Name: Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj analizę metabolomiczną mózgu szczura za pomocą spektroskopii NMR wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie profili metabolitów tkankowych w neurochemii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie ze strony Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 i 7339) jest z wdzięcznością podziękowane.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spektroskopia NMR jest skuteczną metodą pomiaru stężeń związków chemicznych w roztworze w sposób bardzo powtarzalny i dokładny. Jednak, aby uzyskać dane wysokiej jakości, konieczne jest przestrzeganie pewnych zasad dotyczących przygotowania i analizy próbek. Przy oznaczaniu stężeń metabolitów za pomocą spektroskopii NMR ani generacja, ani odbiór sygnału NMR nie dominują nad błędem ilościowym, chyba że intensywność obserwowanego sygnału zbliża się do progu detekcji (szczególnie słaby sygnał). We wszystkich innych przypadk...

Modele mysie były szeroko wykorzystywane w badaniach nad mózgiem1. Korelacje genotyp-fenotyp badano w mózgach myszy i szczurów, badając ekspresję genów na poziomie RNA i/lub białka z jednej strony, a morfologicznymi, funkcjonalnymi, elektrofizjologicznymi i/lub behawioralnymi fenotypami z drugiejstrony 2-6. Jednak, aby w pełni zrozumieć mechanizmy łączące fenotyp z genotypem, konieczne jest zbadanie zdarzeń molekularnych zachodzących po ekspresji białek, tj. metabolizm substratów biochemicznych, na które działają enzymy7. Wymóg ten doprowadził w ciągu ostatnich 10 do 15 lat do renesansu badań metabolicznych w wielu gałęziach biologii8,9. Podczas gdy klasyczne badania metaboliczne często koncentrowały się na szczegółach określonych szlaków, nowe podejście metabolomiczne jest ukierunkowane na kompleksowe badanie globalnego profilu metabolicznego badanej tkanki. Jedną z konsekwencji tej koncepcji jest oczywiste zapotrzebowanie na narzędzia analityczne, które minimalizują stronniczość w kierunku określonych szlaków metabolicznych i/lub klas związków. Jednak klasyczny test biochemiczny opiera się na określonej reakcji chemicznej określonego analitu, którą należy określić przed wykonaniem testu. Natomiast techniki spektroskopowe, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i spektrometria mas (MS) (i), opierają się na szczególnych właściwościach molekularnych (fizycznych) związków biochemicznych, z których każdy powoduje powstanie jednego lub kilku odrębnych sygnałów w widmie wykrytych w trakcie jednego eksperymentu; oraz (ii) wykrywać dużą liczbę różnych związków w jednym eksperymencie.
Tak więc, każde widmo zawiera połączone informacje o całym zakresie metabolitów. Z tego powodu metody spektroskopowe są odpowiednimi narzędziami metabolomiki, ponieważ nie ma potrzeby dokonywania wcześniejszej selekcji w odniesieniu do charakteru mierzonego analitu8. W związku z tym techniki te w naturalny sposób nadają się do badań eksploracyjnych, ponieważ znacznie ułatwiają wykrywanie nieoczekiwanych zmian metabolicznych.
Chociaż spektroskopia NMR i MS mogą być używane zamiennie do analizy wielu metabolitów, każda metoda ma określone zalety i wady, które zostały ostatnio omówione10. Krótko mówiąc, spektroskopia NMR może być zwykle wykonywana z surowych ekstraktów i nie wymaga chromatograficznego rozdzielania związków próbki przed analizą. Z kolei MS pracuje z separacją metodą chromatografii gazowej lub cieczowej (GC lub LC), z wyjątkiem najnowszych osiągnięć, takich jak obrazowanie za pomocą spektrometrii mas. W kilku szczególnych przypadkach, takich jak analiza cukrów, separacja LC może stać się koniecznością również w spektroskopii NMR, ponieważ linie rezonansowe różnych cukrów znacznie się pokrywają w widmach protonów (1H) NMR. Niemniej jednak spektroskopia 1H NMR bez separacji chromatograficznej pozostaje najpopularniejszą, niemal powszechnie stosowaną metabolomiczną metodą NMR. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie próbki jest bardziej czasochłonne i złożone w przypadku stwardnienia rozsianego niż w przypadku spektroskopii NMR. Poważne problemy wynikające z efektów matrycowych występują znacznie rzadziej w spektroskopii NMR niż w stwardnieniu rozsianym, gdzie mogą prowadzić do znacznego osłabienia sygnałów. Oznaczanie ilościowe metabolitów można osiągnąć za pomocą dowolnej metody. Jednak w przypadku stwardnienia rozsianego potrzebnych jest wiele związków wzorcowych ze względu na różnice w efektach matrycy i skuteczności jonizacji między metabolitami. Natomiast do analizy spektroskopowej NMR potrzebny jest tylko jeden wzorzec na próbkę, ponieważ w odpowiednich warunkach pomiarowych ta ostatnia metoda jest z natury ilościowa dzięki ściśle liniowej odpowiedzi NMR obserwowanych jąder. Główną wadą NMR jest jego stosunkowo niska czułość. MS, w szczególności LC-MS, jest bardziej czuły niż NMR o kilka rzędów wielkości; z tego powodu MS ma być preferowany w stosunku do NMR do analizy związków występujących w bardzo niskich stężeniach. Z drugiej strony, nieniszczący charakter eksperymentu NMR jest wyraźną przewagą nad SM; w ten sposób NMR może być wykonywany wielokrotnie na tej samej próbce, np. dla różnych jąder aktywnych NMR, takich jak 1H, fosfor-31 (31P), węgiel-13 (13C), fluor-19 (19F) itp., ponieważ żaden materiał nie jest zużywany przez NMR w przeciwieństwie do pomiarów MS.
Zarówno NMR, jak i MS mogą być stosowane w różnych trybach, z których każdy jest optymalny do wykrywania związków o szczególnych właściwościach chemicznych. Na przykład 31P NMR często lepiej nadaje się niż 1H NMR do analizy umiarkowanie skoncentrowanych związków fosforylowanych, chociaż prawie wszystkie ufosforylowane metabolity zawierają również protony. Jednak ich sygnały 1H NMR mogą być przesłonięte przez sygnały 1H NMR z innych, niefosforylowanych związków, przy czym te ostatnie oczywiście nie powodują sygnałów tła w widmach 31P NMR. W sytuacji analogowej analiza 19F NMR ma być preferowana dla związków fluorowanych, np. leków fluorowanych (brak sygnałów tła od metabolitów endogennych), podczas gdy szczególny przypadek 13C NMR jest interesujący prawie wyłącznie, gdy trzeba śledzić los egzogennych prekursorów metabolicznych znakowanych 13C, ze względu na wyjątkowo niską naturalną liczebność izotopu 13C (ok. 1%). Wiele spektrometrów mas działa w trybie jonów ujemnych lub jonów dodatnich. Dlatego ważne jest, aby przed analizą wiedzieć, czy obserwowane jony są naładowane ujemnie czy dodatnio. Skupiamy się tutaj na protokole analizy metabolomu tkanki mózgowej za pomocą spektroskopii 1H i 31P NMR, ponieważ metoda ta pozwala uzyskać dużą liczbę ważnych stężeń metabolitów przy niskich kosztach pod względem (i) czasu potrzebnego na przygotowanie próbki i (ii) wysiłku wymaganego do ilościowego określenia metabolitów. Wszystkie eksperymenty mogą być wykonywane przy użyciu sprzętu standardowego laboratorium chemii mokrej oraz urządzenia do spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości. Dalsze wymagania zostały opisane w sekcji Protokół poniżej.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>Anesthetic dla zwierząt</td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Dostępny nowszy model: Isotec 4</td></tr><tr><td>Skalpel, nożyczki, kleszcze, zaciski</td><td>Aparat Harvarda Fisher Scientific</td><td>różne różne</td><td>Sprzęt chirurgiczny dla zwierząt</td></tr><tr><td>Narzędzie do zamrażania</td> domowej <td>roboty</td><td>n/a</td><td>Rzemień z płytkami aluminiowymi, do włożenia w ciekłym azocie do chłodzenia</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Parownik azotu</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Może być zastąpiony przez domowe urządzenie</td></tr><tr><td>Moździerz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Tłuczek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Z probówkami pasującymi do wału homogenizatora</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki wirówkowe</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml probówka</td></tr><tr><td>do mikrowirówek</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml probówka; powinna zastąpić probówkę "Eppendorf", jeśli jest kompatybilna z wirnikiem wirówki</td></tr><tr><td>Pipety polistyrenowe</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>o objętości 5 i 10 ml</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96% deuterowany</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96% deuterowany</td></tr><tr><td>Chlorek deuteru</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% w tlenku deuteru</td></tr><tr><td>Deuter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% w tlenku deuteru</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Zimna wirówka</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek cezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>probówki NMR Wilmad</td><td></td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka koncentryczna z trzpieniem NMR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>Pipety NMR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Z końcówkami do objętości od 0,5 do 1 000 &mu; l</td></tr><tr><td>Spektrometr NMR</td><td></td><td></td> Pipet-Aid Drummond XP <td></td>Bruker AVANCE 400 wraz z sondą i innymi akcesoriami</tr><tr><td>Oprogramowanie NMR</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>dostępna nowsza wersja: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Rozpuszczalne w wodzie związki wzorcowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> wzorcowe związki fosfolipidowe <td></td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>różne różne różne</td><td>Źródło plazmalogenów, ale może być < 70 - 80% czystości</td></tr><tr><td>Metylenodifosfonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Badania ekspresji genów na poziomie RNA i białka od dawna wykorzystywane do badania procesów biologicznych leżących u podstaw choroby. Ostatnio genomika i proteomika zostały uzupełnione o kompleksową analizę ilościową puli metabolitów obecnych w systemach biologicznych. Strategia ta, zwana metabolomiką, ma na celu zapewnienie globalnej charakterystyki małocząsteczkowego dopełniacza biorącego udział w metabolizmie. Podczas gdy genom i proteom definiują zadania, które mogą wykonywać komórki, metabolom jest częścią właściwego fenotypu. Wśród metod stosowanych obecnie w metabolomice szczególnie interesujące są techniki spektroskopowe, ponieważ pozwalają na jednoczesną analizę dużej liczby metabolitów bez uprzedniej selekcji dla określonych szlaków biochemicznych, umożliwiając w ten sposób szerokie, bezstronne podejście. W tym miejscu przedstawiono zoptymalizowany protokół eksperymentalny do analizy metabolomicznej za pomocą spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości, która jest metodą z wyboru do efektywnej kwantyfikacji metabolitów tkankowych. Istotnymi zaletami tej metody są: (i) stosowanie surowych ekstraktów, bez konieczności oczyszczania próbki i/lub oddzielania metabolitów; (ii) wewnętrznie ilościowy charakter NMR, pozwalający na ilościowe określenie wszystkich metabolitów reprezentowanych przez widmo NMR z tylko jednym związkiem odniesienia; oraz (iii) nieniszczący charakter NMR umożliwiający wielokrotne wykorzystanie tej samej próbki do wielu pomiarów. Dynamiczny zakres stężeń metabolitów, który można pokryć, jest znaczny ze względu na liniową odpowiedź sygnałów NMR, chociaż metabolity występujące w skrajnie niskich stężeniach mogą być trudne do wykrycia. W przypadku najmniej obfitych związków metoda spektrometrii mas o wysokiej czułości może być korzystna, chociaż technika ta wymaga bardziej skomplikowanych procedur przygotowania próbki i kwantyfikacji niż spektroskopia NMR. Przedstawiamy tutaj protokół NMR dostosowany do analizy mózgu szczura; Jednak ten sam protokół można zastosować do innych tkanek z niewielkimi modyfikacjami.

Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość w metabolicznych widmach NMR ekstraktów z mózgu i innych tkanek, powszechną praktyką było od dłuższego czasu usuwanie lub maskowanie jonów metali (najważniejszych: jonów paramagnetycznych) obecnych w roztworach ekstraktów. Osiągano to poprzez dodanie do ekstraktu czynnika chelatującego, takiego jak EDTA lub CDTA19, lub poprzez przepuszczenie ekstraktu przez żywicę jonowymienną, taką jak Chelex-10020. Wyniki przedstawione na Rysunku 1 wykazują, że ...

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie profili metabolitów o wysokiej rozdzielczości z ekstraktów z mózgu szczura. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie mózgów szczurów i szybkie zamrożenie ich w ciekłym azocie. Drugim krokiem jest ekstrakcja metabolitów mózgu poprzez homogenizację tkanki w wodzie z chloroformem metanolowym, a następnie usunięcie zdenaturowanych białek i rozpuszczalników organicznych.Następnie próbki wodne są liofilizowane, a wszystkie próbki są zluzowane w dobrze zdefiniowanych rozpuszczalnikach. Aby uzyskać optymalną analizę spektroskopową NMR, ostatnim krokiem jest staranne przygotowanie i optymalizacja eksperymentów metabolomicznych NMR. Ostatecznie, widma NMR są wymagane w dobrze zdefiniowanych warunkach eksperymentalnych i oceniane przy użyciu zoptymalizowanych protokołów przetwarzania danych.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w metabolizm mózgu, może być również stosowana do innych tkanek miękkich, takich jak nowotwory, wątroba, nerki i inne narządy. Najpierw wyjmij wcześniej przygotowaną zamrożoną próbkę tkanki mózgowej z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie natychmiast przenieś próbkę tkanki do moździerza częściowo wypełnionego ciekłym azotem.Użyj zimnego tłuczka z ciekłym azotem, aby rozbić zamrożoną tkankę mózgową na mniejsze kawałki, które łatwo zmieszczą się w probówkach używanych do homogenizacji tkanek. Po tej mieszance małe kawałki zamrożonej tkanki mózgowej dokładnie ważą od 250 do 350 miligramów tkanki i przenoszą ją do probówki wypełnionej łącznie czterema mililitrami lodowatego metanolu. Za każdym razem, gdy kawałki zamrożonej tkanki są dodawane do probówki, należy je natychmiast homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego.Po dodaniu ostatniego kawałka zamrożonej próbki mózgu szczura do probówki i homogenizacji, przenieś homogenat do szklanej fiolki o pojemności większej lub równej 20 mililitrów. Zamknij nakrętkę i umieść homogenat na lodzie na 15 minut. Następnie dodaj cztery mililitry lodowatego chloroformu do homogenatu i dokładnie odwiruj.Po zakończeniu umieść homogenat na lodzie na 15 minut. Dodaj cztery mililitry wody do homogenatu po dokładnym zwirowaniu, pozwól homogenatowi odstawić na noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W celu całkowitego rozdzielenia faz przenieś homogenat tkanki mózgowej do probówki o pojemności większej lub równej 20 mililitrów odpornej na chloroform, odwiruj próbkę w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut.Po odwirowaniu użyj pipety do pasty, aby przenieść górną fazę do odpowiedniej 15-mililitrowej probówki odpornej na metanol. Następnie użyj świeżej pipety do pasty, aby przenieść dolną fazę do odpowiedniej, większej lub równej probówki o pojemności 15 mililitrów odpornej na chloroform i umieść ją na lodzie, trzymając probówkę z fazą metanolową na lodzie. Odparować metanol, kierując strumień suchego azotu do roztworu ekstraktu.Zakończ proces parowania, gdy bulgocze azot. Nie powoduje już zmniejszenia objętości roztworu ekstraktu. Po umieszczeniu probówki z fazą chloroformową metanolu na lodzie, należy odparować metanol, kierując strumień suchego azotu na powierzchnię roztworu ekstraktu.Gdy cały rozpuszczalnik zostanie odparowany, zamknij probówkę i utrzymuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do analizy NMR. Aby przygotować fazę wodną do liofilizacji, przenieś wodną próbkę do dokładnie wypłukanej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie zamrozić roztwór ekstraktu, obracając probówkę wirówkową w ciekłym azocie, tak aby wewnętrzna powierzchnia probówki była stopniowo pokrywana zamrożoną cieczą.Gdy cały płyn zostanie zamrożony, przykryj rurkę przebitą nakrętką, aby para mogła się wydostać, i umieść rurkę w butelce z filtrem próżniowym z szeroką szyjką. Po przymocowaniu butelki do liofilizatora należy rozpocząć liofilizację, zakończyć proces liofilizacji. Gdy próbka jest całkowicie sucha, przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w zamkniętej probówce, dopóki nie zostanie użyta do analizy NMR.W przypadku analizy fosfolipidów metodą NMR fosforu, wysuszone lipidy należy rozpuścić w 700 mikrolitrach mieszaniny deuterowanego chloroformu metanolu i 200 milimolowego wodnego roztworu CDTA. Przenieść próbkę do mikroprobówki wirówkowej za pomocą mikropipety z bezpośrednim przemieszczeniem z końcówką odporną na chloroform. W tym momencie ustaw regulację temperatury sondy NMR na żądaną wartość docelową, którą zwykle jest wirówka o temperaturze 25 stopni Celsjusza.Roztwór ekstraktu fosfolipidowego o temperaturze czterech stopni Celsjusza i 11 000 G przez 30 minut w celu odwirowania stałych pozostałości w próbce. Po zakończeniu przenieś 600 mikrolitrów super natiny do wysokiej jakości probówki NMR o pięciomilimetrowej średnicy zewnętrznej. Przygotować odpowiedni współosiowy trzpień wkładki wypełniony wodnym 20-milimolowym roztworem difosforanu metylenu o pH 7,0 w celu odniesienia chemicznego i oceny ilościowej.Umieść tę wkładkę w probówce NMR wypełnionej roztworem ekstraktu fosfolipidowego. Następnie dopasuj rurkę NMR do odpowiedniego kołpaka i przenieś ją do magnesu NMR. Zawiruj próbkę z częstotliwością od 15 do 20 Hz po odczekaniu, aż próbka dostosuje się do ustawionej temperatury.Ostrożnie zminimalizuj jednorodność pola magnetycznego w całej próbce, dostosowując prądy cewki podkładki na osi i poza osią, ustaw parametry akwizycji widma NMR na optymalne wartości, które mogą się różnić w funkcji natężenia pola magnetycznego. Po zakończeniu akwizycji widma należy przetworzyć rozpad swobodnej indukcji przy użyciu zoptymalizowanych parametrów, aby uzyskać najlepsze wyniki dla całego zakresu rezonansów fosfolipidowych. Powtórz przetwarzanie, stosując co najmniej dwie różne procedury filtrowania.Na koniec filtruj bardzo słabe i szerokie sygnały bez znaczącego nakładania się przez izację, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. W tym eksperymencie uzyskano niezwykle wąskie linie widmowe dla wszystkich analizowanych obszarów spektralnych nawet w bardzo zatłoczonych obszarach. Piki w odległości mniejszej niż 0,01 P PP M są prawie całkowicie rozdzielne przy 400 megahercach.W związku z tym można przewidzieć analizę jakościową i ilościową licznych małych, ale obecnie nieprzypisanych pików w przyszłym zwężeniu linii, wybierając 1000 milimolowych zamiast 200. CDTA była pożądana, ale spowodowała superpozycję linii sygnałów fosfolipidowych poprzez wybór 277 kelwinów zamiast 297. Kelwin był pożądany, ale powodował również superpozycję sygnałów fosfolipidowych.Spadek stężenia CDTA z 200 milimolów do 50 milimolowych powoduje jedynie niewielki wzrost szerokości linii i prawie brak zmian w przesunięciach chemicznych. Należy jednak pamiętać, że stężenie tkanki w 50-milimolowym ekstrakcie CDTA jest o połowę niższe niż w 200-milimolowym ekstrakcie CDTA. Wyjaśniając stosunkowo wąskie linie, wykryto dużą liczbę mierzalnych fosfolipidów obejmujących znaczny zakres stężeń.Rozdzielczość spektralna jest nawet wystarczająca do rutynowego wykrywania częściowego rozszczepienia niektórych pików. W związku z tym w przyszłości można przewidzieć analizę jakościową i ilościową kolejnych podgrup fosfolipidów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wykonać każdy krok z najwyższą starannością, aby zagwarantować optymalną analizę metabolitów.

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Opisujemy szczurzy model zespołu stresu pourazowego (PTSD), który wykazuje trwałe zmiany w funkcji neuroendokrynnej oraz opóźnioną, długotrwałą i nasiloną reakcję lękową, charakterystyczną dla pacjentów z PTSD. Opisany tutaj model zwierzęcy oraz metody są przydatne do korelacji biomarkerów w jądrach mózgu, które mają charakter mechanistyczny, ale nie mogą być mierzone u pacjentów, z biomarkerami w obwodowych leukocytach, które podlegają pomiarowi.

Biomarkery w modelu zwierzęcym służące do ujawnienia korelatów neuronalnych, hematologicznych i behawioralnych PTSD

Opisano procedurę progresywnej kolonizacji w celu dalszej oceny jej wpływu na metabolizm wątroby gospodarza. Kolonizację monitoruje się nieinwazyjnie poprzez ocenę wydalania z moczem mikrobiologicznych ko-metabolitów za pomocą profilowania metabolicznego opartego na NMR, natomiast metabolizm wątrobowy ocenia się za pomocą profilowania NMR w technice High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) nienaruszonych próbek biopsji.

Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii 1H NMR

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Źródło: Blanc, J., et al. Funkcjonalna spektroskopia rezonansu magnetycznego przy 7 t w korze lufy szczura podczas aktywacji wąsów. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film ten przedstawia metodę analizy zmian metabolicznych w korze beczki szczura za pomocą funkcjonalnej spektroskopii rezonansu magnetycznego podczas stymulacji wąsów. Wyjściowe widma metabolitów są porównywane z widmami stymulowanymi w celu wykrycia wzrostu mleczanu w korze beczkowatej, potwierdzając pomyślną aktywację neuronów.

Funkcjonalna spektroskopia rezonansu magnetycznego kory lufy szczura podczas stymulacji wąsów

Pozytonowa tomografia emisyjna dla małych zwierząt umożliwia ocenę dwóch głównych substratów energetycznych mózgu: glukozy i ketonów. W niniejszej metodzie 11C-acetooctan i 18F-fluorodeoksyglukoza są wstrzykiwane sekwencyjnie każdemu zwierzęciu, a ich wychwyt jest mierzony ilościowo w określonych obszarach mózgu określonych na podstawie obrazów rezonansu magnetycznego.

Protokół PET-MRI z podwójnym znacznikiem do ilościowego pomiaru wychwytu regionalnych substratów energetycznych mózgu u szczura

Po sprawdzeniu za pomocą funkcjonalnego rezonansu magnetycznego zależnego od poziomu tlenu we krwi (BOLD fMRI), że odpowiedni obszar kory somatosensorycznej pola beczkowego (zwany S1BF) jest prawidłowo aktywowany, głównym celem tego badania jest ilościowe określenie wahań zawartości mleczanu w aktywowanych mózgach szczurów za pomocą zlokalizowanej spektroskopii rezonansu magnetycznego protonów (1H-MRS) przy 7 T.

Funkcjonalna spektroskopia rezonansu magnetycznego przy 7 t w korze lufy szczura podczas aktywacji wąsów

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych z funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (rs-fMRI) w stabilnym stanie spoczynku od szczura przy użyciu niskiej dawki izofluranu w połączeniu z niską dawką deksmedetomidyny.

Akwizycja danych z funkcjonalnego rezonansu magnetycznego w stanie spoczynku u szczura

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

Akwizycja danych z dynamicznej pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i rekonstrukcja w przedziałach czasowych pozwala na analizę metabolicznej łączności mózgu na poziomie pojedynczego podmiotu. Opisujemy metodę pozyskiwania [18F]FDG dynamicznych danych PET mózgu szczura i uzyskania macierzy połączeń poprzez ekstrakcję krzywych czasowo-aktywnych o interesujących nas objętościach.

Badanie metabolicznych połączeń mózgu za pomocą dynamicznej pozytonowej tomografii emisyjnej 2-deoksy-2-[18F]fluoro-D-glukozy na poziomie pojedynczego obiektu

Poznaj analizę metabolomiczną mózgu szczura za pomocą spektroskopii NMR wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie profili metabolitów tkankowych w neurochemii.

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Przeglądaj więcej filmów