Name: Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Naucz się testu nakładkowego do wizualizacji aktywności Streptococcus pneumoniae. Ta metoda pozwala szybko badać aktywność bakteriocyn i wykrywać peptydy quorum sensing w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Elizabeth E. Kennedy Research Award.

1. Przygotowanie szczepu producenta
<ol>
	<li>Smuga szczepu pneumokoków do przetestowania pod kątem produkcji bakteriocyny na 5% tryptycznym agarze sojowym z krwi owczej z zapasów zamrażarki -80 °C. 
	UWAGA: Użycie płytek krwi do początkowego wzrostu szczepu, który ma być badany pod kątem inhibicji, znacznie zwiększa odtwarzalność testu. Ponadto można stosować inne szczepy niepneumokokowe wytwarzające bakteriocyny, chociaż może być konieczne zmodyfikowanie warunków wzrostu dla konkretnego organizmu. Z powodzeniem zastosowaliśmy Streptococcus mitis i Lactococcus lactis w teście nakładkowym.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji szczepu produkcyjnego przygotować płytkę z tryptycznym agarem sojowym (TSA), pipetując od 3 000 do 4 000 jednostek katalazy na płytki zawierające 25 ml TSA i rozprowadzić roztwór katalazy za pomocą sterylnych szklanych kulek. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na około 10 minut pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Zbierz widoczną ilość bakterii na końcówkę pipety. Wbić końcówkę pipety w wysuszoną płytkę TSA. 
	UWAGA: Więcej niż jeden szczep producenta może zostać wbity w pojedynczą płytkę TSA. Ważne jest, aby rozmieścić dźgnięcia tak, aby powstałe aureole nie nakładały się na siebie.
	<ol>
		<li>Jeśli to możliwe, należy uwzględnić znanego producenta bakteriocyny jako kontrolę dodatnią, a szczep, który ma być użyty w nakładce, jako kontrolę ujemną. 
		UWAGA: Kontrole dodatnie i ujemne zostały wcześniej opublikowane i są dostępne na żądanie10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować płytkę TSA zawierającą wielokrotne ukłucia w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie zapasów glicerolu ze szczepu nakładkowego
<ol>
	<li>Przygotować zapasy glicerolu (kultury wyhodowane do połowy fazy wykładniczej, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C po dodaniu glicerolu) przed dniem przeprowadzenia testu nakładkowego. Zaszczepić 5-10 kolonii szczepu pneumokoków w celu zbadania wrażliwości lub wydzielania feromonów w pożywce Todda-Hewitta 0,5% ekstraktem drożdżowym (THY). 
	UWAGA: Budowa reporterów indukowanych BlpC została wcześniej opisana2, a szczepy są dostępne na życzenie.</li>
	<li>Inkubować 5-10 kolonii w szklanych probówkach z 5 ml THY ze szczelnie zamkniętymi pokrywkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C bez wstrząsania.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, aż osiągną OD620 wynoszący od 0,3 do 0,5, 
	UWAGA: Zajmie to około 4-5 godzin, w zależności od użytego szczepu.
	<ol>
		<li>Delikatnie odwróć rurkę kilka razy przed pomiarem średnicy zewnętrznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli eksperyment nie może zostać przeprowadzony tego samego dnia lub szczep będzie używany wielokrotnie w przyszłości, należy przygotować zapasy glicerolu i wznowić eksperyment w późniejszym terminie. W przypadku zapasów glicerolu dodaj glicerol do kultur do końcowego stężenia 20%. Porcje kultur rozmieścić w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. UWAGA: Próbki można przechowywać przez miesiące w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wytwarzasz zapasów glicerolu, użyj próbek bezpośrednio do testu nakładkowego.</li>
</ol>
3. Test nakładki
<ol>
	<li>Tuż przed nałożeniem nakładki należy wymieszać składniki nakładki. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 5 ml THY, 3 000-4 000 U katalazy i 200 μl kultury bulionowej szczepu nałożonego na nakładkę, która była uprawiana tego dnia lub glicerolu z kultury, która została rozmrożona w temperaturze pokojowej. W przypadku stosowania szczepu reporterowego dodać 50 μl X-gal (40 mg/ml) do mieszaniny nakładki. Użyj jednej stożkowej rurki na płytkę.</li>
	<li>Zrównoważyć mieszaninę nakładki w temperaturze pokojowej przed dodaniem stopionego TSA.</li>
	<li>Wyjmij płytkę TSA z dźgniętym szczepem z inkubatora. Rozpuść stały TSA w kuchence mikrofalowej i trzymaj w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C, aż będzie gotowy do użycia. Dodać 3 ml stopionego TSA z 1,5% agarem schłodzonym do 55 °C do nałożonej mieszaniny.
	<ol>
		<li>Przygotuj nałożoną mieszaninę bezpośrednio przed pipetowaniem, mieszanina zacznie bardzo szybko krzepnąć. UWAGA: Jeśli nakładka zacznie krzepnąć przed poszyciem, wyniki będą nieinterpretowalne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać nałożoną mieszaninę, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków do mieszaniny. Powoli nakładać mieszaninę pipetą bezpośrednio na wbitą płytkę TSA. Trzymaj talerz na blacie przez kilka minut, pozwalając agarowi stwardnieć.
	<ol>
		<li>Nie obracaj płytki w celu rozprowadzenia mieszanki nakładki, spowoduje to wciągnięcie wzrostu z dźgniętej kultury do nakładki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie umieścić płytkę TSA z nakładką w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 O/N (około 16-18 godzin).</li>
	<li>Obserwuj płytki po nocnym wzroście. Płytki powinny wydawać się nieprzezroczyste w wyniku wzrostu szczepu nakładki, z wyjątkiem obszarów, w których wystąpiło hamowanie lub sygnalizacja feromonów. Pojawią się one odpowiednio jako czyste lub niebieskie strefy wokół ugodzonego szczepu. 
	UWAGA: Chociaż pomiary średnicy niebieskiego lub prześwitu można określić w celu oceny ilościowej, różnice w średnicy mogą się również różnić w zależności od ilości bakterii, które zostały wbite w płytkę. Test nakładkowy jest testem jakościowym, każda ocena ilościowa powinna być interpretowana z ostrożnością. Każde widoczne oczyszczenie w porównaniu z kontrolą ujemną uznaje się za aktywność.</li>
</ol>

<ol><li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li>
<li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+enterocin+W%2C+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li>
<li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li>
<li>Reichmann, P., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+a+peptide-inducible+two-component+system+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae.</a> FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).</li>
<li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li>
<li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production%2C+purification%2C+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751(2013).</li>
<li>Wladyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+biochemical+characterization%2C+and+cloning+of+a+bacteriocin+from+the+poultry-associated+Staphylococcus+aureus+strain+CH-91%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).</li>
<li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofencin+a%2C+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li>
<li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene%2C+blpA%2C+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li>
<li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li>
<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten test nakładkowy jest szybkim sposobem określenia zakresu aktywności producentów bakteriocyny i wykazania interakcji konkurencyjnych, które mogą wystąpić między szczepami pneumokoków. Test nakładkowy można dostosować do stosowania do badań przesiewowych wielu szczepów pod kątem produkcji bakteriocyny na jednej płytce. Za pomocą tego testu z powodzeniem przeprowadziliśmy badania przesiewowe dużych zbiorów szczepów, używając 48-pinowego replikatora do inokulacji płytek SBA z jednej połowy płytki 96-dołkowej. Po całonocn...

Streptococcus pneumoniae, powszechny kolonizator wielomikrobiologicznej społeczności nosogardzieli, jest w stanie konkurować z innymi pneumokokami i blisko spokrewnionymi gatunkami poprzez produkcję wytwarzanych bakteryjnie peptydów przeciwdrobnoustrojowych (bakteriocyny). Każdy w pełni zsekwencjonowany szczep pneumokoków przebadany do tej pory zawiera wersję locus eptydu bacyrocyny-l ike p, BLP. Wykazano, że wytwarzanie bakteriocyn przez pneumokoki ma istotny wpływ na wyniki zarówno konkurencji in vitro, jak i in vivo 1-4. Na dynamikę konkurencji wpływa ekspresja różnych bakteriocyn wraz z pokrewnymi białkami odpornościowymi w odpowiedzi na określony feromon peptydowy. Indukcja locus blp jest kontrolowana przez system quorum sensing, w którym feromon peptydowy, BlpC, wiąże się z kinazą czujnikową, BlpH, i inicjuje kaskadę sygnalizacyjną, w wyniku której następuje transkrypcja locusblp 5,6. Istnieją cztery warianty alleliczne BlpC, z których każda wiąże się z pokrewnym BlpH6. Aby komórka mogła przetrwać działanie własnej bakteriocyny, geny kodujące pokrewne białka odpornościowe są transkrybowane na tym samym operonie, co każdy z genów bakteriocyny. Zabijanie ma miejsce, jeśli konkurencyjny szczep nie jest w stanie zwiększyć locus blp w odpowiedzi na egzogenny feromon lub jeśli szczep nie ma specyficznego genu odporności wymaganego do ochrony. Kompleks transportowy, BlpAB, jest niezbędny do wydzielania i przetwarzania feromonu peptydowego i peptydów bakteriocyny2,4. Ostatnio wykazano, że znaczna część szczepów pneumokoków to "oszuści", co oznacza, że mają konserwatywną mutację w genie blpA, która uniemożliwia im wydzielanie feromonów i bakteriocyn1,2. Szczepy te są w stanie reagować na egzogenny BlpC2 wydzielany przez sąsiednie szczepy, co pozwala na produkcję białek odpornościowych.
Chociaż prymitywne preparaty bakteriocyn z supernatantów mogą być przygotowywane ze szczepów producentów przy użyciu metod biochemicznych prowadzących do osiągnięcia czystości, to podejście to nie jest przydatne do badania dużych kolekcji izolatów i jeśli poziom ekspresji bakteriocyny jest niski w kulturach uprawianych w bulionie2,7-9. Test nakładkowy jest stosowany jako szybki sposób badania dynamiki konkurencji między szczepami, które mogą istnieć in vitro. W tym celu szczep pneumokoków jest wstępnie zaszczepiany na płytce agarowej i pozostawiany do wzrostu w celu osiągnięcia lokalnych stężeń bakterii wystarczających do indukcji locus blp. Drugi szczep jest następnie zaszczepiany w stopionym miękkim roztworze agaru, który jest następnie nakładany na wstępnie zaszczepiony szczep w celu zbadania wrażliwości. Aby ocenić aktywność locus blp (niezależną od aktywności hamującej), szczepy można nałożyć na serię trzech wcześniej opisanych szczepów reporterowych BlpC. Szczepy te zostały skonstruowane tak, aby zawierały jeden z trzech różnych alleli blPH, które reagują na trzy najczęstsze feromony BlpC wydzielane przez pneumokoki. Szczepy reporterowe mają zintegrowany gen lacZ, który jest pod kontrolą promotora zależnego od BlpH i przenoszą delecję w genie blpC, która zapobiega samostymulacji10,11.

<table><tbody><tr><td>Agar sojowy tryptykazy z 5% krwią owczą</td><td>Fisher</td><td>B21261X</td><td>Do wzrostu z kultur zamrażarskich</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>4,741 Ilość na talerz</td></tr><tr><td>Bulion Todd Hewitt + Ekstrakt drożdżowy (THY)</td><td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&nbsp;</td><td>30 g THB, 5 g ekstraktu drożdżowego, 1 l autoklawu ddH2O</td></tr><tr><td>Tryptyka Rosół sojowy + Płytki agarowe (TSA)</td><td>Fisher</td><td>B11768&nbsp;</td><td>30 g TS, 15 g agaru, 1 l autoklawu ddH2O</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galaktopiranozyd (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Rozpuścić w dimetyloformamidzie</td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophometer</td><td></td><td></td><td>Mierzy OD620 kultur</td></tr><tr><td>37 &deg; C łaźnia</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>37 &deg; Inkubator C z</td> probówką stożkową 5% CO2 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae kolonizuje wysoce zróżnicowaną społeczność wielomikrobiologiczną nosogardzieli, gdzie musi konkurować z organizmami rezydentami. Wykazaliśmy, że wytwarzane bakteryjnie peptydy przeciwdrobnoustrojowe (bakteriocyny) dyktują wynik tych konkurencyjnych interakcji. Wszystkie w pełni zsekwencjonowane szczepy pneumokokowe są nosicielami locus a backerocin-l ike peptide (blp). Locus blp koduje szereg różnych bakteriocyn i wszystkie wysoce konserwatywne składniki potrzebne do ich regulacji, przetwarzania i wydzielania. Różnorodność bakteriocyn znajdujących się w regionie odporności bakteriocynowej (BIR) locus jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do konkurencji pneumokokowej. Wraz z bakteriocynami w BIR znajdują się geny odporności, które są potrzebne do ochrony komórki produkcyjnej przed skutkami działania własnej bakteriocyny. Test nakładkowy jest szybką metodą badania dużej liczby szczepów pod kątem interakcji konkurencyjnych, w których pośredniczą bakteriocyny. Test nakładkowy pozwala również na scharakteryzowanie odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrycie wydzielanych peptydów wyczuwających kworum. Test przeprowadza się poprzez wstępne zaszczepienie płytki agarowej szczepem, który ma być badany pod kątem produkcji bakteriocyny, a następnie nałożenie miękkiej nakładki agarowej zawierającej szczep, który ma być badany pod kątem wrażliwości na bakteriocynę. Strefa prześwitu otaczająca ukłucie wskazuje, że szczep nakładki jest wrażliwy na bakteriocyny wytwarzane przez wstępnie zaszczepiony szczep. Jeśli nie obserwuje się żadnej strefy klirensu, oznacza to, że albo szczep nakładkowy jest odporny na wytwarzanie bakteriocyn, albo szczep wstępnie zaszczepiony nie wytwarza bakteriocyn. Aby określić, czy locus blp jest funkcjonalny w danym szczepie, test nakładkowy można dostosować do oceny wydzielania feromonów peptydowych przez wstępnie zaszczepiony szczep. W tym przypadku w nakładce zastosowano serię czterech szczepów lacZ-reporter o różnej specyficzności feromonowej.

W teście nakładkowym (overlay assay) możliwe są dwa wyniki. Po inkubacji przez noc powinien być widoczny wzrost szczepu wprowadzonego metodą nakłuwania. Na Rysunku 1A szczep nakładkowy jest wrażliwy na produkowane bakteriocyny. Wokół szczepu nakłutego można zaobserwować strefę zahamowania wzrostu. Dodatkowo możliwe jest rozprzestrzenienie się szczepu nakłutego w mieszaninie nakładkowej, co widoczne jest na Rysunku 1A. Na Rysunku 1B szczep nakładkowy jest odporny na wydzi...

Konkurencja w Streptococcus pneumoniae jest wywoływana przez bakteriocyny, małe peptydy przeciwdrobnoustrojowe o działaniu hamującym w stosunku do pneumokoków i innych pokrewnych gatunków. Tutaj opisujemy zoptymalizowany test nakładki bakteryjnej, który pozwala na scharakteryzowanie aktywności bakteriocyny i spektrum hamowania, odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrywania wydzielanych peptydów quorum sensing.

Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja bakterii i aktywności paciorkowcowego zapalenia płuc za pomocą testu nakładkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie dźgnięcie szczepu producenta na płytkę TSA. W drugim etapie przygotowuje się nałożoną mieszaninę odkształceń, a następnie powoli pipetuje się ją na płytkę TSA zawierającą schodkowany szczep wytwórczy.W ostatnim etapie oceniana jest aktywność bakterii. Ostatecznie test nakładkowy może być wykorzystany do wykazania braku aktywności bakterii lub produkcji feromonów przez badany szczep. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak bezpośrednie oczyszczanie bakterii, jest to, że metoda ta jest szybkim sposobem na ustalenie szeregu bakterii, braku aktywności i badanie przesiewowe wielu szczepów pod kątem bakterii w produkcji.Procedurę zademonstruje Natalie Marchek, doktorantka w moim laboratorium. Aby przygotować bakterie w producencie, należy najpierw rozprowadzić interesujący szczep pneumokoków na 5% płytce TSA z krwią owczą i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka nanieś od 3000 do 4 000 jednostek katalizatorów na płytki zawierające 25 mililitrów TSA i użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić katalizatory na płytkach. Po pozostawieniu płytek do wyschnięcia na około 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zbierz widoczną ilość bakterii na końcówkę pipety i wbij końcówkę pipety w wysuszoną płytkę TSA.Jeśli to możliwe, uwzględnij znanego producenta grzechu bakteryjnego jako kontrolę pozytywną i szczep, który ma być użyty w nakładce jako kontrolę negatywną, zapewniając odpowiednią przestrzeń między ukłuciami, aby aureole wzrostu nie nakładały się na siebie. Następnie inkubować kultury kłute w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin w dniu poprzedzającym test nakładkowy, zaszczepić od pięciu do 10 kolonii szczepu pneumokoków do przetestowania w szklanych probówkach zawierających pięć mililitrów pożywki THY zawierającej 0,5% ekstraktu drożdżowego. Następnie zamknij pokrywki tych kultur szczepu glicerolu i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.Po czterech do pięciu godzinach delikatnie odwróć probówki kilka razy, a następnie zmierz od. Gdy kultury osiągną OD dwa 60 od 0,3 do 0,5, dodaj glicerol do końcowego stężenia 20%, a następnie podziel kultury na 1,5 mililitrowe mikroprobówki wirówkowe i przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozmrozić porcję bulionu glicerolu w temperaturze pokojowej.Następnie, tuż przed nałożeniem nakładki, wymieszaj pięć mililitrów THY 3000 z 4 000 jednostek katalizatora i 200 mikrolitrów bulionu glicerolu w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. W przypadku szczepów bakterii reporterowych dodać 50 mikrolitrów Xcel do mieszaniny nakładki, używając jednej stożkowej rurki na płytkę. Umieść nałożoną mieszaninę w temperaturze pokojowej, gdy mieszanina równoważy stopiony stały TSA w kuchence mikrofalowej, a następnie umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza.Gdy stopiony TSA ostygnie do 55 stopni Celsjusza, szybko dodaj trzy mililitry TSA do nałożonej mieszaniny i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół za pomocą pięciomililitrowej pipety. Uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, a następnie powoli pipetować nałożoną mieszaninę bezpośrednio na wbitą płytkę TSA. Po kilku minutach, gdy płytka stwardnieje i bez obracania płytki, ostrożnie umieść nałożoną kulturę kłutą z powrotem w inkubatorze w celu przeprowadzenia posiewu przez noc.Następnego ranka obserwuj nocny wzrost. Płytki powinny wydawać się nieprzezroczyste w wyniku wzrostu szczepu nakładki, z wyjątkiem obszarów, w których wystąpiło zahamowanie lub sygnalizacja feromonów. Istnieją dwa możliwe wyniki testu nakładkowego w tym reprezentatywnym eksperymencie.Po całonocnym posiewie zaobserwowano strefę klirensu otaczającą dźgnięty szczep, co wskazuje, że ten szczep nakładkowy jest wrażliwy na wytwarzane grzechy bakteryjne. Zwróć również uwagę na wirowanie dźgniętego szczepu w mieszance nakładki. W tym eksperymencie szczep nakładkowy był odporny na wydzielanie bakterii, na co wskazuje brak aureoli otaczającej ukłucie.Możliwe jest również, że dźgnięty szczep nie wydziela bakterii do testu sygnalizacyjnego. Możliwe są dwa różne wyniki. W tym eksperymencie dźgnięty szczep wydzielał feromon, który wchodził w interakcję z kinazą histydynową szczepu nakładki, co zaobserwowano w niebieskiej strefie wskazującej na rozpad xal na tym obrazie.Jeśli feromon nie aktywuje transkrypcji locus BLP w szczepie reporterowym lub jeśli dźgnięty szczep nie wydziela feromonu, rozpad skali X nie nastąpi, jak zaobserwowano na tym obrazie Po wykonaniu tej procedury. Inne metody, takie jak analiza mutacji lub sekwencjonowanie, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy jakakolwiek znacząca aktywność hamująca jest przypisywana locus BLP, czy też jest to brak aktywności w wyniku mutacji w genie transportera.

using-overlay-assay-to-qualitatively-measure-bacterial-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Hockett, K. L. i Baltrus, D. A. Zastosowanie techniki nakładki miękkiego agaru do wykrywania związków hamujących produkowanych przez bakterie. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje procedurę wykrywania zabijania podpłynionego bakteriocyną poprzez wykrycie supernatantu szczepu dawcy wywołanego antybiotykiem na miękkiej warstwie agaru zawierającej szczep testowy. Strefy przezroczyste powstałe po inkubacji wskazują na hamowanie bakterii.

Miękki test agarowy do wykrywania zabijania podsycaniego bakteriocyną u strzykawek Pseudomonas

Ten film pokazuje wykrywanie bakterii kwasu mlekowego wytwarzających bakteriocynę pochodzących z kału myszy. Test określa aktywność przeciwdrobnoustrojową bakteriocyny na określone szczepy bakterii.

Ocena potencjału przeciwdrobnoustrojowego mysich bakterii kałowych wytwarzających bakteriocynę

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Testy przestrzegania zaleceń in vitro mogą być wykorzystane do badania przyczepiania się Streptococcus pneumoniae do monowarstw komórek nabłonka i do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak użycie probiotyków do hamowania kolonizacji pneumokoków.

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Testy płytki nazębnej są złotym standardem w kwantyfikacji wirusa, wykorzystując nakładki pułapkowe na monowarstwy komórkowe gospodarza do określenia miana wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się różne półstałe nakładki, tutaj demonstrujemy techniki płytki nazębnej, porównując półstałe nakładki z nową ciekłą celulozą mikrokrystaliczną wśród kilku rodzin wirusów.

Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Test odroczonego hamowania wzrostu może być użyty do oceny wpływu konkurencji jednego izolatu bakteryjnego na drugi. Hamowanie określa się ilościowo, mierząc strefę oczyszczania wokół izolatu wytwarzającego inhibitor, lub ocenia się jakościowo, określając widoczny zakres hamowania.

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Opisujemy prostą metodę badania kultur bakteryjnych pod kątem produkcji związków hamujących inne bakterie.

Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Naucz się testu nakładkowego do wizualizacji aktywności Streptococcus pneumoniae. Ta metoda pozwala szybko badać aktywność bakteriocyn i wykrywać peptydy quorum sensing w badaniach mikrobiologicznych.

Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe

Przeglądaj więcej filmów