Name: Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę zamrażania wysokociśnieniowego i szybkiego podstawiania mrożonego do przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta zachowuje integralność ultrastruktury komórkowej i minimalizuje artefakty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Życzliwość i hojność dr Kenta McDonalda z UC Berkeley są bardzo doceniane. Dziękujemy anonimowemu recenzentowi za bardzo pomocne sugestie. Laboratorium Burch-Smith jest wspierane przez fundusze start-upowe z University of Tennessee.

UWAGA: Procedura QFS wymaga od użytkownika szczególnej ostrożności i ostrożności, dlatego podkreślamy te środki ostrożności tutaj jako Przestrogi i Uwagi, gdzie to możliwe.
1.Przygotowanie do biegu HPF
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki włącz zamrażarkę wysokociśnieniową zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Jednostka HPF używana w tym protokole to jednostka Wohlwend Compact 02 (rysunek 1A) i zajmuje około jednej do półtorej godziny procedury rozruchowej, zanim będzie można rozpocząć uruchamianie HPF.
	<ol>
		<li>Włączanie zamrażarki wysokociśnieniowej Wohlwend Compact 02.
		<ol>
			<li>Włącz instrument, przekręcając główny wyłącznik z "0" na "1".</li>
			<li>Spuść sprężone powietrze do maszyny.</li>
			<li>Uwolnij ciekły azot do maszyny.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "SYSTEM DRY UP".</li>
			<li>Po 30 minutach ponownie naciśnij przycisk "SYSTEM DRY UP".</li>
			<li>Naciśnij przycisk "ON/OFF", aby włączyć instrument.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "AZOT".</li>
			<li>Pozwól maszynie ostygnąć przez 20 minut, nawet jeśli przycisk "DRIVE IN" już się zaświecił.</li>
			<li>Zaświeci się przycisk "DRIVE IN".</li>
			<li>Naciśnij przycisk "DRIVE IN".</li>
			<li>Naciśnij przycisk "AUTO".</li>
			<li>Zaświeci się przycisk "SYSTEM READY".</li>
			<li>Umieść sondę temperatury i ciśnienia w komorze ciśnieniowej i zablokuj ją za pomocą kołka.</li>
			<li>Naciśnij przycisk "JET AUTO". Ten krok sprawdza, czy wzrost ciśnienia i spadek temperatury są zgodne z oczekiwaniami; Zasadniczo jest to próba próbna. Spodziewane są gwałtowne spadki temperatury i gwałtowne wzrosty ciśnienia (rysunek 1B).</li>
			<li>Wykonaj jeszcze dwa cykle JET.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie do przyjmowania zamrożonych próbek
<ol>
	<li>Napełnij izolowane pudełko zawierające uchwyty kriowialne ciekłym azotem (patrz Ostrzeżenia dotyczące bezpieczeństwa), tak aby pojemniki były całkowicie zakryte (Rysunek 1C). 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać środków ochrony indywidualnej, w tym rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych.</li>
	<li>Umieścić odpowiednią liczbę fiolek zawierających pożywkę FS w aluminiowych uchwytach probówek w ciekłym azocie (Rysunek 1C). Dzięki temu protokołowi w jednym kriowialu można umieścić do czterech krążków, z których każdy zawiera pojedynczą próbkę. 
	UWAGA: Fiolki powinny być oznaczone ostrym narzędziem, takim jak rysik z diamentową końcówką i bardzo miękki ołówek.
	<ol>
		<li>Do utrwalania podczas QFS należy użyć 1% OsO4 i 0,1% octanu uranylu w acetonie 9. Przygotować roztwór w dużej objętości, dozować porcje 1,5 ml do kriowialiów i przechowywać zamrożone w ciekłym azocie. 
		UWAGA: Postępuj zgodnie z ostrzeżeniami dotyczącymi bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z OsO4 i octanem uranylu. 
		UWAGA: OsO4 i octan uranylu są niebezpiecznymi substancjami chemicznymi i należy obchodzić się z nimi w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym obuwie z zakrytymi palcami, fartuch laboratoryjny i rękawice. 
		UWAGA: Kriowiale używane do przechowywania próbek do QFS powinny mieć twardy O-ring, aby zapewnić, że probówki pozostaną szczelne podczas QFS, aby uniknąć wycieku OsO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pastę drożdżową, mieszając drożdże piekarskie z mniej więcej równą objętością 10% metanolu za pomocą wykałaczki lub innego podobnego narzędzia, aż pasta będzie gładka. Pasta drożdżowa działa jako zewnątrzkomórkowy krioprotektant i służy do wypełniania przestrzeni wokół próbki w nośniku próbki. Ilość pasty zależy od liczby próbek; W przypadku 10 próbek lub mniej pastę (1 ml) można wymieszać w probówce do mikrowirówki.</li>
</ol>
3. Zamrażanie próbek pod wysokim ciśnieniem
<ol>
	<li>Usuń liść (lub inną tkankę) z rośliny i delikatnie umieść go na kawałku wosku dentystycznego lub innej powierzchni do cięcia. Użyj stempla o średnicy 2,0 mm lub żądanego rozmiaru, aby wyciąć próbkę z liścia. Delikatnie obchodź się z próbką za pomocą kleszczy i pracuj tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, umieść krążek liściowy po stronie 0,2 mm nośnika próbki typu A i całkowicie pokryj pastą drożdżową. Upewnij się, że krążek jest całkowicie wypełniony, a pasta znajduje się na poziomie krawędzi uchwytu, wygładzając pastę drobnym pędzlem (Rysunek 2).</li>
	<li>Umieścić nośnik w uchwycie na próbki. Przykryj próbkę nośnikiem próbki typu B, płaską powierzchnią do dołu. 
	UWAGA: Uchwyt próbki powinien być suchy i mieć temperaturę pokojową.</li>
	<li>Pobrać próbkę do uchwytu na próbkę, włożyć ją do maszyny i rozpocząć cykl zamrażania, naciskając przycisk "JET AUTO", który powinien zakończyć się w ciągu sekundy lub dwóch.</li>
	<li>Pracując tak szybko, jak to możliwe, wyjmij uchwyt z maszyny i umieść końcówkę przytrzymującą próbkę w ciekłym azocie w izolowanym pudełku na górze maszyny HPF. Zanurz końcówki dwóch par kleszczy w ciekłym azocie, aby je schłodzić. 
	UWAGA: Po zamrożeniu z nośnikami należy obchodzić się wyłącznie za pomocą kleszczy chłodzonych ciekłym azotem. Ciepłe (temperatura pokojowa) kleszcze są często przyczyną niepowodzeń w kriotechnikach.</li>
	<li>Otwórz kriowial zawierający pożywkę FS i umieść pokrywkę z boku pudełka. Za pomocą pary kleszczyków chłodzonych ciekłym azotem delikatnie wyjmij krążek z uchwytu próbki, upewniając się, że krążek zawsze znajduje się w ciekłym azocie lub parze. Pracując w oparach ciekłego azotu, przytrzymaj rurkę FS jednym wstępnie schłodzonym kleszkiem, a drugą użyj do umieszczenia uchwytu w fiolce FS. Ponownie przykręcić pokrywkę fiolki FS. Nie umieszczać ciekłego azotu w fiolce. 
	UWAGA: Podczas przenoszenia próbek do kriowialiów w celu QFS należy upewnić się, że w fiolkach nie został uwięziony ciekły azot. Ciekły azot rozszerza się 700-krotnie podczas ocieplenia, a każdy uwięziony ciekły azot może w tym czasie spowodować eksplozje.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 3.1 do 3.7, aż wszystkie żądane próbki zostaną zamrożone. W tej samej fiolce można umieścić wiele krążków liściowych zawierających ten sam rodzaj próbki. Należy pamiętać, że uchwyt próbki należy wysuszyć i doprowadzić do temperatury pokojowej między cyklami zamrażania. Aby zrobić to szybko, podgrzej go suszarką i monitoruj jego temperaturę dotykiem.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do zastąpienia zamrażarki
<ol>
	<li>Całkowicie zanurz aluminiowy blok grzejny w ciekłym azocie na 10 minut lub do momentu zatrzymania wrzenia nukleatu. W tym czasie umieść warstwę suchego lodu (1-2 cm) na dnie pojemnika używanego jako komora FS (Rysunek 3). Do FS można użyć styropianowego pojemnika lub wiaderka na lód wraz z pokruszonym suchym lodem lub granulkami.</li>
	<li>Szybko włóż kriowia zawierające próbki wraz z sondą temperatury do środkowych rzędów bloku grzejnego. Należy upewnić się, że pokrywki fiolek są mocno przykręcone, aby pożywka FS nie wyciekała podczas FS. Rozpocznij rejestrowanie temperatury.
	<ol>
		<li>Wykonaj sondę temperatury, umieszczając termoparę w górnej części kriowialu tak, aby sięgała do dna rurki. Uszczelnij pokrywę rurki żywicą, aby nie wyciekał płyn. Napełnij probówkę 1,5 ml acetonu na początku każdego cyklu QFS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą izolowanych rękawic kriogenicznych lub dużych kleszczy wylej cały ciekły azot z bloku grzejnego. Uważaj, aby nie wylać kriowialików. 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać środków ochrony indywidualnej, w tym rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych.</li>
	<li>Umieścić blok zawierający fiolki na warstwie suchego lodu w komorze QFS. Upewnij się, że blok jest umieszczony tak, aby rurki leżały poziomo, ale z lekkim nachyleniem do góry. Nie powinno być wycieków, jeśli używane są odpowiednie kriowiale.</li>
	<li>Wypełnij komorę QFS suchym lodem, tak aby rurki FS były zakryte, chociaż nie jest konieczne przykrywanie górnej części bloku. Umieść pokrywę na komorze.</li>
</ol>
5. Szybki FS
UWAGA: Wykonaj przebieg QFS w dygestoriach w przypadku, gdy jakikolwiek wyciek OsO4 przypadkowo nastąpi, pomimo innych środków ostrożności.
<ol>
	<li>Umieść komorę QFS na platformowej wytrząsarce obrotowej w dygestoriach i obracaj z prędkością 125 obr./min przez 120 min. W tym czasie temperatura bloku powinna stopniowo wzrastać do około -80 °C. Mieszanie zapewnia mieszanie składników dla lepszego FS. 
	UWAGA: Umieszczenie wytrząsarki w dygestorii i położenie drzwiczek dygestorium powinno być takie samo przez całą procedurę QFS i dla każdego przebiegu QFS, aby zapewnić stałe ogrzewanie próbek.</li>
	<li>Wyjmij suchy lód z komory i kontynuuj wytrząsanie przez kolejną godzinę. 
	UWAGA: temperatura powinna wzrosnąć do około -15 °C do -20 °C.</li>
	<li>Wyjmij próbki i sondę temperatury z komory QFS i umieść na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na kolejne 10-15 minut, aż osiągną temperaturę pokojową. Przestań rejestrować temperaturę.</li>
	<li>Podczas FS wyłącz maszynę HPF.
	<ol>
		<li>Zamknij kurek zbiornika ciekłego azotu, podczas gdy maszyna HPF jest napełniana azotem.</li>
		<li>Naciśnij przycisk "AZOT".</li>
		<li>Poczekaj, aż zgaśnie czerwona kontrolka "TŁOK W DÓŁ".</li>
		<li>Naciśnij przycisk "ON/OFF".</li>
		<li>Naciśnij przycisk "SYSTEM DRY UP".</li>
		<li>Odciąć dopływ sprężonego powietrza do maszyny.</li>
		<li>Po upływie co najmniej 12 godzin (aby zapewnić wyschnięcie wilgoci) wyłącz maszynę, przekręcając główny wyłącznik z "1" na "0".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przetwarzanie po FS
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjmij pożywkę FS za pomocą plastikowych pipet transferowych i umieść w odpowiednim pojemniku na odpady toksyczne. 
	UWAGA: OsO4 i octan uranylu są niebezpiecznymi substancjami chemicznymi i należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem podczas noszenia odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), w tym butów z zakrytymi palcami, fartucha laboratoryjnego i rękawic.</li>
	<li>Umyj próbki czterokrotnie 100% acetonem. Zbierz pierwsze dwa mycia i umieść je w pojemniku na odpady toksyczne.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy usuń próbki tkanek z uchwytów. Utrzymuj próbki mokre w roztworze acetonu i pracuj bardzo delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia próbek. 
	UWAGA: Nie jest to niczym niezwykłym i może być przydatne, aby pasta drożdżowa odpadła w tym momencie od próbek. Pasta drożdżowa jest zwykle bardzo ciemnobrązowa, podczas gdy tkanka liścia jest jeszcze zielona.</li>
	<li>Zebrać próbki w kriowialach zawierających aceton. Kontynuuj przygotowanie próbki (infiltracja i osadzanie) do TEM zgodnie ze zwykłymi protokołami.</li>
</ol>

<ol><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li>
<li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li>
<li>Bowers, B. aM. M. Ch 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowers%2C+BaMM+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).</li>
<li>Mollenhauer, H. H. Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollenhauer%2C+HH+%22Artifacts+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Artifacts in Biological Electron Microscopy</a>. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).</li>
<li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen%2Ffreeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li>
<li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoor%2C+H+%22Cryotechniques+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Cryotechniques in Biological Electron Microscopy</a>. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+electron+microscopy%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li>
<li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li>
<li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li>
<li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li>
<li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li>
<li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li>
<li>Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li>
<li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+substitution+in+3+hours+or+less%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li>
<li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li>
<li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li>
<li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+microanalysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li>
<li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing%2C+cellular+tomography%2C+and+structural+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li>
<li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sukces przedstawionego tutaj protokołu zależy w dużej mierze od użytkownika. Po pierwsze, wymagane jest zaawansowane przygotowanie, aby upewnić się, że wszystkie niezbędne materiały są łatwo dostępne i w ilości wystarczającej do wykonania całego cyklu HPF-QFS. Po drugie, użytkownik musi pracować szybko, przechodząc od kroku do kroku w wydajny sposób, który minimalizuje obsługę próbki, minimalizując w ten sposób zmiany w natywnym stanie tkanki. Po zamrożeniu próbek, a przed ich odwodnieniem, konieczne jest, aby były one p...

Nasza wiedza na temat ultrastruktury komórek pochodzi głównie z mikroskopii elektronowej, która może rozdzielić szczegóły w zakresie kilku nanometrów 1. Pomimo tak potężnej rozdzielczości, TEM nie jest uważany za przyjazny dla użytkownika, ponieważ przygotowanie próbki wymaga czasochłonnych i pracochłonnych protokołów oraz wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej od praktyka. Tradycyjne utrwalanie próbek łączyło użycie aldehydów i tetratlenku osmu przed dalszym przetwarzaniem, które obejmuje odwodnienie, zatopienie w żywicy, a następnie cięcie w celu wytworzenia ultracienkich skrawków, które są następnie barwione metalami ciężkimi. Wiadomo jednak, że utrwalanie chemiczne może powodować artefakty, w tym agregację białek i utratę lipidów 1 oraz zmiany w błonach, które ostatecznie wpływają na kilka przedziałów komórkowych 2. Artefakty te są w dużej mierze przypisywane powolnemu tempu utrwalania i odwadniania w temperaturze pokojowej 3,4,5.
Kriofiksacja przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) pozwala uniknąć większości artefaktów spowodowanych chemicznym utrwalaniem. Zasada kriofiksacji polega na tym, że obniża temperaturę zamarzania wody o 20 stopni, spowalnia zarodkowanie i wzrost kryształków lodu oraz zwiększa lepkość wody w próbce biologicznej, dzięki czemu składniki komórkowe są zasadniczo unieruchomione 6, 7. HPF obniża temperaturę próbki do temperatury ciekłego azotu pod bardzo wysokim ciśnieniem (210 MPa lub 2100 barów) w ciągu milisekund. Prawidłowo wykonany HPF zapobiega tworzeniu się dużych kryształków lodu, które mogą spowodować poważne uszkodzenie ultrastruktury komórek. HPF może być stosowany do utrwalania próbek o grubości 100-200 μm przy typowych stężeniach substancji rozpuszczonych biologicznie 7. Istnieje wiele recenzji na temat fizyki i zasad leżących u podstaw HPF, np. 1,7,8.
Po HPF, próbki są inkubowane w niskiej temperaturze (-78.5 °C do -90 °C) w obecności płynnego rozpuszczalnika organicznego zawierającego chemiczne utrwalacze, takie jak tetratlenek osmu, zazwyczaj przez kilka dni. W tej niskiej temperaturze woda w próbce jest zastępowana rozpuszczalnikiem organicznym, zazwyczaj acetonem lub metanolem 1,9. Dlatego proces ten nazywa się substytucją przez zamrożenie (FS). Próbka jest następnie stopniowo podgrzewana i w tym czasie utrwalana, zwykle za pomocą tetratlenku osmu i octanu uranylu 9. Sieciowanie w niskich temperaturach ma tę zaletę, że utrwala cząsteczki, które są unieruchomione 1. W związku z tym FS wytwarza próbki o wyższej jakości w porównaniu z próbkami utrwalonymi przez konwencjonalne utrwalanie chemiczne w temperaturze pokojowej, w szczególności skutkuje to lepszą konserwacją ultrastrukturalną, lepszym zachowaniem antygenowości i zmniejszoną utratą niezwiązanych składników komórkowych 10,11.
Większość FS jest przeprowadzana przez długie okresy czasu, zazwyczaj do kilku dni. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku próbek roślin 12,13,14. Niedawny protokół opracowany przez McDonalda i Webba znacznie skraca czas FS z kilku dni do kilku godzin 15. W procedurze szybkiego zamrożenia (QFS) FS przeprowadza się w ciągu 3 godzin, podczas gdy w procedurze super szybkiej FS (SQFS) próbki są przetwarzane w ciągu 90 minut. Jakość próbek wytwarzanych tymi metodami jest porównywalna z jakością uzyskiwaną przy użyciu tradycyjnych protokołów FS. Przyjęliśmy protokół QFS do dalszego przetwarzania próbek roślinnych po HPF. Okazało się, że pozwala to zaoszczędzić nie tylko czas, ale także pieniądze, ponieważ QFS i SQFS wykorzystują wspólny sprzęt laboratoryjny zamiast kosztownych dostępnych na rynku maszyn FS.
Przygotowanie tkanek roślinnych do TEM jest często bardzo trudne. Średnio komórki roślinne są większe niż komórki bakteryjne lub zwierzęce. Obecność hydrofobowego woskowego naskórka, grubych ścian komórkowych, dużych wypełnionych wodą wakuoli zawierających kwasy organiczne, hydrolazy i związki fenolowe, które mogą zajmować do 90% całkowitej objętości komórki 16, oraz obecność napowietrzonych przestrzeni znacznie obniża przewodność cieplną systemu 17. Ponadto, w przypadku roślin, grubość próbki prawie zawsze przekracza 20 μm, co stanowi granicę stosowania wiązania chemicznego. Przy tych grubościach niska przewodność cieplna wody zapobiega zamarzaniu większej niż -10 000 °C/s w środku próbki. Szybkość ta jest wymagana, aby uniknąć szkodliwego tworzenia się lodu heksagonalnego (kryształki lodu o mniejszej gęstości i długości fali większej niż 10 do 15 nm) 8. Razem stanowią one wyzwanie zarówno dla prawidłowego zamrożenia próbki, jak i późniejszej FS. Niemniej jednak kriofiksacja jest najlepszą metodą utrwalania próbek roślin. W tym miejscu przedstawiono protokół HPF-QFS próbek tkanek roślinnych. Koncentruje się na gatunku modelowym Arabidopsis thaliana, ale był również używany z Nicotiana benthamiana. Typowe wyniki pokazują, że HPF-QFS wytwarza próbki o jakości porównywalnej do tradycyjnego HPF-FS w ułamku czasu. Przy odpowiednich dostosowaniach protokół ten może być również stosowany w przypadku innych stosunkowo grubych próbek biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Wysokociśnieniowa maszyna do zamrażania Wohlwend HPF Compact 02</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>HPF02</td><td>Ze zintegrowanym oscyloskopem do wyświetlania krzywych zamarzania i ciśnienia; Do wyświetlenia wymagany jest komputer PC (brak w zestawie)&nbsp; parametrów zamrażania</td></tr><tr><td>Uchwyt do nośników aluminiowych DN 3 x 0,5 mm</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki próbek, P=1,000, DN 3 x 0,5 aluminium, typ A</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>241-200</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki próbek, P=1,000, DN 3 x 0,5 aluminium, typ B</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>242-200</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td><td>Wykres</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td></td><td></td> piekarskie <td>Im starsze, tym lepiej, aby uniknąć nadmiernej produkcji gazów (CO2)</td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rejestrator danych termopary EL-USB-TC</td><td>OMEGA Engineering Inc.</td><td>OM-EL-USB-TC&nbsp;</td><td>Bateria zamienna zakupiona osobno</td></tr><tr><td>Sonda temperatury</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>34505</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny 12/13 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-10</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do liści - Harris Uni-core 2.00</td><td>Ted-Pella Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Różowy wosk dentystyczny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne 2 ml</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suszarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td>Kilka par</td></tr></tbody></table>

tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Od 1940 roku transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarcza biologom obrazów materiałów biologicznych o ultrawysokiej rozdzielczości. Jednak ze względu na pracochłonne i czasochłonne protokoły, które wymagają również doświadczenia w przygotowywaniu próbek wolnych od artefaktów, TEM nie jest uważany za technikę przyjazną dla użytkownika. W tradycyjnym przygotowywaniu próbek do TEM stosowano chemiczne utrwalacze w celu zachowania struktur komórkowych. Zamrażanie wysokociśnieniowe to kriofiksacja próbek biologicznych pod wysokim ciśnieniem w celu uzyskania bardzo szybkiego tempa chłodzenia, ograniczając w ten sposób tworzenie się lodu, co jest szkodliwe dla integralności ultrastruktury komórkowej. Zamrażanie wysokociśnieniowe i substytucja przez wymrażanie są obecnie metodami z wyboru w celu uzyskania najwyższej jakości morfologii w sekcjach żywicy dla TEM. Metody te minimalizują artefakty zwykle związane z konwencjonalnym przetwarzaniem TEM cienkich przekrojów. Po kriofiksacji zamrożona woda w próbce jest zastępowana ciekłym rozpuszczalnikiem organicznym w niskich temperaturach, w procesie zwanym substytucją przez wymrażanie. Substytucja zamrażania jest zwykle przeprowadzana przez kilka dni w dedykowanym, kosztownym sprzęcie. Niedawna innowacja pozwala na zakończenie procesu w ciągu trzech godzin, a nie jak zwykle dwóch dni. Po tym zwykle następuje kilka kolejnych dni przygotowania próbki, które obejmuje infiltrację i zatopienie w żywicach epoksydowych przed przekrojeniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i szybkie zastępowanie przez zamrożenie, który umożliwia utrwalenie próbki roślinnej w ciągu kilku godzin. Protokół można łatwo dostosować do pracy z innymi tkankami lub organizmami. Tkanki roślinne są przedmiotem szczególnej troski ze względu na obecność napowietrzonych przestrzeni i wypełnionych wodą wakuoli, które utrudniają zamarzanie wody bez lodu. Ponadto proces wiązania chemicznego jest szczególnie długi w roślinach ze względu na ściany komórkowe utrudniające przenikanie chemikaliów w głąb tkanek. Tkanki roślinne są zatem szczególnie trudne, ale ten protokół jest niezawodny i pozwala uzyskać próbki najwyższej jakości.

Wyniki przedstawione poniżej zostały uzyskane przy użyciu urządzenia Wohlwend Compact 02 do HPF (Rycina 1A). Główną zaletą tego instrumentu jest łatwość obsługi nośników próbek oraz ich uchwytów. W przypadku korzystania z innych urządzeń McDonald zaleca, aby przygotowanie próbek i HPF przeprowadzali dwaj użytkownicy – jeden przygotowujący próbki, a drugi wykonujący zamrażanie i przeniesienie do krioprobówek FS 9. Jednakże nośniki i uchwyty Wohlwend są na tyle proste w obsłudze, że pojedynczy u...

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest unieruchomienie struktur komórkowych komórek roślinnych poprzez substytucję pod wysokim ciśnieniem, zamrażanie i szybkie zamrażanie w celu późniejszej wizualizacji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Osiąga się to poprzez staranne przygotowanie próbki tkanki do zamrożenia poprzez zakodowanie jej krioprotektantem, aby zapewnić, że tkanka zostanie minimalnie uszkodzona podczas zamrażania pod wysokim ciśnieniem. W drugim etapie próbka jest szybko zamrażana pod wysokim ciśnieniem, co unieruchamia składniki komórki i ogranicza tworzenie się krystalicznego lodu, w wyniku czego komórki mają nienaruszoną morfologię.Następnie przeprowadza się szybkie wolne podstawienie w celu zastąpienia wody komórkowej rozpuszczalnikami organicznymi i wprowadzenia utrwalaczy, takich jak tetratlenek osmu, łącząc w ten sposób i stabilizując ultrastruktury komórkowe. Uzyskano wyniki, które wskazują, że zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i szybkie zamrażanie skutecznie zachowują struktury komórkowe i morfologię roślin w oparciu o transmisyjną mikroskopię elektronową. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne utrwala

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę zamrażania wysokociśnieniowego i szybkiego podstawiania mrożonego do przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta zachowuje integralność ultrastruktury komórkowej i minimalizuje artefakty.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów