Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie profili metabolitów o wysokiej rozdzielczości z ekstraktów z mózgu szczura. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie mózgów szczurów i szybkie zamrożenie ich w ciekłym azocie. Drugim krokiem jest ekstrakcja metabolitów mózgu poprzez homogenizację tkanki w wodzie z chloroformem metanolowym, a następnie usunięcie zdenaturowanych białek i rozpuszczalników organicznych.

Następnie próbki wodne są liofilizowane, a wszystkie próbki są zluzowane w dobrze zdefiniowanych rozpuszczalnikach. Aby uzyskać optymalną analizę spektroskopową NMR, ostatnim krokiem jest staranne przygotowanie i optymalizacja eksperymentów metabolomicznych NMR. Ostatecznie, widma NMR są wymagane w dobrze zdefiniowanych warunkach eksperymentalnych i oceniane przy użyciu zoptymalizowanych protokołów przetwarzania danych.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w metabolizm mózgu, może być również stosowana do innych tkanek miękkich, takich jak nowotwory, wątroba, nerki i inne narządy. Najpierw wyjmij wcześniej przygotowaną zamrożoną próbkę tkanki mózgowej z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie natychmiast przenieś próbkę tkanki do moździerza częściowo wypełnionego ciekłym azotem.

Użyj zimnego tłuczka z ciekłym azotem, aby rozbić zamrożoną tkankę mózgową na mniejsze kawałki, które łatwo zmieszczą się w probówkach używanych do homogenizacji tkanek. Po tej mieszance małe kawałki zamrożonej tkanki mózgowej dokładnie ważą od 250 do 350 miligramów tkanki i przenoszą ją do probówki wypełnionej łącznie czterema mililitrami lodowatego metanolu. Za każdym razem, gdy kawałki zamrożonej tkanki są dodawane do probówki, należy je natychmiast homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego.

Po dodaniu ostatniego kawałka zamrożonej próbki mózgu szczura do probówki i homogenizacji, przenieś homogenat do szklanej fiolki o pojemności większej lub równej 20 mililitrów. Zamknij nakrętkę i umieść homogenat na lodzie na 15 minut. Następnie dodaj cztery mililitry lodowatego chloroformu do homogenatu i dokładnie odwiruj.

Po zakończeniu umieść homogenat na lodzie na 15 minut. Dodaj cztery mililitry wody do homogenatu po dokładnym zwirowaniu, pozwól homogenatowi odstawić na noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W celu całkowitego rozdzielenia faz przenieś homogenat tkanki mózgowej do probówki o pojemności większej lub równej 20 mililitrów odpornej na chloroform, odwiruj próbkę w temperaturze 13 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut.

Po odwirowaniu użyj pipety do pasty, aby przenieść górną fazę do odpowiedniej 15-mililitrowej probówki odpornej na metanol. Następnie użyj świeżej pipety do pasty, aby przenieść dolną fazę do odpowiedniej, większej lub równej probówki o pojemności 15 mililitrów odpornej na chloroform i umieść ją na lodzie, trzymając probówkę z fazą metanolową na lodzie. Odparować metanol, kierując strumień suchego azotu do roztworu ekstraktu.

Zakończ proces parowania, gdy bulgocze azot. Nie powoduje już zmniejszenia objętości roztworu ekstraktu. Po umieszczeniu probówki z fazą chloroformową metanolu na lodzie, należy odparować metanol, kierując strumień suchego azotu na powierzchnię roztworu ekstraktu.

Gdy cały rozpuszczalnik zostanie odparowany, zamknij probówkę i utrzymuj próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do analizy NMR. Aby przygotować fazę wodną do liofilizacji, przenieś wodną próbkę do dokładnie wypłukanej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie zamrozić roztwór ekstraktu, obracając probówkę wirówkową w ciekłym azocie, tak aby wewnętrzna powierzchnia probówki była stopniowo pokrywana zamrożoną cieczą.

Gdy cały płyn zostanie zamrożony, przykryj rurkę przebitą nakrętką, aby para mogła się wydostać, i umieść rurkę w butelce z filtrem próżniowym z szeroką szyjką. Po przymocowaniu butelki do liofilizatora należy rozpocząć liofilizację, zakończyć proces liofilizacji. Gdy próbka jest całkowicie sucha, przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w zamkniętej probówce, dopóki nie zostanie użyta do analizy NMR.

W przypadku analizy fosfolipidów metodą NMR fosforu, wysuszone lipidy należy rozpuścić w 700 mikrolitrach mieszaniny deuterowanego chloroformu metanolu i 200 milimolowego wodnego roztworu CDTA. Przenieść próbkę do mikroprobówki wirówkowej za pomocą mikropipety z bezpośrednim przemieszczeniem z końcówką odporną na chloroform. W tym momencie ustaw regulację temperatury sondy NMR na żądaną wartość docelową, którą zwykle jest wirówka o temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Roztwór ekstraktu fosfolipidowego o temperaturze czterech stopni Celsjusza i 11 000 G przez 30 minut w celu odwirowania stałych pozostałości w próbce. Po zakończeniu przenieś 600 mikrolitrów super natiny do wysokiej jakości probówki NMR o pięciomilimetrowej średnicy zewnętrznej. Przygotować odpowiedni współosiowy trzpień wkładki wypełniony wodnym 20-milimolowym roztworem difosforanu metylenu o pH 7,0 w celu odniesienia chemicznego i oceny ilościowej.

Umieść tę wkładkę w probówce NMR wypełnionej roztworem ekstraktu fosfolipidowego. Następnie dopasuj rurkę NMR do odpowiedniego kołpaka i przenieś ją do magnesu NMR. Zawiruj próbkę z częstotliwością od 15 do 20 Hz po odczekaniu, aż próbka dostosuje się do ustawionej temperatury.

Ostrożnie zminimalizuj jednorodność pola magnetycznego w całej próbce, dostosowując prądy cewki podkładki na osi i poza osią, ustaw parametry akwizycji widma NMR na optymalne wartości, które mogą się różnić w funkcji natężenia pola magnetycznego. Po zakończeniu akwizycji widma należy przetworzyć rozpad swobodnej indukcji przy użyciu zoptymalizowanych parametrów, aby uzyskać najlepsze wyniki dla całego zakresu rezonansów fosfolipidowych. Powtórz przetwarzanie, stosując co najmniej dwie różne procedury filtrowania.

Na koniec filtruj bardzo słabe i szerokie sygnały bez znaczącego nakładania się przez izację, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu. W tym eksperymencie uzyskano niezwykle wąskie linie widmowe dla wszystkich analizowanych obszarów spektralnych nawet w bardzo zatłoczonych obszarach. Piki w odległości mniejszej niż 0,01 P PP M są prawie całkowicie rozdzielne przy 400 megahercach.

W związku z tym można przewidzieć analizę jakościową i ilościową licznych małych, ale obecnie nieprzypisanych pików w przyszłym zwężeniu linii, wybierając 1000 milimolowych zamiast 200. CDTA była pożądana, ale spowodowała superpozycję linii sygnałów fosfolipidowych poprzez wybór 277 kelwinów zamiast 297. Kelwin był pożądany, ale powodował również superpozycję sygnałów fosfolipidowych.

Spadek stężenia CDTA z 200 milimolów do 50 milimolowych powoduje jedynie niewielki wzrost szerokości linii i prawie brak zmian w przesunięciach chemicznych. Należy jednak pamiętać, że stężenie tkanki w 50-milimolowym ekstrakcie CDTA jest o połowę niższe niż w 200-milimolowym ekstrakcie CDTA. Wyjaśniając stosunkowo wąskie linie, wykryto dużą liczbę mierzalnych fosfolipidów obejmujących znaczny zakres stężeń.

Rozdzielczość spektralna jest nawet wystarczająca do rutynowego wykrywania częściowego rozszczepienia niektórych pików. W związku z tym w przyszłości można przewidzieć analizę jakościową i ilościową kolejnych podgrup fosfolipidów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wykonać każdy krok z najwyższą starannością, aby zagwarantować optymalną analizę metabolitów.