Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie niekomórkowej zabójczej sztucznej komórki prezentującej antygen na bazie HLA IG lub K-A-A-P-C w celu wyczerpania autoreaktywnych lub niechcianych populacji komórek T. Osiąga się to poprzez pierwsze kowalencyjne powiązanie cząsteczek HLA IG i przeciwciał monoklonalnych Antifa z cząsteczkami dekstranu żelaza wielkości komórki w celu wytworzenia funkcjonalnego K-A-A-P-C W drugim etapie K-A-A-P-C są charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej, aby zapewnić ich prawidłową funkcjonalność. Następnie K-A-A-P-C są ładowane różnymi peptydami, które są przedmiotem zainteresowania, aby celować w niepożądaną populację komórek T specyficznych dla antygenu.

Ostatecznie można przeprowadzić analizę cykliczną przepływu w celu zmierzenia specyficznego dla antygenu zabijania limfocytów T za pośrednictwem tłuszczu przez ładunek pokrewny. K-A-A-P-C. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy napotkaliśmy problemy podczas pracy nad stworzeniem komórkowego antygenu zabójczego prezentującego komórkę, podczas gdy w tym samym czasie pracujemy nad stworzeniem platformy opartej na bitach. Technologia modulacji komórek odpornościowych Aby najpierw wygenerować K-A-A-P-C, dodaj 250 mikrolitrów kulek epoksydowych z bulionu i 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu boranowego do sterylnej szklanej fiolki z zakrętką.

Umieścić fiolkę na magnesie, aby kulki przylegały po dwóch minutach, odessać bufor i wyjąć fiolkę z magnesu. Przemyj kulki raz kolejnym mililitrem buforu ósemkowego, a następnie ponownie zawiesić je w 550 mikrolitrach HLA A dwa IG i anty-ludzkie CD 95 MAB. Delikatnie wstrząsnąć fiolką, aby wymieszać kulki z przeciwciałami, a następnie inkubować kulki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia odwiruj kulki przez dwie minuty w temperaturze 300 g i temperaturze pokojowej, a następnie umieść fiolkę z powrotem na magnesie. Po dwóch minutach odessać bufor ładujący. Wyjmij fiolkę z magnesu i umyj kulki w jednym mililitrze buforu do mycia, ostrożnie wstrząsając.

Po trzecim płukaniu obrócić fiolkę w jednym mililitrze świeżego buforu do przemywania kulek, aby zablokować wszelkie resztki miejsc wiązania białek. Następnego dnia ponownie odkręć kulki i umieść fiolkę z powrotem na magnesie. Po dwóch minutach odessać bufor do płukania.

Wyjmij fiolkę z magnesu i dodaj jeden mililitr PBS do KAPC. Aby sprawdzić jakość kulek, przenieś 1,5 razy 10 do jednej piątej K-A-A-P-C do rurki faksowej i umyj je jednym mililitrem bufora do płukania faksów Resus. Zawiesić granulkę kulki w 100 mikrolitrach buforu do płukania i dodać jeden mikrolitr anty mysiej IgG, jeden PE w celu wykrycia HLA A, dwa IG i jeden mikrolitr anty mysiego IG MFI TC w celu wykrycia anty-ludzkiego CD 95 MAB.

Następnie po 15 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj kulki w jednym mililitrze buforu do płukania faksów Resus. Zawieś je w 250 mikrolitrach buforu do przemywania i odczytaj próbki na cytometrze przepływowym w celu obciążenia peptydami. Przenieść dwa razy 10 do siódmego składnika K-A-A-P-C do nowej sterylnej szklanej fiolki.

Następnie po umieszczeniu kulek na magnesie przez dwie minuty, odessać PBS i ponownie zawiesić kulki w 500 mikrolitrach świeżego PBS zawierającego pięć mikrogramów peptydu. Oznacz fiolkę datą i nazwą załadowanego peptydu, K-A-A-P-C. Następnie przechowuj załadowany K-A-A-P-C w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej trzy dni, aby umożliwić wystarczające obciążenie peptydem HLA A dwa dimery IG w celu przeprowadzenia testu zabijania in vitro A-K-A-A-P-C.

Przemyj K-A-A-P-C załadowany peptydem, jak pokazano, co najmniej sześć razy, aby usunąć cały wolny peptyd. Następnie przenieść K-A-A-P-C i dwa razy 10 do piątych limfocytów T specyficznych dla antygenu do jednego dołka na próbkę 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie w 200 mikrolitrach pożywki do kohodowli w stosunku jeden do jednego po 48 godzinach hodowli w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przenieść próbki do odpowiednich probówek faksowych i umyć je w jednym mililitrze buforu wiążącego nexin five.

Następnie ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach buforu wiążącego nexin five, a następnie inkubuj próbki w jednym mikrolitrze nexin five FITC i pięciu mikrolitrach siedmiu a a d w temperaturze pokojowej. Po 10 do 15 minutach przemyć próbki jednym mililitrem buforu wiążącego nexin five i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu wiążącego nin five. Następnie natychmiast odczytaj próbki na cytometrze przepływowym.

K-A-A-P-C wyświetla jednocześnie HLA A, dwa IG i Antifa MAB, co w porównaniu z metodami opartymi na komórkach nie zmienia się pod wpływem kodowania ani skuteczności transdukcji i może być łatwo modulowane podczas produkcji. K-A-A-P-C są zdolne do zubożania limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro, gdy są załadowane pokrewnym peptydem, podczas gdy nie są obciążone pokrewnymi. K-A-A-P-C nie zubaża limfocytów T, a zatem K-A-A-P-C indukuje apoptozę limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu.

Następnie, gdy K-A-A-P-C są używane do selektywnego zubożania limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszaniny o różnych specyficznościach limfocytów T, minimalna cytotoksyczność przecieka do sąsiednich limfocytów T. Tak więc K-A-A-P-C stanowi znakomite narzędzie do antygenu in vitro, specyficznego dla antygenu zubożenia ludzkich aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu z potencjalnym zastosowaniem klinicznym w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu allogenicznego Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią komórkową do zbadania nowych podejść do leczenia chorób autoimmunologicznych wywołanych przez limfocyty T i odrzucenia przeszczepu.