Name: Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę łączenia mikrostereolitografii i elektroprzędzenia do wytwarzania biodegradowalnych membran PLGA z mikrostrukturami. Technika ta umożliwia badanie zachowań komórek macierzystych w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za fundusze od Wellcome Trust Affordable Healthcare for India oraz stypendium EPSRC Landscape Fellowship dla Ilidy Ortegi, a także za datki od The Electrospinning Company Ltd.

Oświadczenie etyczne: Oczy użyte w tym badaniu zostały użyte zgodnie z Deklaracją Otwartości na Badania na Zwierzętach:
1. Produkcja biodegradowalnych membran PLGA wyposażonych w mikrokieszenie
<ol>
	<li>Rusztowania pierścieniowe powstały w wyniku połączenia technik mikrostereolitografii i elektroprzędzenia31. Zasadniczo proces ten można podsumować w 2 częściach: (i) tworzenie szablonów PEGDA za pomocą mikrostereolitografii oraz (ii) elektroprzędzenie na szablonach w celu odtworzenia leżącej pod spodem struktury PEGDA (w tym przypadku mikrofabrykowanego pierścienia). Te dwa kroki zostały szczegółowo opisane poniżej (rysunki 1 i 2).
	<ol>
		<li>Wytwarzanie szablonów PEGDA metodą mikrostereolitografii (microSL)
		<ol>
			<li>Wykonaj pierścienie przy użyciu modelu 2-warstwowego, przy czym pierwsza warstwa (L1) stanowi podstawę konstrukcji, a druga warstwa (L2) przedstawia 6 mikrokieszeni o morfologii podkowy w zakresie rozmiarów od 300-500 μm. Wytwarzanie pierścieni PEGDA zostało niedawno opisane przez tę grupę22.
			<ol>
				<li>Utwórz L1, rysując czarne koło o średnicy 1,2 cm za pomocą dowolnego odpowiedniego programu do rysowania.</li>
				<li>Utwórz L2 w ten sam sposób, ale dołącz 8 białych struktur w kształcie podkowy o wymiarach 0,5 x 0,35 mm. Rozmieść małe białe kształty podkowy w strukturze czarnego koła.</li>
				<li>Zapisz L1 i L2 w formacie JPEG.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>W fiolce z ciemnego szkła wymieszać diakrylan glikolu polietylenowego (PEGDA, Mn = 250 g/mol) z 1% w/w kamforchinonu, fotoinicjatorem, na mieszadle magnetycznym przez 20 minut.</li>
			<li>Rozszerz wiązkę laserową zestawu do mikrostereolitografii za pomocą teleskopowego układu soczewek, a następnie wyświetl ją na programowalnym komputerowo cyfrowym urządzeniu wielozwierciadlanym (zestaw startowy DMD z obsługą UV). UWAGA: DMD odbija obraz (w tym przypadku pierścień) na lustro przez soczewkę tubusu o ogniskowej 10 cm. Obraz jest następnie kierowany przez pokryte srebrem lustro do fiolki zawierającej polimer utwardzalny (PEGDA).</li>
			<li>Wyreguluj i ostrożnie wyczyść optykę zestawu mikrostereolitografii.</li>
			<li>Umieścić 300 μl mieszaniny PEGDA w studzience na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Upewnij się, że studzienki są wstępnie pokryte teflonem lub innym materiałem nieprzywierającym, aby ułatwić usunięcie struktury po utwardzeniu.</li>
			<li>Włącz niebieski laser (MBL-III 473 nm; 150 mW) i wgraj L1 do oprogramowania ALP3-basic zainstalowanego wcześniej na komputerze. Naświetlić pierwszą warstwę przez 60 sekund. UWAGA: ALP3-basic to interfejs USB, który zapewnia połączenie między komputerem a cyfrowym urządzeniem mikrolustrowym.</li>
			<li>Dodać do studzienki 250 μl więcej PEGDA, wgrać L2 jak opisano powyżej i napromieniować L2 przez 60 sekund.</li>
			<li>Usuń nieutwardzony polimer i umyj pierścień izopropanolem O/N.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wytwarzanie biodegradowalnych membran PLGA metodą elektroprzędzenia 
		UWAGA: Pierścienie PEGDA zostały użyte jako szablony, nad którymi PLGA został elektroprzędzony, przy czym PLGA odtwarzała leżącą poniżej topografię, gdy jest obracana nad tymi szablonami. Po zawirowaniu arkusz polimeru PLGA został oderwany od kolektora. Ostateczna membrana PLGA nie zawierała pierścieni PEGDA, które pozostały przymocowane do metalowego kolektora.
		<ol>
			<li>Rozłóż pierścienie PEGDA na galwanizowanej blasze aluminiowej (12 cm x 20 cm) w celu stworzenia statycznego kolektora elektroprzędzalnego.</li>
			<li>Przymocuj pierścienie za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. UWAGA: Te pierścienie po uformowaniu mogą być ponownie wykorzystane jako szablony do elektroprzędzenia.</li>
			<li>Przygotuj roztwór polimeru do wirowania. Rozpuścić PLGA (50/50 DL-laktyd (52 mol%): glikolid (48 mol%), 44 kg/mol) w dichlorometanie (DCM) w stężeniu 20% m/w.</li>
			<li>Wymieszaj O/N przed użyciem.</li>
			<li>Umieścić 4 strzykawki insulinowe (tępo zakończone, igły o średnicy wewnętrznej 0,8 cm) na pompie strzykawkowej. UWAGA: Cztery strzykawki zapewniały szybsze elektrowirowanie niż praca z pojedynczą strzykawką.</li>
			<li>Do każdej strzykawki wsypać 2,5 ml roztworu PLGA.</li>
			<li>Elektrowirowanie przy natężeniu przepływu 30 μl/min i napięciach w zakresie od 12 do 15 kV. Pozostaw odległość między igłami a kolektorem 15 cm.</li>
			<li>Elektrowirowanie przez 1 godzinę i 30 minut, a na koniec ostrożne oderwanie elektroprzędzonego arkusza PLGA od kolektora podtrzymującego pierścienie PEGDA.</li>
			<li>Pokrój rusztowania elektroprzędzone na okręgi o średnicy 22 mm za pomocą okrągłego dziurkacza i pozostawiając strukturę pierścienia umieszczoną pośrodku.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Długoterminowe przechowywanie mikrofabrykowanych membran PLGA
Uwaga: Pierścienie PLGA zostały wyprodukowane i wysterylizowane przez akredytowane firmy zewnętrzne; próbki były napromieniane zewnętrznym zakresem dawek 25-40 KGy.
<ol>
	<li>Zamontuj membranę w małym pojemniku (plastikowa szalka Petriego) i umieść ją w torbie medycznej.</li>
	<li>Użyj bibuły filtracyjnej, aby stworzyć małe worki filtracyjne do osuszaczy. Aby utworzyć worki, złóż bibułę filtracyjną (średnica 125 mm) i przetnij powstałe półkole na pół; Następnie uszczelnij końce razem za pomocą taśmy.
	<ol>
		<li>Napełnij trzy worki z bibuły filtracyjnej odpowiednio 1 g pomarańczy krzemionkowej, chlorku kobaltu (II) i siarczanu miedzi (II).</li>
		<li>Umieść trzy worki ze środkiem osuszającym w torbie medycznej wraz z elektroprzędzoną membraną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj do torby dostępną w handlu sześciopunktową kartę wskaźnika wilgotności, aby wykryć nagromadzenie wilgoci w okresie przechowywania.</li>
	<li>Użyj próżniowej zgrzewarki do odkurzania i zamykania worka.</li>
	<li>Wyślij membrany pierścieniowe do firmy zewnętrznej w celu napromieniowania γ.</li>
	<li>Napromieniowane γ membrany PLGA należy przechowywać w szerokim zakresie temperatur od -20 °C do +37 °C w wilgotnym środowisku w inkubatorze zawierającym 5%CO2.</li>
	<li>Po przechowywaniu sprawdź wskaźnik wilgotności, aby potwierdzić, że poziom wilgotności jest poniżej 30%.</li>
	<li>Użyj skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby ocenić integralność włókien.</li>
</ol>
3. Izolacja eksplantatów rąbka
Eksplantaty rąbkowe królika zostały wyizolowane z oczu królika (uzyskane z gospodarstwa, gdzie króliki są hodowane do konsumpcji).
<ol>
	<li>Zdezynfekuj oczy królika za pomocą roztworu antyseptycznego (3%).</li>
	<li>Oczyść oczy, usuwając nadmiar tkanki otaczającej rogówkę.</li>
	<li>Oddziel obszar rąbka (zidentyfikowany jako cienki okrągły obszar między rogówką (przezroczysty) a twardówką (biały)) od reszty rogówki za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Pokrój na segmenty (o długości około 1,5 cm) pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Zdezynfekuj segmenty rąbka w 1,5% roztworze antyseptycznym przez 1 min.</li>
	<li>Pokrój segmenty rąbka na małe kawałki (100-500 μm) za pomocą ostrza skalpela.</li>
	<li>Przechowywać małe kawałki tkanki w pożywce hodowlanej (DMEM+Glutamax: Ham's F12 (1:1), 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny, 10 ng/ml EGF i 5 μg/ml insuliny) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu użycia (nie więcej niż 60 min).</li>
</ol>
4. Wyrostek komórek z eksplantatów rąbka
Eksplantaty rąbkowe królików zostały umieszczone zarówno na świeżo wytworzonych mikrofabrykowanych membranach, jak i na membranach, które były pakowane próżniowo i przechowywane przez 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Powlekaj rusztowania pierścieniowe 15 μl kleju fibrynowego (mieszanina fibrynogenu z ludzkiego osocza w stosunku 1:1 o stężeniu 18,75 mg/ml i trombiny z osocza ludzkiego o stężeniu 2,5 U/ml) za pomocą skrobaka do komórek w celu równomiernego rozprowadzenia fibryny.</li>
	<li>Umieść eksplantaty tkanek bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA za pomocą igły 25 G i mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych bardzo delikatnie, aby uniknąć oderwania eksplantatów.
	<ol>
		<li>Zmieniać pożywkę co 3 dni (receptura pożywki opisana w sekcji 3.7) i przechowywać w kulturze przez 2 tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal próbki 3,7% buforowanym formaldehydem przez 10 minut, a następnie wykonaj 3 płukania PBS.</li>
	<li>Wybarwieć przeciwstawnie przez inkubację w 1 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) lub jodku propidyny (PI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć 3 razy w PBS i przechowywać próbki przykryte folią.</li>
	<li>Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 543 nm i 800 nm (dwufotonowe).</li>
</ol>
5. Ustawianie modeli 3D rogówki zranionej przez królika
<ol>
	<li>Oczyść i zdezynfekuj oczy królika zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Owiń oczy królika, zanurzając je w 0,14% wodorotlenku amonu na 5 minut.</li>
	<li>Przepłukać oczy w PBS i zeskrobać nabłonek nożem do sklerotomów.</li>
	<li>Wytnij i odizoluj guzik rogówkowo-twardówkowy, usuwając pozostałą tkankę.</li>
	<li>Umieść nabłonek rogówki stroną do dołu na sterylnym kubku i napełnij 0,5% agarem wyprodukowanym w DMEM.</li>
	<li>Po ustawieniu umieść nabłonek rogówki stroną do góry, na małych szalkach Petriego i dodaj pożywkę hodowlaną (przepis opisany powyżej) do obszaru rąbka. UWAGA: Nie zakrywaj całej rogówki; Utrzymuj hodowlę narządów na granicy faz powietrze-ciecz.</li>
</ol>
6. Izolacja eksplantatów rąbków i włączenie rusztowań pierścieniowych do modeli 3D rogówki królika
<ol>
	<li>Pokryj błony pierścieniowe 15 μl kleju fibrynowego (mieszanina fibrynogenu w stosunku 1:1 o stężeniu 18,75 mg/ml i trombiny o stężeniu 2,5 U/ml). Użyj skrobaka do komórek, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Umieść eksplantaty tkanek bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA za pomocą igły 25 G i mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Umieść pierścienie z eksplantatami tkanek na ogołoconych rogówkach eksplantatami skierowanymi do góry i w warunkach granicy powietrze-ciecz. (Warunki te zostały już wcześniej opisane22).</li>
	<li>Modele hodowli narządów należy utrzymywać przez 4 tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 2 dni.</li>
</ol>
7. Ocena regeneracji rogówki i utrzymania komórek macierzystych
<ol>
	<li>Po 4 tygodniach utrwal rogówki za pomocą 3,7% formaldehydu.</li>
	<li>Przetwórz rogówki do konwencjonalnej histologii, aby wytworzyć skrawki parafiny o wielkości 6 μm.</li>
	<li>Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E).</li>
	<li>W przypadku immunocytochemii odparafinuj skrawki ksylenem (3 min) i ponownie uwodnij w 100% etanolu (1 min), 70% etanolu (1 min) i wodzie destylowanej (2 min).</li>
	<li>Wytycz sekcje za pomocą wstrzykiwacza Dako, aby wyznaczyć małe obszary i uniknąć nadmiernego stosowania przeciwciał.
	<ol>
		<li>Traktuj wyznaczone obszary 0,05% trypsyną (100 μl) przez 20 minut (37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie umyj PBS i dodaj 100 μl 10% koziej surowicy (blokującej) na 1 godzinę.</li>
	<li>Próbki inkubować ze 100 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego cytokeratyny 3 (CK3) i 100 μl p63 w 1% surowicy koziej O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć PBS i potraktować 100 μl biotynylowanego drugorzędowego przeciwciała przeciw mysim (1:1,000 w 1% surowicy koziej) przez 1 godzinę w temperaturze RT.</li>
	<li>Dodaj 100 μl FITC-streptawidyny (1:100 w 1% koziej surowicy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Potraktuj próbki DAPI zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 800 nm (dwufotonowej) i 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Ambati, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+avascularity+is+due+to+soluble+VEGF+receptor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1.</a> Nature. 443, 993-997 (2006).</li>
<li>Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReinach%2C+P+%22Ch+2%2C+Ocular+Transporters%22">Ch 2, Ocular Transporters</a>. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).</li>
<li>Kinoshita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+Human+Ocular+Surface+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).</li>
<li>Fatt, I., Bieber, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady-state+distribution+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+the+in+vivo+cornea%3A+I.+The+open+eye+in+air+and+the+closed+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye.</a> Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).</li>
<li>Shortt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Limbal+Epithelial+Stem+Cell+Niche%3A+Novel+Imaging+Techniques+Permit+In+Vivo+Observation+and+Targeted+Biopsy+of+Limbal+Epithelial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells.</a> STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+crypts%3A+a+novel+anatomical+structure+and+a+putative+limbal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche.</a> British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).</li>
<li>Thoft, R. A., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X%2C+Y%2C+Z+hypothesis+of+corneal+epithelial+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmolog.%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance.</a> Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).</li>
<li>Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+epithelial+repair%3A+modulation+of+stem+cell+and+transit+amplifying+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation.</a> Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).</li>
<li>Djalilian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Notch+signaling+during+corneal+epithelial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation.</a> Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).</li>
<li>Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+Stem+Cells+of+the+Corneal+Epithelium.+Survey+of+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Survey%22%5BJournal%5D)">Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology.</a> Survey. 44, 415-425 (2000).</li>
<li>Dravida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomimetic+scaffold+for+culturing+limbal+stem+cells%3A+a+promising+alternative+for+clinical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).</li>
<li>Rama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+Stem-Cell+Therapy+and+Long-Term+Corneal+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration.</a> New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).</li>
<li>Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivated+corneal+epithelial+stem+cell+transplantation+in+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders.</a> Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).</li>
<li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+cultivating+limbal+derived+corneal+epithelium+on+human+amniotic+membrane+for+clinical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).</li>
<li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+transplantation+for+the+management+of+corneal+epithelial+defects%3A+an+in+vivo+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study.</a> British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).</li>
<li>Nubile, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Stromal+Integration+of+Multilayer+Amniotic+Membrane+Transplantation+in+Corneal+Ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers.</a> American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).</li>
<li>Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane transplantation.</a> British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).</li>
<li>Gicquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Variations+in+Amniotic+Membrane+Used+for+Ex+Vivo+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).</li>
<li>Connon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variation+in+transparency+of+amniotic+membrane+used+in+ocular+surface+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration.</a> British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).</li>
<li>Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+for+Ocular+Surface+Reconstruction%3A+Donor+Variations+and+the+Effect+of+Handling+on+TGF-%CE%B2+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmolog.%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content.</a> Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).</li>
<li>Sitalakshmi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Cultivation+of+Corneal+Limbal+Epithelial+Cells+in+a+Thermoreversible+Polymer+%28Mebiol+Gel%29+and+Their+Transplantation+in+Rabbits%3A+An+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).</li>
<li>Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microfabricated+artificial+limbus+with+micropockets+for+cell+delivery+to+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea.</a> Biofabrication. 5, (2013).</li>
<li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+poly%28lactide-co-glycolide%29+electrospun+scaffolds+to+deliver+cultured+epithelial+cells+to+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea.</a> Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).</li>
<li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).</li>
<li>Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineering+Hydrogels+for+Stem+Cell+Bioengineering+and+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Charlottesv+Va%22%5BJournal%5D)">Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration.</a> Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+Materials+for+Controlling+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate.</a> Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).</li>
<li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li>
<li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li>
<li>Truckenmüller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li>
<li>Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li>
<li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniu tym opisano (a) technikę wytwarzania elektroprzędzonych membran zawierających w sobie mikrocechy oraz (b) sposób przygotowania takich membran do użytku klinicznego poprzez pakowanie próżniowe, promieniowanie gamma, a następnie przechowywanie przed użyciem. W tym konkretnym zastosowaniu opracowaliśmy membrany PLGA zawierające mikrokieszenie, które naśladują cechy fizyczne nisz rąbków komórek macierzystych. Celem tego badania jest (i) opisanie metod dostarczania czytelnikom wiedzy potrzebnej do projektowania i wytwarzania rusztowań zawierających mikrocechy do badań nad wkładem nisz komórek macierzystych w regenerację tkanek oraz (ii) zapewnienie czytelnikowi lepszego zrozumienia, jak przechowywać rusztowania elektroprzędzone przez długi czas.
Z punktu widzenia zastosowań klinicznych przechowywanie błon pierścieniowych ma ogromne znaczenie. W tej pracy degradacja pierścienia była badana przez okres 6 miesięcy. Degradacja membran jest napędzana przez hydrolizę, więc po prostu utrzymując membrany wolne od wilgoci, proces ten zostaje zatrzymany. Blackwood i wsp. stwierdzili, że zmieniając stosunek PLA do PGA, degradacja błony zmienia się32. Badanie to wykazało również, że zwiększając ilość PGA, szybkość degradacji membran elektroprzędzonych wzrosła in vivo22. Tutaj wykazano, że przy pakowaniu próżniowym membran wraz z odrobiną środka osuszającego i napromienianiu ich oraz przechowywaniu w niskich temperaturach przez 6 miesięcy, nie ma zmian w integralności i degradacji włókien. W chwili obecnej 6 miesięcy to tyle, ile badaliśmy z tymi membranami zawierającymi mikrokieszenie, ale dane dotyczące przechowywania przez 1 rok zostały zgłoszone na zwykłych membranach elektroprzędzonych w temperaturze -20 °C22 i mamy teraz niepublikowane dane dotyczące ich przechowywania w temperaturze -20 °C przez 2 lata bez żadnych oznak degradacji. W związku z tym w przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie ich w suchym miejscu w temperaturze -20 °C, ale możliwe jest przechowywanie ich w temperaturze pokojowej nawet w Indiach przez co najmniej 6 miesięcy (być może znacznie dłużej). Włączenie wskaźnika wilgotności umożliwia łatwe sprawdzenie, czy opakowanie utrzymuje membrany w stanie suchym, w którym to przypadku będą one odpowiednie do tego celu.
Transfer komórek z tych pierścieni do modeli rogówki 3D wykazano podczas umieszczania eksplantatów rąbka rogówki w mikrokieszeniach. Grupa ta poinformowała niedawno o przeniesieniu komórek do modelu rogówki królika in vitro poprzez umieszczenie eksplantatów na zwykłych błonach PLGA (błonach bez struktur pierścieniowych)24. Korzystając z obecnych mikrofabrykowanych rusztowań, transfer komórek został posunięty o krok dalej, ponieważ możemy teraz konkretnie zlokalizować eksplantaty tkanek w mikrostrukturach. Możliwość umieszczenia eksplantatów bezpośrednio w niszach pozwala również chirurgowi na użycie membran bezpośrednio na sali operacyjnej, unikając konieczności korzystania z pomieszczenia czystego w celu uprzedniego namnażania rąbkowych komórek macierzystych. Chociaż ta praca koncentruje się na rozwoju urządzeń do chorób rogówki, ta technologia mikrowytwarzania może być również stosowana do opracowywania urządzeń do wielu innych zastosowań. Przyszłe prace będą dotyczyły wytwarzania konstruktów do regeneracji innych tkanek, takich jak skóra i kości.
Podczas gdy projektowanie i wstępne wytwarzanie mikrostruktur PEGDA może być czasochłonne, po wyprodukowaniu struktury mogą być wielokrotnie wykorzystywane bez degradacji. W związku z tym późniejsze wytwarzanie mikrostrukturalnych biodegradowalnych membran PLGA metodą elektroprzędzenia może być przeprowadzane z szybkością porównywalną do produkcji zwykłych ("niestrukturalnych") membran po montażu kolektora. Chociaż w tej pracy wykorzystaliśmy mikrostereolitografię do wytwarzania form, można również zastosować inne metody wytwarzania, takie jak druk 3D lub formowanie wtryskowe. W związku z tym leżąca pod spodem forma może być wykonana z innych polimerów lub metali zamiast PEGDA. W związku z tym technika ta jest bardzo wszechstronna, a naukowcy mogą łatwo dostosować ją do własnych potrzeb i obiektów.
 Własny zestaw do mikrostereolitografii zastosowany w tym badaniu nie pozwoli na przygotowanie konstruktów o cechach poniżej 30 μm; Nie jest to ograniczenie dla opisanej tutaj aplikacji rogówki, ale może mieć kluczowe znaczenie w projektowaniu innych modeli. W takim przypadku inne techniki, takie jak polimeryzacja 2-fotonowa (2PP), mogą być interesujące, jednak technika elektroprzędzenia może nie pozwalać na odtworzenie struktur w skali submikronowej (jest to obecnie badane przez naszą grupę).
Kluczowymi etapami procesu produkcyjnego są: (i) Unikanie nadmiernego utwardzania matryc PEGDA, które można kontrolować, dostosowując czas i ilość fotoinicjatora. (ii) Kontrolowanie warunków elektroprzędzenia, takich jak temperatura i wilgotność. (iii) Odpowiednie przechowywanie elektroprzędzonych membran pierścieniowych przy użyciu pakowania próżniowego i środków osuszających.
Podsumowując, umieszczając eksplantaty tkanki rąbka w mikrocechach błony, wykazaliśmy wyrost komórek z eksplantatów na obszarach niszy, transfer komórek na zranioną rogówkę królika, a następnie ponowną epitelizację rogówki. Zbadano również degradację membran przechowywanych w różnych temperaturach i opracowano protokół pakowania, który umożliwia długotrwałe przechowywanie membran, przy czym ten ostatni jest niezbędny do opracowania membran do użytku klinicznego.

Rogówka, beznaczyniowa centralna zewnętrzna tkanka oka, jest jedną z najważniejszych tkanek zaangażowanych w widzenie1. Istnieje kilka rodzajów komórek, które utrzymują funkcję rogówki. Górna, najbardziej zewnętrzna warstwa rogówki składa się z komórek nabłonka, które mogą mieć grubość około 5-7 warstw2. Warstwa ta zapobiega inwazji bakterii do rogówki3 i umożliwia wnikanie tlenu4. Doniesiono, że komórki macierzyste nabłonka rogówki leżą w niszach lub kryptach (o rozmiarach 120-150 μm) w obwodowym obszarze rogówki znanym jako rąbek5,6. Gdy komórki macierzyste dzielą się, komórki potomne, znane również jako przejściowe komórki amplifikujące, wychodzą z nisz, a gdy podział trwa, komórki poruszają się dośrodkowo do wewnątrz i w górę, powodując końcowe różnicowanie komórek w centralnym obszarze rogówki7,8. Komórki te są rutynowo usuwane w mgnieniu oka, odsłaniając nowsze komórki pod spodem9.
Oprócz tego, że jest miejscem lokalizacji komórek macierzystych nabłonka, rąbek odgrywa również rolę w utrzymywaniu unaczynionej spojówki z dala od obszaru rogówki10. Uszkodzenie rąbka może być spowodowane oparzeniami termicznymi/chemicznymi, promieniowaniem, a także chorobami genetycznymi10. Kiedy tak się dzieje, bariera rąbka zostaje przerwana, umożliwiając komórkom spojówki przemieszczenie się na rogówkę, unaczyniając obszar, powodując w niektórych przypadkach ból i ślepotę. Stan ten jest znany jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych (LSCD)10.
Różne naturalne substraty zostały zgłoszone jako możliwe nośniki komórek macierzystych wspomagających regenerację rogówki. Na przykład błony oparte na kolagenie zostały użyte przez Dravida i wsp. 11 oraz Rama i współpracownicy12 zgłosili stosowanie fibryny w badaniu z udziałem 112 pacjentów. Obecnie jednak najczęściej stosowaną metodą leczenia jest wykorzystanie ludzkiej błony owodniowej z banku tkanek i hodowla komórek nabłonka rąbka na jej powierzchni13,14. Po utworzeniu monowarstwy błona owodniowa jest przyklejana komórką do uszkodzonej rogówki, z której wszystkie komórki spojówkowe i tkanka bliznowata są chirurgicznie usuwane przed przeszczepem komórek14. Błona owodniowa ulega degradacji w ciągu kilku tygodni do miesięcy, pozostawiając komórki nabłonkowe przyczepione do ogołoconego obszaru w celu regeneracji nabłonka15,16. Technika ta okazała się skuteczna w przywracaniu wzroku, jednak nadal istnieje kilka praktycznych problemów, które ograniczają jej powszechne zastosowanie kliniczne. Ponieważ błona owodniowa jest tkanką ludzką, przed użyciem do przeszczepu komórek u pacjentów musi przejść badania przesiewowe przy użyciu dobrych procedur bankowania tkanek. Takie badania przesiewowe jedynie obniżają ryzyko przenoszenia chorób, ale nie mogą go całkowicie wyeliminować17. Oprócz tego pojawiły się doniesienia o zmienności w działaniu błony owodniowej spowodowanej zmiennością między dawcami18,19 i różnymi metodami przetwarzania19,20. Wraz z niewielkim ryzykiem przeniesienia choroby istnieje wymóg, aby ośrodki chirurgiczne miały dostęp do dobrze prowadzonych banków tkanek, które nie są dostępne dla wszystkich.
Chociaż błona owodniowa jest względnie skuteczna, istnieje potrzeba opracowania nowych syntetycznych biodegradowalnych nośników komórkowych do leczenia chorób rogówki. Syntetyczne nośniki pozwoliłyby uniknąć konieczności przeprowadzania procedur bankowych, a także wyeliminowałyby niewielkie ryzyko przenoszenia chorób i zmienności między dawcami. W tym sensie badano materiały takie jak glikol polietylenowy21,22 i PLGA23,24.
Opracowując syntetyczną alternatywę dla ludzkiej błony owodniowej, istnieje również możliwość zaprojektowania w niej pożądanych cech, które mają nadzieję pomóc przetrwać hodowanym komórkom. Włączenie mikrocech do urządzeń biomateriałowych w celu specyficznej kontroli zachowania komórek jest nowym obszarem zainteresowania. Wielu autorów donosiło o pracach nad rozwojem nisz sztucznych komórek macierzystych25-30. Grupa ta poinformowała niedawno o stworzeniu mikrofabrykowanego, biofunkcjonalizowanego sztucznego rąbka ramienia PEGDA do dostarczania komórek nabłonka rąbka22 oraz metodologii wytwarzania elektroprzędzonych biodegradowalnych membran zawierających mikrofabrykowane kieszenie do podtrzymywania komórek nabłonka rąbka31.
Celem tej pracy jest opracowanie nowej technologii produkcji urządzeń z biomateriałów zawierających mikrocechy, które do pewnego stopnia naśladują mikrośrodowiska, w których komórki macierzyste znajdują się w ciele. Opracowaliśmy technikę łączącą mikrostereolitografię i elektroprzędzenie, która pozwala na wytwarzanie biodegradowalnych membran mikrostrukturalnych, które wykazują duży potencjał w zastosowaniach związanych z regeneracją tkanek.
Ważne jest, aby zauważyć, że chociaż w tej pracy technika ta została zastosowana do produkcji pierścieni do regeneracji rogówki, technologia ta może być zastosowana do produkcji urządzeń do regeneracji szerokiego zakresu tkanek nabłonkowych, np. skóry, błony śluzowej jamy ustnej, jelit, dróg oddechowych i nabłonka pęcherza moczowego. W szczególności w tym badaniu opracowaliśmy syntetyczną biodegradowalną membranę, która działa w podobny sposób jak błona owodniowa, dostarczając komórki do rogówki. Błona ta zawiera mikrokieszenie o wielkości około 300 μm (większe niż krypty rąbkowe Palisades Vogta (około 150 μm)). Na koniec opracowaliśmy protokół pakowania, który pozwala na przechowywanie tych membran w temperaturze -20 °C przez ponad 6 miesięcy bez żadnych oznak rozpadu.

<table><tbody><tr><td>Kwas poli(mlekowy-co-glikolowy)</td> <td>Purac</td><td>PDLG5004</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich Or Fisher</td><td>270997 Or Or / 1850/17</td><td>>99,8% zawiera 50-150 ppm stabilizatora amylenu</td></tr><tr><td>Cyfrowe urządzenie do mikrolustra (DMD) Płyta kontrolera Discovery 1100 i Zestaw startowy</td><td>Texas Instruments</td><td>1076N732 (UV)</td><td></td></tr><tr><td>473 nm Laser</td><td>laserowy 2000</td><td>MBL-III</td><td>150 mW</td></tr><tr><td>Diakrylan poli(glikolu etylenowego)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>475629</td><td>Mn = 250 g/mol, 500 ml</td></tr><tr><td>DEMEM + Glutamax</td><td>Fisher</td><td>12077549</td><td></td></tr><tr><td>Szynka' s F12</td><td>Labtech biosura</td><td>LMH1236/500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Labtech biosura</td><td>FB-1090/50</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Insulina Sigma Aldrich</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9326</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>p63</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3737</td><td></td></tr><tr><td>CK3</td><td>Merck Millipore</td><td>CLB218</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>SLS</td><td>HHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Torba klasy medycznej (PET / Folia / LDPE) Zrywalna torebka</td><td>Riverside Medical Ltd. Derby, Wielka Brytania</td><td>Laminat foliowy PET/Folia/LDPE, (12,7,50)</td><td></td></tr><tr><td>Napromienianie gamma (sterylizacja)</td><td>Stosowane technologie sterylizacji (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny, UK) - zakres dawek zewnętrznych 25-40 KGy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy pomarańczowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10087</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232696</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>Sześciopunktowa karta wskaźnika wilgotności</td><td>SCC, USA</td><td>6HIC200</td><td></td></tr><tr><td>Próżniowa zgrzewarka</td><td>próżniowa Andrew James UK Ltd, Bowburn, Wielka Brytania</td><td>VS518</td><td></td></tr><tr><td>Andrew James Rolki do zgrzewania próżniowego 28 cm x 40 metrów</td><td>Andrew James UK Ltd, Bowburn, Wielka Brytania</td><td>BR2805</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)</td> <td>Philips/FEI Mikroskop konfokalny XL-20 SEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss LSM 510 META</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videne Roztwór antyseptyczny</td><td>Ecolab, Swindon, Wielka Brytania</td><td></td><td>3%</td></tr></tbody></table>

połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Problemy z rogówką dotykają milionów ludzi na całym świecie, znacznie obniżając jakość ich życia. Choroba rogówki może być spowodowana chorobami, takimi jak aniridia lub zespół Stevena Johnsona, a także czynnikami zewnętrznymi, takimi jak oparzenia chemiczne lub promieniowanie. Obecne metody leczenia to (i) stosowanie przeszczepów rogówki oraz (ii) stosowanie komórek macierzystych namnażanych w laboratorium i dostarczanych na nośnikach (np. błonie owodniowej); Zabiegi te są stosunkowo skuteczne, ale niestety mogą się nie powieść po 3-5 latach. Istnieje potrzeba zaprojektowania i wyprodukowania nowych urządzeń do biomateriałów rogówkowych, które będą w stanie szczegółowo naśladować środowisko fizjologiczne, w którym komórki macierzyste znajdują się w rogówce. Rąbkowe komórki macierzyste znajdują się w rąbku (okrągłym obszarze między rogówką a twardówką) w określonych niszach znanych jako Palisady Vogta. W ramach tej pracy opracowaliśmy nową technologię platformy, która łączy dwie najnowocześniejsze techniki wytwarzania (mikrostereolitografia i elektroprzędzenie) do wytwarzania błon rogówki, które do pewnego stopnia naśladują rąbek. Nasze błony zawierają sztuczne mikrokieszenie, które mają na celu zapewnienie komórkom ochrony, tak jak robią to Palisady Vogta w oku.

Mikrofabrykowane pierścienie elektroprzędzone zostały wykonane przy użyciu kombinacji mikrostereolitografii i elektroprzędzenia (Rycina 1 i 2). Pierścienie z PEGDA o różnych rozmiarach zostały wytworzone metodą mikrostereolitografii (Rycina 3); technika ta umożliwia wytwarzanie struktur rzędu cm przy jednoczesnym włączaniu mikroelementów. W tym przypadku wykonano pierścienie o średnicach od 1,2-1,6 cm zawierające mikrokieszonki o rozmiarach 350-500 µm (Rycina 4).
W zakresie produkcji, sterylizacji i pakowania materiałów do przyszłego zastosowania klinicznego stwierdzono, że pakowanie próżniowe w workach klasy medycznej znacząco poprawiło możliwość długoterminowego przechowywania membran PLGA (Rycina 5); zastosowanie worka klasy medycznej (PET/folia/LDPE) o grubości 0,12 mm pozwoliło na uzyskanie dłuższego okresu przydatności do użycia. Zostało to zbadane poprzez wysłanie membran do naszych współpracowników w Indiach, gdzie membrany były przechowywane przez okres kilku miesięcy w temperaturze -20 °C, w RT oraz w 37 °C w celowo zawilgoconych warunkach (wilgotna inkubator). Rycina 5 pokazuje, że w celowo prowokacyjnych warunkach przechowywania w 37 °C w warunkach wilgotnych, membrany były stabilne tylko przez około 1 miesiąc w przypadku braku pakowania próżniowego, natomiast osiągnięto 3 miesiące przechowywania w warunkach pakowania próżniowego (Rycina 5 i Tabela 1).
Tabela 1 wykazuje poprawę warunków przechowywania, jaką można osiągnąć nawet w warunkach dobranych tak, aby sprzyjały one pobieraniu wody i pęcznieniu włókien, jeśli zwróci się uwagę na wybór zastosowanej torby.
Pierścienie wspierały rozrost komórek z eksplantatów limbalnych w różnych warunkach: (i) pierścienie świeżo przygotowane i (ii) pierścienie przechowywane przez 6 miesięcy (Rysunek 6). Transfer komórek osiągnięto po 4 tygodniach, umieszczając membrany PLGA na trójwymiarowych modelach z ranami. Komórki rozrosły się z eksplantatów tkankowych umieszczonych na membranach, tworząc nowy nabłonek na uprzednio pozbawionych nabłonka rogówkach (Rysunek 7). Kontrole pozytywne (rogówki bez żadnej obróbki) i negatywne (rogówki z ranami) były również utrzymywane w kulturze przez ten sam okres czasu. Kontrole negatywne potwierdziły brak tworzenia nowego nabłonka w przypadku braku dodanych komórek. Immunocytochemia wykazała, że komórki rozrastające się z eksplantatów były komórkami nabłonka rogówki, ponieważ wykazano ich pozytywność w kierunku markera różnicowania rogówki CK3 (Rysunek 7E).
<img alt="Schemat układu stereolitografii z laserem, ekspanderem wiązki i DMD do druku 3D z użyciem polimerów PEGDA." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat układu mikrostereolitografii do tworzenia pierścieni z PEGDA.
<img alt="Schemat elektroprzędzenia: układ wysokiego napięcia, włókna PEGDA, roztwór PLGA, aluminium pokryte elektrodą." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat procesu elektroprzędzenia z wykorzystaniem mikrowytworzonych pierścieni PEGDA jako matryc.
<img alt="Metoda wycinania i przenoszenia filmu złota o różnych średnicach; schemat eksperymentalny i wyniki." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. (A) przedstawia przykład statycznego kolektora (galwanicznie naniesiona warstwa aluminium z pierścieniami z PEGDA) do przędzenia mikrofabrykowanych membran z PLGA. (B) oraz (E) pokazują odrywanie różnych mat elektroprzędzionych ze statycznych kolektorów. (C) przedstawia matryce z PEGDA o różnych rozmiarach, podkreślając wszechstronność zastosowania mikrostereolitografii do wytwarzania powierzchni bazowej. (D) pokazuje mikrofabrykowaną replikę z PLGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<img alt="Schemat procesu elektroprzędzenia: obrazy SEM, matryca PEGDA, replika PLGA, analiza morfologii włókien." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obraz SEM pierścienia PEGDA z mikroelementem w kształcie podkowy (A); obraz SEM z dużym powiększeniem mikrofabrykowanej kieszonki (B). Obraz w kontraście fazowym pierścienia PLGA z mikroelementem w kształcie podkowy (C); obraz w kontraście fazowym z dużym powiększeniem mikrofabrykowanej kieszonki (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<img alt="Mikrofabrykowane membrany pierścieniowe z PLGA; intensywność włókien w zależności od temp./wieku; SEM włókien; próbki kolorystyczne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wpływ temperatury i czasu na przechowywanie membran z PLGA (50/50) (44 kg/mol) z mikrofabrykowanymi pierścieniami, pakowanych próżniowo i bezz próżniowo, w ciągu 6 miesięcy. Integralność membrany oceniano jako włókna całkowicie nienaruszone (+++), częściowe pęcznienie włókien (++), zlewanie się włókien (+) lub brak nienaruszonych włókien (-). Obrazy SEM oraz trzy osuszacze (pomarańczowa krzemionka, chlorek kobaltu (II) i siarczan miedzi (II)) nie wykazują zmian w integralności włókien ani wilgotności. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<img alt="Równowaga statyczna w inżynierii tkankowej; obrazy mikroskopowe oddziaływania eksplantu z rusztowaniem, 300 μm, 150 μm." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające przerost LEC z eksplantów limbalnych na świeżo wykonanych biodegradowalnych pierścieniach z PLGA (A, B) oraz na pierścieniach po 6 miesiącach przechowywania w temperaturze -20 °C (C, D). Obrazy (A) i (B) odpowiadają komórkom barwionym odpowiednio DAPI (niebieski) i jodkiem propidyny (czerwony). Obraz b to widok ortogonalny z konfokalnego stosu z-stack eksplantu umieszczonego w mikrofabrykowanej kieszeni. Obrazy (C) i (D) wykazują pozytywne barwienie na p63 (zielony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<img alt="Trójwymiarowy model uszkodzonej rogówki w szalce Petriego oraz obrazy mikroskopowe przedstawiające wyniki eksplantacji, tkanka rogówki." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. (A) przedstawia model uszkodzonej rogówki królika z pierścieniowym rusztowaniem i eksplantami tkanki umieszczonymi na rusztowaniu, które zostało wcześniej pokryte klejem fibrynowym. (B) i (C) to kontrole pozytywna i negatywna; kontrola pozytywna to świeża rogówka królika, a kontrola negatywna to rogówka, z której celowo usunięto nabłonek (kontrola negatywna była również hodowana przez 4 tygodnie). (D) to obraz barwienia H&amp;E rogówki wytworzonej metodami inżynierii tkankowej po 4 tygodniach hodowli; rycina pokazuje nowy wielowarstwowy nabłonek utworzony przez komórki migrujące z eksplantów umieszczonych w niszach. (E) to obraz immunocytochemiczny przedstawiający rozrost komórek z eksplantu limbalnego; jądra są barwione DAPI (niebieski), a komórki wykazują pozytywne barwienie na cytokeratynę 3, marker różnicowania rogówki (zielony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;">PLGA (50/50)</td>
			<td colspan="7" style="width:448px;">Integralność włókien dla membran przechowywanych w 37 °C wilgotny</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:64px;">Dzień 0</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 1</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 2</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 3</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 4</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 5</td>
			<td style="width:64px;">Miesiąc 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Niepakowane próżniowo</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:163px;">Próżniowo zamknięte (Worek A) (kompozyt PE, PA) Grubość: 0,14 mm</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:163px;">Próżniowo zapakowane (Worek B) (PET / folia / LDPE) Grubość: 0,75 mm</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+++</td>
			<td style="width:64px;">+</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
			<td style="width:64px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wpływ próżni i różnych worków do przechowywania na integralność membran z PLGA (50/50) (44 kg/mol) badanych w ciągu 6 miesięcy przechowywania. Integralność membran oceniano jako włókna w pełni nienaruszone (+++), częściowe pęcznienie włókien (++), łączenie się włókien (+) lub brak nienaruszonych włókien (-).

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie złożoności przestrzennej 3D w rusztowaniach inżynierii tkankowej poprzez połączenie zastosowania technik wytwarzania przyrostowego i przędzenia elektrycznego. Osiąga się to poprzez stworzenie niedegradowalnej matrycy wykonanej z glikolu polietylenowego, D acrl lub PEG DA, przy użyciu techniki fotoutwardzania warstwa po warstwie zwanej mikrostereolitografią. Jako drugi krok.Szablony są przymocowane do metalowego podłoża, a przędzenie elektryczne jest używane do wytworzenia biodegradowalnej membrany, która naśladuje podstawową morfologię. Następnie badane są procedury pakowania i degradacji membran przędzonych elektronicznie. Przedwczesnej degradacji przechowywanych membran unika się poprzez kontrolowanie temperatury i wilgotności.Ostatni etap polega na umieszczeniu biodegradowalnych błon na modelu 3D uszkodzonej rogówki w celu zbadania ich potencjalnego zastosowania jako urządzeń do regeneracji rogówki. Wyniki pokazują wszechstronność stosowania technik wytwarzania przyrostowego i elektroprzędzenia do tworzenia złożonych membran zawierających mikrokieszenie, które do pewnego stopnia naśladują naturalną niszę komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest jej wszechstronność.Ponieważ nieulegające biodegradacji formy mogą być tworzone jako nowe, przy użyciu szerokiej gamy technik produkcyjnych, metoda ta byłaby interesująca zarówno w dziedzinie produkcji, jak i regeneracji tkanek, a także pomogłaby odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z zachowaniem komórek macierzystych i niszą komórek macierzystych. Ta metoda wytwarzania mikro rusztowań może dostarczyć informacji na temat regeneracji rogówki. Może być również stosowany do innych tkanek nabłonkowych z niszami komórek macierzystych, takich jak skóra i błona śluzowa jamy ustnej, lub w celu zapewnienia innych funkcji 3D i rusztowań do inżynierii szerokiej gamy tkanek.Zarówno lider Ortega, jak i Thomas Patterson będą demonstrować tę procedurę. Rozpocznij tę procedurę od utworzenia L one, pierwszej warstwy. Stanie się to podstawą konstrukcji przy użyciu dowolnego odpowiedniego programu do rysowania dla 1,2-centymetrowego czarnego koła.Następnie utwórz L dwa. Druga warstwa to narysowanie kolejnego 1,2 centymetra czarnego koła, ale zawiera od sześciu do ośmiu białych struktur w kształcie podkowy o wymiarach 0,5 na 0,35 milimetra. Rozmieść małe białe kształty podkowy w strukturze czarnego koła.Zapisz L one i L dwa w formacie JPEG, aby skonfigurować mikrostereolitografię. Najpierw wyreguluj i ostrożnie wyczyść optykę systemu. Umieść 300 mikrolitrów glikolu polietylenowego di acrl lub mieszaniny PEG D w studzience 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.Studnia powinna być wstępnie pokryta teflonem lub innym materiałem nieprzywierającym lub łatwym do usunięcia konstrukcji. Po utwardzeniu włącz niebieski laser i wgraj L one do ALP trzy podstawowe oprogramowanie. To oprogramowanie jest interfejsem USP, który zapewnia połączenie między komputerem a cyfrowym mikro lustrem.Naświetlać pierwszą warstwę przez 60 sekund. Dodaj do studni 250 mikrolitrów więcej kołka da. Prześlij L dwa i naświetlaj L dwa przez 60 sekund.Usuń nieutwardzony polimer i umyj pierścienie izopropanolem przez noc W dniu poprzedzającym wirowanie elektryczne utwórz statyczny kolektor elektroprzędzalny, rozprowadzając pierścienie PEG DA na galwanizowanej blasze aluminiowej o wymiarach 12 centymetrów na 20 centymetrów. Przymocuj pierścienie za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. Przygotuj roztwór polilaktydu co glikolu lub PLGA i wymieszaj go przez noc przed użyciem następnego dnia.Umieść cztery pięciomililitrowe strzykawki z tępo zakończonymi igłami o średnicy wewnętrznej 0,8 centymetra na pompie strzykawkowej. Zamiast jednej strzykawki stosuje się cztery strzykawki. Aby zapewnić szybsze elektrowirowanie, załaduj 2,5 mililitra roztworu PLGA do każdej strzykawki.Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby starać się utrzymać zmienne laro pinine tak stałe, jak to możliwe. Pozostaw odległość między igłami a kolektorem 15 centymetrów. Ustaw natężenie przepływu 30 mikrolitrów na minutę i napięcia w zakresie od 12 do 15 kilowoltów dla elektrowirowania elektrycznego przez godzinę i 30 minut.Po zakończeniu wirowania elektrycznego ostrożnie oderwij arkusz gąbki elektrycznej PLGA od kolektora podtrzymującego pierścienie PEG da. Pierścienie PEG DA mogą być ponownie wykorzystane jako szablony do elektrycznego przędzenia. Użyj okrągłego dziurkacza, aby pociąć rusztowania electro spon na okręgi o średnicy 22 milimetrów.Pozostawienie struktury pierścieniowej umieszczonej pośrodku, aby przygotować membrany PLGA do długotrwałego przechowywania. Zamontuj każdy z nich w małym pojemniku, takim jak plastikowa szalka Petriego, i umieść go w torbie medycznej. Umieść trzy worki ze środkiem osuszającym w torbie klasy medycznej.Dodaj do torby dostępną w handlu sześciopunktową kartę wskaźnika wilgotności. Pozwoli to wykryć nagromadzenie wilgoci w okresie przechowywania. Użyj próżniowej zgrzewarki do odkurzania i zamykania worka.Następnie membrany PLGA są wysyłane do firmy zewnętrznej, promieniowanie gamma lub promieniowanie przed przechowywaniem. W tym eksperymencie bakłażany rąbkowe królika są izolowane z oczu królika uzyskanych z farmy, w której króliki są hodowane do konsumpcji. Najpierw zdezynfekuj oczy królika za pomocą 3% roztworu antyseptycznego.Następnie oczyść oczy, usuwając nadmiar tkanki otaczającej rogówkę. Obszar rąbka można zidentyfikować jako cienki okrągły obszar między przezroczystą rogówką a białą twardówką. Oddziel obszar rąbka od reszty rogówki.Pokrój obszar rąbka na segmenty o długości około 1,5 centymetra, zdezynfekuj segmenty rąbka w 1,5% roztworze antyseptycznym przez minutę. Po dezynfekcji za pomocą ostrza skalpela pokrój segmenty rąbka na małe kawałki. Przechowuj małe kawałki tkanki w pożywce DMEM plus glut max w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla lub maksymalnie godzinę przed użyciem.Aby rozpocząć tę procedurę, użyj skrobaka do komórek, aby pokryć błony pierścieniowe 15 mikrolitrami kleju fibrylinowego. Rozprowadź fibrylinę równomiernie podczas pracy pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj igły o rozmiarze 25, aby umieścić eksplantaty rąbkowe bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA.Umieść pierścienie z eksplanem tkankowym na wcześniej przygotowanych rogówkach. Gdy eksplan jest skierowany do góry i znajduje się w warunkach granicy faz powietrze-ciecz, pierścień PLGA szybko się zwilży i przyjmie kształt modelu rogówki. Utrzymuj modele hodowli narządów przez cztery tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmieniaj pożywkę co dwa dni.Mikrostereolitografia umożliwia wytwarzanie pierścieni PEG DA o różnych rozmiarach i jednoczesne wprowadzanie mikroelementów. Pierścienie mogą być powtarzalnie wykonane i ponownie wykorzystane i można je łatwo przymocować do blachy, która może być używana jako elektroprzędzący kolektor. W tym przykładzie pierścienie zawierają mikrocechy podkowy.Elektroprzędzenie wytwarza następnie repliki PLGA, pakowanie próżniowe membran PLGA znacznie poprawia ich długotrwałe przechowywanie nawet w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celowo wilgotnych warunkach. Rodzaj użytego worka ma również wpływ na stabilność membrany, skaningowa mikroskopia elektronowa i badanie trzech dekantów nie wykazują żadnych zmian w integralności włókien ani wilgotności nienaruszonych włókien. Przerost komórek z implantów rąbka ramiennego lub wsparty zarówno świeżo wykonanymi biodegradowalnymi pierścieniami PLGA, jak i pierścieniami po sześciu miesiącach przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Po umieszczeniu błon PLGA na modelach 3D uszkodzonej rogówki, transfer komórek został osiągnięty po czterech tygodniach. Obrazy H i e pokazują nowy wielowarstwowy nabłonek utworzony przez komórki wychodzące z eksplantatów umieszczonych w niszach. Kontrola ujemna potwierdziła brak tworzenia się nowego nabłonka przy braku jakichkolwiek dodanych komórek.W porównaniu z konwencjonalnym nabłonkiem rogówki obserwowanym w świeżej rogówce królika stosowanej jako kontrola pozytywna. Chemia immunocytologiczna wykazała, że komórki wyrastające z implantów były komórkami nabłonka rogówki, ponieważ były dodatnie dla cytokeratyny trzeciej, markera różnicowania rogówki. Ponieważ elektroprzędzalnie kolektory zawierające niebiodegradowalne szablony są wielokrotnego użytku, produkcja rusztowań może być wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli protokół jest zoptymalizowany.Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową na zbadanie nowego sposobu wytwarzania złożonych błon inżynierii tkankowej zawierających mikrocechy, w których można badać zachowanie komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć niedegradowalny szablon z mikrofabrykacji przy użyciu technik wytwarzania przyrostowego lub podobnych podejść, takich jak modelowanie i jak używać elektroprzędzenia do zwiększania złożoności rusztowań.

combination-microstereolithography-electrospinning-to-produce

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Poznaj metodę łączenia mikrostereolitografii i elektroprzędzenia do wytwarzania biodegradowalnych membran PLGA z mikrostrukturami. Technika ta umożliwia badanie zachowań komórek macierzystych w inżynierii tkankowej.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Przeglądaj więcej filmów