Name: Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Poznaj metodę osadzania fluorescencyjnych mikrosfer w żelach poliakrylamidowych blisko powierzchni hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary sił trakcyjnych komórek w mikroskopii sił trakcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Programowi Interdyscyplinarnej Inicjatywy Innowacyjnej, University of Illinois, grant 12035. S.K. został sfinansowany na UIUC z grantu National Science Foundation (NSF) 0965918 IGERT: Szkolenie następnego pokolenia badaczy w zakresie mechaniki komórkowej i molekularnej oraz bionanotechnologii. Praca ta była częściowo wspierana przez grant z węzła nanoBIO Narodowej Fundacji Nauki (ECC-1227034).

Wytwarzanie i funkcjonalizacja żeli PA o różnej sztywności z fluorescencyjnymi mikrosferami osadzonymi w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej.
1. Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych na górną szybę
<ol>
	<li>Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe (#1.0, średnica 12 mm) wodą z mydłem, a następnie etanolem, aby usunąć zbędny kurz.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na rusztowanej powierzchni (np. uchwycie końcówki do pipet) w taki sposób, aby się nie stykały, aby ułatwić interakcję z szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Pokryj całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych poli-D-lizyną (0,1 mg/ml) przez 1 godzinę (Rysunek 1A).</li>
	<li>W tym czasie należy wykonać rozcieńczenie 1:10 000 roztworu koloidu o średnicy 0,1 μm, czerwonych fluorescencyjnych mikrosfer z wodą dejonizowaną (DI), aby uzyskać gęstość cząstek około 1 mikrosfery na 20μm2 na powierzchni żelu. Na rysunku 2 przedstawiono wyniki różnych rozcieńczeń. Rozcieńczenie to może być modyfikowane w celu zaspokojenia potrzeb określonych eksperymentów.</li>
	<li>Umieść rozcieńczony roztwór w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 30 minut.</li>
	<li>Po 1 godzinie za pomocą pęsety ostrożnie podnieś każdą szkiełko nakrywkowe i wysusz suszarką na powietrzu. Umieść suche szkiełka nakrywkowe z powrotem na startej powierzchni.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczony roztwór koloidu z łaźni ultradźwiękowej i odpipetować 150 μl na każde szkiełko nakrywkowe. Pozostaw na 10 minut (Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj pęsety, aby ostrożnie podnieść każdą szkiełko nakrywkowe i wysuszyć suszarką powietrzem. Umieść suche szkiełka nakrywkowe na startej powierzchni i przechowuj w ciemności, aż będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie żelu PA bezpośrednio na szklanych płytkach Petriego
<ol>
	<li>Rozgrzej płytę grzejną do 100 °C.</li>
	<li>Rozłóż żądaną liczbę szalek Petriego ze szklanym dnem (szalka 35 mm z mikrostudzienką 14 mm, #1.0) na płaskiej powierzchni w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Przykryj szklaną część każdej mikrostudzienki na płytce Petriego 97% 3-aminopropylotrimetoksyslianem (3-APTES) na 7 minut w celu aktywacji chemicznej. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przypadkowego kapania 3-APTES na powierzchnię tworzywa sztucznego na szalce Petriego, aby uniknąć degradacji polistyrenu.</li>
	<li>Po 7 minutach napełnij szalkę Petriego wodą DI i wyrzuć do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Powtórz krok 2.4 3x dla każdej potrawy, a następnie potrząśnij szalką Petriego, aby usunąć nadmiar wody. Umieść szalki Petriego na płycie grzejnej, aż szklana część wyschnie.</li>
	<li>Wyjmij szalki Petriego z płyty grzejnej i wróć na płaską powierzchnię do dygestoria chemicznego.</li>
	<li>W dygestorium chemicznym przygotować roztwór 0,5% aldehydu glutarowego i dobrze przykryć szklaną porcję każdej szalki Petriego roztworem na 30 minut. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć przypadkowego kapania aldehydu glutarowego na powierzchnię plastiku na szalce Petriego, aby uniknąć degradacji plastiku.</li>
	<li>Po 30 minutach napełnij szalkę Petriego wodą demineralizowaną i wyrzuć do pojemnika na odpady w celu wypłukania i usunięcia aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Powtórz krok 2.4 3x dla każdej potrawy, a następnie potrząśnij szalką Petriego, aby usunąć nadmiar wody. Umieść szalki Petriego na płycie grzejnej, aż szklana część wyschnie.</li>
	<li>Przed zmieszaniem składników roztworu żelu PA należy przesunąć funkcjonalizowane szkiełka szkiełkowe do okapu oparów chemicznych w taki sposób, aby były łatwo dostępne, co pozwoliłoby na szybkie ułożenie żelu na płytkach Petriego ze szklanym dnem po wymieszaniu roztworu żelu.</li>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml należy wymieszać 40% bisakryloamidu, 2% akrylamidu i kwasu akrylowego w bezpośrednich odstępach w stężeniach wymienionych w tabeli 1 (dostosowanym do opublikowanego protokołu10), aby uzyskać pożądaną elastyczność matrycy.</li>
	<li>Dodać 100 mM HEPES, 10% nadsiarczanu amonu i TEMED w ilościach podanych w tabeli 1 odpowiadających pożądanej elastyczności matrycy, aby uzupełnić roztwór żelu.</li>
	<li>Natychmiast odpipetować 15 μl roztworu żelu na środek szklanej części szalek Petriego.</li>
	<li>Natychmiast podnieś funkcjonalną szklaną szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety.
	<ol>
		<li>Odwróć szkiełko pokrywy tak, aby kulki fluorescencyjne znajdowały się z boku stykającego się z roztworem żelu.</li>
		<li>Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynnego żelu PA tak, aby funkcjonalizowana strona stykała się z żelem (Rysunek 1C). Uwaga: W celu uzyskania najlepszych rezultatów zaleca się, aby druga osoba pełniła rolę dodawania szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć możliwości częściowej polimeryzacji podczas pipetowania płynnego roztworu żelu PA na wiele szalek Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwróć wszystkie szalki Petriego, aby uniknąć wpływu grawitacji na nanocząstki fluorescencyjne polimeryzujące do niższych poziomów żelu PA.</li>
	<li>Odczekać co najmniej 35 minut lub do momentu, gdy roztwór podstawowy żelu PA wyraźnie spolimeryzuje w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Odwróć szalki Petriego z powrotem i napełnij je PBS, aby pomóc w usunięciu szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Ostrożnie zetknąć się ze szklaną częścią szalki Petriego i konturem szkiełka nakrywkowego, zeskrobując pęsetą obwód szkiełka nakrywkowego. Wykonaj kilka cykli, aż szkiełko nakrywkowe zostanie usunięte. Usuń szkiełko nakrywkowe i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na ostre odpady.</li>
	<li>Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych, kulki fluorescencyjne zostaną przeniesione do żelu (rysunek 1D). Całkowicie przykryj żele PA PBS, umieść pokrywkę szalki Petriego na każdej szalce i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Funkcjonalizujący żel PA z fibronektyną
<ol>
	<li>Przygotować następujące wstępnie zmieszane roztwory zgodnie z opisem w ustalonym protokole11: roztwór do namaczania (137 mM NaCl, 5% (v/v) glicerolu) i 2x bufor koniugacyjny (0,2 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES), 10% (v/v) glicerol, pH 4,5).</li>
	<li>Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć cały PBS z naczyń ze szklanym dnem zawierających żele PA.</li>
	<li>Nasącz roztwór pipetą na każdy żel tak, aby żel był całkowicie zanurzony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Podgrzać chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) i N-hydroksysulfosukcynimid (NHS) do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Wymieszaj 10x roztwory EDC (150 mM, 19 mg/ml w wodzie DI) i NHS (250 mM, 29 mg/ml w wodzie DI).</li>
	<li>Wymieszaj 1 część 10x EDC, 1 część 10x NHS, 3 części wody DI i 5 części 2x bufor koniugacyjny.</li>
	<li>Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć roztwór do namaczania. Upewnij się, że cały płyn został usunięty z powierzchni żelu.</li>
	<li>Dodać tyle roztworu NHS/EDC, aby pokryć powierzchnię żelu i napełnić szklane dno szalki Petriego (150–250 μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Rozmrozić fibronektynę w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu wymieszaj sterylną wodę DI, aby uzyskać roztwór fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml.</li>
	<li>Użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć roztwór NHS/EDC. Upewnij się, że cały płyn został usunięty z powierzchni żelu.</li>
	<li>Do każdego żelu dodać 150 μl roztworu fibronektyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 35 minut, aby umożliwić przyłączenie fibronektyny.</li>
	<li>Po 35 minutach dodać PBS do każdej szalki Petriego i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
</ol>
4. Eksperymenty z siłą trakcyjną
<ol>
	<li>Podgrzej pożywkę komórkową, PBS i trypsynę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Spłucz żele 5x sterylnym PBS, odsysając PBS między płukaniami i pozostaw pod przykryciem w kapturze.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny na 25cm2 do kolby zawierającej komórki. Po wyjęciu komórek z kolby rozcieńczyć trypsynę pożywką komórkową i policzyć komórki. Na podstawie powierzchni żelu określ liczbę komórek wymaganych na żel, aby uzyskać końcową gęstość wysiewu komórek wynoszącą 3,000 komórek/cm2. Rozcieńczyć lub zagęścić zawiesinę w taki sposób, aby 150 μl mieszaniny komórka-pożywka zawierało taką liczbę komórek. Podwielokrotność 150 μl zawiesiny komórkowej na każdy żel.</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego zawierające komórki w inkubatorze na 30 minut. Następnie ostrożnie wyjmij szalki Petriego i napełnij pozostałą część szalki Petriego pożywką (około 2 ml) tak, aby powierzchnia szalki była całkowicie zanurzona.</li>
	<li>Umieść szalki Petriego z powrotem w inkubatorze do czasu uzyskania obrazu.</li>
	<li>Przygotuj mikroskop i system akwizycji danych do obrazowania: włóż obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, włóż pryzmat kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC), wybierz mCherry lub równoważny filtr fluorescencyjny i włącz komorę środowiskową.</li>
	<li>Po przygotowaniu do obrazowania wyjmij jedną szalkę Petriego z inkubatora i delikatnie umieść ją na stoliku mikroskopu. Zdejmij pokrywę szalki Petriego w celu obrazowania DIC.</li>
	<li>Zlokalizuj pojedynczą komórkę i przechwyć pojedynczy nieruchomy obraz komórki w formacie DIC.</li>
	<li>Nie przesuwając stolika mikroskopu, przełącz tryb obrazowania na fluorescencję. Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych i zapisz obraz mikrosfer</li>.
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę komórkową z szalki Petriego za pomocą pipety i dodać 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Wyobraź sobie mikrosfery pod komórką po odłączeniu komórek.</li>
	<li>Użyj analizy prędkości obrazu cząstek (PIV) w ImageJ12, aby obliczyć pole przemieszczenia spowodowane siłami komórkowymi.</li>
</ol>

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics%3A+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-%CE%B2+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li>
<li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+Protocols+in+Cell+Biol%22">Current Protocols in Cell Biol</a>. , Chapter 10, Unit 1 16(2010).</li>
<li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Mol.+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li>
<li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell%E2%80%93cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li>
<li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+chemistry%2C+topography%2C+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface%3A+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li>
<li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li>
<li>Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li>
<li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtanackovic%2C+T+%22Theory+of+Elasticity+for+Scientists+and+Engineers%22">Theory of Elasticity for Scientists and Engineers</a>. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas stosowania tej techniki niezbędne jest prawidłowe rozcieńczenie roztworu kulek oraz wybór kulek w oparciu o pożądany średnicę, sztywność podłoża z żelu PA oraz skalę wielkości zjawisk badanych w planowanym eksperymencie.
Należy zachować ostrożność podczas rozcieńczania roztworu kulek przed funkcjonalizacją górnych szkiełek nakrywkowych. Odległość między kulkami na powierzchni żelu można zmieniać poprzez modyfikację stopnia rozcieńczenia roztworu koloidalnego. Zbyt duże rozcieńczenie ro...

Mechaniczne oddziaływanie żywej komórki z jej lokalnym środowiskiem było powszechnie badane przy użyciu żeli PA. Substraty te opierają się na prostym, dobrze scharakteryzowanym protokole ustanowionym przez Dembo i Wanga w 1997roku1. Jedną z głównych zalet tych substratów jest to, że ich sztywność można dostroić poprzez modyfikację stężeń poszczególnych składników roztworu żelu. Stanowi to pożądaną platformę do badania interakcji komórek ze środowiskami o różnej sztywności. Kiedy żele PA są pokryte białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), komórki przylegają do nich, generując siłę. W wyniku działania siły komórkowej żel odkształca się jako ciało elastyczne. Odkształcenie to zależy od wielkości siły wywieranej przez komórki i właściwości sprężystych żelu. W różnych badaniach wykorzystano żele PA do zbadania sił trakcji komórkowej.
W jednej z odmian produkcji żelu PA, fluorescencyjne mikrosfery (kulki) są osadzone w całym żelu, aby określić ilościowo siły pociągowe komórek na żelach o różnej sztywności2. Po przyłożeniu siły ogniwa kulki przemieszczają się ze swojego początkowego położenia po odkształceniu żelu. Pole odkształcenia jest mierzone na podstawie pojedynczych przemieszczeń ściegu. To pole odkształceń jest wykorzystywane z teorią sprężystości i właściwościami sprężystymi żelu do obliczania sił trakcyjnych. Pomiary te dostarczają informacji na temat tego, w jaki sposób komórki mechanicznie wyczuwają i oddziałują ze swoim lokalnym mikrośrodowiskiem3.
W wielu powszechnie stosowanych protokołach wytwarzania żelu PA, kulki są mieszane z żelem PA w jego płynnym, niespolimeryzowanym stanie. W pełni spolimeryzowany żel PA zawiera kulki fluorescencyjne w całej swojej objętości. Podczas obliczania sił trakcyjnych komórki monitorowane są kulki znajdujące się najbliżej powierzchni żelu (granica faza komórka-podłoże). Zakłada się, że przemieszczenia tych kulek występują na powierzchni hodowli komórkowej w celu uproszczenia obliczeń siły. Rzeczywiste położenie kulek w głębokości żelu jest ignorowane. Jednak w elastycznym ośrodku (takim jak żel PA) koralik bliżej punktu przyłożenia siły przesunie się bardziej niż koralik, który jest dalej od punktu. Tak więc traktowanie przemieszczenia punktu (w miejscu zgrubienia) dystalnie od powierzchni jako tego na powierzchni powoduje niedoszacowanie trakcji komórkowych. Stopień błędu zależy od odległości ściegu od powierzchni. Błędu nie można oszacować bez wiedzy o położeniu ściegu.
Potrzeba prostej metody zamykania koralików bardzo blisko powierzchni hodowli komórkowej została zaspokojona za pomocą kilku technik. Jednym ze sposobów jest zwiększenie gęstości kulek w całym żelu, tak aby w górnej płaszczyźnie ogniskowej znajdowała się wystarczająca liczba kulek, aby mierzyć ruch bardzo blisko powierzchni. Inna technika polega na zbudowaniu konfokalnej komory obrazowania do obrazowania żywych komórek w taki sposób, że zbierane jest światło tylko z koralików w najwyższej płaszczyźnie ogniskowej4. Inna metoda polega na nałożeniu niezwykle cienkiej warstwy żelu PA zawierającego kulki na już spolimeryzowany żel bez kulek5. Wadą każdej z tych technik jest to, że dokładna lokalizacja kulek w żelu nie jest znana. Wprowadza to błąd w obliczeniach pola przemieszczenia ściegów, a tym samym w obliczeniach sił ogniw. Inna technika polega na sprzężeniu kulek z górną powierzchnią już spolimeryzowanego żelu PA za pomocą Sulfo-SANPAH6. Ta technika zapewnia, że kulki znajdują się rzeczywiście tylko na wierzchu żelu PA, ale stopień, w jakim są one osadzone w głębokości żelu, jest nieznany. Może to potencjalnie stworzyć lokalną topografię komórek, która może zmienić zachowanie komórek, ponieważ wcześniejsze prace sugerowały, że komórki mogą wyczuć wypychanie kilku mikronów odsiebie. Niedawno opracowano technikę modelowania żeli PA za pomocą fluorescencyjnych markerów punktowych fibronektyny o średnicy 1 μm w regularnym układzie8. W tym przypadku głębokość markerów fluorescencyjnych jest znana i wynosi zasadniczo zero, ponieważ wzór fibronektyny jest pośrednio drukowany na powierzchni żelu. Jednak ta metoda nie zapewnia ciągłego środowiska, do którego komórki mogą się przyłączać, ponieważ białko ECM jest ograniczone do kropek o średnicy 1 μm. Metoda pełnej integracji kulek śledzących w żelach PA i ograniczenia ich do znanego miejsca bardzo blisko powierzchni nie została jeszcze ustalona.
Tutaj rozwijamy technikę ograniczania fluorescencyjnych kulek o średnicy od sub-μm do μm do płaszczyzny ogniskowej bardzo blisko powierzchni hodowli komórkowej w żelu PA. Żel jest zwykle utwardzany przez umieszczenie niespolimeryzowanego płynnego roztworu żelu między dwiema szklanymi płytkami. Jedna z płytek jest funkcjonalizowana tak, aby żel mocno do niej przylegał. Drugi jest niefunkcjonalny i jest usuwany po utwardzeniu żelu. Modyfikujemy tę zdejmowaną szklaną powierzchnię, pokrywając ją warstwą koralików. Po umieszczeniu płynnego żelu między funkcjonalizowaną a pokrytą perełkami szklaną powierzchnię, kulki przenoszą się do żelu podczas jego utwardzania. Ogranicza to odległość integracji kulek z żelem w odległości 1,6 μm od powierzchni. Szalki Petriego ze szklanym dnem są używane jako przylegająca powierzchnia, na której utwardza się żel. Aby utworzyć płaską górną powierzchnię żelu podczas polimeryzacji, do umieszczenia żelu na płytce Petriego ze szklanym dnem stosuje się okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe. Przed wyprodukowaniem żelu szkiełko nakrywkowe górnej szkła jest powlekane poli-D-lizyną (PDL), co daje dodatni ładunek powierzchniowy. PDL jest przedmuchiwany sprężonym powietrzem, a na szkiełkach nakrywkowych osadza się roztwór kulek w wodzie. Wykorzystujemy karboksylowane mikrokulki fluorescencyjne, które przenoszą ładunek ujemny i oddziałują z dodatnio naładowaną powierzchnią powstałą w wyniku leczenia PDL. Po zdmuchnięciu roztworu ściegu z szkiełka nakrywkowego sprężonym powietrzem, pojedyncza warstwa ściegów pozostaje elektrostatycznie sprzężona z suchym szkiełkiem nakrywkowym. Powłoka PDL nie wpływa na przyczepność szkła do powierzchni żelu, ponieważ szkiełka są nieuszkodzone i usunięte z żelu PA w pełni nienaruszone.
Płytki Petriego ze szklanym dnem są doprowadzane do przylegania poprzez obróbkę 97% 3-aminopropylo-trimetoksyslianu i 0,5% aldehydu glutarowego. Żele PA o pożądanej sztywności powstają poprzez zmieszanie odpowiednich stężeń bisakrylamidu i akrylamidu w standardowej procedurze9. Kroplę roztworu żelu pipetuje się na szalkę Petriego ze szklanym dnem. Szklane szkiełko nakrywkowe zawierające kulki służy do przekładania żelu z szalką Petriego. Po utwardzeniu żelu górne szkiełko nakrywkowe jest usuwane, pozostawiając kulki zatopione w żelu PA w odległości 1,6 μm od powierzchni.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>odczynniki</td></tr><tr><td>97% 3-aminopropylo-trimetoksysliane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% aldehydu glutarowego</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór buforowy HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% Bisakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0,1 i mikro; m Mikrosfery fluorescencyjne (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, Człowiek, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Milipor poli-D-lizyny</td><td></td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysulfosukcynimid (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Kwas akrylowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Materiały</mocny></td></tr><tr><td>35 mm Szklane naczynie dolne ze szkłem nakrywkowym 14 mm Micro-Well #1</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane, średnica 12 mm. </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Numer katalogowy 26023</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA od dawna używane jako platforma do badania sił trakcyjnych komórek ze względu na łatwość produkcji i możliwość dostrojenia ich elastycznych właściwości. Gdy podłoże jest pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, komórki przylegają do żelu i wywierają siły, powodując deformację żelu. Deformacja zależy od przyczepności komórek i właściwości elastycznych żelu. Jeśli pole odkształcenia powierzchni jest znane, przyczepność powierzchniową można obliczyć za pomocą teorii sprężystości. Deformacja żelu jest zwykle mierzona poprzez równomierne osadzanie koralików znaczników fluorescencyjnych w żelu. Sondy przemieszczają się, gdy żel się odkształca. Sondy w pobliżu powierzchni żelu są śledzone. Przemieszczenia zgłaszane przez te sondy są uważane za przemieszczenia powierzchniowe. Ich głębokości od powierzchni są ignorowane. Założenie to wprowadza błąd w obliczeniach siły pociągowej. Aby uzyskać precyzyjny pomiar sił komórek, kluczowe znaczenie ma poznanie lokalizacji kulek. Opracowaliśmy technikę, która wykorzystuje prostą chemię do zamykania fluorescencyjnych kulek znacznikowych o średnicy 0,1 i 1 μm w żelach PA w odległości do 1,6 μm od powierzchni. Szkiełko nakrywkowe pokrywamy poli-D-lizyną (PDL) i koralikami fluorescencyjnymi. Roztwór żelu PA jest następnie umieszczany między szkiełkiem nakrywkowym a przylegającą powierzchnią. Kulki fluorescencyjne przenoszą się do roztworu żelu podczas utwardzania. Po polimeryzacji żel PA zawiera kulki fluorescencyjne na płaszczyźnie blisko powierzchni żelu.

Obrazowanie konfokalne wykorzystano do potwierdzenia, że koraliki znajdowały się rzeczywiście pod powierzchnią żelu oraz do ilościowego określenia ich dokładnej lokalizacji w głąb żelu. Pozwolono, aby koraliki fluorescencyjne o innej długości fali niż te wewnątrz żelu osadziły się na jego powierzchni, a następnie obliczono odległość między zatopionymi nanocząsteczkami fluorescencyjnymi a koralikami na powierzchni za pomocą algorytmu identyfikacji centroidu. Położenie koralika na powierzchni żelu służy jako punkt odniesie...

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie żeli poliakrylamidowych lub PA do hodowli komórkowej z mikrosferami fluorescencyjnymi osadzonymi bardzo blisko powierzchni żelu. Osiąga się to poprzez wstępną funkcjonalizację szkiełek nakrywkowych ze szklaną lizyną D. Drugim krokiem jest pokrycie szkiełek nakrywkowych szkła roztworem zawierającym mikrosfery fluorescencyjne.Następnie żele PA są formułowane przez zmieszanie odpowiednich stężeń bis, akrylamidu i akrylamidu i umieszczane między spodnią powierzchnią a funkcjonalizowaną stroną szkiełek nakrywkowych. Ostatnim krokiem jest funkcjonalizacja żelu za pomocą białka macierzy zewnątrzkomórkowej i hodowli komórek na powierzchni żelu. Ostatecznie mikroskopia sił trakcyjnych służy do pomiaru sił mechanicznych wywieranych przez komórki w wyniku indukowanej przez komórki deformacji substratu.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne wytwarzanie PHL, jest to, że lokalizuje ona mikrosfery fluorescencyjne w znanym miejscu na głębokości żelu, co pozwala na dokładniejsze obliczanie komórkowych sił trakcyjnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ podczas funkcjonalizacji szkiełek

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Poznaj metodę osadzania fluorescencyjnych mikrosfer w żelach poliakrylamidowych blisko powierzchni hodowli komórkowej. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary sił trakcyjnych komórek w mikroskopii sił trakcyjnych.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Przeglądaj więcej filmów