Name: Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę generowania zabójczych sztucznych komórek prezentujących antygen KaAPC do selektywnej eliminacji autoreaktywnych limfocytów T człowieka in vitro. Technika ta umożliwia celowaną terapię chorób autoimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) SCHU-2681/1-1 (C.S.) i KFO 146 (M.F.), grant Departamentu Obrony Departamentu Obrony PC 040972 (M.O.) oraz National Institute of Health granty RO1 CA108835, RO1 Ai44129 (J.P.S.)

1. Generowanie KaAPC opartych na HLA-A2-Ig
<ol>
	<li>Przygotować sterylny bufor boranowy. Sporządzić 0,1 M roztwór kwasu borowego w wodzie i dostosować pH do 7,0. Bufor przefiltrować sterylnie (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować sterylny bufor do płukania kulek. Użyć fosforanowo-solnej soli buforowej (PBS) bez magnezu i wapnia. Dodać ludzką surowicę grupy AB do stężenia końcowego 3%. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do stężenia końcowego 2 mM. Dodać azotek sodu (NaN3) do stężenia końcowego 0,01%. Bufor przefiltrować sterylnie (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 250 μl kulek epoksydowych (około 100 x 106 kulek) ze stanu zapasów do sterylnej szklanej fiolki z zakrętką.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu boranowego.</li>
	<li>Umieścić szklaną fiolkę na magnesie i pozostawić kulki do przylgnięcia na 2 min; odessać bufor i zdjąć szklaną fiolkę z magnesu.</li>
	<li>Przepłukać kulki raz 1 ml buforu boranowego.</li>
	<li>Resuspendować kulki w 550 μl roztworu HLA-A2-Ig o stężeniu 0,018 μg/ml i przeciwciała mAb anty-CD95 ludzkiego (klon CH11) o stężeniu 3,64 μg/ml, a następnie delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie. (Dodatkowe informacje znajdują się w sekcji dyskusji).</li>
	<li>Inkubować szklaną fiolkę na rotatorze w trybie end-over-end w temperaturze 4 °C przez 24 h.</li>
	<li>Odwirować kulki przy 300 x g przez 2 min.</li>
	<li>Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 min i odessać „roztwór ładujący KaAPC”; zdjąć szklaną fiolkę z magnesu, dodać 1 ml buforu do płukania kulek i ostrożnie resuspendować poprzez potrząsanie.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.10 dwukrotnie.</li>
	<li>Inkubować szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 24 h w 1 ml buforu do płukania kulek. Na tym etapie wszystkie pozostałe miejsca wiązania białek zostaną zablokowane przez ludzką surowicę grupy AB zawartą w buforze do płukania kulek.</li>
	<li>Odwirować kulki przy 300 x g przez 2 min.</li>
	<li>Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 min i odessać bufor do płukania kulek; zdjąć szklaną fiolkę z magnesu i zastąpić roztwór 1 ml PBS.</li>
</ol>
2. Kontrola jakości, załadunek peptydów, płukanie, przechowywanie i stabilność KaAPC
<ol>
	<li>Przenieś 1,5 x 105 KaAPC do probówki do FACS i przemyj 1 ml buforu do mycia FACS.</li>
	<li>Resuspenduj kuleczki w 100 μl buforu do mycia FACS i dodaj 1 μl przeciwciała anty-mysiego IgG1 PE (do detekcji części Fc HLA-A2-Ig) oraz 1 μl przeciwciała anty-mysiego IgM FITC (klon R6-60.2, do detekcji przeciwciała mAb przeciw ludzkiemu CD95).</li>
	<li>Inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C, przemyj 1 ml buforu do mycia FACS, a następnie resuspenduj w 250 μl buforu do mycia FACS i odczytaj barwienie za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
<img alt="Histogramy cytometrii przepływowej, analiza HLA-A2-Ig i anty-CD95, porównanie zdarzeń komórkowych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Barwienie kontroli jakości (QC) partii KaAPC przygotowanej zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Barwienie przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu. HLA-A2-Ig wykryto przy użyciu przeciwciała mAb anty-mouse-IgG1 PE, natomiast anty-human-CD95 (anty-Fas) wykryto za pomocą przeciwciała mAb anty-mouse-IgM FITC (patrz sekcja 2.2 protokołu) (linia niebieska). Wypełnione czarne wykresy reprezentują puste kulki zabarwione odpowiednio przeciwciałem mAb anty-mouse-IgG1 PE lub mAb anty-mouse-IgM FITC. Liczby w prawym górnym rogu oznaczają średnią intensywność fluorescencji (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>W celu załadowania peptydów przenieść 20 x 106 KaAPC do nowej sterylnej fiolki szklanej, umieścić na magnesie na 2 min, odessać PBS i resuspender kuleczki w 500 μl świeżego PBS z 5 μg peptydu (Należy pamiętać, że tylko peptydy ograniczone do HLA-A2 będą wiązać się z dimerem!).</li>
	<li>Przechowywać załadowane KaAPC w temperaturze 4 °C do czasu użycia, przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić wystarczające załadowanie peptydu na dimer HLA-A2-Ig.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem wyprać załadowane peptydem KaAPC zgodnie z instrukcją w punkcie 1.14; powtórzyć ten krok co najmniej 6 razy. 
	UWAGA: Jest to kluczowy etap zapewniający całkowite usunięcie wolnego peptydu, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników cytotoksyczności; wykazano, że pozostały wolny peptyd indukuje apoptozę w kulturach limfocytów T specyficznych dla antygenu9. Aby wykluczyć efekt rozpuszczalnego peptydu, należy przeprowadzić analizę kontrolnych próbek nadsączu z załadowanych peptydem i wypranych KaAPC (patrz 3.8).</li>
	<li>Policzyć kuleczki za pomocą hemocytometru i oznaczyć datą, nazwą peptydu oraz stężeniem. 
	UWAGA: Załadowane KaAPC pozostają funkcjonalne w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc. Po upływie miesiąca ponowne załadowanie tym samym peptydem pozwala na wykorzystanie KaAPC przez okres do jednego roku.</li>
</ol>
3. Test zabijania KaAPC in vitro
<ol>
	<li>Przygotować medium do kokultury. Przygotować kompletne medium RPMI uzupełnione o 3% czynnika wzrostu limfocytów T (wykonanego w laboratorium6) oraz 3% autologicznej plazmy dawcy. W przypadku braku autologicznej plazmy dawcy należy użyć inaktywowanego termicznie ludzkiego serum AB.</li>
	<li>Przygotować bufor wiążący AnnexinV. Rozpuścić 8,12 g chlorku sodu (NaCl) i 0,12 g chlorku wapnia (CaCl2) w 990 ml ddH2O. Dodać 10 ml buforu HEPES 1M.</li>
	<li>Wygenerować ludzkie limfocyty T swoiste względem antygenu. (Szczegółowy protokół znajduje się w poprzedniej publikacji7 wykorzystującej sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC)). Należy upewnić się, że swoistość peptydowa wynosi co najmniej &gt;75%, co określono poprzez barwienie tetramerami.</li>
	<li>Dla każdej próbki inkubować 2 x 105 limfocytów T swoistych względem antygenu/studzienkę (w płytce 96-dołkowej o okrągłym dnie) w 200 μl medium do kokultury w stosunku 1:1 z KaAPC przez 48 hr w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Zebrać próbki i przenieść je do probówki do FACS; przemyć 1 ml buforu wiążącego AnnexinV, odwirować przy 300 x g przez 5 min, odlać nadosad i resuspendować w 100 μl buforu wiążącego AnnexinV.</li>
	<li>Przebarwić próbki przy użyciu 1 μl AnnexinV FITC i 5 μl 7-AAD przez 10-15 min w temperaturze pokojowej, przemyć 1 ml buforu wiążącego AnnexinV; odwirować przy 300 x g przez 5 min, odlać nadosad i resuspendować w 250 μl buforu wiążącego AnnexinV.</li>
	<li>Próbki należy niezwłocznie odczytać na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Przygotować następujące próbki w celu określenia swoistej dla antygenu cytotoksyczności wywołanej przez KaAPC: same limfocyty T; limfocyty T + rozpuszczalne przeciwciało anty-CD95; limfocyty T + nieobciążone KaAPC; limfocyty T + KaAPC obciążone niepoznawczym peptydem; limfocyty T + KaAPC obciążone poznawczym peptydem; limfocyty T + nadosad z KaAPC obciążonych poznawczym peptydem.</li>
</ol>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej apoptozy limfocytów T; wykresy kropkowe anneksyny V względem PI, porównujące warunki eksperymentalne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test zabijania KaAPC. Kulki KaAPC obciążone peptydem lub kulki kontrolne (kulki tylko z HLA-A2-Ig) inkubowano przez 48 hr w stosunku 1:1 z limfocytami T specyficznymi dla CMVpp65 (~80%), a następnie zebrano i barwiono anneksyną V oraz jodkiem propidium (PI), aby określić stopień apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej (patrz sekcja protokołu 3.3-3.7). „poznawcze” (cognate) odnosi się do kulek obciążonych CMVpp65, a „niepoznawcze” (non-cognate) do kulek obciążonych peptydem Mart-1. Liczby wskazują procent żywych limfocytów T w dolnym lewym kwadrancie każdego wykresu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="9">
	<li>Aby przeprowadzić eksperymenty krzyżowe, należy wygenerować limfocyty T specyficzne dla dwóch różnych antygenów.</li>
	<li>Dalszą ocenę zdolności KaAPC do specyficznego usuwania antygenu należy przeprowadzić wraz z jednoczesną analizą eliminacji specyficznych limfocytów T w heterogenicznej populacji tych komórek. (Szczegółowy protokół znajduje się w pracy Schütz et al.10).</li>
</ol>

<ol><li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells%3A+the+synthetic+embodiment+of+a+%E2%80%9Cguided+missile%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+but+not+immature+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415</a> 5406-5413 (2003).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+by+Fas+ligand+%28FasL%2FCD95L%29-expressing+Killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li>
<li>Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li>
<li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li>
<li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li>
</ol>

C.S. i M.F. nie mają nic do ujawnienia.
Zgodnie z umową licencyjną pomiędzy NexImmune a Uniwersytetem Johnsa Hopkinsa, dr Schneck i dr Oelke są uprawnieni do udziału w opłatach licencyjnych otrzymywanych przez Uniwersytet od sprzedaży produktów aAPC opisanych w tym artykule. Są również właścicielami akcji NexImmune, które podlegają pewnym ograniczeniom wynikającym z polityki uniwersytetu. Dr Schneck jest członkiem Rady Dyrektorów i Naukowej Rady Doradczej firmy. Warunki tej umowy są zarządzane przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów.

Kluczowym etapem protokołu jest zapewnienie odpowiedniego stosunku sygnału 1 (peptyd MHC) do sygnału 2 (przeciwciało monoklonalne anty-Fas). Przeprowadziliśmy intensywne doświadczenia z miareczkowaniem w celu określenia optymalnego stosunku sygnału 1 i 2; okazało się, że minimalne różnice wynikające z odmiennego stężenia dimeru HLA-A2 Ig lub przeciwciała anty-Fas mogą zakłócać funkcjonalność KaAPC. W związku z tym stężenie obu sygnałów powinno być zawsze weryfikowane, a jakość obu białek regularnie badana, nawet jeśli zostały one zakupione u komercyjnego dostawcy. Ponadto stężenia powinny być zawsze wyznaczane przy użyciu tej samej metody, ponieważ różne testy detekcyjne mogą prowadzić do uzyskania odmiennych wyników stężeń. Funkcjonalność HLA-A2-Ig może być również upośledzona z powodu niepełnego refoldingu i/lub nieefektywnego ładowania peptydów. Co więcej, cząsteczki dimerów mogą agregować w różnym stopniu, co może wpływać na aktywność funkcjonalną białka. W związku z tym rzeczywista ilość dimeru potrzebna do generowania funkcjonalnych i specyficznych KaAPC może się różnić. Ponadto stwierdziliśmy, że optymalny zakres sygnału indukującego śmierć (przeciwciało anty-Fas) na KaAPC jest niezwykle wąski. W naszych badaniach stężenia przekraczające 3,64 μg/ml prowadziły do niespecyficznego zabijania limfocytów T dodatnich dla Fas, natomiast stężenia poniżej 3,64 μg/ml skutkowały zależnym od dawki obniżeniem aktywności cytotoksycznej. Choć warunki te wydają się bardzo rygorystyczne, dbałość o te szczegóły pozwoli na wytworzenie funkcjonalnych i specyficznych KaAPC.
Choć obecny fenotyp KaAPC jest funkcjonalny w zakresie usuwania aktywowanych antygenowo swoistych limfocytów T, wstępne eksperymenty celujące w naiwne lub spoczynkowe antygenowo swoiste limfocyty T nie wykazały istotnej indukcji apoptozy swoistej dla antygenu, ponieważ populacje te charakteryzują się obniżoną ekspresją Fas. W związku z tym można by rozważyć dodanie sygnału kostymulującego do KaAPC w celu indukcji up-regulacji Fas na spoczynkowych limfocytach T, aby uczynić je celem dla KaAPC. Choć jest to wykonalne, wszystkie trzy sygnały będą musiały zostać starannie miareczkowane, aby zapewnić funkcjonalny fenotyp KaAPC.
Dostosowanie platformy koralikowej do matrycy biokompatybilnej lub biodegradowalnej zwiększy możliwości zastosowania KaAPC in vivo. Niedawno Shen et al. zgłosili pomyślne zastosowanie KaAPC in vivo z wykorzystaniem lateksowych koralików o rozmiarze 5 μm skoniugowanych z przeciwciałami anty-Fas (klon Jo2) oraz anty-His/H2-Kb-TRP211. Wykazaliśmy, że ogólna koncepcja sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) może zostać z sukcesem przeniesiona z cząstek o rozmiarach mikrometrycznych (μm) na cząstki o rozmiarach nanometrycznych (nm)12 oraz że funkcjonalność ta jest zależna od geometrii cząstek13. Zatem poprzez zmianę rozmiaru i/lub kształtu przyszłych projektów KaAPC można wpłynąć na funkcjonalność i biodystrybucję in vivo, co może mieć kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia narządowych chorób autoimmunologicznych.
KaAPC pokonują główne wady strategii deplekcji opartych na komórkach, stanowiąc łatwą w użyciu, gotową do zastosowania („off the shelf”), a także efektywną pod względem czasu i kosztów metodę, która jest niezależna od stanu dawcy i wcześniejszego leczenia. KaAPC nie są celami dla sygnałów zabijania autokrynnego ani parakrynnego i nie wykazują wrażliwości na cytolityczne funkcje efektorowe CTL. Zastosowanie KaAPC wymaga zidentyfikowania odpowiedniego antygenu chorobowego i opiera się na ich specyficznym typie HLA. Choć obecnie zidentyfikowano liczne odpowiednie antygeny ograniczone przez HLA-A2 dla cukrzycy typu 1, GvHD i stwardnienia rozsianego2, opracowanie dodatkowych cząsteczek dimerów HLA klasy I, a także trwająca identyfikacja nowych antygenów istotnych w chorobach autoimmunologicznych, będzie dalej zwiększać i rozszerzać możliwości zastosowania KaAPC. Ponadto można rozważyć wykorzystanie KaAPC skierowanych przeciwko różnym epitopom w celu jednoczesnego uderzenia w wiele antygenów.
Podsumowując, KaAPC stanowią elastyczną platformę technologiczną do usuwania antygenowo swoistych limfocytów T. Ich „klockowa” natura umożliwia włączenie nowych sygnałów, takich jak dodatkowe sygnały kostymulujące lub hamujące, np. PD1 lub TRAIL, na różnych matrycach, co mogłoby rozszerzyć i zwiększyć ich późniejszą przydatność in vitro oraz in vivo. Przedstawiamy tutaj protokół krok po kroku generowania KaAPC, pierwszego podejścia opartego na koralikach w celu eliminacji antygenowo swoistych limfocytów T z mieszanin limfocytów T o różnych swoistościach.
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej, aktywacja CTL, analiza Annexin V-APC vs 7AAD, komórki efektorowe pamięci." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. KaAPC eliminują CTL w sposób swoisty dla antygenu. Oznakowane PKH26 aktywowane Fas+ efektorowe komórki pamięci CTL oraz oznakowane PKH67 CTL swoiste dla CMVpp65 od tego samego dawcy zmieszano w stosunku 1:1 i współhodowano z CMVpp65KaAPC przez 48 h. Kultury kontrolne traktowano nieobciążonymi KaAPC lub 1 µg/ml rozpuszczalnego przeciwciała anty-Fas-mAb (klon CH11). Minimalną utratę żywych komórek stwierdzono w nieleczonych mieszanych kulturach CTL (Tmix). Przedstawiono oryginalne dane FACS dla każdej populacji CTL z Tmix. Analizę apoptozy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszą publikacją, stosując oddzielne bramkowanie dla obu populacji limfocytów T10. Liczby przedstawione w górnych lewych kwadrantach oznaczają % wszystkich komórek. Ilustracja pochodzi z jednego reprezentatywnego doświadczenia przeprowadzonego w ramach trzech niezależnych eksperymentów. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Blood. Schütz, C. et al. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 2008; 111, 3546–52. Copyright the American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

W ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu patogennych mechanizmów chorób autoimmunologicznych. Jednak najczęstsze metody leczenia nadal opierają się na kortykosteroidach, a także lekach immunosupresyjnych, takich jak analogi puryn, środki alkilujące i inhibitory kalcyneuryny1. Stosowanie takich leków znacznie poprawiło rokowanie pacjentów, jednak leczenie nie zapewnia wyleczenia leżącego u podstaw zaburzenia immunologicznego. Ponadto pacjenci stają się podatni na infekcje i rozwój raka.
Dlatego ostatecznym celem leczenia chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucenia przeszczepów allogenicznych jest celowanie tylko w komórki T powodujące chorobę, przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i kompetentnego do walki z zaburzeniami immunologicznymi. Wykorzystanie komórek prezentujących antygen (APC) jako leczenia w celu zahamowania odpowiedzi obwodowych limfocytów T zostało po raz pierwszy opisane już w latach 70. przez kilka grup. Od tego czasu opracowano wiele podejść opartych na komórkach (przegląd w Schütz et al.2). Strategie wykorzystujące APC zabójcę z ekspresją FasL jako komórki immunoregulacyjne wykazały obiecujące wyniki wskazujące na potencjał terapeutyczny w leczeniu autoimmunizacji, odrzucenia przeszczepu allogenicznego i przewlekłych infekcji. Istnieją jednak znaczne ograniczenia w strategiach wykorzystujących FasL Killer-APC, które ostatecznie ograniczyły ich zastosowanie kliniczne; (i) wytwarzanie lub izolowanie APC jest czasochłonne, pracochłonne i kosztowne, (ii) pacjenci cierpiący na cytopenię z powodu immunosupresji dostarczają ograniczoną ilość i jakość komórek, (iii) powlekanie lub transdukcja APC z sygnałami indukującymi apoptozę, takimi jak FasL, skutkuje bardzo zmiennymi fenotypami oraz (iv) Killer-APC są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, co w konsekwencji zmniejsza ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym trudno jest zagwarantować zdefiniowany, powtarzalny fenotyp Killer-APC, który można wykorzystać do specyficznej dla antygenu modulacji odpowiedzi limfocytów T in vivo.
Na podstawie naszej poprzedniej pracy z FasL z ekspresją Killer-APC3-5 i sztucznymi komórkami prezentującymi antygen (aAPC)6,7, opracowaliśmy podejście oparte na koralikach (KaAPC) do specyficznego dla antygenu hamowania lub eliminacji autoreaktywnych limfocytów T in vitro. KaAPC składa się z dimeru HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał indukujący apoptozę) kowalencyjnie unieruchomionych na powierzchni paramagnetycznego kulki lateksowej o wielkości 4,5 μm. Zubożają one limfocyty T specyficzne dla antygenu w sposób pośredniczy w Fas/FasL z hodowli komórek T o wielu specyficznościach w sposób specyficzny dla antygenu i niezależnie od szlaku śmierci komórki indukowanej aktywacją (AICD). Zależna od dawki apoptoza w docelowych limfocytach T jest indukowana szybko już po 30minutach8.
KaAPC może być łatwo wygenerowany w kontrolowany sposób, zapewniając zdefiniowany fenotyp z półki i przezwyciężając większość niedociągnięć strategii wyczerpywania się opartych na komórkach. W związku z tym KaAPC wykazuje ogromny potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucania przeszczepów allogenicznych, przyczyniając się do postępu w dziedzinie strategii leczenia specyficznych dla limfocytów T.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB</td><td>Atlanta biologiczna</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 żywice epoksydowe</td><td>Magnes Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Zakręcana szklana fiolka</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD95 (klon CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimer</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi IgG1 PE</td><td>BD/ Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>przeciw mysim IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy okrągły płyta dolna</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (kaapc) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów t specyficznych dla antygenu

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Obecne leczenie chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T opiera się głównie na strategiach globalnej immunosupresji, której w dłuższej perspektywie towarzyszą niekorzystne skutki uboczne, takie jak zmniejszona zdolność do kontrolowania infekcji lub nowotworów złośliwych. W związku z tym należy opracować nowe podejścia, które będą ukierunkowane tylko na komórki pośredniczące w chorobie i pozostawią pozostały układ odpornościowy nienaruszony. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne strategie immunoterapii komórkowej w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T. Większość z tych podejść opiera się na indukujących tolerancję komórkach prezentujących antygen (APC). Jednak oprócz tego, że są technicznie trudne i kłopotliwe, takie podejścia oparte na komórkach są bardzo wrażliwe na odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, co ogranicza ich zdolność terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania niekomórkowych komórek prezentujących sztuczny antygen zabójcy (KaAPC), który pozwala na wyczerpanie patologicznych limfocytów T przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i funkcjonalnego. KaAPC jest alternatywnym rozwiązaniem dla immunoterapii komórkowej, które ma potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu alloidalnego poprzez regulację niepożądanych odpowiedzi limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu.

Cechy tego protokołu obejmują zdefiniowaną generację fenotypu KaAPC, który wyświetla HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał apoptozy) w tym samym czasie, który w porównaniu do metod opartych na komórkach nie jest zmieniany przez skuteczność powlekania lub transdukcji i może być łatwo modulowany podczas produkcji (Rysunek 1). Ponadto KaAPC nie są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, a ich funkcjonalność nie zależy od jakości autologicznych komórek prezentujących antygen przed i po manipulacji in vitro.
KaAPC są zdolne do zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro, gdy są załadowane pokrewnym peptydem, podczas gdy niepowiązane naładowane KaAPC nie zubożą limfocytów T (Rysunek 2). Dlatego KaAPC indukuje apoptozę limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu. Następnie użyliśmy KaAPC do selektywnego zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszaniny o różnych specyficznościach limfocytów T, wykazując, że tylko minimalna cytotoksyczność przeciekała do sąsiednich limfocytów T (Figura 3). W związku z tym KaAPC stanowi znakomite narzędzie do specyficznego dla antygenu in vitro zubożenia ludzkich aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu allogenicznego.

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie niekomórkowej zabójczej sztucznej komórki prezentującej antygen na bazie HLA IG lub K-A-A-P-C w celu wyczerpania autoreaktywnych lub niechcianych populacji komórek T. Osiąga się to poprzez pierwsze kowalencyjne powiązanie cząsteczek HLA IG i przeciwciał monoklonalnych Antifa z cząsteczkami dekstranu żelaza wielkości komórki w celu wytworzenia funkcjonalnego K-A-A-P-C W drugim etapie K-A-A-P-C są charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej, aby zapewnić ich prawidłową funkcjonalność. Następnie K-A-A-P-C są ładowane różnymi peptydami, które są przedmiotem zainteresowania, aby celować w niepożądaną populację komórek T specyficznych dla antygenu.Ostatecznie można przeprowadzić analizę cykliczną przepływu w celu zmierzenia specyficznego dla antygenu zabijania limfocytów T za pośrednictwem tłuszczu przez ładunek pokrewny. K-A-A-P-C. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy napotkaliśmy problemy podczas pracy nad stworzeniem komórkowego antygenu zabójczego prezentującego komórkę, podczas gdy w tym samym czasie pracujemy nad stworzeniem platformy opartej na bitach. Technologia modulacji komórek odpornościowych Aby najpierw wygenerować K-A-A-P-C, dodaj 250 mikrolitrów kulek epoksydowych z bulionu i 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu boranowego do sterylnej szklanej fiolki z zakrętką.Umieścić fiolkę na magnesie, aby kulki przylegały po dwóch minutach, odessać bufor i wyjąć fiolkę z magnesu. Przemyj kulki raz kolejnym mililitrem buforu ósemkowego, a następnie ponownie zawiesić je w 550 mikrolitrach HLA A dwa IG i anty-ludzkie CD 95 MAB. Delikatnie wstrząsnąć fiolką, aby wymieszać kulki z przeciwciałami, a następnie inkubować kulki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnego dnia odwiruj kulki przez dwie minuty w temperaturze 300 g i temperaturze pokojowej, a następnie umieść fiolkę z powrotem na magnesie. Po dwóch minutach odessać bufor ładujący. Wyjmij fiolkę z magnesu i umyj kulki w jednym mililitrze buforu do mycia, ostrożnie wstrząsając.Po trzecim płukaniu obrócić fiolkę w jednym mililitrze świeżego buforu do przemywania kulek, aby zablokować wszelkie resztki miejsc wiązania białek. Następnego dnia ponownie odkręć kulki i umieść fiolkę z powrotem na magnesie. Po dwóch minutach odessać bufor do płukania.Wyjmij fiolkę z magnesu i dodaj jeden mililitr PBS do KAPC. Aby sprawdzić jakość kulek, przenieś 1,5 razy 10 do jednej piątej K-A-A-P-C do rurki faksowej i umyj je jednym mililitrem bufora do płukania faksów Resus. Zawiesić granulkę kulki w 100 mikrolitrach buforu do płukania i dodać jeden mikrolitr anty mysiej IgG, jeden PE w celu wykrycia HLA A, dwa IG i jeden mikrolitr anty mysiego IG MFI TC w celu wykrycia anty-ludzkiego CD 95 MAB.Następnie po 15 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj kulki w jednym mililitrze buforu do płukania faksów Resus. Zawieś je w 250 mikrolitrach buforu do przemywania i odczytaj próbki na cytometrze przepływowym w celu obciążenia peptydami. Przenieść dwa razy 10 do siódmego składnika K-A-A-P-C do nowej sterylnej szklanej fiolki.Następnie po umieszczeniu kulek na magnesie przez dwie minuty, odessać PBS i ponownie zawiesić kulki w 500 mikrolitrach świeżego PBS zawierającego pięć mikrogramów peptydu. Oznacz fiolkę datą i nazwą załadowanego peptydu, K-A-A-P-C. Następnie przechowuj załadowany K-A-A-P-C w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej trzy dni, aby umożliwić wystarczające obciążenie peptydem HLA A dwa dimery IG w celu przeprowadzenia testu zabijania in vitro A-K-A-A-P-C.Przemyj K-A-A-P-C załadowany peptydem, jak pokazano, co najmniej sześć razy, aby usunąć cały wolny peptyd. Następnie przenieść K-A-A-P-C i dwa razy 10 do piątych limfocytów T specyficznych dla antygenu do jednego dołka na próbkę 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie w 200 mikrolitrach pożywki do kohodowli w stosunku jeden do jednego po 48 godzinach hodowli w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przenieść próbki do odpowiednich probówek faksowych i umyć je w jednym mililitrze buforu wiążącego nexin five.Następnie ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach buforu wiążącego nexin five, a następnie inkubuj próbki w jednym mikrolitrze nexin five FITC i pięciu mikrolitrach siedmiu a a d w temperaturze pokojowej. Po 10 do 15 minutach przemyć próbki jednym mililitrem buforu wiążącego nexin five i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu wiążącego nin five. Następnie natychmiast odczytaj próbki na cytometrze przepływowym.K-A-A-P-C wyświetla jednocześnie HLA A, dwa IG i Antifa MAB, co w porównaniu z metodami opartymi na komórkach nie zmienia się pod wpływem kodowania ani skuteczności transdukcji i może być łatwo modulowane podczas produkcji. K-A-A-P-C są zdolne do zubożania limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro, gdy są załadowane pokrewnym peptydem, podczas gdy nie są obciążone pokrewnymi. K-A-A-P-C nie zubaża limfocytów T, a zatem K-A-A-P-C indukuje apoptozę limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu.Następnie, gdy K-A-A-P-C są używane do selektywnego zubożania limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszaniny o różnych specyficznościach limfocytów T, minimalna cytotoksyczność przecieka do sąsiednich limfocytów T. Tak więc K-A-A-P-C stanowi znakomite narzędzie do antygenu in vitro, specyficznego dla antygenu zubożenia ludzkich aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu z potencjalnym zastosowaniem klinicznym w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu allogenicznego Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią komórkową do zbadania nowych podejść do leczenia chorób autoimmunologicznych wywołanych przez limfocyty T i odrzucenia przeszczepu.

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Poznaj metodę generowania zabójczych sztucznych komórek prezentujących antygen KaAPC do selektywnej eliminacji autoreaktywnych limfocytów T człowieka in vitro. Technika ta umożliwia celowaną terapię chorób autoimmunologicznych.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu (Wideo) | JoVE Journal

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Przeglądaj więcej filmów