczkę bardzo delikatnymi naciśnięciami, aż wtyczka zostanie całkowicie włożona i tylko dwumilimetrowy gwint będzie wystawał z Barana. Podczas tego procesu nie powinno być krwawienia z żadnego z Baranów. Szczenięta z krwawieniem podczas zakładania zatyczki do nosa nie mogą być wykorzystywane w eksperymencie.

Pozwól zwierzęciu odpocząć w naczyniu przez pięć minut, aby przyzwyczaić się do wtyczki Przed rozpoczęciem treningu, aby zapobiec zanieczyszczeniu zapachem, przygotuj pachnącą ściółkę w dygestoriach i nosząc nowe rękawice, umieść 500 mililitrów ściółki z wiórów drzewnych w plastikowej torbie. Za pomocą strzykawki nabierz 0,3 mililitra ekstraktu z mięty pieprzowej i spryskaj nim pościel w plastikowej torbie. Zawiąż worek, energicznie potrząśnij workiem i pozwól pościeli spoczywać w torbie przez pięć minut, a przed użyciem umieść pachnącą pościel w przezroczystym, płytkim akrylowym pudełku treningowym o wymiarach 20 na 20 na 20 na pięć centymetrów odkrytym w dygestorium.

Po przygotowaniu pościeli wyrzuć zużyte rękawiczki. Nie dopuszczaj do kontaktu rękawic ze zwierzętami. Umieść 500 mililitrów bezzapachowej pościeli w innym czystym akrylowym pudełku treningowym i upewnij się, że nie ma ona kontaktu z pachnącą pościelą lub zużytymi rękawiczkami.

Rozpocznij paradygmat kondycjonowania zapachu, umieszczając przyzwyczajonego szczeniaka na pachnącej pościeli w celu uzyskania eksperymentalnego zapachu. Plus szczenięta z dodatnim wynikiem udaru OS. Głaszcz szczeniaka przez 30 sekund.

Używając małego pędzla, wykonuj szybkie ruchy okrężne, głównie wokół tylnej części szczeniaka. Głaskanie indukuje uwalnianie noradrenaliny do opuszki węchowej i kory węchowej. Służy to jako bodziec bezwarunkowy.

Pozwól szczeniakowi odpocząć przez 30 sekund. Powtórz 30-sekundowe głaskanie, a następnie 30 sekund odpoczynku, w sumie 10 minut. Kiedy 10 par głaskania i zapachu zostanie zakończonych, wyjmij szczeniaka z pudełka kondycjonującego.

Wyjmij zatyczkę na nos i zwróć szczenię do zapory w celu kontroli. Zapach tylko OS ujemne szczenięta. Połóż przyzwyczajonego szczeniaka na pachnącej pościeli na 10 minut bez głaskania.

Po 10 minutach wyjmij szczeniaka z pudełka kondycjonującego. Wyjmij zatyczkę na nos i załóż szczenię z powrotem do zapory. Lateralizowane badanie preferencji zapachowych jest przeprowadzane w różnych punktach czasowych po końcowej sesji treningowej.

Testowanie odbywa się w komorze testowej ze stali nierdzewnej o wymiarach 30 na 20 na 18 centymetrów, która jest umieszczona na dwóch akrylowych pudełkach treningowych oddzielonych dwucentymetrową strefą neutralną. Jedno pudełko treningowe zawiera pachnącą pościel, podczas gdy drugie pudełko zawiera czystą, bezzapachową pościel. Przygotuj jedną pościel o zapachu mięty pieprzowej i jedną pościel bezzapachową, jak pokazano wcześniej, i umieść każde pudełko po przeciwnych stronach komory testowej.

Dwa centymetry od siebie. Umieść plastikową siatkę na metalowej siatce na podłodze komory testowej. Usuń P z zapory i umieść mocną warstwę bezwonnego smaru silikonowego na zablokowanym Baranie.

Podczas treningu smar może być ponownie nakładany podczas pierwszej procedury testowej, jeśli zajdzie taka potrzeba. Umieść szczeniaka w neutralnej strefie komory testowej. Pozwól szczeniakowi eksplorować komorę przez minutę, rejestrując, ile czasu szczeniak spędził po obu stronach komory, tj. nad miętą pieprzową lub neutralnie pachnącą pościelą.

Przenieś szczeniaka do zakrytej plastikowej komory trzymania i pozwól mu odpocząć przez minutę. Powtórz próby testowe przez łącznie 10 minut, zmieniając początkową orientację szczeniaka w komorze w celu kontrolowania preferencji kierunkowych. Natychmiast po badaniu zetrzyj smar z Barana.

Włóż polietylenową zatyczkę do nosa do przeciwległego Barana, postępując zgodnie z tą samą procedurą odosobnienia RY, którą pokazano wcześniej, i pozwól zwierzęciu odpocząć przez 10 minut. Następnie na szczeniaku przeprowadza się lateralizowane badanie preferencji zapachowych. Znów. Po zakończeniu testów wyjmij wtyczkę i zwróć szczenię do zapory.

Pojedyncze wąskie odosobnienie podczas treningu zapachu plus głaskanie prowadzi do zlateralizowanej pamięci zapachu, która jest ograniczona do oszczędzonych NRI. Kiedy szczenięta są testowane pod kątem preferencji zapachowych z takim samym odosobnieniem, jak podczas treningu, wykazują preferencję dla zapachu kondycjonowanego. Nie zaobserwowano tego, gdy testy przeprowadzono z przeciwległym nie odosobnionym miejscem.

W przeciwieństwie do tego, grupy kontrolne tylko zapachowe nie wykazują preferencji zapachowych, niezależnie od tego, który zapach jest zamknięty. Podczas testów, lateralizowany trening zapachu skutkuje lateralizowaną aktywacją układu węchowego podczas ekspozycji na zapach, immunohistochemia opuszki węchowej lub OB i przedniej kory gruszkowatej lub PC wykazała znacznie mniej ufosforylowanego Creb w okluzowanej półkuli po ekspozycji na zapach w porównaniu z przeciwległą oszczędzoną półkulą. Barwienie Nissela wykazuje porównywalne ciała komórkowe w warstwie komórek mitralnych OB i w warstwie komórek piramidalnych PC obu półkul.

24 godziny po usunięciu czopa nosowego Ekspresja kraba grochowego Po ekspozycji na zapach w komórkach mitralnych OB i komórkach piramidalnych w PC są porównywalne między półkulami okludowanymi i oszczędzonymi. Wskazuje to, że efekt pojedynczego badania bez odosobnienia jest przejściowy i odwracalny i nie powoduje widocznych długoterminowych uszkodzeń neuronów, które mogłyby wpływać na percepcję zapachu i aktywację neuronów na zapachy podczas testów. Po opanowaniu okluzji NA można ją wykonać w mniej niż pięć minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność podczas zatykania nozdrza. Każda nadmierna siła lub niewłaściwa technika może spowodować krwawienie, a tym samym uszkodzenie nozdrza Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak elektrofizjologia ex vivo i techniki molekularne, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące plastyczności synaptycznej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tymczasowych jednostronnych wąskich okluzji w celu lateralizacji uczenia się zapachów i przeanalizowania obwodów neuronalnych leżących u podstaw tworzenia pamięci.