Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie proliferacji i różnicowania komórek linii oligodendrocytów w środowisku, które bardzo przypomina to, które występuje in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw kultur warstwowych czterech mózgów i móżdżku od wczesnych postnatalnych myszy transgenicznych. Pojedyncze komórki w wycinkach są następnie obrazowane w ciągu kilku godzin do dni, aby zobrazować dynamikę komórkową ich proliferacji i różnicowania.

Po obrazowaniu post hoc immunohistochemia komórek służy do określenia różnych cech komórkowych. Ostatecznie wyniki mogą pokazać dynamikę proliferacji i różnicowania komórek w normalnych warunkach oraz po manipulacji farmakologicznej lub genetycznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zdysocjowany węgiel, hodowle neuronów i komórki linii liga incyte, jest to, że kultury warstwowe umożliwiają manipulowanie środowiskiem bezkomórkowym przy jednoczesnym zachowaniu architektury cyto tkankowej.

Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Connecticut co najmniej dwie godziny przed sekcją. Przygotować wkładki do kultur tkankowych na sześciu płytkach dołkowych do każdej. Dobrze dodać jeden mililitr pożywki do hodowli w plastrach, a następnie przenieść płytki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla co najmniej 15 minut przed preparacją.

Umieść bufor do rozwarstwiania na lodzie i zacznij bulgotać 95% tlenem i 5% gazowym dwutlenkiem węgla. Upewnij się również, że wszystkie narzędzia i rozdrabniacz do tkanek są wysterylizowane 70% etanolem. Przenieść tkankę do sterylnego 35-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty natleniony bufor preparacyjny.

Następnie, za pomocą żyletki, odetnij móżdżek i przodomózgowie, a następnie strzałkowo przeciąć przodomózgowie i móżdżek oddzielając półkule. Teraz za pomocą ręcznego rozdrabniacza wykonaj 300-mikronowe odcinki koronalne i strzałkowe czterech mózgowia i móżdżku. Każde zwierzę zwykle daje sześć czterech plasterków mózgowca i sześć plasterków móżdżku.

Idealnie pobiera wycinki obejmujące przednią jedną trzecią ciała modzelowatego, aby zbadać zarówno obszary istoty szarej, jak i białej w tym samym plasterku. Przenieść oddzielone plastry do świeżo bąbelkowanego zimnego buforu do rozwarstwiania na lodzie w buforze, używając małej szpatułki do preparowania lub ważenia. Oddziel poszczególne sekcje i przenieś je do wstępnie inkubowanych.

Sześć naczyń studzienkowych zawierających wkładki do hodowli. Na jednej kulturze można umieścić od dwóch do trzech plasterków. Odpipetować nadmiar buforu preparacyjnego z powierzchni kultury.

Włóż i przenieś płytki do inkubatora, aż zostaną zamocowane. Pożywkę w plastrach należy wymieniać jeden dzień po przygotowaniu plastra, a następnie co drugi dzień, aż do utrwalenia plastra zgodnie z protokołem. W zależności od eksperymentu, użyj plasterków po pięciu do siedmiu dniach.

W kulturze. Używaj tylko tych plasterków, które stają się przezroczyste po pierwszych kilku dniach i odrzuć te, które mają nierówne, nieprzezroczyste obszary widoczne gołym okiem. W kontraście twarzy te nieprzezroczyste obszary wyglądają jak skupisko ciemnych komórek.

Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, martwe nieprzezroczyste obszary występują w nie więcej niż jednym do 5% plasterków. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe proliferacji i różnicowania dwóch komórek NG, użyj trzydniowych do pięciu jednodniowych wycinków od myszy, które wyrażają EGFP w dwóch komórkach NG. Nie pozwól, aby zjeżdżalnie spadły poniżej 37 stopni Celsjusza na dłużej niż 15 minut.

Podczas każdej sesji obrazowania, trzymając płytkę zamkniętą, użyj 10-krotnego obiektywu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby uchwycić obrazy za pierwszym razem. Punkt kultury. Zobrazuj od czterech do ośmiu miejsc na każdym wycinku zarówno z obszarów istoty szarej, jak i białej.

Zobrazuj również przydatne punkty orientacyjne, takie jak krawędzie plasterków, poszczególne komórki lub orientacja odcinków istoty białej w celu relokacji. Poprzedni obraz punktu czasowego może być wykorzystany jako obraz referencyjny podczas relokacji dla podziału dwóch komórek NG i różnicowania oligodendrocytów. Rób zdjęcia co cztery do sześciu godzin, najlepiej przez pięć do siedmiu dni.

Jeśli stosuje się indukowalny marker NG dwa cre, ER YFP, indukować ekspresję reporterową za pomocą pożywki hodowlanej o 100 nano molowcach. Cztery hydroksytamoksyfeny rozpuszczone w aktywności reporterowej etanolu powinny pojawić się w ciągu jednego do dwóch dni. W celu utrwalenia dodaj jeden mililitr utrwalacza na dno kultury.

Włóż i dodaj kolejny mililitr na wierzch plasterków. Nie rozpylaj utrwalacza bezpośrednio na plastry, ponieważ mogą się one oderwać. Utrwalaj tkankę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie za pomocą skalpela.

Wytnij błony z dołączonymi plastrami. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś plastry do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki załadowanej PBS. Następnie przenieś plastry na drugą 24-dołkową płytkę wypełnioną roztworem blokującym zawierającym 5% normalnej surowicy koziej i 0,1% tritton X 100 w PBS.

Pozwól im inkubować w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu przenieś plastry na płytkę wypełnioną pierwszorzędowym przeciwciałem w PBS o 5% NGS. Pozwól im inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia.

Umyj plastry w PBS. Następnie inkubuj plastry z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 5% NGS. Pozostaw inkubację na godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie wykonaj trzy kolejne płukania w PBS, jak poprzednio, i zamontuj plastry tak, aby membrana była skierowana w stronę szkiełka, tak aby nie znajdowała się między obiektywem a tkanką. Aby przeanalizować temporalną dynamikę różnicowania oligodendrocytów, obrazy podziału dwóch komórek NG uzyskano z kultur warstwowych przodomózgowia od myszy transgenicznych P eight NG two creeg przez wiele dni, sekwencje poklatkowe wykonano w ciągu 122 godzin. Fenotyp podzielonych komórek oznaczono za pomocą przeciwciał NG 2 i CC one.

Proliferację komórek oceniano również za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla markera proliferacji komórek. Mapowanie przynęty KI 67 dwóch komórek NG przeprowadzono po indukcji rekombinacji CRE w plasterkach od myszy NG dwóch CRE YFP. Dwa dni po dodaniu czterech hydroksytamoksyfenu.

W hodowlach znaleziono reporter YFP wykazujący ekspresję NG dwie dodatnie komórki. Cztery dni później część tych komórek zróżnicowała się w cyty CC one one dodatnich oligodendrocytów. Dojrzałe oligodendrocyty zobrazowano w kulturach warstw móżdżku z P-L-P-D-S.

Czerwone myszy mielinizowane neurony Perkin były obecne w tych kulturach. Wielokrotne obrazowanie wykazało dodanie mielinizującej się czerwieni DS eksprymującej oligodendrocyty, chemia immunologiczna w tych wycinkach wykazała znaczną ekspresję zasadowego białka mieliny. Wreszcie, obrazowanie w wyższej rozdzielczości czasowej ujawniło stabilne ciała komórkowe oligodendrocytów z niewielkimi ruchami w procesach dystalnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować kultury plasterkowe zarówno z czterech mózgów, jak i móżdżku, wielokrotnie obrazować pojedyncze komórki w ciągu dni lub godzin i analizować los komórek obrazowych za pomocą immunohistochemii post ho. Oprócz obrazowania, plastry te umożliwiają również manipulowanie środowiskiem komórkowym przy użyciu technik mapowania losu, takich jak indukowalna rekombinacja kremu w przygotowanym wycinku.