Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest unieruchomienie struktur komórkowych komórek roślinnych poprzez substytucję pod wysokim ciśnieniem, zamrażanie i szybkie zamrażanie w celu późniejszej wizualizacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Osiąga się to poprzez staranne przygotowanie próbki tkanki do zamrożenia poprzez zakodowanie jej krioprotektantem, aby zapewnić, że tkanka zostanie minimalnie uszkodzona podczas zamrażania pod wysokim ciśnieniem. W drugim etapie próbka jest szybko zamrażana pod wysokim ciśnieniem, co unieruchamia składniki komórki i ogranicza tworzenie się krystalicznego lodu, w wyniku czego komórki mają nienaruszoną morfologię.

Następnie przeprowadza się szybkie wolne podstawienie w celu zastąpienia wody komórkowej rozpuszczalnikami organicznymi i wprowadzenia utrwalaczy, takich jak tetratlenek osmu, łącząc w ten sposób i stabilizując ultrastruktury komórkowe. Uzyskano wyniki, które wskazują, że zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i szybkie zamrażanie skutecznie zachowują struktury komórkowe i morfologię roślin w oparciu o transmisyjną mikroskopię elektronową. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne utrwalanie chemiczne, jest to, że H-P-F-Q-F-S unieruchamia zawartość komórkową w ciągu milisekund, minimalizując tworzenie się artefaktów.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół QFS jest trudny dla początkującego, dlatego zaleca się, aby dwie osoby współpracowały ze sobą, dopóki użytkownicy nie poczują się komfortowo z procedurą. Środki ochrony osobistej, w tym rękawice i okulary kriogenne, muszą być zawsze noszone podczas pracy z ciekłym azotem Napełnij izolowane pudełko zawierające uchwyty na fiolki kriogeniczne ciekłym azotem, tak aby pojemniki były całkowicie zakryte. Utrwalanie podczas substytucji przez szybkie zamrażanie lub QFS to 1% osmu, tetratlenek i 0,1% octan pisuaru w acetonie.

Po przygotowaniu dużej objętości roztworu zgodnie ze wszystkimi ostrzeżeniami dotyczącymi bezpieczeństwa, porcje 1,5 mililitra są dozowane do fiolek kriogenicznych i przechowywane w stanie zamrożonym w ciekłym azocie. Umieść odpowiednią liczbę oznakowanych fiolek kriogenicznych zawierających substytucję zamrażania lub pożywkę FS w aluminiowym, dwa uchwyty w ciekłym azocie. Dzięki temu protokołowi można umieścić do czterech krążków, z których każda zawiera pojedynczą próbkę, w jednej fiolce na około jedną do półtorej godziny przed przygotowaniem próbki.

Zamrażarka wysokociśnieniowa musi być włączona i przygotowana do pracy. Protokół ten wymaga również pasty drożdżowej jako zewnątrzkomórkowego krioprotektantu do wypełniania przestrzeni wokół próbki. W nośniku próbki wymieszaj trochę drożdży piekarskich z mniej więcej równą objętością 10% metanolu za pomocą wykałaczki, aż pasta będzie gładka.

Przy konsystencji mieszanki naleśnikowej ilość potrzebnej pasty zależy od liczby próbek na 10 próbek lub mniej, pastę można wymieszać w mikroprobówce wirówkowej. Aby przygotować próbkę do zamrażania pod wysokim ciśnieniem lub HPF, usuń interesujący liść z rośliny i delikatnie umieść go na kawałku wosku dentystycznego lub innej powierzchni do cięcia. Użyj dziurkacza o średnicy 0,2 milimetra, aby wyciąć próbkę z liścia.

Najważniejszą częścią tej procedury jest przygotowanie próbki do załadowania do tego nośnika próbki. Jeśli próbka jest źle traktowana, żaden inny krok nie pokryje kosztów szkód Praca pod mikroskopem preparacyjnym. Znajdź 0,2 milimetra bok nośnika próbki typu A i pokryj go pastą drożdżową.

Umieść krążek liściowy w nośniku próbki, wygładź pastę drobnym pędzlem, aby upewnić się, że krążek jest całkowicie wypełniony, a pasta znajduje się na poziomie krawędzi uchwytu. Umieść nośnik próbki w uchwycie na próbkę, który powinien być suchy i mieć temperaturę pokojową, przykryj próbkę płaską powierzchnią do przenoszenia próbek typu B do dołu. Umieść przygotowane wcześniej izolowane pudełko na maszynie.

Pobrać próbkę z uchwytu na próbkę do zamrażarki wysokociśnieniowej. Włożyć uchwyt na próbkę zawierającą próbkę do zamrażarki wysokociśnieniowej. Zainicjuj cykl zamrażania, naciskając przycisk jet auto, który powinien zakończyć się w ciągu sekundy lub dwóch, działając tak szybko, jak to możliwe.

Wyjmij uchwyt na próbkę z maszyny i umieść końcówkę. Umieścić próbkę w ciekłym azocie w izolowanym pudełku. Zanurz końcówki dwóch par kleszczy w ciekłym azocie, aby schłodzić je po zamrożeniu.

Z nośnikami należy obchodzić się wyłącznie za pomocą kleszczy chłodzonych ciekłym azotem pracujących pod ciekłym azotem. Otwórz uchwyt próbki, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyjmij nośnik próbki z uchwytu za pomocą kleszczyków chłodzonych ciekłym azotem, upewniając się, że krążek zawsze znajduje się w ciekłym azocie lub parze. Otwórz fiolkę krio zawierającą pożywkę FS i umieść pokrywkę z boku pudełka.

Trzymaj fiolkę kriogeniczną jednym wstępnie schłodzonym kleszkiem i użyj drugich kleszków, aby umieścić krążek w fiolce kriogenicznej. Przykręć wieczko fiolki kriogenicznej z powrotem, uważając, aby nie uwięzić ciekłego azotu w fiolce. Ciekły azot rozszerza się 700-krotnie podczas ocieplenia, a uwięziony ciekły azot może w tym czasie spowodować eksplozje.

Powtarzaj ten proces, aż wszystkie żądane próbki zostaną zamrożone. W tej samej fiolce można umieścić wiele krążków liściowych zawierających ten sam rodzaj próbki. Aby rozpocząć przygotowania do swobodnej substytucji, całkowicie zanurz aluminiowy blok grzejny w ciekłym azocie na 10 minut lub do momentu, gdy ustanie wrzenie nukleinów.

W międzyczasie umieść warstwę suchego lodu na dnie pojemnika, który będzie służył jako komora QFS. Można użyć styropianowego pojemnika lub wiaderka na lód z pokruszonym suchym lodem lub granulkami. Do tej procedury potrzebna jest sonda temperatury.

Termoparę umieszcza się w górnej części fiolki kriogenicznej tak, aby docierała do dna probówki, a wieczko probówki jest uszczelnione żywicą, aby nie wyciekał płyn. Napełnij probówkę 1.5 mililitra acetonu na początku każdego cyklu QFS. Należy upewnić się, że pokrywki fiolek są mocno przykręcone, tak aby pożywka FS nie wyciekała podczas fs.

Szybko włóż fiolki kriogeniczne zawierające próbki wraz z sondą temperatury do środkowych rzędów bloku grzejnego. Rozpocznij rejestrowanie temperatury za pomocą izolowanych rękawic kriogenicznych lub dużych kleszczy. Wylej cały ciekły azot z bloku grzejnego.

Należy uważać, aby nie wylać fiolek z kriogenicznym napojem. Umieścić blok zawierający fiolki w warstwie suchego lodu w komorze QFC. Upewnij się, że blok jest umieszczony tak, aby rurki leżały poziomo, ale z lekkim nachyleniem do góry.

Nie powinno być wycieku, jeśli używane są odpowiednie fiolki kriogeniczne. Wypełnij komorę QFS suchym lodem, tak aby rurki FS były przykryte. Chociaż nie jest konieczne zakrywanie górnej części bloku, umieść pokrywę na komorze.

QFS musi być wykonywany w dygestorium. Umieść komorę QFS z próbkami na platformie wytrząsającej obrotowej i obracaj z prędkością 125 obr./min przez 120 minut. W tym czasie temperatura bloku powinna stopniowo wzrastać do około minus 80 stopni Celsjusza.

Mieszanie zapewnia wymieszanie składników w celu uzyskania lepszych fs. Po dwóch godzinach usuń suchy lód z komory. Użyj rękawicy kriogenicznej, aby szybko podnieść blok grzejny z komory QFS i szybko wylać suchy lód do dodatkowego pojemnika.

Kontynuuj potrząsanie przez kolejną godzinę. W tym czasie temperatura powinna wzrosnąć do około minus 15 stopni Celsjusza do minus 20 stopni Celsjusza. Pod koniec godziny wyjmij próbki i sondę temperatury z komory QFS i umieść je na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na kolejne 10 do 15 minut, aż osiągną temperaturę pokojową.

Przestań rejestrować temperaturę po zakończeniu szybkiej bezpłatnej wymiany. Ostrożnie wyjmij pożywkę FS z każdej fiolki kriogenicznej za pomocą plastikowej pipety transferowej i umieść w odpowiednim pojemniku na odpady toksyczne. Umyj próbki czterokrotnie 100% acetonem.

Zbierz pierwsze dwa mycia i umieść je w pojemniku na odpady toksyczne. Należy uważać, aby nie wyrzucić próbek podczas wyjmowania acetonu. Po umyciu próbek użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć próbki tkanek z nośnika próbki.

Utrzymuj próbki mokre w roztworze acetonu, tak jak to się robi i pracuj bardzo delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia próbek. Nie jest niczym niezwykłym, że pasta drożdżowa odpada od próbek. W tym momencie pasta drożdżowa jest zwykle bardzo ciemnobrązowa, podczas gdy tkanka liścia jest nadal zielona.

Często próbki tkanek wypadają z nośnika próbki podczas FS pobiera się próbki za pomocą pipety transferowej w fiolkach kriogenicznych zawierających aceton. Następnie próbki są przygotowywane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej zgodnie ze standardowymi protokołami. A. Typowa krzywa zmian temperatury podczas QFS jest pokazana na tym wykresie.

Temperatura gwałtownie wzrasta od minus 196 stopni Celsjusza, temperatury ciekłego azotu do około minus 80 stopni Celsjusza. Skok na początku cyklu jest spowodowany elektroniką sondy i nie odzwierciedla rzeczywistego pomiaru temperatury po przygotowaniu próbek HPF i QFS do oglądania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Typowe wyniki są pokazane na tych zdjęciach z próbek liści królika.

Błony plazmatyczne, które są gładkie i dociśnięte do ściany komórkowej, wskazują na dobre utrwalenie. Rozgałęziona plazma dema jest widoczna przy dużym powiększeniu. Inne organelle są również wyraźnie widoczne.

Należą do nich chloroplasty i mitochondria tylakoidów, mikrotubule GOGI i plazma desa, duże centralne VAE pozostają nienaruszone. Niewłaściwa obsługa podczas H-P-F-Q-F-S powoduje artefakty, w tym uszkodzenia wywołane kryształkami lodu i lizę. Osad ołowiu może również tworzyć się podczas barwienia skrawków Po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w cztery i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem i tetratlenkiem osmu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, w tym pracę pod wyciągiem i noszenie środków ochrony osobistej, w tym rękawic, fartuchów laboratoryjnych i okularów.