Name: Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków mózgu do badania dynamiki proliferacji i różnicowania oligodendrocytów. Technika umożliwia obserwację komórek NG2 w czasie rzeczywistym przy zachowaniu architektury tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów National Multiple Sclerosis Society (RG4179 do A.N.), National Institutes of Health (NIH R01NS073425 i R01NS074870 do A.N.) oraz National Science Foundation (A.N.). Dziękujemy dr Frankowi Kirchhoffowi (Uniwersytet Kraju Saary, Homburg, Niemcy) za dostarczenie transgenicznych myszy PLPDsRed. Dziękujemy Youfen Sun za pomoc w utrzymaniu kolonii myszy transgenicznych.

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Connecticut.
UWAGA: W tych eksperymentach do obrazowania komórek NG2 i ich potomstwa użyto odpowiednio konstytutywnych NG2cre18 (JAX#008533) i indukowalnych NG2creER16 (JAX#008538) transgenicznych myszy skrzyżowanych z liniami Z/EG19 (JAX#003920) lub gtRosa26:YFP reporter20 (JAX#006148). Do zobrazowania dojrzałych oligodendrocytów wykorzystano transgeniczne myszy transgeniczne PLPDsRed21. Aby zapewnić stałą przeżywalność, plastry można izolować od myszy do 10 dnia po urodzeniu zarówno z przodomózgowia, jak i móżdżku.
1. Przygotowanie plastra
<ol>
	<li>W kapturze hodowlanym umieścić wkładki do hodowli tkankowych na sześciu płytkach dołkowych i dodać 1 ml pożywki hodowlanej w plasterkach (przepis w sekcji odczynników). Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 co najmniej 2 godziny przed rozbieraniem.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia i rozdrabniacz do tkanek za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Bufor do dyspreparacji bąbelkowej (receptura w sekcji odczynników) z 95% O2, 5% CO2 na lodzie przez co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem preparacji.</li>
	<li>Znieczulej młode myszy, umieszczając je na lodzie na 5-10 minut zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia, potwierdzając, że myszy nie reagują na szczypanie ogona i palców u stóp.</li>
	<li>Odcinaj zwierzętom głowy ostrymi nożyczkami zgodnie z protokołami zwierzęcymi. Szybko usuń czaszkę nad przodomózgowiem i móżdżkiem, wykonując najpierw cięcie strzałkowe, a następnie boczne nacięcie, używając wysterylizowanych narzędzi. Wytnij nerwy czaszkowe z brzusznej powierzchni mózgu i móżdżku, ostrożnie przetaczając tkankę na bok.</li>
	<li>Umieść tkankę w sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym lodowaty natleniony bufor preparacyjny.</li>
	<li>Za pomocą żyletki odetnij móżdżek i przodomózgowie. Następnie wykonaj przecięcie w połowie strzałki przez przodomózgowie i móżdżek, oddzielając półkule.</li>
	<li>Wytnij odcinki koronalne i strzałkowe przodomózgowia i móżdżku o grubości 300 μm za pomocą ręcznego rozdrabniacza tkanek. UWAGA: Ręczny rozdrabniacz tkanek umożliwia szybkie przetwarzanie od sekcji do inkubacji kultury bez konieczności osadzania agarozy. Można również użyć wibratomu, jak opisano wcześniej9.</li>
	<li>Oddzielone plastry przenieść do świeżo bąbelkowanego zimnego buforu do rozwarstwiania na lodzie.</li>
	<li>Użyj małych szpatułek do preparowania lub ważenia, aby oddzielić poszczególne sekcje i przenieś je do wstępnie inkubowanych sześciu dołków z wkładkami hodowlanymi.</li>
	<li>Usunąć nadmiar buforu preparacyjnego z powierzchni wkładki hodowlanej za pomocą jednorazowej pipety transferowej lub końcówki do pipety P 200. Na jednej wkładce hodowlanej można umieścić od dwóch do trzech plastrów przodomózgowia lub trzech wycinków móżdżku. 
	UWAGA: Aby uzyskać spójne wyniki z kulturami przodomózgowia, idealnie jest pobrać plastry obejmujące przednią jedną trzecią ciała modzelowatego (ryc. 1A) w celu zbadania zarówno obszarów istoty szarej, jak i białej w tym samym wycinku. Każde zwierzę zwykle daje 6 plasterków przodomózgowia i 6 plasterków móżdżku.</li>
	<li>Umieścić sześć dołków w inkubatorze i zastąpić pożywkę w plastrach 1 ml pożywki w plastrach 1 dzień po przygotowaniu plastrów, a następnie co drugi dzień aż do utrwalenia plastrów.</li>
	<li>W zależności od eksperymentu użyj plastrów po 5-7 dniach w kulturze. Używaj tylko plasterków, które stają się przezroczyste po pierwszych kilku dniach i odrzucaj te, które mają nierówne, nieprzezroczyste obszary. UWAGA: Nieprzezroczyste obszary w plasterkach są widoczne gołym okiem i wyglądają jak skupisko ciemnych komórek w kontraście fazowym. Po opanowaniu techniki martwe nieprzezroczyste plastry występują rzadko, w mniej niż 1-5% plastrów.</li>
</ol>
2. Obrazowanie poklatkowe podziału komórek NG2 i różnicowania oligodendrocytów
UWAGA: Aby wykonać obrazowanie poklatkowe proliferacji i różnicowania komórek NG2, używamy myszy NG2cre: ZEG16, które wyrażają EGFP w komórkach NG2 i ich potomstwie (Figura 1C-E). Ekspresja reporterowa w tej linii jest wystarczająco silna, aby uzyskać żywe obrazy komórek GFP+ w wycinkach natychmiast po przekroju przez okres co najmniej czterech tygodni. Najwyraźniejsze obrazy uzyskuje się po początkowym okresie przerzedzania wycinka, który występuje w ciągu pierwszych 3-5 dni w hodowli.
<ol>
	<li>Przez cały czas trwania eksperymentu należy przechowywać plastry w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i usuwać tylko na krótkie okresy czasu (mniej niż 15 minut na plasterek), trzymając pokrywkę na płytce sześciodołkowej podczas obrazowania.</li>
	<li>Korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową, uchwyć obrazy w pierwszym punkcie czasowym za pomocą obiektywu 10X. UWAGA: Pierwsze punkty za czas będą się różnić w zależności od eksperymentu i mogą być dniem, w którym plastry zostały przygotowane, lub dowolnym punktem czasowym później.</li>
	<li>Przechwytuj obrazy z wielu regionów w pierwszym punkcie czasowym zarówno w obszarach istoty szarej, jak i białej przekroju. Zanotuj obszar zobrazowany przez określone punkty orientacyjne w przekroju i odwzorowując położenie obrazu na schemacie, który może być używany w kolejnych sesjach obrazowania. Przydatne punkty orientacyjne mogą obejmować krawędzie warstw i/lub orientację odcinków istoty białej. Wyobraź sobie od czterech do ośmiu lokalizacji na każdym wycinku w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Rejestruj kolejne obrazy w odstępach 4-6 godzin, jeśli badasz podział komórek NG2 i różnicowanie oligodendrocytów, najlepiej przez 5-7 dni.</li>
	<li>Uchwyć ostateczny obraz wszystkich regionów i natychmiast napraw plasterki. Dodać 1 ml utrwalacza (4% PFA z 0,1 M l-lizyną 0,01 M metaperiodianem sodu) na dno wkładki hodowlanej, a następnie dodać kolejny 1 ml na wierzch plastrów. Uważaj, aby nie rozpylać utrwalacza bezpośrednio na plasterek, ponieważ może on oderwać się od membrany. Utrwalić tkankę na 30 minut i kontynuować immunohistochemię przy użyciu markerów specyficznych dla stadium rozwoju, jak opisano w punkcie 4.</li>
	<li>Plastry umyć 0,2 M buforem fosforanowo-sodowym 3 x 10 min. W razie potrzeby należy przechowywać plastry w temperaturze 4 °C w 0,2 M buforze fosforanu sodu przez 1-3 dni przed barwieniem immunologicznym, ale najlepiej przeprowadzić barwienie w ciągu 24 godzin. Postępuj zgodnie z immunohistochemią, jak opisano poniżej w sekcji 4, aby określić proporcję komórek, które zróżnicowały się w oligodendrocyty (ryc. 2D-F).</li>
</ol>
3. Mapowanie losu potomstwa komórek NG2 przy użyciu indukowalnych reporterowych myszy transgenicznych w kulturach plastrowych
UWAGA: Aby śledzić losy komórek NG2 od określonego punktu czasowego w hodowli, można użyć indukowalnych myszy transgenicznych NG2creER:YFP.
<ol>
	<li>Indukować rekombinację Cre i ekspresję reporterową przez dodanie 100 nM 4OHT rozpuszczonego w etanolu do pożywki hodowlanej. UWAGA: Komórki reporterowo-dodatnie powinny pojawić się w ciągu 1-2 dni z wydajnością indukcji ~ 20-25% komórek YFP + NG2 + / NG2 + i w tym momencie wszystkie będą komórkami na etapie komórki NG2 (Rysunek 2A-C)</li>
	<li>Napraw i umyj plastry w różnych punktach czasowych po różnych manipulacjach (opisanych w sekcjach 2.5 i 2.6).</li>
</ol>
4. Immunohistochemia wycinków
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela wyciąć błony z plastrami przymocowanymi do wkładek.</li>
	<li>Przenieść plastry do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki zawierającej buforowaną sól fizjologiczną z fosforanami (PBS) za pomocą zestawu pęsety, uważając, aby nie zakłócić składu plastra podczas podnoszenia membrany.</li>
	<li>Przenieś plastry na 24-dołkową płytkę z roztworem blokującym zawierającym 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i 0,1% Triton-X100 w PBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować wycinki w pierwotnym przeciwciałie O/N w 5% NGS w PBS w temperaturze 4 °C. Do identyfikacji komórek w stadium komórkowym NG2 należy użyć przeciwciał przeciwko NG2 i PDGFRα. Do identyfikacji zróżnicowanych oligodendrocytów należy użyć przeciwciała przeciwko antygenowi polipowatości gruczolakowatej coli (APC; klon CC1).</li>
	<li>Drugiego dnia umyć plastry w PBS 3 x15 min, następnie inkubować w przeciwciałach drugorzędowych w 5% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT. Umyć plastry w PBS 3 x15 min i zamontować na szkiełkach. Zamontuj plastrami do góry i membraną skierowaną w stronę szkiełka, tak aby membrana nie znajdowała się między obiektywem a tkanką.</li>
</ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Mielinizacja w ośrodkowym układzie nerwowym jest niezbędna do efektywnej komunikacji neuronalnej i przeżycia aksonów22. Komórki NG2 w sposób ciągły wytwarzają mielinizujące oligodendrocyty do wieku dorosłego, utrzymując jednocześnie populację rezydentną w większości regionów mózgu16,23–25. Opisano już pewne mechanizmy genetyczne i molekularne regulujące różnicowanie tych komórek, ale wiele pozostaje do odkrycia. Organotypowe kultury warstwowe są wygodnym narzędziem do badania t...

Organiczne kultury warstwowe ośrodkowego układu nerwowego okazały się niezwykle przydatne do badania biologii neuronów i komórek glejowych w częściowo nienaruszonym systemie1–4. Hodowle te są stosunkowo proste do przyjęcia i zachowują wiele korzyści płynących z pierwotnych zdysocjowanych kultur komórkowych, takich jak manipulowanie środowiskiem zewnątrzkomórkowym i łatwy dostęp do wielokrotnego, długoterminowego obrazowania żywych komórek i zapisów elektrofizjologicznych 5-9. Ponadto kultury warstwowe utrzymują trójwymiarową cytoarchitekturę tkanek, regionalne połączenia neuronalne, a większość głównych typów komórek jest obecna w systemie. Te właściwości sprawiają, że kultury te są unikalnym i wygodnym systemem do badania zachowania i fizjologii pojedynczych komórek z interakcjami komórkowymi i środowiskowymi.
Komórki NG2 to populacja komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków, które nadal się namnażają i generują mielinizujące oligodendrocyty podczas rozwoju embrionalnego i posturodzeniowego10. Zostały one szeroko przebadane w zdysocjowanych pierwotnych hodowlach komórkowych, a niedawny rozwój transgenicznych linii myszy z ekspresją białek fluorescencyjnych specyficzną dla komórek NG2 ułatwił mapowanie losów in vivo i zapisy elektrofizjologiczne w preparatach ostrych plastrów. Nawet przy tych badaniach niewiele wiadomo na temat czasowej dynamiki proliferacji komórek NG2 i różnicowania oligodendrocytów. Chociaż zdysocjowana hodowla komórkowa jest szeroko stosowana w manipulacjach farmakologicznych i genetycznych, nie nadaje się do badania różnic funkcjonalnych tych komórek w różnych regionach mózgu, szczególnie gdy pożądane jest utrzymanie kontekstu mikrośrodowiska komórkowego. Kultury Slice stanowią prostą alternatywę, która jest podatna na manipulacje farmakologiczne i została wykorzystana do zbadania mielinizacji oligodendrocytów11,12, odpowiedzi komórkowej po demielinizacji wywołanej lizolecytyną (LPC) lub przeciwciałami13,14 oraz indukcji remielinizacji poprzez leczenie farmakologiczne15.
Opisano metodę badania i przeprowadzania obrazowania na żywo oraz analizy tkanek stałych (lub postfiksacji) proliferacji komórek NG2 i różnicowania oligodendrocytów w organotypowych kulturach warstwowych pobranych zarówno z przodomózgowia, jak i móżdżku. Jest to potężna metoda, którą można wykorzystać do badania losu pojedynczych komórek NG2 po podziale16 oraz do odkrywania zależnych od regionu i wieku różnic w proliferacji komórek NG2 indukowanej czynnikiem wzrostu17. Ta stosunkowo prosta technika jest szeroko dostępna do dalszego badania wewnętrznych i/lub środowiskowych mechanizmów komórkowych regulujących fizjologię tych komórek glejowych i ich reakcję na aktywność neuronalną lub uszkodzenie mieliny.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Podłoże do hodowli plastrów</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0,4mM</td></tr><tr><td>Hyklon surowicy końskiej</td><td></td><td>SH30074,03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">Miareczkować do pH 7,22 za pomocą NaOH, przefiltrować z filtrem butelkowym i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Bufor preparacyjny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (bezwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>askorbinowySigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filtruj z filtrem butelkowym i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, natlenij 95%O2 5% CO2 przed użyciem</td></tr><tr> <td colspan="4">Inne odczynniki i materiały</td></tr><tr><td>4-hydroksytamoksyfen (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr> <tr><td>L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0,1M</td></tr><tr><td>Metaperiodian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0,01M</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty NG2</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty CC1</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty Ki67</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty NeuN</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Specyficzne dla gatunku przeciwciała drugorzędowe</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z wkładkami membranowymi do hodowli DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 0,45&mu; m wielkość porów</td><td>Fisher Scientific PICM03050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry butelkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td> mieszanina gazów <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sterylne płytki sześciodołkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Szpatułki <td></td><td></td><td></td><td>preparacyjne (hipokampowe) lub ważące</td></tr><tr><td>Rozdrabniacz</td><td></td><td></td><td></td>tkanek ręczny lub automatyczny</tr><tr><td>Żyletki Jednorazowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety</td><td></td><td></td><td></td>transferowe</tr><tr><td>Sterylne szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego 35 mm i 60 mm</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>odwróconą fazą </td><td></td><td></td><td></td>Mikroskop</tr><tr><td>z przepływem laminarnym Kaptur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td>do hodowli tkanek</tr><tr><td>Mikroskop odwróconej fluorescencji</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Komórki wyrażające NG2 (polidendrocyty, komórki prekursorowe oligodendrocytów) są czwartą główną populacją komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym. Podczas rozwoju embrionalnego i pourodzeniowego aktywnie się namnażają i wytwarzają mielinizujące oligodendrocyty. Komórki te były powszechnie badane w pierwotnych kulturach dysocjacyjnych, kokulturach neuronów oraz w utrwalonych tkankach. Korzystając z nowo dostępnych linii myszy transgenicznych, można wykorzystać systemy hodowli warstwowej do zbadania proliferacji i różnicowania komórek linii oligodendrocytów zarówno w obszarach istoty szarej, jak i białej przodomózgowia i móżdżku. Kultury plastrowe są przygotowywane z myszy we wczesnym okresie poporodowym i są trzymane w kulturze przez okres do 1 miesiąca. Wycinki te mogą być obrazowane wiele razy w okresie hodowli w celu zbadania zachowania i interakcji komórkowych. Metoda ta umożliwia wizualizację podziału komórek NG2 i etapów prowadzących do różnicowania oligodendrocytów, umożliwiając jednocześnie szczegółową analizę zależnej od regionu heterogeniczności funkcjonalnej komórek NG2 i oligodendrocytów. Jest to potężna technika, którą można wykorzystać do zbadania wewnętrznych i zewnętrznych sygnałów wpływających na te komórki w czasie w środowisku komórkowym, które bardzo przypomina to znalezione in vivo.

Poniżej przedstawiono przykłady reprezentatywnych danych uzyskanych z hodowli skrawków przedmózgowia i móżdżku linii myszy transgenicznych P8 NG2cre:ZEG, NG2creER:YFP oraz PLPDsRed. Obrazowanie komórek NG2 może być prowadzone przez kilka dni w skrawkach przedmózgowia i móżdżku (Rycina 1B-D, Video 1), a fenotyp tych komórek można określić po utrwaleniu i immunobarwieniu przeciwciałami NG2 oraz CC1 (Rycina 1E). Oprócz obrazowania żywych komórek, proliferację komórek można ocenić za pomocą ...

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku. Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie proliferacji i różnicowania komórek linii oligodendrocytów w środowisku, które bardzo przypomina to, które występuje in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw kultur warstwowych czterech mózgów i móżdżku od wczesnych postnatalnych myszy transgenicznych. Pojedyncze komórki w wycinkach są następnie obrazowane w ciągu kilku godzin do dni, aby zobrazować dynamikę komórkową ich proliferacji i różnicowania.Po obrazowaniu post hoc immunohistochemia komórek służy do określenia różnych cech komórkowych. Ostatecznie wyniki mogą pokazać dynamikę proliferacji i różnicowania komórek w normalnych warunkach oraz po manipulacji farmakologicznej lub genetycznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zdysocjowany węgiel, hodowle neuronów i komórki linii liga incyte, jest to, że kultury warstwowe umożliwiają manipulowanie środowiskiem bezkomórkowym przy jednoczesnym zachowaniu architektury cyto tkankowej.Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Connecticut co najmniej dwie godziny przed sekcją. Przygotować wkładki do kultur tkankowych na sześciu płytkach dołkowych do każdej. Dobrze dodać jeden mililitr pożywki do hodowli w plastrach, a następnie przenieść płytki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla co najmniej 15 minut przed preparacją.Umieść bufor do rozwarstwiania na lodzie i zacznij bulgotać 95% tlenem i 5% gazowym dwutlenkiem węgla. Upewnij się również, że wszystkie narzędzia i rozdrabniacz do tkanek są wysterylizowane 70% etanolem. Przenieść tkankę do sterylnego 35-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty natleniony bufor preparacyjny.Następnie, za pomocą żyletki, odetnij móżdżek i przodomózgowie, a następnie strzałkowo przeciąć przodomózgowie i móżdżek oddzielając półkule. Teraz za pomocą ręcznego rozdrabniacza wykonaj 300-mikronowe odcinki koronalne i strzałkowe czterech mózgowia i móżdżku. Każde zwierzę zwykle daje sześć czterech plasterków mózgowca i sześć plasterków móżdżku.Idealnie pobiera wycinki obejmujące przednią jedną trzecią ciała modzelowatego, aby zbadać zarówno obszary istoty szarej, jak i białej w tym samym plasterku. Przenieść oddzielone plastry do świeżo bąbelkowanego zimnego buforu do rozwarstwiania na lodzie w buforze, używając małej szpatułki do preparowania lub ważenia. Oddziel poszczególne sekcje i przenieś je do wstępnie inkubowanych.Sześć naczyń studzienkowych zawierających wkładki do hodowli. Na jednej kulturze można umieścić od dwóch do trzech plasterków. Odpipetować nadmiar buforu preparacyjnego z powierzchni kultury.Włóż i przenieś płytki do inkubatora, aż zostaną zamocowane. Pożywkę w plastrach należy wymieniać jeden dzień po przygotowaniu plastra, a następnie co drugi dzień, aż do utrwalenia plastra zgodnie z protokołem. W zależności od eksperymentu, użyj plasterków po pięciu do siedmiu dniach.W kulturze. Używaj tylko tych plasterków, które stają się przezroczyste po pierwszych kilku dniach i odrzuć te, które mają nierówne, nieprzezroczyste obszary widoczne gołym okiem. W kontraście twarzy te nieprzezroczyste obszary wyglądają jak skupisko ciemnych komórek.Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, martwe nieprzezroczyste obszary występują w nie więcej niż jednym do 5% plasterków. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe proliferacji i różnicowania dwóch komórek NG, użyj trzydniowych do pięciu jednodniowych wycinków od myszy, które wyrażają EGFP w dwóch komórkach NG. Nie pozwól, aby zjeżdżalnie spadły poniżej 37 stopni Celsjusza na dłużej niż 15 minut.Podczas każdej sesji obrazowania, trzymając płytkę zamkniętą, użyj 10-krotnego obiektywu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uchwycić obrazy za pierwszym razem. Punkt kultury. Zobrazuj od czterech do ośmiu miejsc na każdym wycinku zarówno z obszarów istoty szarej, jak i białej.Zobrazuj również przydatne punkty orientacyjne, takie jak krawędzie plasterków, poszczególne komórki lub orientacja odcinków istoty białej w celu relokacji. Poprzedni obraz punktu czasowego może być wykorzystany jako obraz referencyjny podczas relokacji dla podziału dwóch komórek NG i różnicowania oligodendrocytów. Rób zdjęcia co cztery do sześciu godzin, najlepiej przez pięć do siedmiu dni.Jeśli stosuje się indukowalny marker NG dwa cre, ER YFP, indukować ekspresję reporterową za pomocą pożywki hodowlanej o 100 nano molowcach. Cztery hydroksytamoksyfeny rozpuszczone w aktywności reporterowej etanolu powinny pojawić się w ciągu jednego do dwóch dni. W celu utrwalenia dodaj jeden mililitr utrwalacza na dno kultury.Włóż i dodaj kolejny mililitr na wierzch plasterków. Nie rozpylaj utrwalacza bezpośrednio na plastry, ponieważ mogą się one oderwać. Utrwalaj tkankę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie za pomocą skalpela.Wytnij błony z dołączonymi plastrami. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś plastry do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki załadowanej PBS. Następnie przenieś plastry na drugą 24-dołkową płytkę wypełnioną roztworem blokującym zawierającym 5% normalnej surowicy koziej i 0,1% tritton X 100 w PBS.Pozwól im inkubować w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu przenieś plastry na płytkę wypełnioną pierwszorzędowym przeciwciałem w PBS o 5% NGS. Pozwól im inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.Umyj plastry w PBS. Następnie inkubuj plastry z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 5% NGS. Pozostaw inkubację na godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie wykonaj trzy kolejne płukania w PBS, jak poprzednio, i zamontuj plastry tak, aby membrana była skierowana w stronę szkiełka, tak aby nie znajdowała się między obiektywem a tkanką. Aby przeanalizować temporalną dynamikę różnicowania oligodendrocytów, obrazy podziału dwóch komórek NG uzyskano z kultur warstwowych przodomózgowia od myszy transgenicznych P eight NG two creeg przez wiele dni, sekwencje poklatkowe wykonano w ciągu 122 godzin. Fenotyp podzielonych komórek oznaczono za pomocą przeciwciał NG 2 i CC one.Proliferację komórek oceniano również za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla markera proliferacji komórek. Mapowanie przynęty KI 67 dwóch komórek NG przeprowadzono po indukcji rekombinacji CRE w plasterkach od myszy NG dwóch CRE YFP. Dwa dni po dodaniu czterech hydroksytamoksyfenu.W hodowlach znaleziono reporter YFP wykazujący ekspresję NG dwie dodatnie komórki. Cztery dni później część tych komórek zróżnicowała się w cyty CC one one dodatnich oligodendrocytów. Dojrzałe oligodendrocyty zobrazowano w kulturach warstw móżdżku z P-L-P-D-S.Czerwone myszy mielinizowane neurony Perkin były obecne w tych kulturach. Wielokrotne obrazowanie wykazało dodanie mielinizującej się czerwieni DS eksprymującej oligodendrocyty, chemia immunologiczna w tych wycinkach wykazała znaczną ekspresję zasadowego białka mieliny. Wreszcie, obrazowanie w wyższej rozdzielczości czasowej ujawniło stabilne ciała komórkowe oligodendrocytów z niewielkimi ruchami w procesach dystalnych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować kultury plasterkowe zarówno z czterech mózgów, jak i móżdżku, wielokrotnie obrazować pojedyncze komórki w ciągu dni lub godzin i analizować los komórek obrazowych za pomocą immunohistochemii post ho. Oprócz obrazowania, plastry te umożliwiają również manipulowanie środowiskiem komórkowym przy użyciu technik mapowania losu, takich jak indukowalna rekombinacja kremu w przygotowanym wycinku.

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Ten film demonstruje technikę ex vivo do wywoływania śmierci komórek mózgowych, w której pośredniczą cytotoksyczne limfocyty T CD8+. Po uzyskaniu wycinków mózgu, aktywowane limfocyty T CD8 + skierowane do oligodendrocytów są przenoszone na wycinki, aby celować w osłonkę mielinową i oligodendrocyty. Po inkubacji uszkodzenie mieliny i śmierć neuronów można ocenić histologicznie w obszarach zainteresowania.

Technika ex vivo indukowania śmierci neuronów za pomocą limfocytów T CD8+ specyficznych dla oligodendrocytów

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Oligodendrocyty mielinizujące sprzyjają szybkiemu rozprzestrzenianiu potencjału czynnościowego i przetrwaniu neuronów. Opisano tutaj protokół specyficznej dla oligodendrocytów ekspresji białek fluorescencyjnych w organotypowych wycinkach mózgu z późniejszym obrazowaniem poklatkowym. Ponadto przedstawiono prostą procedurę wizualizacji niebarwionej mieliny.

Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków mózgu do badania dynamiki proliferacji i różnicowania oligodendrocytów. Technika umożliwia obserwację komórek NG2 w czasie rzeczywistym przy zachowaniu architektury tkanki.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Przeglądaj więcej filmów