Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie żeli poliakrylamidowych lub PA do hodowli komórkowej z mikrosferami fluorescencyjnymi osadzonymi bardzo blisko powierzchni żelu. Osiąga się to poprzez wstępną funkcjonalizację szkiełek nakrywkowych ze szklaną lizyną D. Drugim krokiem jest pokrycie szkiełek nakrywkowych szkła roztworem zawierającym mikrosfery fluorescencyjne.

Następnie żele PA są formułowane przez zmieszanie odpowiednich stężeń bis, akrylamidu i akrylamidu i umieszczane między spodnią powierzchnią a funkcjonalizowaną stroną szkiełek nakrywkowych. Ostatnim krokiem jest funkcjonalizacja żelu za pomocą białka macierzy zewnątrzkomórkowej i hodowli komórek na powierzchni żelu. Ostatecznie mikroskopia sił trakcyjnych służy do pomiaru sił mechanicznych wywieranych przez komórki w wyniku indukowanej przez komórki deformacji substratu.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne wytwarzanie PHL, jest to, że lokalizuje ona mikrosfery fluorescencyjne w znanym miejscu na głębokości żelu, co pozwala na dokładniejsze obliczanie komórkowych sił trakcyjnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ podczas funkcjonalizacji szkiełek nakrywkowych należy przeprowadzić utwardzanie przestrzenne, aby zapewnić prawidłowe przenoszenie bitów fluorescencji na pierwsze miejsce PHL. Wcześniej oczyszczona szklana pokrywa ślizga się po startej powierzchni tak, że się nie stykają.

Aby ułatwić interakcję z szkiełkami nakrywkowymi, należy pokryć całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych 0,1 miligrama na mililitr poli D lizyny przez jedną godzinę. W tym czasie należy rozcieńczyć roztwór koloidu o średnicy 0,1 mikrometra w ilości od 1 do 10 000. Czerwone mikrosfery fluorescencyjne z dejonizowaną wodą w celu uzyskania gęstości cząstek około jednej mikrosfery na 20 mikronów kwadratowych na powierzchni żelu.

Umieść rozcieńczony roztwór w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 30 minut. Po godzinie za pomocą pęsety ostrożnie podnieś każdą szkiełko nakrywkowe i wysusz suszarką na powietrzu. Następnie zwróć suche szkiełka nakrywkowe na startą powierzchnię.

Po usunięciu rozcieńczonego roztworu koloidu z kąpieli ultradźwiękowej, należy odpipetować 150 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko nakrywkowe. Po 10 minutach za pomocą pęsety ostrożnie podnieś każdą szkiełko nakrywkowe i wysusz suszarką powietrzem. Gdy suche szkiełka nakrywkowe zostaną zwrócone na wyrównaną powierzchnię, przechowuj je w ciemności, aż będą gotowe do użycia.

Następnie ułóż żądaną liczbę szalek Petriego ze szklanym dnem na płaskiej powierzchni w okapie oparów chemicznych. Przykryj szklaną część każdej szalki Petriego. Mikro studzienka z 97% trzech aminokwasów trimetylo-propylu przez siedem minut w celu aktywacji chemicznej.

Po siedmiu minutach napełnij szalkę Petriego wodą dejonizowaną i wyrzuć roztwór do pojemnika na odpady. Ostrożnie przykryj szklaną część każdej szalki Petriego. Dobrze z wcześniej przygotowanym 0,5% roztworem aldehydu glutarowego przez 30 minut.

Po 30 minutach napełnij szalkę Petriego wodą dejonizowaną i wyrzuć ją do pojemnika na odpady, aby wypłukać i usunąć skórę aldehydu glutarowego. Przed zmieszaniem składników roztworu żelu poliakrylamidowego należy przesunąć funkcjonalizowane szkiełka szkiełkowe do okapu oparów chemicznych w taki sposób, aby były łatwo dostępne, co pozwoliłoby na szybkie ułożenie żelu na płytkach Petriego ze szklanym dnem. Po wymieszaniu roztworu żelu w 15-mililitrowej probówce wirówkowej należy natychmiast wymieszać 40% akryloamidu, 2% akrylamidu i kwasu akrylowego.

Aby uzyskać pożądaną elastyczność matrycy, dodaj 100 milimolowych HEP, 10% amonu na siarczan i zespolone w ilości odpowiadające pożądanej elastyczności matrycy. Aby uzupełnić roztwór żelu, natychmiast odpipetować 15 mikrolitrów roztworu żelu na środek szklanej części szalek Petriego. Po podniesieniu pęsetą funkcjonalizowanego szkła nakrywkowego należy go odwrócić tak, aby kulki fluorescencyjne znajdowały się po stronie stykającej się z roztworem żelu.

Następnie delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynnego żelu poliakrylamidowego, tak aby funkcjonalizowana strona stykała się z żelem. Następnie odwróć wszystkie szalki Petriego, aby uniknąć wpływu grawitacji na fluorescencyjne nanocząstki. Polimeryzacja do niższych poziomów żelu poliakrylamidowego.

Po polimeryzacji odwróć szalki Petriego z powrotem i napełnij je BS. Ostrożnie zetknąć się ze szklaną częścią szalki Petriego i konturem szkiełka nakrywkowego, używając pęsety, aby zeskrobać obwód szkiełka nakrywkowego. Po kilku cyklach skrobania. Usuń szkiełko nakrywkowe i wyrzuć je do odpowiedniego pojemnika na ostre odpady.

Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych umieść pokrywkę szalki Petriego na każdej szalce i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy żele z poliakryloamidu ogrzeją się do temperatury pokojowej, użyj pompy próżniowej w okapie biologicznym, aby usunąć cały PBS ze szklanych naczyń zawierających żele, pipetuj wcześniej przygotowany roztwór namoczaj na każdym żelu, tak aby żel był całkowicie zanurzony. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę, dodać 150-250 mikrolitrów uprzednio przygotowanego roztworu H-S-E-D-C, aby pokryć powierzchnię żelu i napełnić szklane dno płytki Petriego.

Następnie inkubuj żele w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po usunięciu roztworu N-H-S-E-D-C za pomocą próżni, do każdego żelu dodać 150 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu fibronektyny. Ponownie inkubować w temperaturze pokojowej przez 35 minut, aby umożliwić przyłączenie fibronektyny.

W tym momencie podgrzej pożywkę komórkową PBS i trypsynę do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Spłucz żele pięć razy sterylną wodą dejonizowaną. Zasysając wodę między płukaniami, przykryj żele, pozostawiając je w kapturze.

Dodaj jeden mililitr trypsyny na 25 centymetrów kwadratowych do kolby zawierającej komórki. Po wyjęciu komórek z kolby rozcieńczyć trypsynę pożywką komórkową. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru na podstawie powierzchni żelu.

Określić liczbę komórek wymaganą na żel do uzyskania końcowej gęstości osadzenia komórek wynoszącej 3000 komórek na centymetr kwadratowy, rozcieńczyć lub zagęścić zawiesinę tak, aby 150 mikrolitrów mieszaniny pożywek komórkowych zawierało tę liczbę komórek. Następnie Eloqua nanieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na każdy żel. Następnie szalki Petriego zawierające komórki umieszcza się w inkubatorze przez 30 minut.

Po ostrożnym wyjęciu szalek Petriego z inkubatora, napełnij pozostałą część szalki Petriego około dwoma mililitrami pożywki, tak aby powierzchnia szalki była całkowicie zanurzona. Umieść szalki Petriego z powrotem w inkubatorze do czasu uzyskania obrazu. Po przygotowaniu do obrazowania delikatnie umieść jedną z szalek Petriego na stoliku mikroskopu.

Po zdjęciu pokrywki szalki Petriego w celu obrazowania DIC, zlokalizuj pojedynczą komórkę i uchwyć pojedynczy nieruchomy obraz komórki w DIC bez przesuwania stolika mikroskopu. Przełącz tryb obrazowania na fluorescencję. Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych i zapisz obraz mikrosfer

Ostrożnie usunąć pożywkę komórkową z płytki Petriego za pomocą pipety i dodać 0,05% trypsyny EDTA. Ustaw ostrość na obrazie DIC, aby pokazać żel, od którego odłączyła się komórka. Następnie zobrazuj mikrosfery pod komórką po odłączeniu komórek.

Obrazowanie konfokalne wykorzystano do ustalenia, że kulki znajdowały się pod powierzchnią żelu i do ilościowego określenia ich dokładnej lokalizacji, pozwolono na osadzenie się na powierzchni fluorescencyjnych kulek o innym rozmiarze i długości fali niż te wewnątrz żelu. Położenie osadzonych kulek służy jako odniesienie dla górnej powierzchni żelu, gdzie komórki wywierają siłę na przyleganie. Po obrazowaniu konfokalnym obliczono odległość między osadzonymi nanocząstkami fluorescencyjnymi a tymi na powierzchni.

Odległość ta określała dokładną głębokość kulek w żelu. Pokazano tutaj rozkład przestrzenny ściegu i rzut na płaszczyznę YZ. Drabinka zapewnia głębokość wszystkich kulek z powierzchni żelu.

Średnia głębokość kulek 0,1 mikrona wynosi 619 nanometrów, 467 nanometrów 278 nanometrów dla żeli poliakrylamidowych o sztywności odpowiednio 10 i 40 kilopaskalach. Odpowiednie głębokości dla kulek o średnicy jednego mikrona wynoszą minus 20 nanometrów w żelach 40 kilopaskalowych, 12 nanometrów w żelach 10 i 1 255 nanometrów w żelach o średnicy jednego kilopaskala. Zmierzono głębokość kulek rozproszonych w żelu i porównano ją z głębokościami.

Korzystając z przedstawionej techniki. Pokazano tutaj zmienność dyspersji kulek na głębokości żelu poliakrylowego przy użyciu tradycyjnych metod wytwarzania. Pole przemieszczenia dla komórki fibroblastu i odpowiadającej jej warstwy kulek fluorescencyjnych jest pokazane tutaj.

Koraliki na obrzeżach obrazu wydają się nieco nieostre, co jest efektem optycznym ze względu na obiektyw zanurzony w wodzie. Po dodaniu trypsyny komórka jest uwalniana z powierzchni, w wyniku czego zdeformowana powierzchnia żelu poliakrylowego powraca do swojego pierwotnego stanu. Po opanowaniu, tę technikę wytwarzania i funkcjonalizacji PHL można wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać żele poliakryloamidowe z fluorescencyjnymi mikrosferami, zlokalizowanymi w znanym miejscu na głębokości żelu w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej. Dla dokładniejszego obliczania sił uciągu ogniwa.