In vitro Rekonstytucja kompleksów roślin i zielonych alg zbierających światło

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest odtworzenie in vitro kompleksów białek pigmentowych roślin lub alg zbierających światło. Osiąga się to poprzez ekstrakcję pigmentów z liści szpinaku lub kultur glonów i nadmierną ekspresję APA prote w e coli. W drugim etapie prote APA miesza się z pigmentami w celu uzyskania odtworzonego kompleksu.

Następnie odtworzony kompleks białek pigmentowych jest oczyszczany z nadmiaru pigmentów i uzyskuje się wyniki niesfałdowanego białka, które wykazują podobne cechy spektroskopowe odtworzonego kompleksu białek pigmentowych i natywne oparte na widmach absorpcyjnych, widmach fluorescencyjnych i deizmie kołowym. Główną zaletą tej procedury jest to, że pozwala nam uzyskać stosunkowo dużą ilość kompleksów białek pigmentowych, a także manipulować kompleksami za pomocą zmutowanych mieszanin białek i pigmentów o różnych składach, demonstrując procedurę będzie Alberto na, doktorant w laboratorium Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji całkowitego pigmentu z liści szpinaku. Za pomocą blendera homogenizuj garść szpinaku, pozostaw około 20 gramów w 100 mililitrach zimnego buforu do mielenia przez 20 sekund.

Przefiltrować roztwór przez dwie warstwy nylonowej tkaniny o słabej średnicy 20 mikrometrów i odwirować filtrat o stężeniu 1 500 G przez 10 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Usuń supernatant i dodaj jeden mililitr buforu do mycia na zimno.

Ponownie zawiesić osad zawierający chloroplasty miękkim pędzlem artystycznym. Po ponownym zawieszeniu osadu dodać 50 mililitrów roztworu o stężeniu 10 000 g przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić osad w 50 mililitrach wirówki buforowej do mycia, roztworu o stężeniu 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, od tego momentu całkowicie usunąć supernatant.

Ta procedura musi być wykonywana w ciemności. Aby uniknąć utleniania pigmentu, dodaj około 20 mililitrów 80% acetonu buforowanego węglanem sodu w celu ekstrakcji pigmentów, pozostaw roztwór na lodzie na 10 minut. Wirowanie od czasu do czasu paletuje składniki komórkowe przez wirowanie w temperaturze 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Całkowita ekstrakcja pigmentu powinna dać białą osadkę. Zebrać snat do rozdzielacza. Dodać 0,4 objętości eteru dathylu.

Wstrząśnij energicznie i upewnij się, że otworzyłeś zawory, aby odpuścić gaz. Dodać 0,8 objętości pkt 33 molowego chlorku sodu i energicznie wymieszać. Odczekaj około 10 minut, aż warstwy się rozdzielą.

Faza eterowa na wierzchu zawiera wyekstrahowane pigmenty. Usuń i wyrzuć przezroczystą dolną fazę. Usunąć eter, wlewając go z górnej części rozdzielacza do odpowiedniego szklanego pojemnika.

Wysuszyć eter, dodając łyżkę granulowanego bezwodnego siarczanu sodu. Zamieszaj roztwór i odczekaj około pięciu minut, aby środek osuszający wchłonął wodę z eteru. Gdy eter jest wystarczająco wysuszony.

Powinno być trochę swobodnie unoszących się kryształów i brak zbrylania się siarczanu sodu. Zdekantować eter do nowego szklanego pojemnika, pozostawiając stały siarczan sodu za podwielokrotnymi pigmentami i wysuszyć je w próżni obrotowej, aż aceton zostanie całkowicie odparowany. Wysuszone pigmenty należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza.

Ekstrakcja keratynoidu ze szpinaku nie jest pokazana w tym filmie, ale wysuszone pigmenty są również przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kompleks do zbierania światła lub LHC do rekonstytucji został poddany ekspresji i oczyszczony z E. coli w postaci ciał inkluzyjnych. Dla powodzenia rekonstytucji kluczowe znaczenie ma stosunek między białkami barwnikowymi a ilością zużytego buforu.

Ta procedura powinna być wykonywana w słabym świetle. Ponownie zawiesić 800 mikrogramów ciał inkluzyjnych LHC w sumie 400 mikrolitrach te. Do dwumililitrowej probówki fuge dodaj 400 mikrolitrów dwóch x rozpuszczonych roztworów, buforu i wiru.

Na krótko dodaj 0,6 mikrolitra 14,8 molowego bulionu etanolowego beta mar CAPTA . Aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów, podgrzewaj białko w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Krótko zwiruj i umieść w temperaturze pokojowej na trzy minuty.

Ponownie zawiesić 500 mikrogramów całkowitych wysuszonych pigmentów chlorofilowych oraz 80 mikrogramów pigmentów keratynoidowych w 30 mikrolitrach 100% etanolu przez energiczne wirowanie. Przez jedną minutę. Wiruj mieszankę pigmentów w temperaturze 15 800 G w czterech stopniach Celsjusza przez około 30 sekund i upewnij się, że nie ma granulki bezpośrednio po wirowaniu, powoli dodawaj mieszankę pigmentów do schłodzonego białka podczas wirowania.

Uważaj, aby nie wirować zbyt energicznie, ponieważ białko może przelać się przez górną część rurki. Kontynuuj wirowanie przez pięć do 10 sekund, a następnie umieść rurkę na mokrym lodzie. Dodaj 94 mikrolitry 20% ósemkowego, beta D glukozydu lub og, aby uzyskać końcowe stężenie 2%Vortex krótko i trzymaj na lodzie przez 10 minut, dodaj 90 mikrolitrów dwumolowego chlorku potasu, aby uzyskać końcowe stężenie od 150 do 200 mikromolowców.

Krótko wiruj i trzymaj na lodzie przez 20 minut. Wiruj w temperaturze 15 800 GS w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieś natant SUP do 10-mililitrowej tuby, nie naruszając pelletu.

Utrzymuj natynę w chłodnym miejscu i chroń przed światłem. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kolumny SRO o zawartości jednego mililitra niklu, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Dodaj trzy do czterech mililitrów buforu OG do próbki białka i załaduj próbkę do kolumny.

Przepłukać kolumnę pięcioma mililitrami buforu OG, a następnie dwoma mililitrami buforu płuczącego OG. Eluować związane białko za pomocą trzech mililitrów buforu elu. Zbierz zielone ellu, które zawiera odtworzone białko.

Gradient sacharozy przygotowuje się w sposób opisany w tekście protokołu, ostrożnie usuwając go z górnej krawędzi gradientu, taką samą objętość, jak w przypadku frakcji zielonej, o której mowa w kolumnie SRO niklu. Powoli załaduj odtworzoną próbkę na wierzch, uważając, aby nie zakłócić gradientu. Umieść rurkę i wagę w wahadłowym wirniku kubełkowym S SW 41 lub SW 60 i wiruj w ultrawirówce z prędkością 200 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin z powolnym przyspieszaniem i zatrzymywaniem się bez przerw.

Po zakończeniu ultrawirówki użyj kleszczyków, aby ostrożnie usunąć gradient z uchwytu probówki. Zielony pasek to frakcja do zebrania. Widmo absorpcyjne CP 24.

Białko wiążące chlorofil AB odtworzone in vitro porównuje się ze spektrum kompleksu natywnego. Identyczne widma wskazują na praktycznie identyczny skład i organizację pigmentu. Jakość odtworzonego kompleksu można również ocenić za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Ponieważ pigmenty emitują fluorescencję po wzbudzeniu na różnych długościach fal, chlorofil A przy 440 nanometrach, chlorofil B przy 475 nanometrach i zils przy 500 nanometrach. Widma emisji fluorescencji odtworzonego kompleksu CP 24 typu dzikiego i znormalizowanego do maksimum wykazują efektywny transfer energii z chlorofilu B i wypełnienia XANTHE do chlorofilu A. Obecność chlorofilu B nieskoordynowanego z białkiem można rozpoznać po dodatkowym ramieniu około 650 nanometrów. Obecność wolnego chlorofilu A prowadzi natomiast do dodatkowej emisji około 675 nanometrów.

Fluorescencyjne widma emisyjne na 475 nanometrach, cytowanie zarówno odtworzonego, jak i natywnego kompleksu CP 24, pokazują pojedynczy pik na głębokości 681 nanometrów, co wskazuje, że zrekonstytuowany kompleks jest prawidłowo sfałdowany. Zrekonstruowany CP 24 i rodzimy kompleks również wykazują bardzo podobne koliste widma charyzmatu. Pojedyncze reszty aminokwasowe ważne dla koordynacji różnych pigmentów mogą być zmieniane w celu analizy właściwości poszczególnych pigmentów lub oceny ich wkładu w funkcję i stabilność kompleksu.

Pokazano tutaj widma absorpcyjne typu dzikiego i zmutowanego CP 29. Zielona linia pokazuje różnice między dwoma wykresami W przypadku tate, ta technika, w tym gradient SUSE, ultrawirowanie można wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.