Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie glikanów Olink. Osiąga się to poprzez pierwsze rozdzielenie glikoprotein za pomocą strony SDS. Drugim krokiem jest umycie kawałków żelu zawierających interesującą nas glikoproteinę.

Następnie glikany olink są uwalniane przez redukcyjną eliminację beta. Ostatnim etapem jest glikan na metylację z podziałem faz. Ostatecznie trwałe glikany metylowane są analizowane za pomocą tandemowej spektrometrii mas w celu wykrycia struktur i ilościowego określenia obfitości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wysokosprawna chromatografia cieczowa, jest to, że nasza metoda oddziela neutralne i naładowane glikany metylowane w szybkim podziale fazowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nauki o glikoproteinach, umożliwiając kompleksową charakterystykę lub połączonych glikanów uwalnianych z rozwiązanych glikoprotein. Przed rozpoczęciem tej procedury należy rozpuścić glikoproteiny za pomocą elektroforezy żelowej.

Po elektroforezie umieść żel na szklanej płytce i wytnij obszar zainteresowania za pomocą czystego skalpela, aby zwiększyć wydajność glikanów OG. Przenieś interesującą Cię opaskę żelu na inną szklaną płytkę i pokrój kawałek w około dwumilimetrową kostkę. Przenieś małe kawałki żelu do szklanej rurki o wymiarach 13 na 100 milimetrów za pomocą mikroszpatułki ze stali nierdzewnej.

Następnie dodaj jeden mililitr 25-milimolowego wodorowęglanu amonu lub ambi do probówki z próbką. Po zakręceniu probówki zakrętką z żyłki teflonowej, delikatnie wymieszaj zawartość, przesuwając probówkę, a następnie odstaw ją na 10 minut. Następnie ostrożnie wyjmij ambit ze szklanej rurki.

Za pomocą pastwiska lub szklanej pipety dodaj jeden mililitr acetonu nitrylu do szklanej probówki, aby całkowicie pokryć kawałki żelu. Po zamknięciu probówki delikatnie wymieszaj zawartość, przesuwając probówkę, a następnie odstaw ją na 10 minut. Po zakończeniu usuń acetonowy nitryl ze szklanej rurki.

Po powtórzeniu poprzednich kroków, aż jasnoniebieski kolor zostanie wyeliminowany, dodaj dwa mililitry octanu etylu i ponownie zamknij probówkę. Umieść probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc, mieszając koniec nad końcem. Po usunięciu płukania octanem etylu wykonaj trzy płukania dwoma mililitrami wody dejonizowanej.

Po wysuszeniu kawałków żelu dodaj 500 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu. I stańmy przez trzy do pięciu minut na lodzie, aby zrównoważyć żel do podstawowych warunków, które zwiększają regenerację glikanów. Następnie dodaj 500 mikrolitrów dwóch molowych wodorków boro sodu w 100 milimolowym wodorotlenku sodu, co daje końcowe stężenie jednego molowego wodorku boro sodu w 100 milimolowym wodorotlenku sodu.

Po delikatnym wymieszaniu probówki inkubować próbkę w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 18 godzin. W ciągu pierwszej godziny inkubacji delikatnie mieszaj probówkę co 15 minut. Po zakończeniu reakcji eliminacji beta i umieszczeniu probówki na lodzie, powoli dodawaj kroplami 10% kwasu octowego.

Aby zneutralizować zasadę, delikatnie przekręć probówkę z próbką między dodatkami kwasu octowego, odwiruj probówkę, aby wyeliminować pęcherzyki i zapobiec rozlaniu, jeśli to konieczne. Aby wykonać małą szklaną kolumnę, podrap i złam końcówkę pastwiska lub szklanej pipety za pomocą ceramicznego noża, tak aby stożek końcówki pipety miał około jednego centymetra długości. Po rozdzieleniu korka z waty szklanej popchnij go w kierunku końcówki, tworząc podporę dla łoża żywicy.

Zabezpiecz kolumnę pipety szpilką do bielizny i umieść na szklanej probówce. Następnie umyj pustą pipetę zawierającą watę szklaną jednym mililitrem metanolu i trzema mililitrami 5% kwasu octowego. Po zawirowaniu zawiesiny żywicy kationitów wodorowych Dow X w 5% kwasie octowym.

Przenieś wystarczającą ilość wody, aby wytworzyć jednomililitrową objętość złoża w kolumnie pipety pastwiska, przepłukać kolumnę za pomocą pięciu objętości 5% kwasu octowego, sprawdzając przepływ pod kątem pojawienia się cząstek żywicy. Po umieszczeniu kolumny na nowej szklanej rurce o wymiarach 16 na 125 milimetrów, załaduj próbkę do kolumny. Po zebraniu przepływu należy wymyć glikany z co najmniej trzema objętościami 5% kwasu octowego do tej samej probówki.

Po liofilizacji dodać 300 mikrolitrów 10% kwasu octowego w metanolu do wysuszonej probówki z próbką. Po wirowaniu usuń powstały bat trimetylowy przez odparowanie pod strumieniem azotu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po powtórzeniu etapów ponownego zawieszania i suszenia co najmniej cztery razy, próbkę należy rozpuścić w 5% kwasie octowym.

Po załadowaniu próbki do zrównoważonej kolumny C 18, zebrać przepływ do szklanej rurki z nakrętką o wymiarach 13 na 100 milimetrów. Eluować glikany OOG za pomocą trzech mililitrów 5% kwasu octowego do tej samej probówki. Następnie liofilizuj próbkę, aby przygotować odczynnik bazowy do metylacji perm.

Dodaj 400 mikrolitrów 50% wodorotlenku sodu do czystej szklanej rurki o wymiarach 13 na 100 milimetrów. Następnie dodaj 800 mikrolitrów bezwodnego metanolu do tej samej probówki. Dodaj cztery mililitry bezwodnego tlenku dimetylosulfy i wiruj, aby wytworzyć biały osad.

Odwirować próbkę w temperaturze 600 razy G przez jedną minutę w celu osadu. Po odrzuceniu supernatantu i dodaniu czterech mililitrów bezwodnego tlenku dimetylosulfosulowego do osadu, odczynnik należy powtórzyć jeszcze cztery razy, aż zawiesina bazowa stanie się przezroczysta. Rozpuść granulowaną zasadę w trzech mililitrach bezwodnego tlenku dimetylosulfy i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół czystą pipetą pastwiskową.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów bezwodnego tlenku dimetylosulfy do wysuszonej próbki i odwiruj. Aby go zawiesić, dodaj 300 mikrolitrów zawiesiny zawiesiny bazowej do próbki i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów metanu ITOM. Uszczelnij probówkę nakrętką wyłożoną teflonem i energicznie mieszaj przez pięć minut za pomocą wiru.

Aby zatrzymać reakcję metylacji trwałej ondulacji, umieść probówkę na lodzie i dodaj dwa mililitry 5% kwasu octowego. Po wirowaniu należy pięciokrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby zmniejszyć pozostałą objętość metanu ITOM przez odparowanie. W tym momencie dodaj dwa mililitry di chlorometanu do próbki po wirowaniu i odwirowaniu.

Przenieś górną warstwę wodną do nowej szklanej rurki o wymiarach 13 na 100 milimetrów. Po powtórzeniu przemywania wodnego warstwy di chlorometanu, należy połączyć drugą fazę wodną z pierwszą warstwą wodną. Po powtórzeniu przemywania wodą fazy di chlorometanu dwa do trzech razy, przenieść fazę di chlorometanu do czystej szklanej probówki za pomocą czystej pipety pastwiskowej.

Następnie wysuszyć fazę organiczną pod strumieniem azotu w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Po zrównoważeniu kolumny C 18 i załadowaniu na nią warstwy wodnej. Przemyć kolumnę C 18 wodą, a następnie wymyć permowane metylowane siarczany o glikanów do nowej szklanej probówki z dwoma mililitrami 50% acetonitrylu Analizuj permowane metylowane glikany OG przez bezpośrednią infuzję do odpowiedniego spektrometru masowego przy użyciu źródła nano electro spray przy natężeniu przepływu strzykawki od 0,4 do 0,6 mikrolitra na minutę w temperaturze 210 stopni Celsjusza.

Temperatura kapilarna do fragmentacji przez dysocjację wywołaną zderzeniem w MSM S i wielowymiarowym MS instrumentu pułapki jonowej stosuje 30 do 40% reprezentatywnych widm masowych energii zderzenia próbek glikanów olink metylowanych do permu uwolnionych z mucyny bydlęcej przy użyciu redukcyjnej eliminacji beta ingel pokazano tutaj w górnym panelu. Widma są zdominowane przez zanieczyszczenie polidyspersyjne pochodzące z żelu poliakrylamidowego. Dolny panel pokazuje, że mycie kawałków żelu octanem etylu przed eliminacją beta eliminuje ten problem.

Glikany z tuszem uwalniano z bydlęcej mucyny podszczękowej przez redukcyjną eliminację beta Ingel za pomocą kawałków żelu, które były krojone na małe lub duże plasterki. Odzysk glikanów z tuszu z małych kawałków żelu był prawie dziesięciokrotnie większy niż z dużych plastrów żelu. Obojętne glikany metylowane w stanie permu są odzyskiwane w organicznej fazie di chlorometanu.

Podczas gdy onowa trwała glikany metylowane są ilościowo dzielone na fazę wodną. Wydajność i prostota metody podziału faz znacznie ułatwia przepustowość próbek i późniejsze podejścia analityczne. Nonsiarczanowane glikany O metylowane perm odzyskano z fazy organicznej, a wszystkie glikany sul glikany metylowane perm odzyskano z fazy wodnej, co ułatwia identyfikację i charakterystykę glikanów prawie siarczanowanych izobarem i niesiarczanowanych.

Glikany te różnią się tylko o 0,1 jednostki masy i byłyby trudne do rozdzielenia bez fizycznego oddzielenia tych dwóch gatunków przez podział fazowy po jego opracowaniu. Technika ta pozwoliła na dokładne zbadanie różnorodności glikanów w próbkach tkanek, hodowanych komórkach, systemach modelowych i próbkach pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie zgrupować i podzielić wszystkie połączone glikany uwolnione z białek glikowych.

Rozwiązane przez stronę SDS.