Name: In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji kompleksów zbierających światło in vitro z liści szpinaku i białka APA z E. coli. Protokół umożliwia analizę spektroskopową i manipulację składem kompleksów białkowo-pigmentowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych przez grant ERC dla RC oraz przez Holenderską Fundację Badań nad Materią (FOM) poprzez program FOM (10TM01).

1. Całkowita ekstrakcja pigmentu z liści szpinaku
<ol>
	<li>Homogenizować jedną garść liści szpinaku (~20 g) w 100 ml zimnego buforu do mielenia (patrz Tabela 1) za pomocą blendera przez 20 sekund.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez dwie warstwy nylonowej tkaniny o średnicy porów 20 μm i odwirować filtrat o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający chloroplasty za pomocą miękkiego pędzla w 1 ml zimnego buforu do przemywania (patrz Tabela 1). Po ponownym zawieszeniu osadu dodać 50 ml buforu do przemywania i odwirować roztwór o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad (tylakoidy) w 50 ml buforu do przemywania (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć supernatant. W tym momencie wykonaj następujące kroki w ciemności, aby uniknąć utleniania pigmentu.</li>
	<li>Dodać ~ 20 ml 80% acetonu buforowanego Na2CO3 (patrz Tabela 1) w celu ekstrakcji pigmentów. Pozostaw roztwór na lodzie na 10 minut, od czasu do czasu wirując.</li>
	<li>Granulować składniki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeśli pigmenty nie zostaną całkowicie wyekstrahowane, osadek będzie miał zielony kolor i krok 1.6 należy powtórzyć.</li>
	<li>Zebrać supernatant do rozdzielacza. Dodać 0,4 objętości eteru dietylowego, energicznie wstrząsnąć i otworzyć zawór, aby odpuścić gaz.</li>
	<li>Dodać 0,8 objętości 0,33 M NaCl i energicznie wymieszać. Odczekaj ~10 minut, aż warstwy się rozdzielą. Faza eterowa na wierzchu zawiera wyekstrahowane pigmenty. Usuń przezroczystą dolną fazę. 
	UWAGA: Jeśli separacja nie jest wyraźna, zamroź i rozmroź roztwór, aby poprawić separację faz.</li>
	<li>Usunąć eter, wlewając go z górnej części rozdzielacza do odpowiedniego szklanego pojemnika. Wysuszyć, dodając łyżkę granulowanego bezwodnego siarczanu sodu. Zamieszaj roztwór i odczekaj ~5 minut, aby środek osuszający wchłonął wodę z eteru. 
	UWAGA: Powtórz ten krok, jeśli siarczan sodu wydaje się całkowicie zbity ze sobą; Powinno być kilka swobodnie unoszących się kryształów, gdy eter jest wystarczająco wysuszony. Jeśli utworzy się warstwa wody, usuń ją pipetą Pasteura przed dodaniem dodatkowego bezwodnego siarczanu sodu.</li>
	<li>Zdekantować eter do nowego szklanego pojemnika, pozostawiając siarczan sodu w postaci stałej.</li>
	<li>Odparować eter w obrotowym speedvacu lub pod strumieniemN2.</li>
	<li>Pigmenty należy całkowicie rozpuścić w 10 ml 100% acetonu.</li>
	<li>Rozcieńczyć niewielką ilość (~3 μl) w 1 ml 80% acetonu i zmierzyć widma absorpcyjne oraz określić stosunek Chl a/b i stężenie Chl metodą opisaną przez Porra i wsp. (1989)Rozdział 15.</li>
	<li>Podwielokrotność pigmentów należy podzielić i wysuszyć w obrotowym speedvacu lub pod strumieniemN2, aż aceton zostanie całkowicie odparowany. Wysuszone pigmenty przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja karotenoidów ze szpinaku
<ol>
	<li>Wykonaj kroki od 1.1 do 1.5. W tym momencie wykonaj następujące kroki w ciemności, aby uniknąć utleniania pigmentu.</li>
	<li>Zawiesić osad tylakoidów w ~ 50 ml 96% etanolu buforowanego Na2CO3 (patrz Tabela 1) w celu ekstrakcji pigmentów. Pozostaw roztwór na lodzie na 5 minut.</li>
	<li>Granulować składniki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeśli pigmenty nie zostaną całkowicie wyekstrahowane, granulka będzie miała zielony kolor i krok 2.2 należy powtórzyć.</li>
	<li>Zebrać supernatant i dodać 0,1 objętości 80% KOH (w/v), aby zainicjować zmydlanie.</li>
	<li>Pozostawić roztwór w temperaturze 4 °C O/N, szczelnie zamknięty i chroniony przed światłem.</li>
	<li>Zebrać roztwór do rozdzielacza. Dodać 1 objętość eteru dietylowego i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 0,8 objętości 0,33 M NaCl i delikatnie wymieszać. Odczekaj ~10 minut, aż warstwy się rozdzielą. Pomarańczowa faza eterowa na wierzchu zawiera zmydlone karotenoidy. Usuń zieloną dolną fazę, opróżniając ją przez zawór odcinający lejka.</li>
	<li>Dodaj 3 objętości wody i delikatnie wymieszaj, aby usunąć wodorotlenek potasu. Pozwól warstwom się rozdzielić. UWAGA: Jeśli górna faza wydaje się mętna, dodaj niewielką ilość NaCl (np. 3 g NaCl w 200 ml roztworu) i delikatnie zamieszaj do rozpuszczenia.</li>
	<li>Usunąć dolną fazę, opróżniając ją przez zawór odcinający lejka.</li>
	<li>Wykonaj kroki od 1.10 do 1.13.</li>
	<li>Rozcieńczyć niewielką ilość (~3 μl) w 1 ml 80% acetonu i zmierzyć widma absorpcyjne przy 440 nm w 80% acetonie. Aby określić stężenie, należy użyć średniego współczynnika ekstynkcji dla karotenoidów (ε440 = 255)16 według następującego wzoru: Samochód [mg/ml] = (Abs440 nm/225) x 11 (droga optyczna) = 1 cm.</li>
	<li>Podwielokrotność karotenoidów należy podzielić na składniki i wysuszyć w urządzeniu speedvac lub pod strumieniemN2, aż cały eter dietylowy zostanie odparowany. Wysuszone pigmenty przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Całkowita ekstrakcja pigmentu i karotenoidów z Chlamydomonas reinhardtii
<ol>
	<li>Hoduj C. reinhardtii na stałym podłożu TAP17 na szalce Petriego, rozprowadzając niewielką ilość płynnej kultury na powierzchni. Rosnąć pod ciągłym strumieniem świetlnym o wielkości 20 μmol zdjęcia PSA m-2 sec-1, aż do wyświetlenia zielonej warstwy komórek.</li>
	<li>Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, zebrać niewielką ilość C. reinhardtii ze stałej pożywki TAP i umieścić komórki w 500 ml pożywki TAP17 w kolbie o pojemności 1 l. Hoduj kulturę w temperaturze 25 °C z mieszaniem 170 obr./min pod ciągłym strumieniem świetlnym 20 μmol photos PSA m-2 sec-1.</li>
	<li>Po 5-6 dniach hodowla powinna osiągnąć koniec fazy logarytmicznej (6 x 106 komórek/ml lub 2-2,5 gęstości optycznej przy 750 nm). Odwirować kulturę przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby uzyskać całkowitą ekstrakcję pigmentu, wykonaj kroki od 1.6 do 1.15.</li>
	<li>Wydajność całkowitego ekstraktu pigmentowego rozpoczynająca się od 500 ml pełnej kultury wzrostu C. reinhardtii wynosi około 5 ml roztworu o stężeniu 0,5 mg chl a+b / ml.</li>
	<li>W przypadku ekstrakcji karotenoidów wykonaj kroki od 2.2 do 2.12.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie ciał inkluzyjnych
<ol>
	<li>Sklonuj sekwencję kodującą interesującego nas białka LHC do wektora ekspresji, który skutkuje stopionym C-końcowym znacznikiem He przy użyciu standardowych procedur biologii molekularnej. Przekształć ten konstrukt w szczep gospodarza E. coli, taki jak BL21 (DE3).</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy, bufor detergentu, bufor trytonu, TE (tabela 1), 1 M izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) i pożywkę LB18 z odpowiednimi antybiotykami.</li>
	<li>Pobrać pojedynczą kolonię E. coli zawierającą klon ekspresyjny ze świeżo prążkowanej płytki do ~ 5 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami, stosując standardowe procedury6. Rosnąć w temperaturze 37 °C z mieszaniem 220 obr./min przez co najmniej 16 godzin.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml kultury O/N do 1 l kolby Erlenmeyera z 250 ml LB uzupełnionymi odpowiednim antybiotykiem.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 2-3 godziny (lub do momentu, gdy OD600 wyniesie ~0,6) w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min.</li>
	<li>Dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Kontynuuj wzrost komórek w temperaturze 37 °C z prędkością 220 obr./min przez 3-4 godziny.</li>
	<li>Odwirowywać kulturę przez 10 minut przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C w wstępnie zważonej probówce wirówkowej. Dokładnie odrzucić supernatant i określić wagę osadu, ponownie ważąc i odejmując wagę probówki wirówkowej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek E. coli w 0,8 ml/g buforu do lizy przez energiczne wirowanie. 
	UWAGA: Alternatywnie, granulat komórkowy można zamrozić w temperaturze -80C do późniejszego wykorzystania. Jeśli zaczynasz od zamrożonego granulatu, pozostaw do całkowitego rozmrożenia przed dodaniem buforu do lizy.</li>
	<li>Dodać 2 mg lizozymu na gram komórek i inkubować na mokrym lodzie z okazjonalnym wirowaniem przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 20 μg/ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 μg/ml RNAse. Wirować i umieszczać na lodzie na 30 min.</li>
	<li>Dodać 2 ml zimnego buforu detergentu na gram komórek. Dobrze wymieszaj i utrzymuj RT przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml (w razie potrzeby podzielić na dwie probówki). Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnego buforu Triton i całkowicie zawiesić osad przez sonifikację (3 impulsy x 5 s x 50% mocy w odstępach 20 sekund). UWAGA: Umieść rurkę w małej zlewce otoczoną lodowatą wodą, aby była zimna podczas sonifikacji. W przypadku wielu probówek, po ponownym zawieszeniu należy połączyć zawieszone ciała inkluzyjne w jedną rurkę.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.13 i 4.14 dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić inkluzje w 1 ml zimnego TE z sonifikacją w celu ostatecznego przepłukania w celu usunięcia buforu Triton. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia ciał wtrącających.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml zimnego TE metodą sonifikacji.</li>
	<li>Oceń stężenie białka za pomocą standardowych metod, takich jak test Bradforda19. Przechowywać podwielokrotności ciał inkluzyjnych w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Rekonstytucja
Protokół ten zwykle daje 1-2 ml odtworzonego białka o OD 4, gdy absorbancja jest mierzona w regionie Qy (600-750 nm). Ilość można dowolnie regulować, jednak należy zadbać o zachowanie odpowiednich proporcji podczas zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w Tabeli 1: 2x Bufor do rozpuszczenia, 20% OG, 2 M KCl, TE. Wykonaj następujące czynności przy słabym oświetleniu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 800 μg ciał inkluzyjnych LHC w sumie 400 μl TE w probówce do mikrofuge o pojemności 2 ml. Dodać 400 μl 2x Bufor do rozpuszczania i krótko</li> przetrząsnąć.
	<li>Dodać 0,6 μl β-merkaptoetanolu (zapas 14,8 M), aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM. Podgrzewać białko przez 1 minutę w temperaturze 98 °C. Krótko wirować i umieszczać w temperaturze RT na 3 minuty.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 500 μg całkowitych wysuszonych pigmentów chlorofilowych plus 80 μg pigmentów karotenoidowych w 30 μl 100% EtOH przez energiczne wirowanie przez 1 minutę lub umieścić w sonikatorze kąpielowym na 1-2 minuty.</li>
	<li>Odwiruj mieszankę pigmentów ~30 sekund w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C i upewnij się, że nie ma granulki. Jeśli jest granulka, powtórz wirowanie i/lub sonifikację. WAŻNE: Po ponownym zawieszeniu i odwirowaniu natychmiast dodaj pigment do białka, w przeciwnym razie może się ono agregować i będzie wymagało ponownego zawieszenia.</li>
	<li>Powoli dodawaj mieszankę pigmentów do schłodzonego białka podczas wirowania. Kontynuuj wirowanie przez 5-10 sekund i umieść rurkę na mokrym lodzie. Uważaj, aby nie wirować zbyt energicznie, ponieważ białko może przelać się przez górną część rurki.</li>
	<li>Dodać 94 μl 20% oktylu β-D-glukopiranozydu (OG) (stężenie końcowe 2%), krótko zmieszać i trzymać na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 90 μl KCl 2 M (końcowe stężenie 150-200 mM), krótko zmieszać i trzymać na lodzie 20 minut. UWAGA: w tym czasie można rozpocząć przygotowanie kolumny (sekcja 6).</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu (wytrąconego LDS) do probówki o pojemności 10 ml. Przechowywać w chłodnym miejscu i chronić przed światłem.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie kolumny niklowej
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1: bufor OG, bufor płuczący OG, bufor elucyjny.</li>
	<li>Podłącz kolumnę Ni-Sepharose (1 ml) lub jej odpowiednik do pompy perystaltycznej, upewniając się, że żadne powietrze nie dostanie się do wnętrza kolumny podczas tego kroku i następnych kroków.</li>
	<li>Ustaw prędkość pompy na 1 ml/min i przepłucz kolumnę 5-10 ml wody, aby usunąć roztwór do przechowywania.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę z 3-4 ml buforu OG.</li>
	<li>Dodać 3-4 ml buforu OG do próbki białka i załadować do kolumny. UWAGA: jeśli białko znajdowało się na lodzie dłużej niż 10 minut po usunięciu LDS, należy ponownie wirować w temperaturze 15 800 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie dodatkowe wytrącenia LDS.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 5 ml buforu OG.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 2 ml buforu do płukania OG.</li>
	<li>Eluować związane białko za pomocą 3 ml buforu elucyjnego. Zebrać zieloną elucję, która zawiera odtworzone białko. UWAGA: Zwykle jest to łącznie około 1 ml.</li>
</ol>
7. Wirowanie w gradionym przepływie sacharozy
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1: roztwór sacharozy, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.</li>
	<li>Napełnić probówki ultrawirówek roztworem sacharozy i zamrażać w temperaturze -20 °C O/N lub -80 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z zamrażarki i pozostaw do niezakłóconego rozmrożenia w temperaturze 4 °C. UWAGA: Proces zamrażania/rozmrażania tworzy gradient od 0,1 do 1 M sacharozy. Probówka o pojemności 15 ml zwykle rozmraża się w ciągu około 3 godzin.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć z góry tę samą objętość, co zielona frakcja wymyta z kolumny sefarozy niklu w kroku 6.8. Następnie powoli załaduj odtworzoną próbkę na wierzch, aby uniknąć zakłócenia gradientu.</li>
	<li>Wyważ probówki i wiruj z prędkością 200 000 x g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego SW-41 lub SW-60 przez 18 godzin, ustawionego na wolne przyspieszanie i zatrzymywanie się bez hamulców.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij gradient z uchwytu probówki za pomocą kleszczy. Użyj strzykawki z długą igłą z otworem, aby zebrać frakcję od góry. UWAGA: Alternatywnie zbieraj frakcje od dołu, przekłuwając rurkę igłą i zbierając krople.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Białka błonowe nie są tak łatwe do zbadania. Izolacja natywnych białek błonowych jest skomplikowana ze względu na konieczność rozpuszczania dwuwarstwy lipidowej za pomocą detergentów, które mogą uszkodzić białko i usunąć niezbędne kofaktory. Białka te mogą być również obecne w niewielkich ilościach w błonach biologicznych lub być zmieszane z blisko spokrewnionymi białkami, jak w przypadku kompleksów do zbierania światła, co utrudnia oczyszczanie pojedynczych kompleksów. Heterologiczna ekspresja białek w E. coli i rekonstytucja in vitro dają możliwość uniknięcia tych problemów. Rekonstytucja i oczyszczanie in vitro sfałdowanych białek prowadzi do powstania kompleksów, które mają cechy bardzo podobne do cech natywnych kompleksów20,21,23, a zatem mogą być wykorzystywane do badania kompleksów, których nie można oczyścić do jednorodności 24–27.
Metoda ta wykorzystuje szpinak, który jest łatwo dostępny przez cały rok, jako źródło całkowitego pigmentu i preparatów karotenoidowych. W przypadku niektórych rekonstytucji białek rodzimych dla glonów preferowane jest stosowanie pigmentów oczyszczonych z glonów ze względu na różne składy pigmentów. Stosunek Chl a/b i stosunek Chl/car pozostaje taki sam niezależnie od źródła pigmentu.
Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że skuteczność rekonstytucji wynosi zwykle około 35%28. W związku z tym konieczne jest usunięcie niezwiązanych pigmentów i niesfałdowanej apoproteiny z roztworu po rozpuszczeniu. W niniejszym protokole przedstawiono dwuetapowy protokół oczyszczania (patrz również wyniki). Należy jednak zauważyć, że etap gradientu sacharozy nie pozwala na całkowite oddzielenie apo i holobiałka. W przypadku większości analiz nie stanowi to problemu, ponieważ apoproteina nie zawiera pigmentów, a tym samym nie zakłóca pomiarów funkcjonalnych. Jednak w przypadku, gdy konieczne jest całkowite usunięcie apoproteiny z frakcji zawierającej odtworzony kompleks (na przykład w celu obliczenia stechiometrii pigmentu do białka), można zastosować kolumnę do wymiany anionowej (szczegółowe informacje można znaleźć w Passarini i in. 200929 ).
Zdolność do ponownego zawijania rekombinowanych białek zbierających światło za pomocą izolowanych pigmentów in vitro daje możliwość "manipulowania" kompleksami poprzez modyfikację "środowiska" rekonstytucji na różne sposoby, zmieniając w ten sposób charakterystykę powstałego kompleksu. Na przykład, zmiana składu pigmentu podczas rozpuszczenia może spowodować powstanie kompleksu o zmienionym składzie pigmentowym. Cecha ta może być wykorzystana do badania wpływu różnych pigmentów na strukturę i stabilność kompleksu. Zwykle preparat pigmentowy otrzymywany ze szpinaku ma stosunek Chl a/b 3:1 i stosunek Chl/samochód 2,9:1. W takim stosunku zazwyczaj powstaje odtworzone białko o takich samych właściwościach jak białko natywne. Jednak dostosowanie stosunku Chl a/b poprzez dodanie oczyszczonego Chl a lub b może wpływać na wiązanie różnych pigmentów ze względu na różną selektywność miejsc wiązania30–33. Jest to możliwe, ponieważ większość miejsc wiązania pigmentu nie jest całkowicie selektywna dla Chl a lub Chl b, ale może pomieścić oba, chociaż z różnym powinowactwem10,30,34. W podobny sposób wykazano również, że miejsca wiązania karotenoidów są w stanie pomieścić więcej niż jeden gatunek ksantofilu8,35–38. Różne rekonstytucje CP26, innego kompleksu pigmentowo-białkowego roślin wyższych, przy użyciu różnych kompozycji pigmentowych przedstawiono w tabeli 2 39. Rekonstytucje te wykorzystano do oceny powinowactwa miejsc wiązania do poszczególnych pigmentów39. Warto zauważyć, że aby otrzymać kompleks o takim samym składzie pigmentowym jak natywny, stosunek Chl a/b mieszanki pigmentów musi wynosić 3:1. Wydaje się, że tak jest w przypadku wszystkich kompleksów LHC wyższych roślin20,40.
Połączenie biologii molekularnej z techniką rekonstytucji pozwala na bardziej szczegółowe zbadanie właściwości kompleksu wiążącego Chl. Znaczenie różnych domen białkowych dla stabilności i fałdowania kompleksów lub ich udziału w interakcjach białko-białko zostało określone przez skrócenie apoproteiny lub przeprowadzenie mutagenezy losowej8,41–44. Pojedyncze reszty aminokwasowe ważne dla koordynacji różnych pigmentów mogą być zmieniane poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu analizy właściwości poszczególnych pigmentów lub oceny ich udziału w funkcji i stabilności kompleksu10,28,29,45–52. Rycina 6 przedstawia odtworzony Lhcb4 (CP29) z mutacją histydyny w pozycji 216,53. Porównanie składu pigmentowego kompleksów typu dzikiego i zmutowanego pokazuje, że mutacja indukuje utratę jednej cząsteczki Chl a, co wskazuje, że miejsce docelowe mieści Chl a w kompleksie WT. Różnice w widmach absorpcyjnych WT i mutantu, po normalizacji do zawartości pigmentu, pokazują również właściwości absorpcyjne utraconego pigmentu. W tym przypadku różnicę można dostrzec w głównym piku przy długości fali 680 nm, co wskazuje, że Chl a koordynowany przez His216 absorbuje na tej długości fali (więcej szczegółów na temat tego mutanta i właściwości spektroskopowych można znaleźć w Mozzo et al. 200853). Analiza mutacji może być również wykorzystana do określenia wpływu środowiska na właściwości spektroskopowe pigmentów54.
Podsumowując, białka zbierające światło można łatwo odtworzyć in vitro , w wyniku czego powstają kompleksy pigment-białko o bardzo podobnych właściwościach do kompleksów natywnych. W ten sposób eliminowane są trudności związane z izolacją natywnych białek, a jednocześnie dostarczane są preparaty białkowe o wysokiej wydajności i czystości do dalszych badań. Podkreślono znaczenie stosunku 3:1 Chl a/b w tworzeniu autentycznego kompleksu, a w celu zilustrowania zastosowań tej techniki podano przykłady odtworzonych LHC typu dzikiego i zmutowanego.

Aparat fotosyntetyczny roślin i glonów zawiera integralne białka błonowe, które wiążą chlorofil a (chl a), b (chl b) i karotenoidy (car). Te kompleksy pigmentowo-białkowe są aktywne w zbieraniu energii świetlnej i przekazywaniu tej energii wzbudzenia do centrów reakcji, gdzie jest wykorzystywana do promowania separacji ładunków2. Są one również zaangażowane w regulacyjne mechanizmy sprzężenia zwrotnego, które chronią aparat fotosyntetyczny przed uszkodzeniami spowodowanymi silnym światłem3,4. Kompleksy do zbierania światła (LHC) składają się z dużej rodziny pokrewnych białek w roślinach i algach5.
Jednorodne oczyszczanie każdego członka rodziny zostało skomplikowane przez bardzo podobne właściwości chemiczne i fizyczne kompleksów. Ponadto procedury oczyszczania często powodują utratę pigmentów lub innych potencjalnych kofaktorów, takich jak lipidy. Rekonstytucja in vitro stanowi skuteczną metodę przezwyciężenia tych problemów. LHC związany z Photosystem II (LHC-II) został po raz pierwszy odtworzony in vitro przez Plumleya i Schmidta w 1987roku. Naukowcy wyekstrahowali zdelipidowane białko i pigmenty oddzielnie od chloroplastów roślinnych, a następnie połączyli zdenaturowane białko pod wpływem ciepła z pigmentami w obecności siarczanu dodecylu litu (LDS), po czym nastąpiły trzy cykle zamrażania i rozmrażania1. Wykazały one, że właściwości spektralne odtworzonych kompleksów LHC były bardzo podobne do kompleksów oczyszczonych z roślin. Łatwość rekonstytucji kompleksów pigmentowo-białkowych LHC, prawdopodobnie ze względu na jakąś wrodzoną cechę samoorganizacji, wraz z trudnością w izolowaniu oczyszczonych kompleksów z organizmów, doprowadziła do szybkiego przyjęcia tej metody przez innych badaczy. Rekonstytucja białek fotosyntetycznych z nadekspresją w Escherichia coli (E. coli) została osiągnięta przez Paulsena i współpracowników w 1990roku. U E. coli nadekspresja białek błonowych jest zwykle zawarta w ciałach inkluzyjnych, co ułatwia ich oczyszczanie. Rekonstytucję uzyskuje się poprzez denaturację termiczną ciał inkluzyjnych zawierających rekombinowane białko w obecności LDS, a następnie dodanie pigmentów, które inicjują fałdowanie białka. Składanie kompleksu LHCII jest procesem dwuetapowym: po pierwsze, chlorofil a jest wiązany w czasie krótszym niż 1 minuta; Po drugie, chlorofil B jest wiązany i stabilizowany przez kilka minut7.
Oprócz dostarczania wglądu w dynamikę fałdowania, rekonstytucja in vitro w połączeniu z mutagenezą ukierunkowaną na miejsce pozwoliła na identyfikację konkretnych aminokwasów ważnych dla stabilności (np. 8,9) lub koordynacji pigmentu (np. 10). Manipulowanie warunkami ponownego fałdowania poprzez dostosowanie parametrów, takich jak skład pigmentu lub detergenty, zidentyfikowało również elementy krytyczne dla prawidłowego fałdowania, takie jak zapotrzebowanie na ksantofile dla kompleksu LHCII (np. 1,11). Ponadto badanie właściwości poszczególnych pigmentów związanych z kompleksami było możliwe przy użyciu kompleksów odtworzonych in vivo (np. 10).
Opisana tutaj metoda zaczyna się od izolacji pigmentów (chlorofilów i karotenoidów) ze szpinaku i zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii. Następnie szczegółowo opisano ekspresję i oczyszczanie białka LHC z E. coli w postaci ciał inkluzyjnych, po czym następuje rekonstytucja LHC, a następnie oczyszczanie za pomocą kolumny powinowactwa Ni. W ostatnim etapie odtworzone kompleksy są dalej oczyszczane przez wirowanie w gradionym tempie sacharozy w celu usunięcia wolnych pigmentów i niesfałdowanych apoprotein. Protokół ten stanowi zoptymalizowaną procedurę obejmującą kilka modyfikacji, które zostały wprowadzone przez różne laboratoria na przestrzeni czasu1,6,10,12–14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Ściereczka nylonowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m pores</td></tr><tr><td>Miękki pędzel malarski dla artystów&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAaza</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Mleko</td><td></td><td></td><td></td>w proszku</tr><tr><td>RNAaza</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;- D-glukopiranozyd</td><td>Sigma</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>patrz referencje 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>patrz numer referencyjny 19</td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

W roślinach i zielonych algach światło jest wychwytywane przez kompleksy zbierające światło (LHC), rodzinę integralnych białek błonowych, które koordynują chlorofile i karotenoidy. In vivo białka te są fałdowane za pomocą pigmentów, tworząc kompleksy, które są wprowadzane do błony tylakoidowej chloroplastu. Duże podobieństwo właściwości chemicznych i fizycznych członków rodziny, wraz z faktem, że mogą one łatwo stracić pigmenty podczas izolacji, sprawia, że ich oczyszczanie w stanie rodzimym jest wyzwaniem. Alternatywne podejście do otrzymywania jednorodnych preparatów LHC zostało opracowane przez Plumleya i Schmidta w 1987roku1, którzy wykazali, że możliwe jest odtworzenie tych kompleksów in vitro zaczynając od oczyszczonych pigmentów i niesfałdowanych apoprotein, w wyniku czego uzyskano kompleksy o właściwościach bardzo zbliżonych do kompleksów natywnych. Otworzyło to drogę do wykorzystania rekombinowanych białek eksprymowanych przez bakterie do rekonstytucji in vitro. Metoda rekonstytucji jest skuteczna z wielu powodów: (1) można otrzymać czyste preparaty pojedynczych kompleksów, (2) skład pigmentu można kontrolować w celu oceny ich udziału w strukturze i funkcji, (3) rekombinowane białka mogą być mutowane w celu zbadania funkcjonalnej roli poszczególnych reszt (np. miejsc wiązania pigmentu) lub domeny białkowej (np. interakcja białko-białko, fałdowanie). Metoda ta została zoptymalizowana w kilku laboratoriach i zastosowana do większości kompleksów zbierających światło. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę odtwarzania kompleksów do zbierania światła in vitro stosowaną obecnie w naszym laboratorium, a także podane są przykłady opisujące zastosowania tej metody.

Ten protokół szczegółowo opisuje odtwarzanie kompleksów zbierających światło in vitro. Te integralne białka błonowe koordynują chlorofile i karotenoidy i są odpowiedzialne za zbieranie światła w roślinach wyższych i zielonych algach.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odtworzenie in vitro kompleksów białek pigmentowych roślin lub alg zbierających światło. Osiąga się to poprzez ekstrakcję pigmentów z liści szpinaku lub kultur glonów i nadmierną ekspresję APA prote w e coli. W drugim etapie prote APA miesza się z pigmentami w celu uzyskania odtworzonego kompleksu.Następnie odtworzony kompleks białek pigmentowych jest oczyszczany z nadmiaru pigmentów i uzyskuje się wyniki niesfałdowanego białka, które wykazują podobne cechy spektroskopowe odtworzonego kompleksu białek pigmentowych i natywne oparte na widmach absorpcyjnych, widmach fluorescencyjnych i deizmie kołowym. Główną zaletą tej procedury jest to, że pozwala nam uzyskać stosunkowo dużą ilość kompleksów białek pigmentowych, a także manipulować kompleksami za pomocą zmutowanych mieszanin białek i pigmentów o różnych składach, demonstrując procedurę będzie Alberto na, doktorant w laboratorium Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji całkowitego pigmentu z liści szpinaku. Za pomocą blendera homogenizuj garść szpinaku, pozostaw około 20 gramów w 100 mililitrach zimnego buforu do mielenia przez 20 sekund.Przefiltrować roztwór przez dwie warstwy nylonowej tkaniny o słabej średnicy 20 mikrometrów i odwirować filtrat o stężeniu 1 500 G przez 10 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj jeden mililitr buforu do mycia na zimno.Ponownie zawiesić osad zawierający chloroplasty miękkim pędzlem artystycznym. Po ponownym zawieszeniu osadu dodać 50 mililitrów roztworu o stężeniu 10 000 g przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić osad w 50 mililitrach wirówki buforowej do mycia, roztworu o stężeniu 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, od tego momentu całkowicie usunąć supernatant.Ta procedura musi być wykonywana w ciemności. Aby uniknąć utleniania pigmentu, dodaj około 20 mililitrów 80% acetonu buforowanego węglanem sodu w celu ekstrakcji pigmentów, pozostaw roztwór na lodzie na 10 minut. Wirowanie od czasu do czasu paletuje składniki komórkowe przez wirowanie w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Całkowita ekstrakcja pigmentu powinna dać białą osadkę. Zebrać snat do rozdzielacza. Dodać 0,4 objętości eteru dathylu.Wstrząśnij energicznie i upewnij się, że otworzyłeś zawory, aby odpuścić gaz. Dodać 0,8 objętości pkt 33 molowego chlorku sodu i energicznie wymieszać. Odczekaj około 10 minut, aż warstwy się rozdzielą.Faza eterowa na wierzchu zawiera wyekstrahowane pigmenty. Usuń i wyrzuć przezroczystą dolną fazę. Usunąć eter, wlewając go z górnej części rozdzielacza do odpowiedniego szklanego pojemnika.Wysuszyć eter, dodając łyżkę granulowanego bezwodnego siarczanu sodu. Zamieszaj roztwór i odczekaj około pięciu minut, aby środek osuszający wchłonął wodę z eteru. Gdy eter jest wystarczająco wysuszony.Powinno być trochę swobodnie unoszących się kryształów i brak zbrylania się siarczanu sodu. Zdekantować eter do nowego szklanego pojemnika, pozostawiając stały siarczan sodu za podwielokrotnymi pigmentami i wysuszyć je w próżni obrotowej, aż aceton zostanie całkowicie odparowany. Wysuszone pigmenty należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.Ekstrakcja keratynoidu ze szpinaku nie jest pokazana w tym filmie, ale wysuszone pigmenty są również przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kompleks do zbierania światła lub LHC do rekonstytucji został poddany ekspresji i oczyszczony z E. coli w postaci ciał inkluzyjnych. Dla powodzenia rekonstytucji kluczowe znaczenie ma stosunek między białkami barwnikowymi a ilością zużytego buforu.Ta procedura powinna być wykonywana w słabym świetle. Ponownie zawiesić 800 mikrogramów ciał inkluzyjnych LHC w sumie 400 mikrolitrach te. Do dwumililitrowej probówki fuge dodaj 400 mikrolitrów dwóch x rozpuszczonych roztworów, buforu i wiru.Na krótko dodaj 0,6 mikrolitra 14,8 molowego bulionu etanolowego beta mar CAPTA . Aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów, podgrzewaj białko w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Krótko zwiruj i umieść w temperaturze pokojowej na trzy minuty.Ponownie zawiesić 500 mikrogramów całkowitych wysuszonych pigmentów chlorofilowych oraz 80 mikrogramów pigmentów keratynoidowych w 30 mikrolitrach 100% etanolu przez energiczne wirowanie. Przez jedną minutę. Wiruj mieszankę pigmentów w temperaturze 15 800 G w czterech stopniach Celsjusza przez około 30 sekund i upewnij się, że nie ma granulki bezpośrednio po wirowaniu, powoli dodawaj mieszankę pigmentów do schłodzonego białka podczas wirowania.Uważaj, aby nie wirować zbyt energicznie, ponieważ białko może przelać się przez górną część rurki. Kontynuuj wirowanie przez pięć do 10 sekund, a następnie umieść rurkę na mokrym lodzie. Dodaj 94 mikrolitry 20% ósemkowego, beta D glukozydu lub og, aby uzyskać końcowe stężenie 2%Vortex krótko i trzymaj na lodzie przez 10 minut, dodaj 90 mikrolitrów dwumolowego chlorku potasu, aby uzyskać końcowe stężenie od 150 do 200 mikromolowców.Krótko wiruj i trzymaj na lodzie przez 20 minut. Wiruj w temperaturze 15 800 GS w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieś natant SUP do 10-mililitrowej tuby, nie naruszając pelletu.Utrzymuj natynę w chłodnym miejscu i chroń przed światłem. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kolumny SRO o zawartości jednego mililitra niklu, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Dodaj trzy do czterech mililitrów buforu OG do próbki białka i załaduj próbkę do kolumny.Przepłukać kolumnę pięcioma mililitrami buforu OG, a następnie dwoma mililitrami buforu płuczącego OG. Eluować związane białko za pomocą trzech mililitrów buforu elu. Zbierz zielone ellu, które zawiera odtworzone białko.Gradient sacharozy przygotowuje się w sposób opisany w tekście protokołu, ostrożnie usuwając go z górnej krawędzi gradientu, taką samą objętość, jak w przypadku frakcji zielonej, o której mowa w kolumnie SRO niklu. Powoli załaduj odtworzoną próbkę na wierzch, uważając, aby nie zakłócić gradientu. Umieść rurkę i wagę w wahadłowym wirniku kubełkowym S SW 41 lub SW 60 i wiruj w ultrawirówce z prędkością 200 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin z powolnym przyspieszaniem i zatrzymywaniem się bez przerw.Po zakończeniu ultrawirówki użyj kleszczyków, aby ostrożnie usunąć gradient z uchwytu probówki. Zielony pasek to frakcja do zebrania. Widmo absorpcyjne CP 24.Białko wiążące chlorofil AB odtworzone in vitro porównuje się ze spektrum kompleksu natywnego. Identyczne widma wskazują na praktycznie identyczny skład i organizację pigmentu. Jakość odtworzonego kompleksu można również ocenić za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.Ponieważ pigmenty emitują fluorescencję po wzbudzeniu na różnych długościach fal, chlorofil A przy 440 nanometrach, chlorofil B przy 475 nanometrach i zils przy 500 nanometrach. Widma emisji fluorescencji odtworzonego kompleksu CP 24 typu dzikiego i znormalizowanego do maksimum wykazują efektywny transfer energii z chlorofilu B i wypełnienia XANTHE do chlorofilu A. Obecność chlorofilu B nieskoordynowanego z białkiem można rozpoznać po dodatkowym ramieniu około 650 nanometrów. Obecność wolnego chlorofilu A prowadzi natomiast do dodatkowej emisji około 675 nanometrów.Fluorescencyjne widma emisyjne na 475 nanometrach, cytowanie zarówno odtworzonego, jak i natywnego kompleksu CP 24, pokazują pojedynczy pik na głębokości 681 nanometrów, co wskazuje, że zrekonstytuowany kompleks jest prawidłowo sfałdowany. Zrekonstruowany CP 24 i rodzimy kompleks również wykazują bardzo podobne koliste widma charyzmatu. Pojedyncze reszty aminokwasowe ważne dla koordynacji różnych pigmentów mogą być zmieniane w celu analizy właściwości poszczególnych pigmentów lub oceny ich wkładu w funkcję i stabilność kompleksu.Pokazano tutaj widma absorpcyjne typu dzikiego i zmutowanego CP 29. Zielona linia pokazuje różnice między dwoma wykresami W przypadku tate, ta technika, w tym gradient SUSE, ultrawirowanie można wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Ten manuskrypt opisuje prostą i wysokoprzepustową metodę łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek z hydrofobowymi pigmentami, która opiera się na emulsjach typu woda w oleju. Wykazano skuteczność metody w łączeniu natywnych chlorofili z czterema wariantami rekombinowanych rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil (WSCP) roślin kapustnych ulegających ekspresji w E. coli.

Emulsje typu woda w oleju: nowy system łączenia rozpuszczalnych w wodzie białek wiążących chlorofil z pigmentami hydrofobowymi

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Tutaj prezentujemy protokół rozdzielania rozpuszczonych kompleksów tylakoidów za pomocą natywnej elektroforezy Zielonego Żelu. Zielone pasma żelowe są następnie charakteryzowane za pomocą skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) i dostarczane są podstawowe kroki do analizy danych.

Separacja kompleksów białek tylakoidów szpinaku za pomocą natywnej elektroforezy zielonego żelu i charakterystyki pasma przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Poznaj metodę rekonstytucji kompleksów zbierających światło in vitro z liści szpinaku i białka APA z E. coli. Protokół umożliwia analizę spektroskopową i manipulację składem kompleksów białkowo-pigmentowych.

In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Przeglądaj więcej filmów