Name: Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj nieradioaktywny test TRAP do pomiaru aktywności telomerazy w różnych regionach mózgu myszy. Ta metoda pozwala porównać poziom aktywności między mózgiem samców i samic.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez technologię B.G. Negev i wkład Lindy Powers.

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną ds. eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Ben-Guriona (IL-39-08-2010).
1. Ekstrakcja białka mózgu myszy
<ol>
	<li>Przygotować 3 probówki po 15 ml każda, zawierające 5 ml roztworu Ringera i umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Poświęć mysz za pomocą znieczulenia izofluranem (UWAGA – użyj kaptura chemicznego) na 10-20 sekund, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i natychmiastowe ścięcie.</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki i płucz przez kilka sekund lodowatym roztworem Ringera, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej.</li>
	<li>Za pomocą ostrza chirurgicznego oddziel móżdżek (CR) i pień mózgu (BS) od kory czołowej. Następnie oddziel móżdżek od pnia mózgu i odetnij płat czołowy (FL) od kory czołowej; Usuń opuszkę węchową z płata czołowego. Umieść 3 obszary mózgu w wyznaczonych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Homogenizować tkankę w każdej probówce. Dodaj świeży, lodowaty roztwór Ringera, tak aby każda probówka zawierała taką samą objętość i wirować przez 7 minut przy 800 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 100 μl buforu do lizy CHAPS do każdej probówki. Dobrze wymieszać, przepuszczając roztwór kilka razy (~10) przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 21 G i inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść zawartość każdej probówki do nowej probówki do mikrowirówki i wirować przez 30 minut przy 13 000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i oznaczyć stężenie białka przy użyciu wcześniej ustalonej metody. Przechowywać ekstrakty białkowe w porcjach po 10 μl w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Test TRAP Przygotowanie instrumentów, roztworów reakcyjnych i obliczenia rozcieńczenia białka
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednią liczbę znakowanych probówek do mikrowirówek do rozcieńczeń ekstraktu białkowego i buforu reakcyjnego telomerazy. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, należy wykonywać wszystkie pipetowanie zgodnie z protokołem, używając końcówek filtrujących.</li>
	<li>Rozmrozić następujące roztwory na lodzie: mieszanina reakcyjna TRAP 10x, starter TS, dNTP, UPW i ekstrakty białkowe (patrz tabela materiałów dla odczynników i stężeń odczynników).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór ekstraktu białkowego do końcowego stężenia 1 μg/μl przy użyciu ultraczystej wody (UPW).</li>
</ol>
3. Reakcja telomerazy
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną telomerazy, dodając do probówki mikrowirówki: 2 μl mieszanki TRAP (10x), 1 μl startera TS (0,1 μg), 1 μl dNTP (10 mM) i 15 μl UPW. W przypadku wielu próbek pomnóż wyżej wymienione objętości przez liczbę próbek plus 1.</li>
	<li>Dodać 19 μl mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki reakcyjnej i dodać 1 μl rozcieńczonego ekstraktu białkowego (1 μg białek) do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 20 μl.</li>
	<li>Umieścić probówki reakcyjne w łaźni wodnej podgrzanej o temperaturze 30 °C na 45 minut.</li>
</ol>
4. Reakcja PCR
<ol>
	<li>Piętnaście minut przed końcem reakcji telomerazy rozmrozić następujące roztwory: starter ACX, bufor Titanium Taq, UPW.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR, dodając do probówki mikrowirówki: 2,5 μl buforu tytanowego Taq (10x), 1 μl startera ACX (0,1 μg), 2 μl UPW (1 μl, gdy stosuje się IC) i 0,5 μl polimerazy tytanowej Taq (50x). W przypadku wielu próbek należy pomnożyć wyżej wymienione objętości przez liczbę próbek plus 2.</li>
	<li>Dodać 6 μl mieszaniny PCR do każdej probówki PCR i dodać całą objętość reakcji telomerazy (20 μl) do każdej probówki, aby uzyskać końcową objętość 26 μl.</li>
	<li>Włóż probówki PCR do termocyklera PCR i uruchom następujący program: 
	- 90 °C – 2 min. 
	- 94 °C – 30 sek.* 
	- 60 °C – 30 sek.* 
	- 72 °C – 45 sek.* 
	- 72 °C – 2 min. 
	Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	* = 34 cykle</li>
</ol>
5. Przygotowanie mini-żelu agarozowego, bieganie próbek i barwienie żelem
<ol>
	<li>Dodać 25 ml schłodzonego buforu do elektroforezy (TBE) i mieszadło do zlewki o objętości 2-4 razy większej od roztworu buforowego i powoli wsypać 1,125 g proszku agarozy o wysokiej rozdzielczości (HR), podczas gdy roztwór jest szybko mieszany. Wyjmij mieszadło, przykryj zlewkę folią spożywczą i wbij mały otwór w celu wentylacji. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej na "niskiej" mocy przez 3 minuty, a następnie przełącz na "wysoką" moc i podgrzewaj roztwór w krótkich impulsach, uważając, aby nie spowodować rozlania. Zwróć uwagę, że gdy piana powstała w wyniku ogrzewania stanie się dużymi bąbelkami i zniknie po kilku sekundach, agaroza jest gotowa.</li>
	<li>Przelać żel do poziomego aparatu do mini-żelu, po zestaleniu się żelu w temperaturze pokojowej pozostawić żel do schłodzenia przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Załadować każdy tor 25 μl próbki TRAP (20 μl produktów TRAP PCR i 5 μl 6-krotnego barwnika w żelu) i uruchomić pod napięciem 110 V przez 3 godziny w chłodni o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj barwnik kwasem nukleinowym 3x roztwór roboczy, dodając 15 μl 10 000x barwienie kwasów nukleinowych, roztwór podstawowy do 50 ml podwójnej wody destylowanej (DDW) z 0,1 M NaCl (0,29 g). Plamić żel przez 20 minut, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Użyj transiluminatora UV o długości fali 302 nm, aby zobaczyć pasma DNA drabinki TRAP.</li>
</ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Analiza aktywności telomerazy w mózgu myszy za pomocą testu TRAP składa się z 4 głównych etapów: 1) ekstrakcja białek z określonych obszarów tkanki mózgowej 2) wydłużenie startera TS przez telomerazę - reakcja telomerazy 3) amplifikacja produktów reakcji telomerazy przez PCR 4) oddzielenie produktów PCR za pomocą żelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości.
Ten zmodyfikowany test TRAP rozwiązuje dwie główne trudności, które wynikają z tradycyjnego testu: zastosowanie radioaktywnych dCTP do czuł...

Telomeraza to rybonukleoproteina złożona z odwrotnej transkryptazy telomerazy (TERT), podjednostki katalitycznej telomerazy i składnika RNA (TERC). Kanoniczną rolą telomerazy jest zachowanie właściwej długości telomerów poprzez dodawanie powtarzających się sekwencji (TTAGGG) do końców telomerowych, promując w ten sposób integralność genomu i proliferację komórek1. Dodatkowe role przypisano TERT w komórkach, tj. nadaje on odporność na apoptozę indukowaną przez różne czynniki uszkadzające2, chroni ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste przed stresem oksydacyjnym3 i odgrywa rolę pro-survivalową w całkowicie zróżnicowanych neuronach poprzez asocjację z ziarnistościami TIA1 dodatniego RNA4.
TERT ulega ekspresji i jest aktywny głównie w komórkach dzielących się somatycznie i w większości typów nowotworów, podczas gdy ekspresja enzymu i poziomy aktywności są ściśle regulowane w komórkach niedzielących się5,6. Badania wykazały, że w mózgu gryzoni aktywność telomerazy staje się niewykrywalna do 10 dnia po urodzeniu, podczas gdy mRNA TERT utrzymuje się na niższym poziomie do dorosłości7. Inne badania wykazały aktywność telomerazy w strefie podkomorowej dorosłego, opuszki węchowej, hipokampie oraz w dorosłym móżdżku i korze mózgowej8. Niedawno wykazaliśmy, że nowe związki, które zwiększają ekspresję i aktywność telomerazy w mózgu i rdzeniu kręgowym, wywierają działanie neuroprotekcyjne u myszy z wstrzyknięciem N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), opóźniają początek i postęp stwardnienia zanikowego bocznego u myszy transgenicznych SOD1 i zwiększają przeżywalność neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym tych myszy9. Aby w pełni zrozumieć pro-survivalową rolę telomerazy w neuronach i mózgu, konieczne jest opracowanie prostego i stosunkowo czułego szybkiego testu do wykrywania aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu.
Protokół wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) jest dobrze znanym czułym testem łączącym kanoniczną aktywność telomerazy i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). W tym teście telomeraza dodaje powtórzenia TTAGGG do oligonukleotydu substratu telomerazy (startera TS), a następnie amplifikację PCR, która generuje drabinkę DNA 6 par zasad (bp) przy użyciu startera odwróconego TS – ACX. Rozdział 32DCTP znakowane P służą do wykrywania małej ilości produktów PCR. Drabina DNA jest rozwiązywana przez sekwencjonowanie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Zarówno intensywność prążków DNA, jak i długość drabiny DNA odzwierciedlają odpowiednio ilość aktywnych cząsteczek enzymu i ich procesywność10.
Ten tradycyjny test ma kilka głównych trudności: niebezpieczeństwo narażenia na substancje radioaktywne, duże i trudne do opanowania sekwencjonowanie PAGE oraz zużycie czasu działania żelu i naświetlenie filmu produktu radioaktywnego (w obu przypadkach przez noc).
Ten protokół oferuje ulepszony test oparty na miniżelu agarozowym nieradioaktywnym. Drabinka DNA 6 pz jest rozwiązywana przy użyciu 4,5% żelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości, a wykrywanie odbywa się za pomocą bardzo czułego barwienia kwasem nukleinowym. Połączenie użycia miniżelu agarozowego o wysokiej rozdzielczości i wrażliwego barwienia kwasem nukleinowym zapewnia łatwy w obsłudze test, eliminuje niebezpieczeństwo narażenia na radioaktywność i znacznie skraca całkowity czas trwania testu z 3 dni do kilku godzin.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Wykonany ręcznie, wymieszaj następujące ilości w UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (zakupiony od Sigma). Podwielokrotności są zamrażane w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> Ringera <td>Wykonany ręcznie, wymieszaj następujące składniki w DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glukoza bezwodna.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Ostrożnie obchodź się z kapturem chemicznym</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Podkład Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td>Oligonukleotydy <td>Sigma</td><td></td><td>DNA uporządkowane w formacie SUCHYM i UPW dodane zgodnie z wymaganym stężeniem</td></tr><tr><td>Starter ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTACCCCTAACC-3')</td>Oligonukleotydy <td>Sigma</td><td></td><td>DNA zamówione w formacie SUCHYM i UPW dodane zgodnie z wymaganymi stężenie</td></tr><tr><td>Tytan Taq Polimeraza / Bufor</td><td>Clontech</td><td>S1792 / S1793</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o wysokiej rozdzielczości</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Każda wysokiej jakości agaroza o wysokiej rozdzielczości może być nasycona</td></tr><tr><td>Aparat mini-żelowy</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie kwasem nukleinowym (GEL-RED)</td><td>Podkład IC Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>(5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td> Oligonukleotydy <td>Sigma</td><td></td><td>DNA uporządkowane w formacie SUCHYM i dodane do wody ultraczystej zgodnie z wymaganym stężeniem</td></tr><tr><td>Bufor do lizy CHAPS</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9852S</td><td>Dodaj PMSF (inhibitor proteazy) do końcowego stężenia 1 mM</td></tr><tr><td>Ultra Pure Water (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>Myszy CD-1</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (trap)

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomeraza, rybonukleoproteina, jest odpowiedzialna za utrzymanie długości telomerów, a tym samym promowanie integralności genomu, proliferacji i długości życia. Ponadto telomeraza chroni mitochondria przed stresem oksydacyjnym i nadaje odporność na apoptozę, co sugeruje jej możliwe znaczenie dla przetrwania niemitotycznych, wysoce aktywnych komórek, takich jak neurony. Wcześniej wykazaliśmy zdolność nowych aktywatorów telomerazy do zwiększania aktywności i ekspresji telomerazy w różnych regionach mózgu myszy oraz do ochrony komórek neuronów ruchowych przed stresem oksydacyjnym. Wyniki te wzmacniają pogląd, że telomeraza bierze udział w ochronie neuronów przed różnymi uszkodzeniami. Aby podkreślić rolę telomerazy w mózgu, porównujemy tutaj aktywność telomerazy w mózgu myszy płci męskiej i żeńskiej oraz jej zależność od wieku. Test TRAP jest standardową metodą wykrywania aktywności telomerazy w różnych tkankach lub liniach komórkowych. Tutaj pokazujemy analizę aktywności telomerazy w trzech regionach mózgu myszy poprzez niedenaturacyjną ekstrakcję białek przy użyciu buforu do lizy CHAPS, a następnie modyfikację standardowego testu TRAP.
W tym dwuetapowym teście, endogenna telomeraza wydłuża określony substrat telomerazy (starter TS) poprzez dodanie powtórzeń TTAGGG 6 bp (reakcja telomerazy). Produkty reakcji telomerazy są amplifikowane w reakcji PCR, tworząc drabinę DNA o przyrostach 6 pz. Analiza drabiny DNA odbywa się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości 4,5%, a następnie barwienia bardzo czułym barwieniem kwasem nukleinowym.
W porównaniu do tradycyjnego testu TRAP, który wykorzystuje radioaktywne dCTP znakowane 32P do wykrywania DNA i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozwiązywania drabiny DNA, ten protokół oferuje nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do oceny aktywności telomerazy w mózgu myszy, wykazując zdolność do wykrywania różnic w aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy żeńskiej i męskiej.

Ekstrakty białkowe z całych komórek przygotowano z płata czołowego (FL), pnia mózgu (BS) i móżdżku (CR), pochodzące od 3 samic i 3 samców myszy CD-1 w wieku 1 i 3 miesięcy dla zmodyfikowanego testu TRAP oraz od 3 samców myszy CD-1 w wieku 2 miesięcy dla radioaktywnego testu TRAP. Aktywność telomerazy wykrywano w 1 µg ekstraktu białkowego przy użyciu zmodyfikowanego testu TRAP oraz w 2 µg ekstraktu białkowego dla radioaktywnego testu TRAP. Wykrywanie aktywności telomerazy za pomocą radioaktywnego testu TRAP oraz zmodyfiko...

Telomeraza ulega ekspresji w mózgu noworodka, a także w różnych obszarach mózgu dorosłego. Przedstawiamy nietoksyczny, oszczędzający czas test TRAP do analizy aktywności telomerazy w różnych obszarach mózgu myszy i wykrywania różnic w aktywności telomerazy między mózgami myszy płci męskiej i żeńskiej.

Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności telomerazy w normalnej tkance mózgowej. Osiąga się to poprzez przygotowanie ekstraktów białkowych z całych komórek z różnych tkanek mózgowych jako źródła aktywnego enzymu telomerazy. Drugim krokiem jest dodanie równoważnych ilości ekstraktów białkowych do specyficznej mieszaniny reakcyjnej telomerazy zawierającej substrat i nukleotydy potrzebne do aktywności telomerazy.Następnie produkty reakcji telomerazy są amplifikowane metodą PCR i analizowane za pomocą elektroforezy żelowej aros o wysokiej rozdzielczości. Ostatnim krokiem jest wizualizacja amplifikowanych produktów reakcji telomerazy poprzez barwienie żelu aros bardzo wrażliwym środkiem barwiącym DNA, ostatecznie wyniki testu protokołu wielokrotnej amplifikacji tego promienia totonowego wykazują przyrost sześciu par zasad, drabiny DNA równoważne aktywności promieniowania totonowego w różnych tkankach mózgowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test pułapki promieniotwórczej lub komercyjne zestawy do testowania pułapek, jest to, że protokół ten oferuje stosunkowo efektywną czasowo i kosztowo alternatywę.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w aktywność tkanki mózgowej, można ją również zastosować do każdej innej żywej tkanki lub hodowli komórkowej. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować trzy 15-mililitrowe probówki, z których każda zawiera pięć mililitrów roztworu Ringera. Umieść rurki na lodzie po usunięciu mózgu z myszy poddanej eutanazji.Płucz mózg przez kilka sekund lodowatym roztworem dzwonka, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej. Za pomocą ostrza chirurgicznego oddziel móżdżek i pień mózgu od kory czołowej. Następnie oddziel móżdżek od pnia mózgu.Usuń opuszkę węchową z płata czołowego i odetnij płat czołowy od kory czołowej. Umieść trzy obszary mózgu w wyznaczonych 15-mililitrowych probówkach, homogenizuj tkankę w każdej probówce. Następnie dodaj świeży lodowaty roztwór dzwonka, tak aby każda probówka zawierała taką samą objętość i wirować przez siedem minut w temperaturze 800 razy G, usuń supernatant i dodaj 100 mikrolitrów plasterków spierzchniętych.Bufor do każdej probówki. Dobrze wymieszaj, przepuszczając roztwór około 10 razy przez jednomililitrową strzykawkę z makaronem o rozmiarze 21, inkubować na lodzie przez 30 minut. Po 30 minutach przenieś zawartość każdej probówki do nowej probówki do mikrowirówki i wiruj przez 30 minut.Po 13 000 razy, G, przenieś supinat do nowej mikroprobówki wirówkowej. Po oznaczeniu stężenia białka przy użyciu wcześniej ustalonej metody należy przechowywać ekstrakty białkowe w porcjach po 10 mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpocznij tę część protokołu od przygotowania odpowiedniej liczby znakowanych mikroprobówek wirówkowych do rozcieńczeń ekstraktu białkowego i buforu reakcyjnego telomerazy dla następujących roztworów na lodzie.10 x Mieszanka reakcyjna pułapki DS starter dn TPS, woda ultraczysta i ekstrakty białkowe Rozcieńczyć roztwór ekstraktu białkowego do końcowego stężenia jednego mikrograma na mikrolitr. Używając ultraczystej wody, pipetowanie należy wykonywać za pomocą końcówek filtrujących, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub reakcji telomerów. Każda próbka wymaga mieszaniny reakcyjnej telomerów, która składa się z dwóch mikrolitrów mieszanki pułapki, jednego mikrolitra startera TS, jednego mikrolitra DN NTP i 15 mikrolitrów ultraczystej wody dla wielu próbek.Pomnóż te objętości przez liczbę próbek plus jedną, dodaj 19 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej MASE do każdej probówki reakcyjnej, a następnie jeden mikrolitr rozcieńczonego ekstraktu białkowego. Aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów, umieść probówki reakcyjne w łaźni wodnej podgrzanej do 30 stopni Celsjusza na 45 minut. Na 15 minut przed zakończeniem reakcji thres należy przygotować się do amplifikacji produktów reakcji thres, mieszając następujące roztwory: starter CX, tytanowy bufor adhezyjny i ultraczystą wodę.Każda próbka wymaga mieszaniny reakcyjnej PCR składającej się z 2,5 mikrolitra buforu technologicznego tytanu, jednego mikrolitra startera CX, dwóch mikrolitrów wody ultraczystej i 0,5 mikrolitra polimerazy tytanowej dla wielu próbek. Pomnóż te objętości przez liczbę próbek plus dwa. Dodaj sześć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej PCR do każdej probówki PCR i dodaj całą objętość z reakcją mase do każdej probówki.Aby uzyskać końcową objętość 26 mikrolitrów, włóż probówki PCR do termocyklera PCR i uruchom następujący program, 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie 34 cykle po 94 stopnie Celsjusza przez 30 sekund. 60 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 45 sekund. I ostatnie dwie minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza.Po zakończeniu reakcji PCR produkty PCR należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować róże jajeczne do odlewania mini żelu, najpierw dodaj 25 mililitrów schłodzonego buforu do elektroforezy TBE i mieszadło do zlewki o objętości od dwóch do czterech razy większej od roztworu buforowego i zacznij mieszać. Następnie powoli wsyp 1,125 grama proszku aros o wysokiej rozdzielczości.Podczas gdy roztwór szybko się miesza, usuń pasek gwiazdy. Przykryj zlewkę folią spożywczą i przebij mały otwór w celu wentylacji. Podczas uderzania w agros bardzo ważne jest, aby osiągnąć temperaturę wrzenia, aby całkowicie go rozpuścić.Pamiętaj, aby poświęcić pełną uwagę zlewce w kuchence mikrofalowej, aby upewnić się, że wytworzona piana nie rozleje się. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej na małej mocy przez trzy minuty, po czym przełącz na wysoką moc i podgrzewaj roztwór w krótkich impulsach, uważając, aby nie rozlać się. Odleć żel do poziomego mini aparatu żelowego i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej Po zestaleniu żelu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przed użyciem do elektroforezy załaduj każdą linię 25 mikrolitrami próbki pułapki i pracuj pod napięciem 110 woltów przez trzy godziny w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas pracy żelu. Przygotuj trzy x roztwór roboczy barwienia kwasem nukleinowym, dodając 15 mikrolitrów 10 000 x roztworu podstawowego barwienia kwasów nukleinowych do 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody z 0,1 molowym chlorkiem sodu. Po zakończeniu elektroforezy próbek należy barwić żel przez 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.Na koniec użyj oświetlacza UV trans o długości fali 302 nanometrów. Aby zobaczyć drabinę pułapek, wykryto aktywność telomerów pasm DNA w regionach mózgu myszy zarówno za pomocą tradycyjnych, jak i zmodyfikowanych testów pułapek. Lepszą wizualizację i rozdzielczość produktów DNA telomerów zaobserwowano za pomocą zmodyfikowanego testu, co widać po długości i intensywności drabiny DNA.Stopniowe zmniejszanie się produktów telomerowego DNA zaobserwowano, gdy w zmodyfikowanym teście pułapki zastosowano zmniejszające się stężenia ekstraktów białkowych, co sugeruje jego czułość na wykrywanie aktywności telomerów przy niższych stężeniach białek, wykrywanie aktywności telomerazy za pomocą zmodyfikowanego testu w trzech regionach mózgu jednomiesięcznych samic i samców myszy nie wykazało istotnych różnic. Jednak u trzymiesięcznych myszy wyższa aktywność telomerazy wykazuje się w płacie czołowym i pniu mózgu w porównaniu z móżdżkiem, co ujawnia intensywność pasm DNA i długość drabiny produktów DNA. Podczas przejścia myszy w dorosłość aktywność promieniowania thoma wzrasta w płacie czołowym i zmniejsza się w pniu mózgu i móżdżku.Aktywność telomerów ome wydaje się być również wyższa w płacie czołowym u kobiet. W przeciwieństwie do wyższej aktywności telomerów w pniu mózgu i móżdżku u mężczyzn, po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo określić aktywność thoma w wybranej tkance.

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Telomery i telomeraza odgrywają istotną rolę w procesie starzenia się i nowotworzenia. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób wygenerować dwa mysie indukowane allele knock-in telomerazy i jak je wykorzystać w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem.

Wykorzystanie mysich indukowanych alleli telomerazy w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) syntetyzuje nie tylko telomeryczne DNA, ale także dwuniciowe RNA poprzez aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany test do wykrywania zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA endogennego TERT.

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

Tutaj opisujemy protokół generowania realnego modelu samicy mysiej z nielosową inaktywacją chromosomu X, tzn. chromosom X odziedziczony po matce jest nieaktywny w 100% komórek. Opisujemy również protokół testowania wykonalności, tolerancji i bezpieczeństwa farmakologicznej reaktywacji nieaktywnego chromosomu X in vivo.

Nielosowy mysi model do farmakologicznej reaktywacji Mecp2 na nieaktywnym chromosomie X

Udało nam się przekształcić standardowy test protokołu wielokrotnej amplifikacji telomerów (TRAP) do zastosowania w kropelkowych reakcjach łańcuchowych polimerazy cyfrowej. Ten nowy test, nazwany ddTRAP, jest bardziej czuły i ilościowy, co pozwala na lepsze wykrywanie i analizę statystyczną aktywności telomerazy w różnych komórkach ludzkich.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptacja protokołu amplifikacji powtórzeń telomerów do kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj nieradioaktywny test TRAP do pomiaru aktywności telomerazy w różnych regionach mózgu myszy. Ta metoda pozwala porównać poziom aktywności między mózgiem samców i samic.

Aktywność telomerazy w różnych regionach mózgu myszy: test nieradioaktywnej amplifikacji powtórzeń telomerazy (TRAP)

Przeglądaj więcej filmów