Name: Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Poznaj metodę nagrywania optycznego i elektrofizjologicznego u przebudzonych, swobodnie poruszających się myszy. Technika wykorzystuje unoszoną powietrzem mobilną klatkę domową do mikroskopii dwufotonowej i pomiarów patch-clamp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Eero Castrenowi za jego cenne uwagi na temat manuskryptu. Prace są wspierane przez granty z Akademii Fińskiej, Fińskiego Centrum Mobilności Międzynarodowej oraz Fińskiej Wyższej Szkoły Neuronauki (Brain and Mind Doctoral Program).

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby lepiej zrozumieć fizjologię i patologię mózgu, należy przeprowadzić badania na różnych poziomach złożoności przygotowania, wykorzystując najbardziej odpowiednie techniki dla każdego preparatu. Obecnie szeroki zakres metodologii neuronauki (od fMRI całego ciała po mikroskopię STED suborganelli) jest łatwo stosowany do znieczulonych zwierząt, podczas gdy eksperymenty na przytomnych i zachowujących się zwierzętach stanowią poważne wyzwanie metodologiczne.
Opisano tu nowatorskie podejście, w którym zwierzę laboratoryjne, mimo że jest mocno unieruchomione głową, może poruszać się po podnoszonej powietrzem mobilnej klatce domowej i badać swoje namacalne otoczenie w warunkach bezstresowych. Prezentowany tutaj preparat dla zwierząt zachowujących się z głową ma szereg istotnych zalet. Po pierwsze, dane elektrofizjologiczne lub obrazowe uzyskane tą metodą nie są zagrożone ani przez znieczulenie, ani przez stres wywołany ograniczeniami. Umieszczenie myszy w mobilnej klatce domowej jest szybkie i nie wymaga znieczulenia zwierzęcia nawet przejściowo. Po drugie, podniesiona powietrzem klatka domowa zapewnia stabilność mechaniczną, która jest potrzebna do ilościowego określenia zmian w morfologii neuronów i rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej pojedynczych komórek u obudzonych zwierząt. Wreszcie, konstrukcja mobilnej klatki domowej jest bardziej kompaktowa w porównaniu z bieżnią sferyczną, co pozwala na umieszczenie mobilnej klatki domowej pod standardowym mikroskopem pionowym w celu obrazowania dwufotonowego lub zapisu patch-clamp w mózgu obudzonej myszy.
Mocne zamocowanie głowy w mobilnej klatce domowej wymaga wszczepienia specjalnie zaprojektowanego czteroskrzydłowego metalowego uchwytu, z okrągłym otworem pośrodku umożliwiającym optyczny lub elektryczny dostęp do leżącego poniżej obszaru mózgu. Te metalowe uchwyty są przymocowane do czaszki za pomocą kombinacji kleju, cementu dentystycznego i małej wkręconej w kość czaszki. Ta procedura chirurgiczna została opracowana w oparciu o dużą liczbę wcześniej opublikowanych procedur i stwierdzono, że skutkuje stabilnym i powtarzalnym przygotowaniem okna czaszkowego. Do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo wykorzystano okno w kształcie księżyca34, kraniotomię o niewielkich rozmiarach (mniej niż 0,5 mm)32 oraz preparat pokryty szkłem35 . W tym przypadku "odwróconemu" okienku czaszki wszczepiono dużą (3,5 mm średnicy) lub małą (mniej niż 0,5 mm średnicy) kraniotomię. Minimalizacja ruchów mózgu ma kluczowe znaczenie dla stabilnych zapisów pojedynczych komórek, dlatego zaleca się wykonywanie kraniotomii o małych rozmiarach do eksperymentów elektrofizjologicznych. Po wszczepieniu okienka czaszkowego do eksperymentów z obrazowaniem optycznym, zwierzętom pozwala się na regenerację przez co najmniej 2 lub 3 tygodnie, podczas których okno najpierw przejściowo traci swoją przezroczystość, a następnie ją odzyskuje (z wydajnością 50-70%, w zależności od tła genetycznego szczepu myszy). Przezroczystość okienka czaszki i stabilność cementowej "czapeczki" z cementu dentystycznego przymocowanej do czaszki można sprawdzić za pomocą zwykłego mikroskopu dwuokularowego i kontroli fizycznej podczas pracy ze zwierzętami. Pod koniec 2-3 tygodniowego okresu rekonwalescencji zwierzęta, które wykazują jakiekolwiek oznaki resztkowego pooperacyjnego stanu zapalnego lub uszkodzeń mechanicznych cementu dentystycznego, powinny zostać wykluczone z doświadczeń i zakończone.
Optymalny wiek do rozpoczęcia treningu myszy to 2-4 miesiące (co odpowiada masie ciała 20-40 g). U młodszych zwierząt zakotwiczenie "czapeczki" z cementu dentystycznego do czaszki może być zawodne, co może zmniejszyć jej odporność na naprężenia mechaniczne powodowane przez poruszanie się myszy z głową w mobilnej klatce domowej. Chociaż samce i samice myszy wydają się równie chętne do poruszania się w mobilnej klatce domowej, istnieje tendencja do osiągania lepszego odsetka okien czaszkowych odzyskujących przezroczystość u samic myszy (dane nie pokazane). W związku z tym, aby zapewnić zrównoważoną mieszankę płci w kohorcie zwierząt wybranych do obrazowania, zaleca się wszczepienie okien czaszkowych około 30% więcej samców myszy. Wiadomo, że interakcje społeczne poprawiają samopoczucie zwierząt i zmniejszają stres, dlatego zaleca się, aby rodzeństwo z miotu było obsługiwane i szkolone równolegle i trzymane razem w klatkach grupowych.
W przeciwieństwie do procedur opublikowanych dla przygotowania bieżni sferycznej13, metoda wykorzystująca mobilną klatkę domową nie wymaga znieczulenia myszy w momencie unieruchomienia głowy. Różnica ta jest ważna, ponieważ pozwala wykluczyć jakiekolwiek szczątkowe skutki, jakie nawet krótki i "lekki" epizod znieczulenia może mieć na pomiary fizjologiczne uzyskane wkrótce potem. Rzeczywiście, nawet jeśli w badaniach, w których unieruchomienie głowy wykonano w znieczuleniu, a rzeczywiste eksperymenty rozpoczęto po krótkim okresie oczekiwania13, nie można wykluczyć możliwych długotrwałych skutków krótkiego epizodu znieczulenia na dane eksperymentalne. Inne badania opierały się na niedoborze wody w celu systematycznego przyzwyczajania zwierząt do fiksacji głowy i wykorzystywały nagrodę w postaci wody jako sposób motywowania zwierzęcia do pozostawania wbezruchu. Jednak metoda fiksacji głowy oparta na nagrodzie ogranicza wybór odpowiednich testów behawioralnych i, co ważne, zajmuje jedno z dobrze ugruntowanych skojarzeń bodziec – nagroda. W przeciwieństwie do tego, metoda przyzwyczajania myszy do fiksacji głowy w mobilnej klatce domowej nie wymaga pozbawienia wody i późniejszej nagrody.
Uzupełnienie mobilnej klatki domowej o system dostarczania wody jest zalecane w przypadku długotrwałych eksperymentów. Przedstawione tutaj sesje treningowe i eksperymenty ze zwierzętami zostały przeprowadzone w ciągu dnia (między 8 rano a 18 wieczorem), co odpowiada fizjologicznie pasywnemu okresowi dla tych myszy, które są trzymane zgodnie ze standardowym 12-godzinnym harmonogramem światła (światła włączają się o 6 rano i wyłączają o 18). Ponieważ spożycie wody jest bezpośrednio związane z aktywnością myszy, w okresie pasywnym myszy nie wymagają dostarczania wody, jeśli czas trwania sesji treningowej/obrazowania/nagrywania nie przekracza 2 godzin. Oprócz czasu i czasu trwania sesji treningowych, należy zająć się kwestią optymalnej liczby sesji wymaganych do przyzwyczajenia zwierząt do mobilnej klatki domowej. W tym celu zastosowano dwa kryteria oceny stresu wywołanego procedurami stabilizacji głowy: i) utrata masy ciała oraz ii) poziom aktywności lokomotorycznej. Jak pokazano na rysunku 6, utrata masy ciała osiąga średni poziom 6% w drugim dniu treningu i jest całkowicie odwrócona w dniu treningu 4 (rysunek 6A). Zgodnie z dynamiką ważenia, poziom aktywności lokomotorycznej zwierząt z unieruchomioną głową jest tłumiony w pierwszym dniu treningu, ale stabilizuje się w 4 dniu treningu (ryc. 6D). Na podstawie tych pomiarów sugerujemy, że minimalny czas trwania okresu szkolenia myszy w mobilnej klatce domowej wynosi 4 dni, zgodnie z opisem w niniejszym protokole.
Korzystanie z podnoszonej powietrzem, mobilnej klatki domowej z płaską podłogą pozwala na dodanie złożonych zadań (sensomotorycznych, percepcyjnych i poznawczych) do paradygmatów treningowych dla myszy z głową. W niniejszej pracy przedstawiono dwa protokoły testów behawioralnych. Oba protokoły wykorzystują sygnały zapachowe i mogą być łączone z obrazowaniem/zapisami podłużnymi w korze myszy. Chociaż mobilna klatka domowa jest wykonana z materiałów nienasiąkliwych, nadal należy wziąć pod uwagę możliwe zakłócenia między zapachem urządzenia a zapachem testowym. Innym czynnikiem, który może zakłócać wizualne/dotykowe wskazówki eksperymentu behawioralnego, jest połączenie między ścianą a wkładką, które nie jest bezszwowe i dlatego może być postrzegane przez zwierzę jako punkt orientacyjny. Warto w tym miejscu zauważyć, że w celu zminimalizowania stresu zwierzęcia podczas takich interwencji, jak umieszczanie bawełny wydzielającej zapach na ścianie mobilnej klatki domowej, eksperymentator powinien ćwiczyć wykonywanie takich interwencji tak szybko, jak to możliwe i unikać długotrwałego obchodzenia się z klatką węglową. Można sobie wyobrazić alternatywne strategie prezentacji nowego zapachu/obiektu, np. umieszczanie kropli roztworu hydrożelowego lub przedmiotów (takich jak chipsy spożywcze) na małych półkach przymocowanych do wewnętrznej powierzchni ściany klatki węglowej na wysokości zgodnej z ułożeniem głowy zwierzęcia.
Mobilna klatka domowa umożliwia zwierzętom z mocowaną głową wykonywanie szerokiego zakresu dwuwymiarowych ruchów, w tym lokomocji poziomej, przysiadów, pielęgnacji, ubijania, lizania, szturchania nosa, wykwalifikowanych ruchów przedniej łapy i dotykania ściany kończynami przednimi, jak pokazano w niniejszym badaniu. Korzystając z mobilnej klatki domowej i przedstawionych tutaj protokołów, naukowcy mogą badać sensomotoryczny układ neuronalny z wysokim poziomem kontroli zarówno nad warunkami stymulacji, jak i odczytami behawioralnymi. Co więcej, badania zdolności poznawczych u obudzonych myszy mogą być przeprowadzane podczas zadań związanych z kondycjonowaniem, nawigacją przestrzenną i podejmowaniem decyzji.
Istnieje kilka praktycznych ograniczeń tej metody. Po pierwsze, potrzebna jest znaczna ilość sprężonego powietrza, aby osiągnąć siłę podnoszenia klatki domowej i przeprowadzić długotrwałe eksperymenty. Po drugie, mobilna klatka domowa w swojej obecnej realizacji ma zaledwie 18 cm średnicy, a zatem zapewnia stosunkowo małą i prostą przestrzeń w porównaniu z wirtualną rzeczywistością, gdzie można zaprojektować złożone środowisko eksperymentalne bez żadnych ograniczeń przestrzennych. Po trzecie, podczas prezentowanych tu eksperymentów ze stymulacją wąsów i nagrodą wykorzystano urządzenie, które ogranicza możliwość kontaktu myszy ze ścianą. Dodanie zewnętrznego kanału stymulacji wzrokowej lub sensorycznej (takiego jak projektor światła skierowanego do oka) wymagałoby zaprojektowania bardziej ergonomicznego i kompaktowego urządzenia w porównaniu z rozwiązaniami wieloekranowymi lub kopułkowymi, które zostały wykorzystane w eksperymentach z bieżnią sferyczną.
Podsumowując, wykorzystanie myszy z głową poruszających się w mobilnej klatce domowej podnoszonej powietrzem znacznie ułatwia badania, które łączą komórkowe, molekularne i behawioralne poziomy obserwacji i manipulacji w jednym eksperymencie. Konkretne zastosowania zilustrowane tutaj obejmują obrazowanie mikroskopowe dwufotonowe, wewnętrzne obrazowanie sygnału optycznego i zapisy patch-clamp u nieznieczulonych myszy zachowujących się. Oczekuje się, że takie podejście otworzy nowe horyzonty w eksperymentach na obudzonych, zachowujących się myszach i posłuży jako użyteczne narzędzie zarówno do opracowywania leków, jak i podstawowych badań nad funkcjonowaniem mózgu.

Ekscytującym trendem w neuronaukach jest rozwijanie eksperymentalnych podejść do molekularnego i komórkowego badania sieci neuronalnych w mózgu rozbudzonych, zachowujących się gryzoni. Takie podejścia mogą rzucić nowe światło na procesy neurofizjologiczne, które leżą u podstaw funkcji motorycznych, integracji sensomotorycznej, percepcji, uczenia się, pamięci, a także progresji urazów, neurodegeneracji i chorób genetycznych. Co więcej, zapis z mózgu obudzonego zwierzęcia daje nadzieję na opracowanie nowych środków terapeutycznych i metod leczenia.
Rośnie świadomość, że znieczulenie, które było powszechnie stosowane w eksperymentach neurofizjologicznych, może wpływać na podstawowe mechanizmy funkcjonowania mózgu, potencjalnie prowadząc do błędnej interpretacji wyników eksperymentów. W ten sposób szeroko stosowana znieczulająca ketamina szybko zwiększa tworzenie nowych kolców dendrytycznych i poprawia funkcję synaptyczną1; Inny powszechnie stosowany środek znieczulający, izofluran w znieczuleniu chirurgicznym, całkowicie hamuje spontaniczną aktywność kory mózgowej u nowonarodzonych szczurów i blokuje oscylacje wrzeciona u dorosłych zwierząt2. Obecnie tylko ograniczona liczba podejść umożliwia eksperymenty na nieznieczulonych myszach za pomocą obrazowania mikroskopowego dwufotonowego lub zapisów patch-clamp. Podejścia te można podzielić na preparaty swobodnie poruszające się i przytwierdzane do głowy.
Wyjątkowa atrakcyjność preparatu dla swobodnie poruszających się zwierząt polega na tym, że pozwala na ocenę naturalnego zachowania, w tym ruchów całego ciała podczas nawigacji. Jednym ze sposobów na zobrazowanie wnętrza mózgu swobodnie poruszającego się gryzonia jest przymocowanie zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie lub fiberoskopu3-5. Jednak zminiaturyzowane urządzenia mają zwykle ograniczoną wydajność optyczną w porównaniu z obiektywną mikroskopią dwufotonową i nie można ich łatwo połączyć z zapisami z użyciem krosówek całych komórek6.
Istniejące rozwiązania do naprawiania głowy obudzonego gryzonia polegały głównie na fizycznym ograniczeniu7,8 lub na szkoleniu zwierzęcia do dobrowolnego krępowania głowy9. Innym popularnym podejściem jest umożliwienie zwierzęciu poruszania się kończynami poprzez umieszczenie go np. na bieżni sferycznej10; Takie podejście jest często łączone z komputerowo generowaną rzeczywistością wirtualną. Eksperymenty elektrofizjologiczne na myszach z głową wykorzystywały głównie zapisy zewnątrzkomórkowe i były wykorzystywane do badania centralnej regulacji funkcji układukrążenia11, wpływu znieczulenia na aktywność neuronalną12, odpowiedzi słuchowej w pniu mózgu13 i przetwarzania informacji14. Pionierskie zapisy wewnątrzkomórkowe/całokomórkowe u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania przeprowadzono w 2000 roku i koncentrowały się na aktywności neuronalnej związanej z percepcją i ruchem15-20. Mniej więcej w tym samym czasie opublikowano pierwsze mikroskopowe badania obrazowe na obudzonych myszach, w których mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w korze czuciowej fizycznie skrępowanych szczurów7 i na myszach biegających na sferycznej bieżni21.
Późniejsze badania mikroskopowe i elektrofizjologiczne in vivo wykazały, że preparat do unieruchomienia głowy można z powodzeniem połączyć z paradygmatami behawioralnymi opartymi na ruchach kończyn przednich, rozpoznawaniu zapachów, ubijaniu i lizaniu8,22-25. Myszy umieszczone na bieżni sferycznej można wyszkolić w poruszaniu się po wirtualnym środowisku wizualnym generowanym przez komputer10,26. Zapisy wewnątrzkomórkowe/zewnątrzkomórkowe wykazały, że u zwierzęcia poruszającego się po takim wirtualnym środowisku z głową można wykryć aktywację komórek miejsca hipokampa27. W wirtualnym środowisku wizualnym myszy wykazują normalny rytm theta związany z ruchem w lokalnym potencjale pola i precesję fazy theta podczas aktywnego ruchu27. Ostatnio wzorce aktywności przestrzennej i czasowej populacji neuronów zostały zarejestrowane optycznie u myszy podczas zadań decyzyjnych pamięci roboczej w środowisku wirtualnym28.
Pomimo umożliwienia przełomowych badań, projekt bieżni sferycznej ma kilka nieodłącznych ograniczeń. Po pierwsze, zwierzę musi poruszać się po nieograniczonej powierzchni obracającej się piłki unoszącej się powietrzem, która nie stwarza żadnych namacalnych przeszkód, takich jak ściany czy bariery. To ograniczenie jest tylko częściowo kompensowane przez generowaną komputerowo "rzeczywistość wirtualną", ponieważ bodźce wizualne są prawdopodobnie mniej skuteczne w przypadku myszy i szczurów w porównaniu z dotykowymi bodźcami sensorycznymi (np. dotykiem wąsów lub lizawką), na których gatunki te naturalnie polegają. Po drugie, znaczna krzywizna powierzchni piłki może być niewygodna dla myszy laboratoryjnych przyzwyczajonych do chodzenia po płaskiej podłodze w swoich klatkach. Wreszcie, sama średnica piłki (co najmniej 200 mm dla myszy i 300 mm dla szczurów) sprawia, że pionowy rozmiar kulistego urządzenia bieżni jest stosunkowo duży. Utrudnia to połączenie bieżni sferycznej z większością dostępnych na rynku zestawów mikroskopowych i często wymaga zbudowania nowej konfiguracji wokół bieżni za pomocą specjalnie wykonanych ram mikroskopowych.
Tutaj opisana jest nowatorska metoda, w której mysz z głową może poruszać się po mobilnej klatce z płaską podłogą i namacalnymi ścianami, a także badać środowisko fizyczne w warunkach bezstresowych. W tym artykule przedstawiono procedury treningu myszy i fiksacji głowy oraz przedstawiono reprezentatywne przykłady, w których mikroskopia dwufotonowa, wewnętrzne obrazowanie optyczne i zapisy patch-clamp są wykonywane w mózgu myszy zachowujących się w stanie czuwania.

<table><tbody><tr><td>Pęseta, stal nierdzewna, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Trymer do zwierząt, maszynka do golenia</td><td>Aesculap Isis</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lornetkowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Biologiczny regulator temperatury z poduszką grzewczą ze stali nierdzewnej</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>ostrze mikrochirurgiczne</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Rurka borokrzemianowa z żarnikiem</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Do produkcji pipet punktowych</td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Widoczność w nocy</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon weterynarz</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła jednorazowe</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Smar do oczu</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Do ochrony oczu podczas pracy i jako roztwór wiskozy do zanurzenia&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterowanie wiertłem Foredom</td><td>&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść z mikrosilnikiem</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Czteroskrzydłowy metalowy uchwyt</td> Uchwyt na głowę <td>neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dla myszy</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Zmontowany na instrumencie stereotaktycznym</td></tr><tr><td>Gąbka kolagenowa do hemostazy</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol weterynarz</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do mikroobciągania, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikroelektrod</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Ściągacz pionowy do produkcji pipet szklanych</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Śruba mini</td><td>Centrostyle</td><td>Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobilny klatka domowa</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Waciki włókninowe, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampony chirurgiczne</td></tr><tr><td>Klej poliakrylowy</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td></td><td>1.5 grubość</td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki studenckie do irysów, proste 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun weterynarz</td><td></td></tr></tbody></table>

płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Powszechnie uznaje się, że stosowanie środków znieczulających może podważyć znaczenie danych elektrofizjologicznych lub mikroskopowych uzyskanych z mózgu żywego zwierzęcia. Co więcej, długa rekonwalescencja po znieczuleniu ogranicza częstotliwość powtarzających się epizodów rejestracji/obrazowania w badaniach podłużnych. W związku z tym oczekuje się, że nowe metody, które pozwoliłyby na stabilne zapisy od nieznieczulonych myszy zachowujących się, przyczynią się do postępu w dziedzinie neuronauk komórkowych i poznawczych. Istniejące rozwiązania obejmują zarówno zwykłe fizyczne ograniczenia, jak i bardziej wyrafinowane podejścia, takie jak bieżnie liniowe i sferyczne używane w połączeniu z komputerowo generowaną rzeczywistością wirtualną. W tym miejscu opisano nowatorską metodę, w której mysz z głową może poruszać się po podniesionej powietrzem mobilnej klatce domowej i badać jej otoczenie w bezstresowych warunkach. Metoda ta pozwala naukowcom na przeprowadzanie testów behawioralnych (np. uczenia się, habituacji lub rozpoznawania nowych obiektów) jednocześnie z obrazowaniem mikroskopowym dwufotonowym i/lub zapisami patch-clamp, a wszystko to połączone w jednym eksperymencie. Ten artykuł wideo opisuje zastosowanie urządzenia do fiksacji głowy wybudzonego zwierzęcia (mobilna klatka domowa), demonstruje procedury przyzwyczajania zwierząt i ilustruje szereg możliwych zastosowań tej metody.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest przeznaczona do obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych pomiarów elektrofizjologicznych u myszy budzących się, z unieruchomioną głową, lecz w pozostałym zakresie swobodnie poruszających się i wykazujących naturalne zachowania. Zwierzę może poruszać się w dwóch wymiarach w rzeczywistym (w przeciwieństwie do wirtualnego), namacalnym i znanym mu środowisku, podczas gdy czaszka zwierzęcia jest mocno przymocowana do ramienia stabilizującego głowę. Przyzwyczajanie myszy do podwieszonej w powietrzu mobilnej klatki domowej polega na 4-6 dniach treningu, obejmującego dwie 2-godzinne sesje dziennie (Rycina 1). Przeszkolone zwierzęta mogą być następnie niezwłocznie wykorzystane w eksperymentach. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji rejestracji metodą patch-clamp, które są oddzielone odstępami czasu wynoszącymi od kilku godzin do kilku dni lub tygodni. Co ważne, zarówno rejestracje optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być przeprowadzane jednocześnie ze stymulacją poznawczą lub behawioralną oraz odczytami odpowiedzi w ramach jednego eksperymentu.
Aby ocenić stabilność mechaniczną fiksacji głowy myszy w mobilnej klatce domowej, zebrano sekwencje obrazów naczyń korowych znakowanych dekstranem sprzężonym z fluorescencją oraz dendrytów korowych wykazujących ekspresję YFP podczas poruszania się zwierząt doświadczalnych w mobilnej klatce domowej (Rysunek 2). Maksymalne przesunięcia mózgu podczas lokomocji zwierząt zazwyczaj nie przekraczały 1-1,5 µm. Przesunięcia te występowały w kierunkach poziomych i bardzo rzadko prowadziły do wykrywalnego przesunięcia płaszczyzny obrazowania, co czyniło zbędną jakąkolwiek korekcję artefaktów ruchowych. Stabilna fiksacja głowy w mobilnej klatce domowej umożliwia kwantyfikację poszczególnych kolców dendrytycznych u zwierząt w stanie czuwania z taką samą niezawodnością, jak u myszy zanarkizowanych. Gęstość, morfologia i wymiana kolców dendrytycznych mogą być monitorowane w badaniach podłużnych z wielokrotnymi sesjami obrazowania przeprowadzanymi w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni.
Użyteczność mobilnej klatki domowej do funkcjonalnego obrazowania optycznego przetestowano w korze somatosensorycznej czuwających myszy, stosując dwa podejścia: i) mikroskopię dwufotonową u myszy transgenicznych Thy1-GCaMP3 oraz ii) obrazowanie wewnętrznych sygnałów optycznych u myszy typu dzikiego. Obrazowanie Ca2+ przeprowadzono w warstwie 2/3, która zawiera ciała wielu fluorescencyjnie znakowanych neuronów, a także ich dendryty i aksony (Rysunek 3). Wykresy fluorescencji w czasie z wybranych obszarów zainteresowania (ROI) przedstawiono na Rysunku 3, co demonstruje spontaniczną aktywność neuronalną (mierzoną jako przejściowe wzrosty fluorescencji GCaMP3) podczas aktywnej nawigacji myszy w mobilnej klatce domowej. Obrazowanie optyczne oparte na sygnałach wewnętrznych pozwala na mapowanie przestrzennego rozkładu domen funkcjonalnych. Rysunek 4 ilustruje falowe zmiany poziomu natlenowania krwi (odzwierciedlające regionalną aktywację neuronów), które rozprzestrzeniały się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibrissami z częstotliwością 0,05 Hz.
Aby przetestować wykonalność rejestracji metodą patch-clamp z wykorzystaniem mobilnej klatki domowej, użyto myszy C57Bl/6J w wieku 2-3 miesięcy. Rejestrację neuronów warstwy 2/3 w korze somatosensorycznej przeprowadzono w konfiguracji whole-cell w trybie current clamp. Rejestracja patch-clamp w mózgu budzących się myszy z utrwaloną głową w mobilnej klatce domowej była w zasadzie analogiczna do ślepego patch-clampingu w skrawkach mózgu. Około 50% prób zakończyło się pomyślnym utworzeniem gigaseala, z czego ponad 70% pozwoliło na stabilną rejestrację w konfiguracji whole-cell. Nie zaobserwowano przypadków utraty kontaktu gigaseala w wyniku mechanicznego przemieszczenia komórek. Rysunek 5 przedstawia 60-sekundowy fragment reprezentatywnej, 10-minutowej rejestracji current-clamp skorelowanej z epizodami aktywnych (bieganie) i pasywnych (odpoczynek) stanów myszy.
<img alt="Układ do analizy zachowania myszy; schemat mobilnej klatki domowej i wykres osi czasu eksperymentu." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Metoda fiksacji głowy u budzących się myszy w mobilnej klatce domowej. A) Przegląd konstrukcji mobilnej klatki domowej z systemem podnoszenia pneumatycznego oraz ilustracje ogólnej koncepcji. B) Schemat typowego harmonogramu eksperymentu. Badanie rozpoczyna się od implantacji okna czaszkowego na dwa tygodnie przed przyzwyczajeniem myszy do manipulacji i owijania, po czym następują osiem sesji treningowych odbywających się dwa razy dziennie. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji rejestracji patch-clamp, rozmieszczonych w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni. Zarówno pomiary optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być przeprowadzane równolegle ze stymulacją poznawczą lub behawioralną i odczytami wyników w ramach jednego eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie optyczne: schemat analizy przepływu krwi w korze; dane o prędkości, struktura mikrokrążenia." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przykład obrazowania mikroskopowego dwufotonowego u czuwających myszy poruszających się w mobilnej klatce domowej. A,B) Naczynia korowe, znakowane dekstranem 70 kDa sprzężonym z Texas Red. Średnicę poszczególnych segmentów naczyń mierzy się poprzez wykreślanie w czasie profilu linii prowadzonych w poprzek światła naczynia w okresach spoczynku i biegu myszy (A). Szybkość przepływu krwi w tętnicach i żyłach mierzy się za pomocą skanowania liniowego wzdłuż linii prowadzonych równolegle do ściany naczynia (B). C,D) Szczegóły morfologii neuronów zwizualizowane w mózgu myszy transgenicznych wykazujących ekspresję YFP w subpopulacji neuronów pod promotorem Thy1. Rekonstrukcja trójwymiarowa neuronów piramidowych w korze somatosensorycznej myszy (C). Obrazy gałęzi dendrytycznej uzyskane u czuwającej, aktywnej myszy są wystarczająco stabilne do kwantyfikacji morfologii poszczególnych kolców dendrytycznych (D). E) Kwantyfikacja ruchów mózgu spowodowanych ruchami myszy. Przesunięcia o większej amplitudzie korelują z okresami biegu myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Skoki poziomu wapnia w mózgu myszy Thy1-GCaMP3; mikroskopia fluorescencyjna i wykresy sygnałów." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykład aktywności populacji neuronalnej w budzącej się myszy Thy1-GCaMP3 poruszającej się w mobilnej klatce domowej. A) Obraz dwufotonowy neuronów warstwy II/III kory mózgowej. ROI, np. ciała komórek neuronalnych, dendryty i aksony, zaznaczono na żółto. B) Ślady ΔF/F fluorescencji GCaMP3 z ROI pokazanych na A (serie czasowe rejestrowane z częstotliwością 1,5 s/klatkę). C) Powiększony obszar obrazowany z częstotliwością 65 ms/klatkę. D) Fluorescencja z żółtych ROI na C wykreślona w funkcji czasu, wykazująca przejściowe wzrosty (kolor czerwony) fluorescencji GCaMP3, które odpowiadają epizodom napływu Ca2+ indukowanego potencjałami czynnościowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie naczyniowej mikrokrażki, mapy ciepła przepływu krwi; wyniki kodowane kolorami; badania kliniczne." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykład mapowania przestrzennego rozkładu odpowiedzi funkcjonalnych w korze mózgowej budzonej myszy za pomocą obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych. A) Widok w polu jasnym powierzchownych naczyń krwionośnych przez okno czaszkowe. B) Mapa amplitudy aktywności bazowej w klatce domowej podczas 6-minutowego epizodu. C) Mapa amplitudy aktywności neuronalnej rozprzestrzeniającej się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibrys o częstotliwości 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wzorce wyładowań neuronów; eksperyment elektrofizjologiczny; wykres napięcie-czas; analiza potencjału błonowego." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Przykład rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell w korze mózgowej czuwającej myszy poruszającej się w mobilnej klatce domowej. A) Rejestracja w trybie current-clamp z neuronu w warstwie 2/3 kory mysiej. Wstrzyknięcie prądu o natężeniu 100 pA przez 0,5 s (oznaczone pod śladem) powoduje wystąpienie serii potencjałów czynnościowych. Komórka wykazała adaptację częstotliwości impulsów charakterystyczną dla neuronów piramidalnych. B) Ciągła rejestracja w trybie current-clamp z tego samego neuronu skorelowana z aktywnością lokomocyjną myszy (pokazana na różowo nad śladem). Reprezentatywna aktywność spontaniczna neuronu warstwy 2/3 podczas okresów spoczynku myszy (C) i biegu (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy efektu treningu; zmiany masy ciała, ścieżki ruchu, czasy sesji; porównanie myszy z unieruchomioną głową." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Ubytek masy ciała i aktywność lokomotoryczna myszy z unieruchomioną i nieunieruchomioną głową podczas sesji treningowych w mobilnej klatce domowej. A) Masa ciała zwierząt (średnia+SD,%) przed sesjami treningowymi. Należy zauważyć, że utrata masy ciała jest całkowicie odwrócona do 7-8th sesji treningowej. B) Trajektoria poziomego poruszania się myszy względem mobilnej klatki domowej, wyekstrapolowana z monitorowanego ruchu mobilnej klatki domowej podczas 8th sesji treningowej. C) Monitorowane ruchy myszy z nieunieruchomioną głową eksplorującej okrągłą klatkę podczas 8th sesji treningowej. D) Czas trwania ruchu myszy z unieruchomioną głową (koło) i nieunieruchomioną głową (trójkąt) podczas 1-4th dnia treningu (średnia+SD,%). Należy zauważyć, że w dniu 4. myszy z unieruchomioną głową nie wykazują ani zamierania (jak w dniu 1.), ani nadmiernej aktywności lokomotorycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Cześć, nazywam się Hel Lin, jestem studentką studiów podyplomowych w Near Science Center na Uniwersytecie Helsińskim. Dzisiaj ja i moi koledzy pokażemy Wam, jak wykonywać nagrania optyczne i elektrofizjologiczne u przytomnych zwierząt, ale poza tym swobodnie poruszających się i zachowujących się. Nasza metoda tworzy namacalne, znajome środowisko, w którym mysz może nawigować i eksplorować.Podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia, wszczepiamy przewlekłe okno czaszkowe i przyzwyczajamy mysz do podmuchiwanej drogą powietrzną klatki mobilnego domu, która przesuwa się pod stopami zwierzęcia. Podczas poruszania się po płaskiej powierzchni, klatka domku mobilnego może być umieszczona pod standardowym mikroskopem pionowym w celu obrazowania dwóch fotonów lub umieszczona w zestawie elektrofizjologicznym do rejestracji za pomocą zacisku krosowego w mózgu myszy wybudzającej. Wszystkie przedstawione tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.Wszczepiamy okna czaszkowe zgodnie z opublikowanymi protokołami z niewielkimi modyfikacjami po implantacji okienka czaszkowego. W tym okresie rekonwalescencji zwierzę może dojść do siebie przez co najmniej dwa lub trzy tygodnie, przy czym okno zwykle odzyskuje swoją przezroczystość. Zwierzęta z jakimikolwiek objawami resztkowego pooperacyjnego stanu zapalnego są wykluczane z doświadczeń.Trenuj zwierzęta wybrane do badania, aby przyzwyczaić je do fiksacji głowy. W klatce domku mobilnego obchodź się z myszą spokojnie przez pięć do 10 minut, unikając gwałtownych ruchów i dźwięków, a następnie włóż ją z powrotem do klatki domowej. Powtórz procedurę dwa lub trzy razy w nierównych odstępach czasu.Klatka w przyczepie kempingowej umożliwia mocowanie głowy bez znieczulania zwierzęcia przed mocowaniem głowy. Użyj szmatki, aby owinąć mysz dwa lub trzy razy w nierównych odstępach. Upewnij się, że zwierzę pozostaje spokojne, gdy jest owinięte.W przeciwnym razie powtarzaj procedurę, aż mysz w pełni się do niej przyzwyczai. Rozpocznij trening myszy dwa razy dziennie w klatce w przyczepie kempingowej następnego dnia po zakończeniu obsługi. Zważ zwierzęta przed każdą sesją treningową.Zwierzęta wykazujące ubytek masy ciała powyżej 10% powinny zostać wykluczone z badania. Dostosuj pozycję ramienia mocującego głowę, aby dopasować je do wielkości wyszkolonego zwierzęcia. Podłącz wlot powietrza do klatki w domu mobilnym do standardowego wylotu powietrza pod ciśnieniem laboratoryjnym.Upewnij się, że ciśnienie powietrza jest wystarczające do swobodnego unoszenia się w domowej klatce transportowanej drogą powietrzną. Rozpocznij szkolenie przyzwyczajonych zwierząt w klatce w przyczepie kempingowej. Unieruchom mysz, owijając ją.Włóż metalowy uchwyt przymocowany do głowy zwierzęcia do ramienia mocującego głowę i mocno go zamocuj, dokręcając. Włącz przepływ powietrza, aby podniesiona drogą powietrzną klatka domowa lewitowała. Usuń szmatkę i pozwól myszy zbadać klatkę domową.Podczas pierwszej sesji treningowej myszy mogą wykazywać zamarzanie i drżenie oraz erekcję ogona. Aby przyzwyczaić zwierzę do hałasu, należy zapewnić mu stałą ekspozycję na dźwięki otoczenia, na przykład za pomocą tłumaczenia radiowego lub nagranej muzyki i mowy podczas wszystkich sesji treningowych, a także podczas eksperymentów. Aby uniknąć przewlekłego stresu, używaj jasnego oświetlenia świetlnego podczas pierwszej godziny sesji treningowej.Po pierwszej godzinie przeprowadź trening w ciemności i użyj kamery bliskiej podczerwieni do monitorowania zachowania zwierzęcia. Po zakończeniu sesji treningowej uwolnij zwierzę z ramienia mocującego głowę, gubiąc. Zwróć zwierzę z powrotem do klatki domowej na co najmniej dwie godziny przed następną sesją treningową.Trzymanie myszy w klatce z dwiema lub więcej innymi myszami zmniejszy poziom stresu. Opcjonalnie możesz umieścić klatkę transportowaną drogą powietrzną razem ze zwierzęciem w jego klatce domowej. Wzbogaci to środowisko i może wzmocnić przyzwyczajenie zwierzęcia do klatki w przyczepie kempingowej.Podczas ostatniej sesji treningowej myszy są przyzwyczajone do fiksacji głowy i powinny wykazywać bezstresowe zachowanie, spokojnie poruszając się po przewiezionej drogą powietrzną klatce domowej. W przypadku braku światła widzialnego, trajektorię lokomocji myszy można śledzić, monitorując ruchy klatki za pomocą kamery bliskiej podczerwieni lub optycznej myszy komputerowej. Podczas dłuższych sesji treningowych, które trwają dłużej niż jedną lub dwie godziny, rozważ podanie myszy wody pitnej, ręcznie lub za pomocą uchwytu na pipety przymocowanego do ramy klatki mobilnego domu.Poniższy diagram podsumowuje oś czasu typowego badania eksperymentalnego. Badanie rozpoczyna się od implantacji okna czaszkowego na dwa tygodnie przed kontaktem z myszą i jest kontynuowane ośmioma sesjami treningowymi dwa razy dziennie. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji nagrywania z użyciem zacisku krosowego, które są rozmieszczone w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni.Zarówno eksperymenty optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być wykonywane równolegle z bodźcami i odczytami poznawczymi lub behawioralnymi. Mikroskopia dwufotonowa to unikalna nieliniowa technologia optyczna, która umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym struktur komórkowych, a nawet subkomórkowych w głębokich warstwach korowych mózgu gryzoni. Aby przeprowadzić eksperyment obrazowania pod mikroskopem dwufotonowym, umieść wyszkolone zwierzę w klatce domku mobilnego, wyreguluj korki, aby chronić optykę mikroskopu przed przypadkowym uszkodzeniem.Wyczyść szybę nakrywkową okna czaszki, aby usunąć cząsteczki kurzu. Upuść płyn zanurzeniowy na szkło nakrywkowe. Zalecamy stosowanie roztworu viscus, ponieważ woda szybko odparowuje.Platformę można umieścić na typowym zmotoryzowanym stole optycznym za pomocą trybu szerokiego pola mikroskopu fluorescencyjnego i długoprzepustowego filtra emisyjnego. Oceń unaczynienie mózgu i wybierz obszar zainteresowania. Aby zobrazować naczynia korowe, wstrzyknij do żyły ogonowej unieruchomionego i unieruchomionego zwierzęcia o wadze 70 kilogramów, Daltona, Teksasu z czerwonym sprzężonym tekstem Tran.Ta sekwencja obrazów pokazuje poklatkowe nagranie miejsc i tętnic w korze mózgowej zachowującej się myszy podczas poruszania się po klatce domu mobilnego. Wykreślając profil linii poprowadzonych w poprzek światła naczynia, można zmierzyć zmiany średnicy naczynia i ruchliwości poszczególnych segmentów naczynia. Szybkość przepływu krwi w tętnicach i żyłach można zmierzyć za pomocą skanowania linii wzdłuż linii narysowanych równolegle do ściany naczynia. Grzywna.Szczegóły morfologii neuronów można uwidocznić u myszy transgenicznych, które wyrażają YFP w subpopulacji neuronów pod promotorem tajwańskim. Te dwa Zacks porównują stabilność obrazowania między zwierzętami znieczulonymi i wybudzonymi. Na prawym panelu bocznym znajdują się dendryty pochodzące od zwierzęcia znieczulonego mieszaniną ketaminy i ksylazyny.Podczas gdy lewy panel boczny pokazuje obraz dendrytów w obudzonym zwierzęciu chodzącym po klatce przyczepy kempingowej. Indywidualna morfologia kręgosłupa u obudzonych zwierząt może być analizowana z taką samą wiarygodnością i precyzją, jak u znieczulonych myszy. Przemieszczenie mózgu podczas biegu zwierząt zwykle nie przekracza jednego do półtora mikrometra.Ruchy te zachodzą w kierunkach poziomych i bardzo rzadko powodują przesunięcie płaszczyzny obrazowania, co sprawia, że korekcja artefaktów ruchu nie jest konieczna. W większości przypadków zdolność do chronicznego monitorowania aktywności neuronalnej w obudzonym żywym mózgu jest niezbędna do zrozumienia organizacji i funkcji układu nerwowego. Używając metody "tie one G Camp" dla trzech transgenicznych myszy, obrazujemy spontaniczną aktywność neuronalną u obudzonych myszy zachowujących się w klatce mobilnego domu.Ta sekwencja zdjęć poklatkowych pokazuje reprezentatywne przykłady skoków wapnia w ciałach komórek nerwowych, nitach i aksonach. Obrazowanie optyczne oparte na sygnałach wewnętrznych umożliwia mapowanie rozkładu przestrzennego domen funkcjonalnych w celu przeprowadzenia eksperymentu z wewnętrznym obrazowaniem optycznym. Umieść wyszkolone zwierzę w klatce domowej umieszczonej pod obiektywem aparatu.Oczyść szkło nakrywkowe z kurzu. Umieść kroplę glicerolu i przykryj ją pięciomilimetrowym okrągłym szkiełkiem nakrywkowym. Dostosuj pozycję kamery o dużej szybkości.Umieść manipulator z rurką nadmuchu powietrza naprzeciwko wibracji kontralateralnej. Użyj zielonych świateł, aby zobrazować mapę statku. Skoncentruj się głębiej w korze mózgowej, około 400 mikrometrów poniżej naczyń korowych.Umieść filtr pasmowo-przepustowy przed kamerą i oświetl korę czerwonym światłem. Pozwól myszy przyzwyczaić się do platformy przez co najmniej 30 minut. Rejestruj podstawową aktywność podczas sześciominutowego epizodu.Stymuluj wibracje co 10 sekund za pomocą zaciągnięć powietrza przez łączny okres sześciu minut. Obraz ten ilustruje aktywność neuronalną rozchodzącą się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibracyjną z częstotliwością 0,05 herca. Aby wykonać zapisy elektrofizjologiczne pojedynczej komórki, należy umieścić wyszkolone zwierzę, któremu wszczepiono odwrócone okno czaszki, w klatce domku mobilnego.Powoli i ostrożnie wyjmij szklankę nakrywkową z metalowego uchwytu. Odśwież bufor korowy i oczyść okno czaszki z zanieczyszczeń za pomocą tamponu hemostatycznego. Umieść elektrodę masową w buforze korowym.Napełnij pipetę z zaciskiem krosowym roztworem wewnątrzkomórkowym. Zastosuj nadciśnienie do pipety rejestrującej za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora, pogłęb pipetę w korze mózgowej i uzyskaj giga uszczelnienie kontaktu z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Po nagraniu wyjmij pipetę, odśwież bufor korowy i zamknij okienko czaszki za pomocą przyklejenia szkła nakrywkowego do metalowego uchwytu.Zastosowanie podmuchiwanej drogą powietrzną klatki domowej pozwala połączyć obrazowanie i elektrofizjologię z klasycznymi paradygmatami behawioralnymi, takimi jak uczenie się, rehabilitacja lub zachowania związane z lękiem. Węch jest ważnym bodźcem sensorycznym dla myszy i może być wykorzystywany do stymulacji w testach pamięciowych oraz do oceny reakcji na nowość. Aby przeprowadzić test węchowy przyzwyczajenia, umieść wyszkolone zwierzę w klatce w przyczepie domowej i pozwól mu na adopcję.Na 30 minut przymocuj czysty kawałek bawełny nasączony wodą z kranu do wewnętrznej ściany klatki domku mobilnego za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Po pięciu minutach wymień czystą bawełnę na ścianie domowej klatki na nową nasączoną płynem o zapachu wanilii. Powtórz pięciominutową ekspozycję na zapach wanilii trzy razy w pięciominutowych odstępach między sesjami.Aby zmierzyć poziom zainteresowania zapachem. Policz łączny czas, w którym zwierzę spędza zwrócone twarzą do strefy docelowej i całkowity czas poruszania się klatki w przyczepie kempingowej. Podczas ostatniej, piątej sesji, zaprezentuj społecznie znaczący zapach.Zwilż nowy bawełniany aplikator kilkoma kroplami moczu myszy płci przeciwnej. Aby ocenić reakcję na nowość, podziel klatkę domu mobilnego na cztery strefy. Przymocuj dwa kawałki bawełny naprzeciwko siebie. Kolor.Zakoduj je za pomocą znaczników po zewnętrznej stronie ścian klatki domowej podczas pierwszej próby. Umieść dwa czyste kawałki bawełny. Następnie zastąp je bawełną nasączoną 1% ekstraktem waniliowym.Podczas trzeciej próby umieść bawełnę waniliową w strefie numer jeden, a kawałek bawełny nasączony 1% ekstraktem z banana w strefie . Po drugie, aby zmierzyć preferencję dla braku zapachu. Oblicz czas, jaki zwierzęta spędzają twarzą w twarz z brakiem zapachu, jako procent skumulowanego czasu spędzonego w obliczu innych stref.Cześć, nazywam się Leo Kiro i jestem głównym badaczem w Centrum Neuronauki Uniwersytetu w Helsinkach. Mam nadzieję, że podobał Ci się ten film i uznałeś go za przydatny. Przez ostatnie pięć lat pracowaliśmy z dwójką nad mikroskopią in vivo, a stosowanie ogólnych i estetycznych zawsze było wielkim problemem, ponieważ estetyka ingeruje w funkcjonowanie mózgu, przepływ krwi i wszystko.A dziś cieszę się, że możemy pracować na wybudzonych zwierzętach i wykonywać stabilne eksperymenty obrazowania mikroskopowego oraz walidować i weryfikować wyniki, które wcześniej uzyskaliśmy u znieczulonych zwierząt. Jestem pewien, że zastosowanie klatki do domu mobilnego i metody, które dziś zaprezentowaliśmy, zwiększą znaczenie badań in vivo w ogóle i doprowadzą do nowych i przełomowych wyników, i nie mogę się doczekać.

flat-floored-air-lifted-platform-new-method-for-combining-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Instrukcje dotyczące taniego konstruowania i chirurgicznego wszczepiania myszom przewlekłego przezczaszkowego montażu elektroencefalograficznego o dużej gęstości są dostarczone. Opisano również techniki nagrywania, ekstrakcji i przetwarzania sygnału.

Akwizycja elektroencefalograficzna o dużej gęstości w modelu gryzoni przy użyciu tanich zasobów typu open source

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

To badanie wprowadza metodę jednoczesnego rejestrowania lokalnych potencjałów pola w mózgu, elektrokardiogramów, elektromiogramów i sygnałów oddechowych swobodnie poruszającego się szczura. Technika ta, która obniża koszty eksperymentów i upraszcza analizę danych, przyczyni się do zrozumienia interakcji między mózgiem a narządami obwodowymi.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego, elektrokardiogram, elektromiogram i rytm oddychania swobodnie poruszającego się szczura

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Opracowaliśmy pojedynczą platformę do śledzenia zachowań zwierząt podczas dwóch zadań związanych z nauką asocjacyjną zależnych od włókien wspinaczkowych. Niedroga konstrukcja umożliwia integrację z eksperymentami optogenetycznymi lub obrazowymi ukierunkowanymi na aktywność móżdżku związaną ze wspinaniem się włókien.

Elastyczna platforma do monitorowania sensorycznego uczenia się asocjacyjnego zależnego od móżdżku

Szczegółowo opisana jest nowa procedura funkcjonalnego obrazowania u szczurów obudzonych z głową.

Implanty głowy do neuroobrazowania u przytomnych, nieruchomych szczurów

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Poznaj metodę nagrywania optycznego i elektrofizjologicznego u przebudzonych, swobodnie poruszających się myszy. Technika wykorzystuje unoszoną powietrzem mobilną klatkę domową do mikroskopii dwufotonowej i pomiarów patch-clamp.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach (Wideo) | JoVE Journal

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Przeglądaj więcej filmów