Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe
30 września 2014
Konkurencja w Streptococcus pneumoniae jest wywoływana przez bakteriocyny, małe peptydy przeciwdrobnoustrojowe o działaniu hamującym w stosunku do pneumokoków i innych pokrewnych gatunków. Tutaj opisujemy zoptymalizowany test nakładki bakteryjnej, który pozwala na scharakteryzowanie aktywności bakteriocyny i spektrum hamowania, odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrywania wydzielanych peptydów quorum sensing.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja bakterii i aktywności paciorkowcowego zapalenia płuc za pomocą testu nakładkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie dźgnięcie szczepu producenta na płytkę TSA. W drugim etapie przygotowuje się nałożoną mieszaninę odkształceń, a następnie powoli pipetuje się ją na płytkę TSA zawierającą schodkowany szczep wytwórczy.
W ostatnim etapie oceniana jest aktywność bakterii. Ostatecznie test nakładkowy może być wykorzystany do wykazania braku aktywności bakterii lub produkcji feromonów przez badany szczep. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak bezpośrednie oczyszczanie bakterii, jest to, że metoda ta jest szybkim sposobem na ustalenie szeregu bakterii, braku aktywności i badanie przesiewowe wielu szczepów pod kątem bakterii w produkcji.
Procedurę zademonstruje Natalie Marchek, doktorantka w moim laboratorium. Aby przygotować bakterie w producencie, należy najpierw rozprowadzić interesujący szczep pneumokoków na 5% płytce TSA z krwią owczą i inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka nanieś od 3000 do 4 000 jednostek katalizatorów na płytki zawierające 25 mililitrów TSA i użyj sterylnych szklanych kulek, aby rozprowadzić katalizatory na płytkach. Po pozostawieniu płytek do wyschnięcia na około 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zbierz widoczną ilość bakterii na końcówkę pipety i wbij końcówkę pipety w wysuszoną płytkę TSA.
Jeśli to możliwe, uwzględnij znanego producenta grzechu bakteryjnego jako kontrolę pozytywną i szczep, który ma być użyty w nakładce jako kontrolę negatywną, zapewniając odpowiednią przestrzeń między ukłuciami, aby aureole wzrostu nie nakładały się na siebie. Następnie inkubować kultury kłute w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin w dniu poprzedzającym test nakładkowy, zaszczepić od pięciu do 10 kolonii szczepu pneumokoków do przetestowania w szklanych probówkach zawierających pięć mililitrów pożywki THY zawierającej 0,5% ekstraktu drożdżowego. Następnie zamknij pokrywki tych kultur szczepu glicerolu i inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania.
Po czterech do pięciu godzinach delikatnie odwróć probówki kilka razy, a następnie zmierz od. Gdy kultury osiągną OD dwa 60 od 0,3 do 0,5, dodaj glicerol do końcowego stężenia 20%, a następnie podziel kultury na 1,5 mililitrowe mikroprobówki wirówkowe i przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozmrozić porcję bulionu glicerolu w temperaturze pokojowej.
Następnie, tuż przed nałożeniem nakładki, wymieszaj pięć mililitrów THY 3000 z 4 000 jednostek katalizatora i 200 mikrolitrów bulionu glicerolu w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. W przypadku szczepów bakterii reporterowych dodać 50 mikrolitrów Xcel do mieszaniny nakładki, używając jednej stożkowej rurki na płytkę. Umieść nałożoną mieszaninę w temperaturze pokojowej, gdy mieszanina równoważy stopiony stały TSA w kuchence mikrofalowej, a następnie umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza.
Gdy stopiony TSA ostygnie do 55 stopni Celsjusza, szybko dodaj trzy mililitry TSA do nałożonej mieszaniny i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół za pomocą pięciomililitrowej pipety. Uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, a następnie powoli pipetować nałożoną mieszaninę bezpośrednio na wbitą płytkę TSA. Po kilku minutach, gdy płytka stwardnieje i bez obracania płytki, ostrożnie umieść nałożoną kulturę kłutą z powrotem w inkubatorze w celu przeprowadzenia posiewu przez noc.
Następnego ranka obserwuj nocny wzrost. Płytki powinny wydawać się nieprzezroczyste w wyniku wzrostu szczepu nakładki, z wyjątkiem obszarów, w których wystąpiło zahamowanie lub sygnalizacja feromonów. Istnieją dwa możliwe wyniki testu nakładkowego w tym reprezentatywnym eksperymencie.
Po całonocnym posiewie zaobserwowano strefę klirensu otaczającą dźgnięty szczep, co wskazuje, że ten szczep nakładkowy jest wrażliwy na wytwarzane grzechy bakteryjne. Zwróć również uwagę na wirowanie dźgniętego szczepu w mieszance nakładki. W tym eksperymencie szczep nakładkowy był odporny na wydzielanie bakterii, na co wskazuje brak aureoli otaczającej ukłucie.
Możliwe jest również, że dźgnięty szczep nie wydziela bakterii do testu sygnalizacyjnego. Możliwe są dwa różne wyniki. W tym eksperymencie dźgnięty szczep wydzielał feromon, który wchodził w interakcję z kinazą histydynową szczepu nakładki, co zaobserwowano w niebieskiej strefie wskazującej na rozpad xal na tym obrazie.
Jeśli feromon nie aktywuje transkrypcji locus BLP w szczepie reporterowym lub jeśli dźgnięty szczep nie wydziela feromonu, rozpad skali X nie nastąpi, jak zaobserwowano na tym obrazie Po wykonaniu tej procedury. Inne metody, takie jak analiza mutacji lub sekwencjonowanie, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy jakakolwiek znacząca aktywność hamująca jest przypisywana locus BLP, czy też jest to brak aktywności w wyniku mutacji w genie transportera.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowany test nakładki bakteryjnej (bacterial overlay assay) służący do wizualizacji aktywności Streptococcus pneumoniae. Test ten umożliwia charakteryzację aktywności bakteriocyn, odporności oraz wykrywanie peptydów quorum sensing.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Peptydy przeciwdrobnoustrojowe
- Konkurencja bakteryjna
Wprowadzenie
- Streptococcus pneumoniae konkuruje z wykorzystaniem bakteriocin.
- Bakteriociny są małymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi.
- Zrozumienie aktywności bakteriocin może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Quorum sensing odgrywa rolę w komunikacji bakteryjnej.
Cel badania
- Wizualizacja aktywności bakteryjnej przy użyciu metody nakładki (overlay assay).
- Ocena aktywności bakteriocin oraz ich spektrum hamowania.
- Wykrywanie peptydów quorum sensing.
Zastosowane metody
- Wszczepienie szczepu producenta na płytkę TSA metodą nakłucia.
- Przygotowanie i nałożenie mieszaniny szczepu nakładkowego.
- Ocena aktywności bakteryjnej po nałożeniu warstwy nakładkowej.
- Porównanie tej metody z technikami bezpośredniego oczyszczania.
Główne wyniki
- Test nakładkowy skutecznie wykazuje brak aktywności bakterii.
- Umożliwia szybki przesiew wielu szczepów.
- Demonstruje produkcję feromonów przez szczep produkujący.
- Stanowi szybką alternatywę dla istniejących metod.
Wnioski
- Zoptymalizowany test nakładkowy jest cennym narzędziem do badania bakteryjczyn.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie interakcji bakteryjnych.
- Może ona ułatwić dalsze badania nad strategiami przeciwdrobnymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test nakładkowy pozwala na szybki screening szczepów bakteryjnych pod kątem produkcji i wrażliwości na bakteriocyny, wspierając wczesną walidację celów w procesie poszukiwania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Dzięki wizualizacji interakcji konkurencyjnych i sygnalizacji quorum sensing metoda ta dostarcza wglądu w mechanizmy konkurencji bakteryjnej, co może pomóc w identyfikacji związków wiodących i ograniczaniu ryzyka w przypadku kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe. Podejście to ułatwia priorytetyzację szczepów lub szlaków o potencjale terapeutycznym przed podjęciem czasochłonnych i kosztownych prac nad ich oczyszczaniem lub charakterystyką.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie produkcji bakteriocyn z przystosowaniem konkurencyjnym w środowiskach polimikrobowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację locus blp jako determinantu antagonizmu bakteryjnego bez konieczności oczyszczania peptydów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję szczepów w ramach portfolio poprzez identyfikację tych, które wykazują aktywną sekrecję bakteriocyn, w celu dalszego ograniczania ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do późniejszego przesiewu przeciwdrobnoustrojowego poprzez potwierdzenie aktywności bakteriocyn oraz profili odporności.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje jakościowe odczyty (strefy zahamowania wzrostu, sygnały reporterowe indukowane feromonami) w wielu szczepach w celu zapewnienia powtarzalnej analizy porównawczej.
- Wartość skalowalności: Ułatwia wysokoprzepustową ocenę bibliotek szczepów, umożliwiając szybką identyfikację producentów oraz wrażliwych wskaźników do optymalizacji testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy aktywność bakteriocyn w fazie odkryć z istotnością przedkliniczną poprzez charakteryzację specyficznych dla szczepów spektrów hamowania oraz mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia, czy obserwowane hamowanie jest przypisywalne locus blp, co ogranicza liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji trafień przeciwdrobnoustrojowych.
- Dopasowanie biomarkerów: Wykrywa wydzielane peptydy quorum sensing, które mogą służyć jako biomarkery translacyjne aktywacji szlaków w środowiskach naturalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza nakładkowa (overlay assay) wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając weryfikację hipotez w procesie walidacji celu oraz umożliwiając przygotowanie testów do przepływów pracy w celu identyfikacji wiodących związków skupionych na peptydach przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotez dotyczących mechanizmów konkurencji bakteryjnej poprzez wizualizację inhibicji pośredniczonej przez bakteriocyny oraz wzorców wrażliwości specyficznych dla poszczególnych szczepów.
- Przesiewanie: Generowanie jakościowych odczytów aktywności, które służą do standaryzacji testów i zapewnienia powtarzalności kampanii przesiewowych ukierunkowanych na producentów bakteriocyn.
- Analityka: Dostarczanie mierzalnych wyników, takich jak tworzenie się stref inhibicji i aktywacja genu reporterowego (np. rozkład lacZ), w celu porównania warunków i śledzenia modulacji szlaków.
- Badania translacyjne: Powiązanie laboratoryjnych obserwacji sekrecji bakteriocyn z potencjalnym znaczeniem in vivo poprzez ocenę funkcjonalności locus blp w izolatach klinicznych lub środowiskowych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie wielokrotnego użytku platformy przesiewowej do oceny aktywności bakteriocyn w zróżnicowanych panelach szczepów, co ogranicza redundantny rozwój metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie konkurencji zapośredniczonej przez bakteriocyny.
- Wartość operacyjna: zwiększa powtarzalność i standaryzację jakościowych ocen aktywności przeciwdrobnoustrojowej pomiędzy laboratoriami.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go we wczesnych programach przeciwdrobnoustrojowych poprzez szybką identyfikację fałszywie ujemnych producentów lub szczepów odpornych.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację szczepów lub loci z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazaną funkcjonalność bakteriocyn i profile wrażliwości.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie obchodzenia się z bakteriami beztlenowymi oraz technik nakładania sterylnych warstw w celu zapobiegania kontaminacji i zapewnienia dokładnej interpretacji stref.
- Metoda jest zależna od dostępu do płytek TSA, podłoża THY, szczepów reporterowych lacZ oraz kontrolowanych warunków inkubacji (37°C, 5% CO2).
- Konieczna jest standaryzacja głębokości nakłucia, objętości nakładanej warstwy oraz czasu inkubacji, aby zapewnić powtarzalne odczyty inhibicji lub sygnałów dla różnych użytkowników.
- Należy uwzględnić zmienność kinetyki wzrostu szczepów i czasu sekrecji feromonów podczas adaptacji testu do nowych tłem genetycznych lub gatunków.
- Metoda jest ograniczona do wyników jakościowych lub półilościowych; niezbędne są metody komplementarne (np. mutageneza, sekwencjonowanie), aby potwierdzić zależność od locus blp lub funkcjonalność transportera.
