Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Cześć, nazywam się Hel Lin, jestem studentką studiów podyplomowych w Near Science Center na Uniwersytecie Helsińskim. Dzisiaj ja i moi koledzy pokażemy Wam, jak wykonywać nagrania optyczne i elektrofizjologiczne u przytomnych zwierząt, ale poza tym swobodnie poruszających się i zachowujących się. Nasza metoda tworzy namacalne, znajome środowisko, w którym mysz może nawigować i eksplorować.

Podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia, wszczepiamy przewlekłe okno czaszkowe i przyzwyczajamy mysz do podmuchiwanej drogą powietrzną klatki mobilnego domu, która przesuwa się pod stopami zwierzęcia. Podczas poruszania się po płaskiej powierzchni, klatka domku mobilnego może być umieszczona pod standardowym mikroskopem pionowym w celu obrazowania dwóch fotonów lub umieszczona w zestawie elektrofizjologicznym do rejestracji za pomocą zacisku krosowego w mózgu myszy wybudzającej. Wszystkie przedstawione tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.

Wszczepiamy okna czaszkowe zgodnie z opublikowanymi protokołami z niewielkimi modyfikacjami po implantacji okienka czaszkowego. W tym okresie rekonwalescencji zwierzę może dojść do siebie przez co najmniej dwa lub trzy tygodnie, przy czym okno zwykle odzyskuje swoją przezroczystość. Zwierzęta z jakimikolwiek objawami resztkowego pooperacyjnego stanu zapalnego są wykluczane z doświadczeń.

Trenuj zwierzęta wybrane do badania, aby przyzwyczaić je do fiksacji głowy. W klatce domku mobilnego obchodź się z myszą spokojnie przez pięć do 10 minut, unikając gwałtownych ruchów i dźwięków, a następnie włóż ją z powrotem do klatki domowej. Powtórz procedurę dwa lub trzy razy w nierównych odstępach czasu.

Klatka w przyczepie kempingowej umożliwia mocowanie głowy bez znieczulania zwierzęcia przed mocowaniem głowy. Użyj szmatki, aby owinąć mysz dwa lub trzy razy w nierównych odstępach. Upewnij się, że zwierzę pozostaje spokojne, gdy jest owinięte.

W przeciwnym razie powtarzaj procedurę, aż mysz w pełni się do niej przyzwyczai. Rozpocznij trening myszy dwa razy dziennie w klatce w przyczepie kempingowej następnego dnia po zakończeniu obsługi. Zważ zwierzęta przed każdą sesją treningową.

Zwierzęta wykazujące ubytek masy ciała powyżej 10% powinny zostać wykluczone z badania. Dostosuj pozycję ramienia mocującego głowę, aby dopasować je do wielkości wyszkolonego zwierzęcia. Podłącz wlot powietrza do klatki w domu mobilnym do standardowego wylotu powietrza pod ciśnieniem laboratoryjnym.

Upewnij się, że ciśnienie powietrza jest wystarczające do swobodnego unoszenia się w domowej klatce transportowanej drogą powietrzną. Rozpocznij szkolenie przyzwyczajonych zwierząt w klatce w przyczepie kempingowej. Unieruchom mysz, owijając ją.

Włóż metalowy uchwyt przymocowany do głowy zwierzęcia do ramienia mocującego głowę i mocno go zamocuj, dokręcając. Włącz przepływ powietrza, aby podniesiona drogą powietrzną klatka domowa lewitowała. Usuń szmatkę i pozwól myszy zbadać klatkę domową.

Podczas pierwszej sesji treningowej myszy mogą wykazywać zamarzanie i drżenie oraz erekcję ogona. Aby przyzwyczaić zwierzę do hałasu, należy zapewnić mu stałą ekspozycję na dźwięki otoczenia, na przykład za pomocą tłumaczenia radiowego lub nagranej muzyki i mowy podczas wszystkich sesji treningowych, a także podczas eksperymentów. Aby uniknąć przewlekłego stresu, używaj jasnego oświetlenia świetlnego podczas pierwszej godziny sesji treningowej.

Po pierwszej godzinie przeprowadź trening w ciemności i użyj kamery bliskiej podczerwieni do monitorowania zachowania zwierzęcia. Po zakończeniu sesji treningowej uwolnij zwierzę z ramienia mocującego głowę, gubiąc. Zwróć zwierzę z powrotem do klatki domowej na co najmniej dwie godziny przed następną sesją treningową.

Trzymanie myszy w klatce z dwiema lub więcej innymi myszami zmniejszy poziom stresu. Opcjonalnie możesz umieścić klatkę transportowaną drogą powietrzną razem ze zwierzęciem w jego klatce domowej. Wzbogaci to środowisko i może wzmocnić przyzwyczajenie zwierzęcia do klatki w przyczepie kempingowej.

Podczas ostatniej sesji treningowej myszy są przyzwyczajone do fiksacji głowy i powinny wykazywać bezstresowe zachowanie, spokojnie poruszając się po przewiezionej drogą powietrzną klatce domowej. W przypadku braku światła widzialnego, trajektorię lokomocji myszy można śledzić, monitorując ruchy klatki za pomocą kamery bliskiej podczerwieni lub optycznej myszy komputerowej. Podczas dłuższych sesji treningowych, które trwają dłużej niż jedną lub dwie godziny, rozważ podanie myszy wody pitnej, ręcznie lub za pomocą uchwytu na pipety przymocowanego do ramy klatki mobilnego domu.

Poniższy diagram podsumowuje oś czasu typowego badania eksperymentalnego. Badanie rozpoczyna się od implantacji okna czaszkowego na dwa tygodnie przed kontaktem z myszą i jest kontynuowane ośmioma sesjami treningowymi dwa razy dziennie. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji nagrywania z użyciem zacisku krosowego, które są rozmieszczone w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni.

Zarówno eksperymenty optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być wykonywane równolegle z bodźcami i odczytami poznawczymi lub behawioralnymi. Mikroskopia dwufotonowa to unikalna nieliniowa technologia optyczna, która umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym struktur komórkowych, a nawet subkomórkowych w głębokich warstwach korowych mózgu gryzoni. Aby przeprowadzić eksperyment obrazowania pod mikroskopem dwufotonowym, umieść wyszkolone zwierzę w klatce domku mobilnego, wyreguluj korki, aby chronić optykę mikroskopu przed przypadkowym uszkodzeniem.

Wyczyść szybę nakrywkową okna czaszki, aby usunąć cząsteczki kurzu. Upuść płyn zanurzeniowy na szkło nakrywkowe. Zalecamy stosowanie roztworu viscus, ponieważ woda szybko odparowuje.

Platformę można umieścić na typowym zmotoryzowanym stole optycznym za pomocą trybu szerokiego pola mikroskopu fluorescencyjnego i długoprzepustowego filtra emisyjnego. Oceń unaczynienie mózgu i wybierz obszar zainteresowania. Aby zobrazować naczynia korowe, wstrzyknij do żyły ogonowej unieruchomionego i unieruchomionego zwierzęcia o wadze 70 kilogramów, Daltona, Teksasu z czerwonym sprzężonym tekstem Tran.

Ta sekwencja obrazów pokazuje poklatkowe nagranie miejsc i tętnic w korze mózgowej zachowującej się myszy podczas poruszania się po klatce domu mobilnego. Wykreślając profil linii poprowadzonych w poprzek światła naczynia, można zmierzyć zmiany średnicy naczynia i ruchliwości poszczególnych segmentów naczynia. Szybkość przepływu krwi w tętnicach i żyłach można zmierzyć za pomocą skanowania linii wzdłuż linii narysowanych równolegle do ściany naczynia. Grzywna.

Szczegóły morfologii neuronów można uwidocznić u myszy transgenicznych, które wyrażają YFP w subpopulacji neuronów pod promotorem tajwańskim. Te dwa Zacks porównują stabilność obrazowania między zwierzętami znieczulonymi i wybudzonymi. Na prawym panelu bocznym znajdują się dendryty pochodzące od zwierzęcia znieczulonego mieszaniną ketaminy i ksylazyny.

Podczas gdy lewy panel boczny pokazuje obraz dendrytów w obudzonym zwierzęciu chodzącym po klatce przyczepy kempingowej. Indywidualna morfologia kręgosłupa u obudzonych zwierząt może być analizowana z taką samą wiarygodnością i precyzją, jak u znieczulonych myszy. Przemieszczenie mózgu podczas biegu zwierząt zwykle nie przekracza jednego do półtora mikrometra.

Ruchy te zachodzą w kierunkach poziomych i bardzo rzadko powodują przesunięcie płaszczyzny obrazowania, co sprawia, że korekcja artefaktów ruchu nie jest konieczna. W większości przypadków zdolność do chronicznego monitorowania aktywności neuronalnej w obudzonym żywym mózgu jest niezbędna do zrozumienia organizacji i funkcji układu nerwowego. Używając metody "tie one G Camp" dla trzech transgenicznych myszy, obrazujemy spontaniczną aktywność neuronalną u obudzonych myszy zachowujących się w klatce mobilnego domu.

Ta sekwencja zdjęć poklatkowych pokazuje reprezentatywne przykłady skoków wapnia w ciałach komórek nerwowych, nitach i aksonach. Obrazowanie optyczne oparte na sygnałach wewnętrznych umożliwia mapowanie rozkładu przestrzennego domen funkcjonalnych w celu przeprowadzenia eksperymentu z wewnętrznym obrazowaniem optycznym. Umieść wyszkolone zwierzę w klatce domowej umieszczonej pod obiektywem aparatu.

Oczyść szkło nakrywkowe z kurzu. Umieść kroplę glicerolu i przykryj ją pięciomilimetrowym okrągłym szkiełkiem nakrywkowym. Dostosuj pozycję kamery o dużej szybkości.

Umieść manipulator z rurką nadmuchu powietrza naprzeciwko wibracji kontralateralnej. Użyj zielonych świateł, aby zobrazować mapę statku. Skoncentruj się głębiej w korze mózgowej, około 400 mikrometrów poniżej naczyń korowych.

Umieść filtr pasmowo-przepustowy przed kamerą i oświetl korę czerwonym światłem. Pozwól myszy przyzwyczaić się do platformy przez co najmniej 30 minut. Rejestruj podstawową aktywność podczas sześciominutowego epizodu.

Stymuluj wibracje co 10 sekund za pomocą zaciągnięć powietrza przez łączny okres sześciu minut. Obraz ten ilustruje aktywność neuronalną rozchodzącą się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibracyjną z częstotliwością 0,05 herca. Aby wykonać zapisy elektrofizjologiczne pojedynczej komórki, należy umieścić wyszkolone zwierzę, któremu wszczepiono odwrócone okno czaszki, w klatce domku mobilnego.

Powoli i ostrożnie wyjmij szklankę nakrywkową z metalowego uchwytu. Odśwież bufor korowy i oczyść okno czaszki z zanieczyszczeń za pomocą tamponu hemostatycznego. Umieść elektrodę masową w buforze korowym.

Napełnij pipetę z zaciskiem krosowym roztworem wewnątrzkomórkowym. Zastosuj nadciśnienie do pipety rejestrującej za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora, pogłęb pipetę w korze mózgowej i uzyskaj giga uszczelnienie kontaktu z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Po nagraniu wyjmij pipetę, odśwież bufor korowy i zamknij okienko czaszki za pomocą przyklejenia szkła nakrywkowego do metalowego uchwytu.

Zastosowanie podmuchiwanej drogą powietrzną klatki domowej pozwala połączyć obrazowanie i elektrofizjologię z klasycznymi paradygmatami behawioralnymi, takimi jak uczenie się, rehabilitacja lub zachowania związane z lękiem. Węch jest ważnym bodźcem sensorycznym dla myszy i może być wykorzystywany do stymulacji w testach pamięciowych oraz do oceny reakcji na nowość. Aby przeprowadzić test węchowy przyzwyczajenia, umieść wyszkolone zwierzę w klatce w przyczepie domowej i pozwól mu na adopcję.

Na 30 minut przymocuj czysty kawałek bawełny nasączony wodą z kranu do wewnętrznej ściany klatki domku mobilnego za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Po pięciu minutach wymień czystą bawełnę na ścianie domowej klatki na nową nasączoną płynem o zapachu wanilii. Powtórz pięciominutową ekspozycję na zapach wanilii trzy razy w pięciominutowych odstępach między sesjami.

Aby zmierzyć poziom zainteresowania zapachem. Policz łączny czas, w którym zwierzę spędza zwrócone twarzą do strefy docelowej i całkowity czas poruszania się klatki w przyczepie kempingowej. Podczas ostatniej, piątej sesji, zaprezentuj społecznie znaczący zapach.

Zwilż nowy bawełniany aplikator kilkoma kroplami moczu myszy płci przeciwnej. Aby ocenić reakcję na nowość, podziel klatkę domu mobilnego na cztery strefy. Przymocuj dwa kawałki bawełny naprzeciwko siebie. Kolor.

Zakoduj je za pomocą znaczników po zewnętrznej stronie ścian klatki domowej podczas pierwszej próby. Umieść dwa czyste kawałki bawełny. Następnie zastąp je bawełną nasączoną 1% ekstraktem waniliowym.

Podczas trzeciej próby umieść bawełnę waniliową w strefie numer jeden, a kawałek bawełny nasączony 1% ekstraktem z banana w strefie . Po drugie, aby zmierzyć preferencję dla braku zapachu. Oblicz czas, jaki zwierzęta spędzają twarzą w twarz z brakiem zapachu, jako procent skumulowanego czasu spędzonego w obliczu innych stref.

Cześć, nazywam się Leo Kiro i jestem głównym badaczem w Centrum Neuronauki Uniwersytetu w Helsinkach. Mam nadzieję, że podobał Ci się ten film i uznałeś go za przydatny. Przez ostatnie pięć lat pracowaliśmy z dwójką nad mikroskopią in vivo, a stosowanie ogólnych i estetycznych zawsze było wielkim problemem, ponieważ estetyka ingeruje w funkcjonowanie mózgu, przepływ krwi i wszystko.

A dziś cieszę się, że możemy pracować na wybudzonych zwierzętach i wykonywać stabilne eksperymenty obrazowania mikroskopowego oraz walidować i weryfikować wyniki, które wcześniej uzyskaliśmy u znieczulonych zwierząt. Jestem pewien, że zastosowanie klatki do domu mobilnego i metody, które dziś zaprezentowaliśmy, zwiększą znaczenie badań in vivo w ogóle i doprowadzą do nowych i przełomowych wyników, i nie mogę się doczekać.