Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie złożoności przestrzennej 3D w rusztowaniach inżynierii tkankowej poprzez połączenie zastosowania technik wytwarzania przyrostowego i przędzenia elektrycznego. Osiąga się to poprzez stworzenie niedegradowalnej matrycy wykonanej z glikolu polietylenowego, D acrl lub PEG DA, przy użyciu techniki fotoutwardzania warstwa po warstwie zwanej mikrostereolitografią. Jako drugi krok.

Szablony są przymocowane do metalowego podłoża, a przędzenie elektryczne jest używane do wytworzenia biodegradowalnej membrany, która naśladuje podstawową morfologię. Następnie badane są procedury pakowania i degradacji membran przędzonych elektronicznie. Przedwczesnej degradacji przechowywanych membran unika się poprzez kontrolowanie temperatury i wilgotności.

Ostatni etap polega na umieszczeniu biodegradowalnych błon na modelu 3D uszkodzonej rogówki w celu zbadania ich potencjalnego zastosowania jako urządzeń do regeneracji rogówki. Wyniki pokazują wszechstronność stosowania technik wytwarzania przyrostowego i elektroprzędzenia do tworzenia złożonych membran zawierających mikrokieszenie, które do pewnego stopnia naśladują naturalną niszę komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest jej wszechstronność.

Ponieważ nieulegające biodegradacji formy mogą być tworzone jako nowe, przy użyciu szerokiej gamy technik produkcyjnych, metoda ta byłaby interesująca zarówno w dziedzinie produkcji, jak i regeneracji tkanek, a także pomogłaby odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z zachowaniem komórek macierzystych i niszą komórek macierzystych. Ta metoda wytwarzania mikro rusztowań może dostarczyć informacji na temat regeneracji rogówki. Może być również stosowany do innych tkanek nabłonkowych z niszami komórek macierzystych, takich jak skóra i błona śluzowa jamy ustnej, lub w celu zapewnienia innych funkcji 3D i rusztowań do inżynierii szerokiej gamy tkanek.

Zarówno lider Ortega, jak i Thomas Patterson będą demonstrować tę procedurę. Rozpocznij tę procedurę od utworzenia L one, pierwszej warstwy. Stanie się to podstawą konstrukcji przy użyciu dowolnego odpowiedniego programu do rysowania dla 1,2-centymetrowego czarnego koła.

Następnie utwórz L dwa. Druga warstwa to narysowanie kolejnego 1,2 centymetra czarnego koła, ale zawiera od sześciu do ośmiu białych struktur w kształcie podkowy o wymiarach 0,5 na 0,35 milimetra. Rozmieść małe białe kształty podkowy w strukturze czarnego koła.

Zapisz L one i L dwa w formacie JPEG, aby skonfigurować mikrostereolitografię. Najpierw wyreguluj i ostrożnie wyczyść optykę systemu. Umieść 300 mikrolitrów glikolu polietylenowego di acrl lub mieszaniny PEG D w studzience 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Studnia powinna być wstępnie pokryta teflonem lub innym materiałem nieprzywierającym lub łatwym do usunięcia konstrukcji. Po utwardzeniu włącz niebieski laser i wgraj L one do ALP trzy podstawowe oprogramowanie. To oprogramowanie jest interfejsem USP, który zapewnia połączenie między komputerem a cyfrowym mikro lustrem.

Naświetlać pierwszą warstwę przez 60 sekund. Dodaj do studni 250 mikrolitrów więcej kołka da. Prześlij L dwa i naświetlaj L dwa przez 60 sekund.

Usuń nieutwardzony polimer i umyj pierścienie izopropanolem przez noc W dniu poprzedzającym wirowanie elektryczne utwórz statyczny kolektor elektroprzędzalny, rozprowadzając pierścienie PEG DA na galwanizowanej blasze aluminiowej o wymiarach 12 centymetrów na 20 centymetrów. Przymocuj pierścienie za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. Przygotuj roztwór polilaktydu co glikolu lub PLGA i wymieszaj go przez noc przed użyciem następnego dnia.

Umieść cztery pięciomililitrowe strzykawki z tępo zakończonymi igłami o średnicy wewnętrznej 0,8 centymetra na pompie strzykawkowej. Zamiast jednej strzykawki stosuje się cztery strzykawki. Aby zapewnić szybsze elektrowirowanie, załaduj 2,5 mililitra roztworu PLGA do każdej strzykawki.

Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby starać się utrzymać zmienne laro pinine tak stałe, jak to możliwe. Pozostaw odległość między igłami a kolektorem 15 centymetrów. Ustaw natężenie przepływu 30 mikrolitrów na minutę i napięcia w zakresie od 12 do 15 kilowoltów dla elektrowirowania elektrycznego przez godzinę i 30 minut.

Po zakończeniu wirowania elektrycznego ostrożnie oderwij arkusz gąbki elektrycznej PLGA od kolektora podtrzymującego pierścienie PEG da. Pierścienie PEG DA mogą być ponownie wykorzystane jako szablony do elektrycznego przędzenia. Użyj okrągłego dziurkacza, aby pociąć rusztowania electro spon na okręgi o średnicy 22 milimetrów.

Pozostawienie struktury pierścieniowej umieszczonej pośrodku, aby przygotować membrany PLGA do długotrwałego przechowywania. Zamontuj każdy z nich w małym pojemniku, takim jak plastikowa szalka Petriego, i umieść go w torbie medycznej. Umieść trzy worki ze środkiem osuszającym w torbie klasy medycznej.

Dodaj do torby dostępną w handlu sześciopunktową kartę wskaźnika wilgotności. Pozwoli to wykryć nagromadzenie wilgoci w okresie przechowywania. Użyj próżniowej zgrzewarki do odkurzania i zamykania worka.

Następnie membrany PLGA są wysyłane do firmy zewnętrznej, promieniowanie gamma lub promieniowanie przed przechowywaniem. W tym eksperymencie bakłażany rąbkowe królika są izolowane z oczu królika uzyskanych z farmy, w której króliki są hodowane do konsumpcji. Najpierw zdezynfekuj oczy królika za pomocą 3% roztworu antyseptycznego.

Następnie oczyść oczy, usuwając nadmiar tkanki otaczającej rogówkę. Obszar rąbka można zidentyfikować jako cienki okrągły obszar między przezroczystą rogówką a białą twardówką. Oddziel obszar rąbka od reszty rogówki.

Pokrój obszar rąbka na segmenty o długości około 1,5 centymetra, zdezynfekuj segmenty rąbka w 1,5% roztworze antyseptycznym przez minutę. Po dezynfekcji za pomocą ostrza skalpela pokrój segmenty rąbka na małe kawałki. Przechowuj małe kawałki tkanki w pożywce DMEM plus glut max w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla lub maksymalnie godzinę przed użyciem.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj skrobaka do komórek, aby pokryć błony pierścieniowe 15 mikrolitrami kleju fibrylinowego. Rozprowadź fibrylinę równomiernie podczas pracy pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj igły o rozmiarze 25, aby umieścić eksplantaty rąbkowe bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA.

Umieść pierścienie z eksplanem tkankowym na wcześniej przygotowanych rogówkach. Gdy eksplan jest skierowany do góry i znajduje się w warunkach granicy faz powietrze-ciecz, pierścień PLGA szybko się zwilży i przyjmie kształt modelu rogówki. Utrzymuj modele hodowli narządów przez cztery tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zmieniaj pożywkę co dwa dni.

Mikrostereolitografia umożliwia wytwarzanie pierścieni PEG DA o różnych rozmiarach i jednoczesne wprowadzanie mikroelementów. Pierścienie mogą być powtarzalnie wykonane i ponownie wykorzystane i można je łatwo przymocować do blachy, która może być używana jako elektroprzędzący kolektor. W tym przykładzie pierścienie zawierają mikrocechy podkowy.

Elektroprzędzenie wytwarza następnie repliki PLGA, pakowanie próżniowe membran PLGA znacznie poprawia ich długotrwałe przechowywanie nawet w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celowo wilgotnych warunkach. Rodzaj użytego worka ma również wpływ na stabilność membrany, skaningowa mikroskopia elektronowa i badanie trzech dekantów nie wykazują żadnych zmian w integralności włókien ani wilgotności nienaruszonych włókien. Przerost komórek z implantów rąbka ramiennego lub wsparty zarówno świeżo wykonanymi biodegradowalnymi pierścieniami PLGA, jak i pierścieniami po sześciu miesiącach przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po umieszczeniu błon PLGA na modelach 3D uszkodzonej rogówki, transfer komórek został osiągnięty po czterech tygodniach. Obrazy H i e pokazują nowy wielowarstwowy nabłonek utworzony przez komórki wychodzące z eksplantatów umieszczonych w niszach. Kontrola ujemna potwierdziła brak tworzenia się nowego nabłonka przy braku jakichkolwiek dodanych komórek.

W porównaniu z konwencjonalnym nabłonkiem rogówki obserwowanym w świeżej rogówce królika stosowanej jako kontrola pozytywna. Chemia immunocytologiczna wykazała, że komórki wyrastające z implantów były komórkami nabłonka rogówki, ponieważ były dodatnie dla cytokeratyny trzeciej, markera różnicowania rogówki. Ponieważ elektroprzędzalnie kolektory zawierające niebiodegradowalne szablony są wielokrotnego użytku, produkcja rusztowań może być wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli protokół jest zoptymalizowany.

Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową na zbadanie nowego sposobu wytwarzania złożonych błon inżynierii tkankowej zawierających mikrocechy, w których można badać zachowanie komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć niedegradowalny szablon z mikrofabrykacji przy użyciu technik wytwarzania przyrostowego lub podobnych podejść, takich jak modelowanie i jak używać elektroprzędzenia do zwiększania złożoności rusztowań.