Name: Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj szybkie genotypowanie noworodków myszy i tworzenie pierwotnych kultur neuronów na warstwie glejowej. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych modeli z letalnością neonatalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują naukowcom z University of Iowa, doktorom Luisowi Tecedorowi, Ines Martins i Beverly Davidson za instrukcje i pomocne komentarze dotyczące kultur prążkowia, a także doktorom Karze Gordon, Nicole Bode i Pedro Gonzalez-Alegre za pomoc w genotypowaniu i dyskusje. Dziękujemy również dr Ericowi Weyandowi (Animal Identification and Marking Systems) za pomocne komentarze dotyczące tatuowania oraz dr Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) za pomocne komentarze dotyczące hodowli myszy. Praca ta była wspierana przez granty z American Heart Association, Departamentu Obrony (nagroda Peer Reviewed Medical Research Program W81XWH-14-1-0301), Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation i Whitehall Foundation (N.C.H.).

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Iowa.
1. Długoterminowa identyfikacja myszy za pomocą tatuowania opuszków łap
<ol>
	<li>Unieruchom łapę tak, aby opuszka łapy (powierzchnia podeszwowa) była skierowana w stronę eksperymentatora. Przytrzymaj łapę kciukiem i palcem wskazującym. Uważaj, aby nie uszczypnąć łapy. 
	UWAGA: Stabilne unieruchomienie jest ważne, aby zapewnić, że pigment tatuażu zostanie umieszczony w skórze właściwej opuszki łapy, a tym samym jest trwały 7.</li>
	<li>Przetrzyj poduszkę łapy 70% etanolem na gąbce lub waciku z gazy.</li>
	<li>Nałóż olejek do skóry na aplikator z bawełnianą końcówką i delikatnie dociśnij końcówkę do powierzchni opuszki łapy kilka razy. Używaj tylko niewielkiej ilości olejku do skóry; Występujący w dużych ilościach zapobiega przedostawaniu się pigmentu do skóry.</li>
	<li>Zanurz końcówki igieł do tatuażu w tuszu do tatuażu tuż przed tatuowaniem. Używaj czystych, aseptycznych i ostrych igieł do tatuowania, aby zmniejszyć ból i możliwość infekcji, a także zwiększyć skuteczność tatuowania.</li>
	<li>Podczas gdy powierzchnia opuszki łapy jest pokryta olejem skórnym, dociśnij końcówki igły do tatuażu pionowo i lekko do skóry pośrodku opuszki łapy i wstrzyknij tusz wiele razy. Zobacz Tabelę materiałów/sprzętu, aby uzyskać informacje na temat elektrycznego systemu tatuowania.</li>
	<li>Rozpyl 70% etanolu na gąbkę z gazy, delikatnie dociśnij ją do łapy, aby usunąć nadmiar pigmentu tatuażu z powierzchni skóry i sprawdź jakość tatuażu. Sprawdź, czy na środku opuszki łapy znajduje się ciemna, okrągła plamka, która różni się od normalnej pigmentacji skóry. Jeśli tatuaż nie jest wystarczająco ciemny lub duży, aby można go było łatwo oglądać, powtórz poprzednie kroki tatuowania.</li>
</ol>
2. Genotypowanie nowonarodzonych myszy przy użyciu zestawu do szybkiego genotypowania PCR
<ol>
	<li>Zdezynfekuj dystalny koniec ogona myszy 70% etanolem, odetnij 5 mm lub mniej końcówki ogona i przenieś ją do probówki z 8-probówkowym paskiem typu używanego do PCR. Użyj nieużywanej żyletki dla każdego szczeniaka, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Alternatywnie użyj nożyczek, ale w tym przypadku ostrożnie i dokładnie usuń pozostałą tkankę na ostrzach za pomocą 70% etanolu. Sprawdź, czy nie ma krwawienia. Jeśli wystąpi krwawienie, należy uciskać odciętą część ogona gąbką z gazy, aż krwawienie ustanie.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu do ekstrakcji DNA do każdej probówki PCR zawierającej próbkę. Zobacz Tabelę materiałów/wyposażenia, aby zapoznać się z jego składem i informacjami o zestawie.</li>
	<li>Umieść pasek probówki w termocyklerze PCR i rozpocznij ekstrakcję DNA za pomocą następującego programu: 1 cykl w temperaturze 55 °C przez 10 minut, 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut i trzymanie w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jest to ten sam termocykler PCR, który jest później używany do PCR.</li>
	<li>Po zakończeniu ekstrakcji DNA wyjmij pasek probówki z termocyklera i odwróć 5 razy.</li>
	<li>Przenieść 4 μl roztworu (ekstraktu DNA) z każdej próbki do nieużywanej probówki z 8-probówkowym paskiem i wymieszać z: 10 μl 2X PCR Ready Mix II, 2 μl zmieszanych starterów do przodu i do tyłu (zalecane przy 0,5 μM; patrz Tabela materiałów/sprzętu dla sekwencji) i 4 μl H2O wolnego od nukleaz, dla każdej próbki. Wirować krótko (np. 3 sekundy) za pomocą wirówki stołowej. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem obsługi.</li>
	<li>Wykonaj cykle termiczne. Zobacz Tabelę materiałów/wyposażenia, aby zapoznać się z programem termicznym.</li>
	<li>Wykryj produkty amplifikowanego DNA. Załadować całkowity roztwór reakcyjny z PCR (20 μl) bezpośrednio do studzienki żelu agarozowego. Załaduj markery masy cząsteczkowej do osobnej studzienki. Zastosuj pole elektryczne.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne pasm w świetle ultrafioletowym.</li>
</ol>
3. Pierwotna hodowla neuronów mózgowych myszy na warstwie glejowej
UWAGA: Procedury preparacji mózgu i dysocjacji komórek (3.1) są wspólne dla wszystkich późniejszych procedur. Procedury dla hodowli gleju myszy (3.2), hodowli gleju szczurów (3.3) i hodowli neuronów myszy (3.4) opisano oddzielnie poniżej.
<ol>
	<li>Rozwarstwienie mózgu i dysocjacja komórkowa
	<ol>
		<li>Złożyć w ofierze jedno młode myszy lub szczura przez ścięcie, szybko usunąć mózg i umieścić go w roztworze Hanksa (patrz Tabela 1 dla składu) + 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w naczyniu o średnicy 35 mm (trzymanym na lodzie).</li>
		<li>Przetnij mózg przez linię środkową na dwie półkule. Usuń obszar zainteresowania (np. korę mózgową, prążkowie i hipokamp) z każdej półkuli mózgu. Usuń opony mózgowe i główne naczynia krwionośne z powierzchni. Pokrój obszar mózgu na 4-10 cienkich plasterków za pomocą ostrza chirurgicznego.</li>
		<li>Wypłucz plastry mózgu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, raz roztworem Hanksa + 20% FBS, a następnie 3 razy roztworem Hanksa (tj. bez surowicy) (wszystko w temperaturze 4 °C). Aby spłukać, dodaj 5-10 ml roztworu, pozwól plasterkom mózgu osiąść na dnie probówki, odessaj roztwór od góry i dodaj świeży roztwór. Zakończ procedurę płukania, odsysając roztwór.</li>
		<li>Przefiltrować 2 ml roztworu wytrawiającego zawierającego trypsynę (patrz tabela 1 dla składu) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i filtra strzykawkowego 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do probówki zawierającej wycinki mózgu. Pozwól trypsynizacji postępować przez 13 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zneutralizować roztwór trypsyny najpierw przez zasysanie jego większości, a następnie przez dodanie 7-10 ml roztworu Hanksa + 20% FBS (4 °C).</li>
		<li>Wycinki mózgu opłukać dwukrotnie roztworem Hanksa + 20% FBS, a następnie trzy razy roztworem Hanksa (tj. bez surowicy) (wszystko w temperaturze 4 °C). Zakończ procedurę płukania, odsysając roztwór.</li>
		<li>Przefiltrować 2 ml roztworu dysocjacyjnego (patrz tabela 1 dla składu) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i filtra strzykawkowego 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do probówki z plastrami mózgu.</li>
		<li>Mechanicznie dysocjuj komórki, delikatnie rozcierając 10-20 razy, aż znikną widoczne kawałki tkanki. Użyj bawełnianej, wypolerowanej pipety Pasteura i unikaj tworzenia pęcherzyków podczas rozcierania.</li>
		<li>Odczekaj 3 minuty, aż małe kawałki się usiądą.</li>
		<li>Przenieść większość roztworu (~1,5 ml, pozostawiając trochę roztworu na dnie) do 15 ml probówki wirówkowej, która zawiera 3 ml roztworu Hanksa + 20% roztworu FBS (4 °C), używając bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura. Nie przenoś całego roztworu, ponieważ włączenie jakiegokolwiek osadu na dnie zwykle powoduje pogorszenie jakości kultury.</li>
		<li>Wirować przez 13 minut przy ~185 g (~1 100 obr./min) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Delikatnie odessać supernatant, dodać 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego (37 °C) do osadu i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując kilkakrotnie za pomocą bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura. 
		UWAGA: Do różnych celów hodowlanych stosuje się trzy różne rodzaje pożywek galwanicznych: pożywkę posiewającą-1 dla komórek glejowych myszy, pożywkę posiewającą-2 dla neuronów myszy oraz pożywkę posiewającą-3 dla neuronów szczurów i komórek glejowych (patrz tabela 1 dla kompozycji).</li>
		<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórek, wymieszać ją z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego i zmierzyć gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowle gleju myszy
	<ol>
		<li>Umyj szkiełka nakrywkowe, aby pomóc w ustaleniu zdrowych kultur komórek myszy.
		<ol>
			<li>Zanurz szklane szkiełka nakrywkowe (okrągłe, o średnicy 12 mm) w 70% kwasie azotowym w szklanej szalce Petriego. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i umieścić ją na wytrząsarce orbitalnej O/N.</li>
			<li>Opłucz szklane szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego co najmniej trzy razy wodą destylowaną. Zanurz je w wodzie destylowanej. Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej O/N.</li>
			<li>Wysuszyć szkiełka nakrywkowe na bibule filtracyjnej Whatman 150 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
			<li>Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie.</li>
			<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oznacz i genotyp nowonarodzonych myszy zgodnie z krokami 1 i 2.</li>
		<li>Uzyskaj komórki mózgowe od szczeniąt myszy, zgodnie z krokiem 3.1. 
		UWAGA: Użycie kory mózgowej jest typowe dla przygotowania warstwy zasilającej glej myszy. Jednak inne obszary mózgu, takie jak hipokamp i prążkowie, będą działać po odpowiednim dostosowaniu gęstości komórek ze względu na różną liczbę i wydajność komórek z różnych regionów.</li>
		<li>Dodać ~4 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1 do końcowej zawiesiny komórek (~1 ml). W celu wstępnego podgrzania pożywki hodowlanej należy umieścić roztwór w inkubatorze hodowli (5% CO2-95% O2, 37 °C) O/N, aby umożliwić ustabilizowanie się wartości temperatury i pH.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do niepowlekanej kolby hodowlanej T25 za pomocą bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli.</li>
		<li>Po 1 dniu in vitro (DIV) przepłukać wyhodowane komórki w kolbie T25 dwukrotnie pożywką galwaniczną o temperaturze 1 (4 °C). Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Płukanie przeprowadzić poprzez całkowite zassanie pożywki do wnętrza kolby za pomocą pipety Pasteura, dodanie ~5 ml świeżej pożywki i delikatne przechylenie kolby kilka razy w ruchu wirowym.</li>
		<li>W 6-9 DIV (tj. na jeden dzień przed trypsynizacją i posiewem na szkiełkach nakrywkowych, w krokach 3.2.8-3.2.13), umieścić 100 μl materiału powlekającego z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (uwagi dotyczące materiału powlekającego znajdują się w Tabeli materiałów/urządzeń) na szklanych szkiełkach nakrywkowych w naczyniu do hodowli i umieścić szalkę do hodowli w inkubatorze do hodowli.</li>
		<li>Przy 7-10 DIV, gdy komórki są w 20-40% zlewające się (przestrzennie ciągłe), trypsynizuj je.
		<ol>
			<li>Przepłukać kolbę jeden raz, zasysając cały roztwór z kolby i dodając ~13 ml roztworu Hanksa (4 °C), delikatnie przechylić kolbę kilka razy ruchem wirowym i całkowicie zassać roztwór.</li>
			<li>Dodać 40 μl roztworu DNazy (stężenie końcowe, 750 jednostek/ml) do 4 ml roztworu trypsyny-EDTA, przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do komórek w kolbie.</li>
			<li>Pozostawić trypsynizację do dezynfekcji na 13 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
			<li>Zneutralizować roztwór trypsyny, dodając do kolby 2 ml 100% FBS (4 °C).</li>
			<li>Przenieść trypsynizowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności od 5 do 10 ml, dodać ~4 ml roztworu Hanksa + 20% FBS (4 °C), odwirować przy ~185 g i 4 °C przez 13 minut i odessać supernatant.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1.</li>
		<li>Zmierzyć gęstość komórek zgodnie z krokiem 3.1.13.</li>
		<li>Całkowicie odessać materiał powlekający ze szklanych szkiełek nakrywkowych i umieścić ~50 μl zawieszonych komórek glejowych na szkiełkach nakrywkowych. 
		UWAGA: Komórki te utworzą warstwę zasilającą glej.</li>
		<li>Umieścić naczynie hodowlane ze szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze.</li>
		<li>20-60 minut później dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1 do każdej studzienki i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze. Uwaga: Podczas dodawania podłoża galwanicznego pomocne będzie użycie innej pipety w celu dociśnięcia obwodu szkiełka nakrywkowego (w miejscu, w którym nie ma platerowanych komórek), tak aby szkiełko nakrywkowe nie unosiło się w podłożu.</li>
		<li>W 1 DIV warstwy zasilającej glejowej (tj. na szklanym szkiełku nakrywkowym) zastąpić pożywkę 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1, zasysając cały roztwór do studzienki, a następnie napełniając go świeżą pożywką.</li>
		<li>Przy 2-3 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki są w 80-100% zlewane, dodać inhibitor mitotyczny (10 μl mieszaniny 5-fluoro-2'-deoksyurydyny + urydyny; końcowe stężenia odpowiednio 81,2 i 204,8 μM) do każdej studzienki, aby zahamować replikację DNA, a tym samym zahamować proliferację komórek glejowych.</li>
		<li>Przy 7-9 DIV, gdy komórki są w 90-100% zlewające się (1-2 godziny przed posiewem neuronów na glejowej warstwie zasilającej), zastąp pożywkę hodowlaną wstępnie podgrzanym podłożem galwanicznym-2 (37 °C). 
		UWAGA: Neurony zostaną posiane tego samego dnia, przy użyciu kroku 3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultury glejowe szczurów
	<ol>
		<li>Pokryj kolbę hodowlaną T25 tym samym materiałem powłokowym. 
		UWAGA: Jest to konieczne do późniejszego usunięcia nieprzylegających komórek w kroku 3.3.5.
		<ol>
			<li>Dodać 2,0 ml materiału powlekającego do kolby i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli.</li>
			<li>Po 2-3 godzinach całkowicie zassać materiał powlekający, tak aby dno kolby wyschło.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobrać komórki od młodych szczurów, zgodnie z krokiem 3.1. 
		UWAGA: Region CA3-CA1 hipokampa służy do przygotowania warstwy zasilającej glej szczurów. Jednak inne obszary mózgu, takie jak kora mózgowa i prążkowie, będą działać po dostosowaniu do różnic w gęstości komórek spowodowanych różną liczbą i wydajnością komórek z różnych regionów.</li>
		<li>Dodać ~4 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-3 do końcowej zawiesiny komórek (~1 ml).</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do powlekanej kolby hodowlanej T25 za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli (5% CO2-95% O2, 37°C).</li>
		<li>Przy 2-3 DIV, gdy komórki zlewają się w 20-40%, usunąć nieprzylegające lub słabo przylegające komórki, szczelnie zamykając pokrywkę, energicznie potrząsając kolbą ~10 razy, zasysając roztwór i dodając 4-5 ml podłoża galwanicznego-3 (w temperaturze 4 °C). Powtórz tę procedurę raz. Zbadaj hodowane komórki na całym dnie kolby (np. za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym), aby potwierdzić, że te, które wydają się neuronalne (tj. te, dla których zewnętrzna krawędź ciała komórki wydaje się jasna fazowo) są całkowicie usunięte. Powtarzaj procedurę tak często, jak to konieczne, aby usunąć te komórki, a następnie umieść kolbę z powrotem w inkubatorze. 
		UWAGA: Moc i całkowita wymagana liczba "wstrząsów" może się różnić w zależności od poszczególnych eksperymentatorów. Ważne jest, aby nie utrzymywać całkowitej liczby wstrząsów do ustalonej liczby, ale potwierdzić, że komórki podobne do neuronów są eliminowane.</li>
		<li>Przy 6-8 DIV, gdy komórki są w 90-100% zlewne, przejdź przez komórki glejowe, trypsynizując je, jak w kroku 3.2.8.</li>
		<li>Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C), dodać 10 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C), przenieść trypsynizowane komórki do niepowlekanej kolby T75 i wyhodować je w inkubatorze. 
		UWAGA: Komórki glejowe szczurów zostaną pasażowane dwukrotnie; W przeciwieństwie do tego, komórki glejowe myszy są pasażowane tylko raz, ponieważ stają się niezdrowe po wielu przejściach. Komórki glejowe szczurów zostaną przepuszczone w kolbach T75, które nie są pokryte żadnym materiałem powlekającym. Powłoka pozwala komórkom glejowym szczura rosnąć zbyt szybko i wytwarzać wiele komórek rzęskowych (przypuszczalnych komórek wyściółki), które później pogorszą stan hodowli neuronów.</li>
		<li>W temperaturze 17-19 działek hodowli glejowej w kolbie (tj. 11 dni po pasażowaniu i jeden dzień przed trypsynizacją i posiewem na szkiełkach nakrywkowych w krokach 3.3.9-3.3.14) umieścić 100 μl materiału powlekającego na niemytych szklanych szkiełkach nakrywkowych (okrągłych, o średnicy 12 mm) w naczyniu hodowlanym i umieścić szalkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli. 
		UWAGA: W przypadku kultur glejowych szczurów nie zauważono różnicy w wynikach hodowli z myciem szkiełek nakrywkowych lub bez niego.</li>
		<li>Przy 18-20 DIV hodowli glejowej w kolbie (tj. 12 dni po pasażowaniu) należy przygotować warstwę zasilającą glej, trypsynizując hodowane komórki, zgodnie z krokiem 3.2.8.</li>
		<li>Podczas wirowania należy całkowicie odessać materiał powlekający ze szklanych szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Po odwirowaniu zawiesić osad w 1 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C) i zmierzyć gęstość komórek, zgodnie z krokiem 3.1.13.</li>
		<li>Dostosuj gęstość glejową do 104 żywych komórek/ml i umieść 100 μl zawiesiny komórek glejowych na szkiełkach nakrywkowych z powlekanego szkła. 
		UWAGA: Komórki te utworzą warstwę zasilającą glej.</li>
		<li>Umieść naczynie hodowlane ze szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze na 20-60 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml podłoża galwanicznego o temperaturze 3 (4 °C) do każdej studzienki i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Przy 3-4 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki na szkiełku nakrywkowym są w 40-80% zlewne, dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (patrz Tabela 1 dla składu), która zawiera cytozynę β-D-arabinofuranozyd (AraC, końcowe stężenie 4 μM), aby zatrzymać proliferację komórek glejowych. Umieść neurony w 7-9 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki są w 60-80% zlewne, wykonując krok 3.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowle neuronów myszy
	<ol>
		<li>Oznacz i genotyp nowonarodzonych myszy zgodnie z krokami 1 i 2.</li>
		<li>Użyj szczeniąt myszy w kroku 3.1.</li>
		<li>Dostosuj gęstość zawiesiny żywych komórek do ~2,0 x 105 komórek/ml za pomocą wstępnie podgrzanego pożywki posiewającej-2 do posiewu na komórkach glejowych myszy lub przy użyciu pożywki pożywki-3 do posiewu komórek glejowych szczurów.</li>
		<li>Umieść komórki na warstwie zasilającej glej, delikatnie dodając zawiesinę komórkową do pożywki hodowlanej w każdym dołku. Uwaga: Objętość zawiesiny komórek, która ma zostać dodana, zostanie określona na podstawie docelowej liczby komórek w basenie hodowlanym. Na przykład płytka ~ 60 μl zawiesiny komórek, aby osiągnąć 12 000 komórek / studnię.</li>
		<li>Należy pamiętać, że po pokryciu neuronów nie są konieczne żadne zmiany roztworu. Należy uważać, aby uniknąć odparowania roztworu ze studzienek w trakcie hodowli, nawilżając wnętrze inkubatora kultur.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autor (Zhengmin Huang) jest prezesem firmy EZ BioResearch LLC, która produkuje odczynniki opisane w tym artykule.

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje procedury tatuowania w celu znakowania/identyfikacji myszy, genotypowania myszy na podstawie końcówek ogonów oraz hodowli neuronów mózgowych myszy o niskiej gęstości. W jednej rundzie eksperymentów z udziałem 6-8 szczeniąt, procedury te zwykle wymagają odpowiednio ~0,5 godziny, ~4 godziny i ~2 godziny, w sumie 6-7 godzin. To sprawia, że praktyczne jest, aby pojedynczy eksperymentator wykonał wszystkie procedury niezbędne od momentu narodzin szczeniąt do posiewu kultur neuronalnych – ...

Modele chorób genetycznych gryzoni okazały się przydatne w ustalaniu fizjologicznych funkcji normalnych białek i kwasów nukleinowych, a także patofizjologicznych konsekwencji ich defektów. Przykłady obejmują myszy z niedoborem białek zaangażowanych w kluczowe funkcje komórkowe, a także mysie modele zaburzeń, takich jak choroba Alzheimera. Jednak niektóre manipulacje genetyczne mogą prowadzić do śmiertelności noworodków wkrótce lub kilka dni po urodzeniu. W takich przypadkach pierwotne hodowle komórkowe są ważnym narzędziem, ponieważ żywe komórki można uzyskać od embrionalnych lub nowonarodzonych szczeniąt przed śmiercią, można je utrzymywać przez co najmniej kilka tygodni in vitro, a w tym czasie wczesny rozwój neuronów można śledzić za eksperymentami biochemicznymi, funkcjonalnymi i morfologicznymi. W przypadku kultur pierwotnych korzystne może być ułożenie neuronów na płytkach o niskiej gęstości; Dzięki temu możliwe jest uwidocznienie poszczególnych somatów, dendrytów, trzonów aksonalnych i zakończeń nerwowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Jednak przetrwanie i różnicowanie neuronów przy niskiej gęstości zazwyczaj wymaga, aby były one posiane na warstwie zasilającej glej, współhodowane z komórkami glejowymi przy braku kontaktu fizycznego z nimi lub hodowane w pożywce kondycjonowanej przez glej 1.
Tworzenie kultur neuronalnych o niskiej gęstości na warstwach zasilających glej może być zależne od szybkiego i niezawodnego genotypowania - w ciągu kilku godzin, a nie kilku dni. Szybkość jest szczególnie ważna, gdy genotyp neuronów musi być dopasowany do genotypu przygotowanej wcześniej warstwy zasilającej glej. Jako bardziej praktyczny przykład, może być konieczne podjęcie decyzji, które młode o jakim genotypie wykorzystać w tworzeniu kultur, aby zoptymalizować wydajność eksperymentu.
Tutaj demonstrujemy działający protokół, który został użyty do szybkiego, uproszczonego i niezawodnego genotypowania myszy w poprzednich publikacjach 2-6. Używane są ogonki pod mysz i dostępny w handlu zestaw. Protokół ten obejmuje jednoetapową ekstrakcję kwasów nukleinowych z tkanki i nie wymaga ani etapu oczyszczania kwasów nukleinowych, ani użycia buforu terminacyjnego ("roztwór zatrzymujący"). Wiarygodność tej metody genotypowania ilustruje przedstawienie wyników serii testów, w których wprowadzono różnice w odniesieniu do wyjściowej ilości próbek, wieku zwierząt i długości amplikonów PCR. Ten zestaw oferuje zalety automatycznej ekstrakcji i niezawodności.
Dla kompleksowości, pokazano również użycie tatuowania do długoterminowej identyfikacji zgenotypowanych myszy. Tatuowanie odbywa się poprzez nałożenie tuszu do tatuażu na skórę właściwą (pod naskórkiem) 7. Opisano procedurę tatuowania opuszków łap nowonarodzonych lub 1-dniowych myszy, chociaż tatuaże można wykonywać na innych częściach ciała, takich jak ogony i palce u nóg, oraz na zwierzętach w każdym wieku. Ponadto zademonstrowane zostaną procedury posiewu i hodowli neuronów myszy o niskiej gęstości, oparte na zoptymalizowanym przygotowaniu różnych typów warstw zasilających glej 2,8.
Używamy genetycznego mysiego modelu dziedzicznego zaburzenia neurologicznego dystonii DYT1 - autosomalnie dominującego zaburzenia ruchowego spowodowanego mutacją w genie TOR1A (c.904_906delGAG/c.907_909delGAG; p.Glu302del/p.Glu303del) 9. Kodowane białko, torsinA, należy do rodziny białek "ATPaz związanych z różnorodną aktywnością komórkową" (AAA+), których członkowie na ogół pełnią funkcje podobne do białek, pomagając w: rozwijaniu białek, rozkładaniu kompleksu białkowego, transporcie błonowym i fuzji pęcherzyków 10-13. Mutacja powoduje delecję kodonu kwasu glutaminowego w ramce i może prowadzić do manifestacji "uogólnionej izolowanej dystonii o wczesnym początku" 14,15. Jednak mechanizmy patofizjologiczne odpowiedzialne za to zaburzenie pozostają słabo poznane. W modelu myszy typu knock-in zmutowanym allelem jest Tor1atm2Wtd, wymieniony dalej jako Tor1aΔE. Heterozygotyczne myszy knock-in ΔE-torsinA są żywotne i genetycznie naśladują ludzkich pacjentów z dystonią DYT1, podczas gdy homozygotyczne myszy knock-in umierają po urodzeniu 16,17, przy czym na ulatencję do śmierci pourodzeniowej wpływa podłoże genetyczne 18. Wczesna śmierć homozygotycznych myszy knock-in wymaga, aby zarówno genotypowanie zwierząt, jak i tworzenie kultur neuronalnych zostało szybko zakończone. Jako kolejny przykład genotypowania zostanie wykorzystany Tfap2a (czynnik transkrypcyjny AP-2α, aktywujące białko wiążące wzmacniacz 2α). Białko kodowane przez ten gen jest ważne w regulacji wielu procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie, przeżycie i apoptoza 19.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI - Maszyna do tatuażu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cleanser</td><td>Systemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Służy do czyszczenia igieł i uchwytu po tatuowaniu.</td></tr><tr><td>Suszarka maszynowa</td><td>Systemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Służy do suszenia igieł i uchwytu po czyszczeniu.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Black Pigment</td><td>Systemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do przygotowania skóry</td><td>Systemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.</td><td>Końcówka Q</td> <td>NSPA1</td>.</tr><tr><td>Rozwiązanie do przygotowania skóry</td><td>Systemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Ten odczynnik dostarcza cienką warstwę oleju, która zwiększa efektywność tatuowania i zapobiega blaknięciu tatuażu, poprzez: (informacje od dostawcy): 1) zapobiegając tymczasowemu zabrudzeniu skóry niewytatuowanej, umożliwiając w ten sposób łatwą ocenę jakości tatuażu na opuszkach łap, zanim szczeniak wróci do swojej domowej klatki &ndash; Poplamioną powierzchnię skóry można pomylić ze skórą wytatuowaną, 2) zmniejszenie uszkodzeń skóry podczas tatuowania &ndash; Zmiękczenie skóry i nasmarowanie igły pomoże igle wniknąć w skórę bez powodowania uszkodzenia skóry oraz 3) zapobiegnie przedostawaniu się tlenu cząsteczkowego do skóry, zmniejszając w ten sposób reakcje zapalne na reaktywne formy tlenu, które mogą być generowane.</td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI - genotypowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Zestaw do genotypowania Fast Tissue/Tail PCR (format probówki paskowej)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Czerwony, ładujący barwnik do elektroforezy jest zawarty w roztworze 2X PCR Ready Mix.</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy tkanek A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Przygotuj roztwór do ekstrakcji DNA, mieszając 20 i mikro; l roztworu do lizy tkanek A i 180 &mikro; l roztworu do lizy tkanek B na próbkę.</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy tkanek B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Przygotuj roztwór do ekstrakcji DNA, mieszając 20 i mikro; l roztworu do lizy tkanek A i 180 &mikro; l roztworu do lizy tkanek B na próbkę.</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Gatunek zoptymalizowany pod kątem agarozy, klasa do biologii molekularnej</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>Stosujemy 2% żele agarozowe w buforze TAE zawierające barwnik żelowy SYBR Safe DNA (rozcieńczony 10 000-krotnie) lub bromek etydyny (0,5 &mikro; g/ml objętości żelu).</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet, bez aerozolu, 0,1-10 i mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Używaj sterylnych końcówek do pipet, które są wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem, końcówki filtrujące Premium Fit, 0,5-20 i mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Używaj końcówek do pipet, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem, końcówki filtrujące Premium Fit, 1-200 i mikro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Używaj sterylnych końcówek do pipet, które są wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</td></tr><tr><td>Marker masy cząsteczkowej, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Używamy jednego z tych trzech markerów masy cząsteczkowej.</td></tr><tr><td>Marker masy cząsteczkowej, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Marker masy cząsteczkowej, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR, 8-probówkowe paski z indywidualnie mocowanymi górnymi nakrętkami kopułkowymi, naturalne, 0,2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy. Pasek z 8 probówkami jest łatwiejszy w obsłudze i grupowaniu próbek niż pojedyncze probówki.</td></tr><tr><td>Probówki PCR, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy.</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek Seal-Rite 0,5 ml, naturalna</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy.</td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA * 10 000x stężenie w DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Startery do amplifikacji genu Tor1a w &Delta; Myszy knock-in E-torsinA:</td><td></td><td></td><td>5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CCC, CC-3' (do przodu) i 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, AC, AAC, CAC-3' (do tyłu) (odniesienie 18). Startery te zastosowano w końcowym stężeniu 1,0 ng/&mikro; l (~0,16 &mikro; M) (odniesienie 2).</td></tr><tr><td>Startery do amplifikacji genu Tfap2a u myszy</td><td></td><td></td> typu dzikiego <td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (do przodu), 5'-CGT GTG GCT GTT GTT GTT GCT GAG GTA-3' (do tyłu) dla amplikonu 498-bp, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (do przodu), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GGA GAT CAT TC-3' (do tyłu) dla amplikonu 983-bp, oraz 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (do przodu), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (do tyłu) dla amplikonu z 1990 r. Te podkłady są używane w temperaturze 0,5 &mikro;M.</td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI - hodowla</td><td></td><td></td><td></td>komórkowa</tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Zobacz sekcję komentarzy urydyny, aby uzyskać więcej informacji.</td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 35 x 10 mm, kolby</td> do hodowli komórkowych BD <td>353001</td><td></td><td>poddane</td> działaniu kultur</tr><tr><td>tkankowych, T25, poddane działaniu kultur tkankowych, z nasadką z zatyczką, 25 cm2 Obszar wzrostu, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych, T75, poddane działaniu kultur tkankowych, z przechyloną szyjką, wentylowana nasadka, 75 cm2 Obszar wzrostu, 250 ml</td><td></td> Probówka stożkowa 353136 <td></td><td>BD falcon</td></tr>, <tr><td>polipropylen, 15 ml</td><td></td> Szkiełka komorowe <td>BD falcon</td> 352095 <td></td></tr><tr><td>Countess (licznik numerów komórek)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-Arabinofuranozyd chlorowodorek (chlorowodorek Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza (dekstroza) bezwodna, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie, szkło Petriego 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNaza Typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>Roztwór podstawowy przygotowuje się w stężeniu 1 500 jednostek/20 &mu; l = 75 000 jednostek/ml w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka glukoza, GlutaMAX, pirogronian</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, membrana o średnicy 50 mm, 0,2 &micro; m Wielkość porów</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Szybka jednostka filtrująca PES, 500 ml, membrana o średnicy 90 mm, 0,2 i mikro; m Wielkość porów</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 12 mm Okrągłe, grubość 0,09&ndash; 0,12 mm, nr 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sole zrównoważone Hanksa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (miareczkowanie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, 37%, odczynnik A.C.S</td><td>. Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4&bull;( 7H2O), BioUltra, &ge; 99,5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Roztwór do membrany podstawnej, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Jest to materiał powłokowy do szkiełek nakrywkowych i kolb. 1) Aby go przygotować, rozmrozić roztwór Matrigel Basement Membrane Matrix na lodzie, co zwykle zajmuje ~1 dzień. Za pomocą wstępnie schłodzonej pipety rozprowadzić rozmrożony roztwór do wstępnie schłodzonych kolb T25 na lodzie i przechowywać kolby w temperaturze -20 °C. Aby przygotować roboczy roztwór Matrigel, należy rozmrozić podzielony Matrigel w kolbie na lodzie, rozcieńczyć 50-krotnie, dodając wstępnie schłodzony roztwór MEM i utrzymywać rozcieńczony roztwór w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby wstępnie schłodzić wszystkie kultury i podłoża, które mają kontakt z Matrigel, z wyjątkiem okresu powlekania szkiełek nakrywkowych i po ich powlekaniu, aby zapobiec przedwczesnemu tworzeniu się żelu. 2) Aby pokryć szklane szkiełka nakrywkowe lub kolby hodowlane preparatem Matrigel, należy nałożyć roztwór Matrigel na powierzchnię. Przed poszyciem komórek ważne jest, aby całkowicie wysuszyć powierzchnię. W tym celu pomocne może być zasysanie Matrigelu podczas wirowania komórkowego bezpośrednio przed posiewem komórek i pozostawienie wystarczającej ilości czasu na wyschnięcie.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Przedłużacz surowicy, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe, 24-dołkowe płytki BD Falcon 353047</td><td></td><td></td><td></td>poddane kulturze</tr><tr><td>tkankowej, płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowej</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), płyn</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Kwas azotowy</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (suplement neuronalny) 21&nbsp;</td><td>przygotowane w laboratorium</td><td></td><td>Źródło: odniesienie 69</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, 5 i frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Użyj tego bawełnianego wkładu 5 i frac34; &rdquo; Pipeta Pasteura do rozcierania komórkowego. Wcześniej wypoleruj końcówkę na gorąco, aby wygładzić powierzchnię cięcia i zmniejszyć średnicę wewnętrzną do 50-80% oryginału. Zbyt mała końcówka zakłóci pracę komórek i zmniejszy ich żywotność, ale zbyt duża końcówka zmniejszy skuteczność rozcierania.</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, 9" &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl), SigmaUltra, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 5 ml&nbsp;</td><td>Pipeta serologiczna 357543</td><td></td><td></td>sokolak</tr> BD, <tr><td>10 ml</td><td>Pipeta sokol</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 25 ml</td><td>Pipeta sokoła 357525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD, 50 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3, wodorowęglan sodu), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH), granulki, 99,998% metali śladowych na bazie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO4&bull;( 7H2O)), &ge; 99,99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, SigmaUltra, &ge; 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, sterylny, 0,2 i mikro; m</td> Strzykawka do <td>431219</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna, Holo, osocze bydlęce</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie błękitem trypanowym, 0,4%</td> <td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Służy do liczenia żywych/martwych komórek. Wymień stary roztwór błękitu trypanowego, jeśli jest ponownie używany wiele razy (np. kilka razy w tygodniu przez kilka tygodni), ponieważ spowoduje on wytrącenie się osadów i spowoduje błędne odczyty gęstości komórkowej.</td></tr><tr><td>Trypsyna, typ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA, 0,25%&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>Roztwór podstawowy przygotowuje się w 50 mg 5-fluoro-2'-deoksyurydyny i 125 mg urydyny w 25 ml DMEM (odpowiednio 8,12 i 20,48 mM).</td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI - immunocytochemia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało, królicze poliklonalne przeciwciało anty-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>, mysi monoklonalny koktajl anty-GFAP</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT - tatuaż</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Ten system tatuażu noworodków gryzoni to system elektryczny, który działa poprzez szybkie przesuwanie 1- lub 3-punktowych igieł do tatuażu pionowo w głąb skóry. Aktywuj maszynkę do tatuażu raz na około 0,5 sekundy, podczas gdy końcówki igieł do tatuażu są trzymane prostopadle do powierzchni skóry. Preferujemy tatuowanie trzyigłowe, aby zmaksymalizować wytatuowany obszar, ale tatuowanie jednoigłowe jest skuteczne na węższych obszarach, np. palcach u nóg lub jeśli konieczna jest precyzyjna kontrola mechaniczna, np. gdy tatuowane są liczby. Dwie rundy tatuowania z najmniejszą prędkością (ustawienie "1" z 3 kroków) są zazwyczaj wystarczające, aby uzyskać widoczny i długotrwały tatuaż opuszków łap.</td></tr><tr><td>WYPOSAŻENIE - system do genotypowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza, poziomy, Wide Mini&#8211; Komórka podrzędna GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>Typowe parametry elektroforezy to natężenie pola elektrycznego o natężeniu 6 V/cm i czas trwania 25 minut dla żelu o długości 10 cm.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Nasze reakcje PCR dla genu Tor1a w &#916; Myszy knock-in E-torsinA są następujące: 1 cykl denaturacji w 94 &#176; C przez 3 minuty, 35 cykli denaturacji w 94 &#176; C przez 30 sekund, wyżarzanie w temperaturze 58 &#176; C przez 30 sekund, przedłużenie na 72 i #176; C przez 2 min. Po tym następuje ostateczne rozszerzenie na 72 i #176; C przez 10 minut i trzymając w temperaturze 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Zasilacz, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT - hodowle</td><td></td><td></td><td></td>komórkowe</tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Ten automatyczny licznik komórek oddzielnie mierzy gęstość żywych i martwych komórek (odpowiednio niebarwionych i barwionych błękitem trypanowym). Ważne jest, aby znać optymalny zakres pomiarów gęstości: licznik, którego używamy, ma najwyższą dokładność w zakresie od 1 x 105 do 4 x 106 komórek/ml. Jeśli zmierzone wartości gęstości komórek wykraczają poza zalecany zakres, należy odpowiednio wyregulować objętość ponownego zawieszenia.</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa II, typ A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Ten kaptur jest używany do wszystkich procedur hodowli komórkowych, z wyjątkiem sekcji mózgu.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2, AutoFlow, kontrola wilgotności Płaszcz wodny</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Pozioma czysta ławka</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Ta czysta ławka służy do sekcji mózgu (kroki 3.1.1 i 3.1.2 "Rozwarstwienie mózgu i dysocjacja komórkowa)".</td></tr><tr><td>Wytrząsarka wolnoobrotowa Orbit LS</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Superspeed Wirówka</td><td>Fisher</td><td>46910 (wirówka)/46922 (wirnik)</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Analiza morfologii i funkcji neuronów ssaków w wysokiej rozdzielczości często wymaga genotypowania poszczególnych zwierząt, a następnie analizy pierwotnych kultur neuronów. Opisujemy zestaw procedur dotyczących: znakowania nowonarodzonych myszy do genotypowania, szybkiego genotypowania i ustanawiania kultur neuronów mózgowych o niskiej gęstości od tych myszy. Poszczególne myszy są znakowane poprzez tatuowanie, co pozwala na długotrwałą identyfikację trwającą do wieku dorosłego. Genotypowanie według opisanego protokołu jest szybkie i wydajne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasu nukleinowego z dobrą niezawodnością. Jest to przydatne w okolicznościach, w których nie ma wystarczającej ilości czasu na konwencjonalne genotypowanie, np. u myszy cierpiących na śmiertelność noworodków. Pierwotne hodowle neuronów są generowane przy niskiej gęstości, co umożliwia eksperymenty obrazowe w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Ta metoda hodowli wymaga przygotowania glejowych warstw zasilających przed posiewem neuronów. Protokół stosuje się w całości do mysiego modelu dystonii zaburzeń ruchowych DYT1 (myszy knock-in ΔE-torsinA), a hodowle neuronów są przygotowywane z hipokampa, kory mózgowej i prążkowia tych myszy. Protokół ten można zastosować do myszy z innymi mutacjami genetycznymi, a także do zwierząt innych gatunków. Co więcej, poszczególne komponenty protokołu mogą być wykorzystywane do izolowanych podprojektów. Tym samym protokół ten będzie miał szerokie zastosowanie, nie tylko w neurobiologii, ale także w innych dziedzinach nauk biologicznych i medycznych.

Jako przykład zastosowania tego protokołu, pokazane są reprezentatywne wyniki dla znakowania myszy za pomocą tatuowania, niezawodnego genotypowania w różnych warunkach eksperymentalnych i zakładania pierwotnych kultur neuronalnych na warstwach zasilających glej.
Tatuowanie
Nowonarodzone szczenięta zostały oznaczone na opuszkach łap za pomocą systemu do tatuowania ("Noworodek" na rysunku 1). Etykiety były wyraźnie widoczne w wieku 3 ...

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Ogólnym celem tej procedury jest genotypowanie nowonarodzonych myszy i wygenerowanie kultur neuronalnych o niskiej gęstości na glejowej warstwie zasilającej. Osiąga się to poprzez szybkie genotypowanie nowonarodzonych myszy za pomocą końcówek ogonów w drugim kroku. Tego samego dnia mózgi są preparowane i hodowane jako warstwy żywicielskie gleju.Następnie, po kilku tygodniach, kolejna grupa nowonarodzonych myszy jest szybko genotypowana, a komórki neuronalne są generowane z mózgów zwierzęcia do hodowli na poprzednich warstwach gleju. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do szybkiego i niezawodnego genotypowania, a także do generowania zdrowych neuronów i komórek glejowych. Istnieją dwie główne zalety tego protokołu.Jednym z nich jest to, że możemy hodować zdrowe neurony o bardzo niskiej gęstości do eksperymentów obrazowych, umieszczając je na glejowej warstwie płodu. Drugą zaletą jest to, że nowonarodzone myszy mogą być genotypowane w ciągu kilku godzin, co pozwala na dopasowanie genotypów neuronów i glejowej warstwy płodowej. Jestem asystentem naukowym w laboratorium Harta.Zademonstruję procedury genotypowania i hodowli. Zacznij od dodania 200 mikrolitrów roztworu do ekstrakcji DNA do każdej probówki PCR zawierającej próbkę. Umieść pasek probówki w termocyklerze PCR, a następnie rozpocznij ekstrakcję DNA po zakończeniu ekstrakcji.Wyjmij pasek rurki z termocyklera i odwróć rurki pięć razy. Następnie przenieś cztery mikrolitry ekstraktu DNA z każdej próbki do nieużywanej probówki na pasku z ośmioma probówkami i wymieszaj próbkę z 10 mikrolitrami dwóch gotowych XPCR. Wymieszaj dwa, dwa mikrolitry zmieszanych starterów do przodu i do tyłu oraz cztery mikrolitry wody wolnej od nukleaz.Dla każdej próbki umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij program cykli termicznych. Po zakończeniu programu załaduj 20 mikrolitrów każdej amplifikowanej próbki lub markera masy cząsteczkowej bezpośrednio do odpowiedniego dołka żelu aros. Następnie uruchom żel i uzyskaj fluorescencyjne obrazy pasm w świetle ultrafioletowym.Aby wykryć amplifikowane produkty DNA, zacznij od usunięcia obszarów zainteresowania z każdej półkuli mózgu, a następnie przenieś tkanki mózgowe do 15-mililitrowej probówki. Pozwól chusteczce osiąść na dnie probówki, a następnie zastąp roztwór z górnej części plastrów pięcioma do 10 mililitrami lodu. Roztwór Hanka z płodową surowicą bydlęcą lub bez, jak wskazano powyżej, całkowicie odsysając cały roztwór.Po czwartym praniu za pomocą trzymililitrowej strzykawki przecedzić dwa mililitry świeżo przygotowanej próbyny zawierającej roztwór trawiący przez strzykawkę o średnicy 0,2 mikrometra. Przefiltrować bezpośrednio do probówki zawierającej tkanki mózgowe i pozwolić, aby izacja trypsyny postępowała w temperaturze pokojowej. Po 13 minutach zneutralizuj reakcję, najpierw odsysając większość roztworu trypsyny, a następnie dodając od siedmiu do 10 mililitrów lodowatego roztworu motka z płodową surowicą bydlęcą.Następnie przepłukać tkanki w roztworze Hanka z płodową surowicą bydlęcą lub bez niej, jak właśnie pokazano. Następnie przefiltruj dwa mililitry roztworu dysocjacyjnego na tkanki mózgowe. Następnie mechanicznie rozdziel komórki za pomocą delikatnej próbki od 10 do 20 razy za pomocą bawełnianego, polerowanego ogniowo PE lub pipety.Kontynuuj próbę, aż widoczne kawałki tkanki znikną. Odczekaj trzy minuty, aż małe kawałki osiądą, a następnie użyj pipety PEs, aby przenieść około 1,5 mililitra roztworu do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej trzy mililitry lodowatego roztworu Hanka z płodową surowicą bydlęcą, wirować probówki przez 13 minut w temperaturze 185 g i czterech stopniach Celsjusza. Następnie ostrożnie odessać supernatant za pomocą tej samej pipety Pasteura.Delikatnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze wstępnie rozgrzanego podłoża galwanicznego. Następnie dodaj około czterech mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego. Przenieść zawiesinę komórkową do niepowlekanej kolby hodowlanej T 25 i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po jednym dniu in vitro przepłukać komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami lodowatego podłoża galwanowego, raz delikatnie przechylając kolbę kilka razy ruchem wirowym po sześciu do dziewięciu dniach in vitro, umieścić 100 mikrolitrów materiału powlekającego z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanych szkiełkach przykrywkowych w naczyniu do hodowli komórkowych i umieścić naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia przepłukać kolbę, zasysając cały roztwór z kolby i dodając około 13 mililitrów lodowatego roztworu motki. Następnie całkowicie odessać roztwór.Następnie przefiltruj cztery mililitry roztworu trypsyny EDTA i DNA bezpośrednio na komórki i pozwól komórkom oddzielić się od kolby hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 13 minutach zneutralizuj reakcję za pomocą dwóch mililitrów lodowatej, 100% płodowej surowicy bydlęcej i użyj pipety o pojemności od pięciu do 10 mililitrów, aby przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie umyj komórki, dodając około czterech mililitrów lodowatego roztworu mutka z odwirowaniem płodowej surowicy bydlęcej, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego. Jeden.Teraz całkowicie odessać materiał powlekający z okładki, szkiełek i nałożyć około 50 mikrolitrów zawieszonych komórek glejowych na szkiełka nakrywkowe. Aby utworzyć warstwę zasilającą glej, inkubuj komórki glejowe przez 20 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego, po jednym do każdego szkiełka nakrywkowego, podczas dodawania pożywki galwanicznej. Przydatne jest użycie innej pipety do dociśnięcia obwodu szkiełka nakrywkowego, tak aby szkiełko nakrywkowe nie unosiło się w podłożu.Po całonocnej hodowli. Zastąp pożywkę jednym mililitrem świeżego, wstępnie rozgrzanego podłoża galwanicznego, jeden po dwóch do trzech dniach. In vitro dodaj 10 mikrolitrów inhibitora mitotycznego do każdej kultury warstwy zasilającej, aby zahamować replikację DNA i proliferację komórek glejowych po siedmiu do dziewięciu dniach.In vitro zastąpić pożywkę hodowlaną wstępnie podgrzanym pożywką do powlekania dwa. Następnie delikatnie umieść około 50 do 100 mikrolitrów mysich komórek neuronalnych w wstępnie rozgrzanym pożywce galwanicznej, po dwa na każdej warstwie zasilającej glej. Na tym zdjęciu gen tour one A został amplifikowany z genomowego DNA, wyizolowanego z klipsów ogonowych noworodków, heterozygotycznych i homozygotycznych szczeniąt typu dzikiego z modelu dystonii knockin DYT one.Wyraźnie widoczne są oddzielne prążki dla alleli typu dzikiego i zmutowanego. Na tym rysunku pokazano dwa reprezentatywne pola z hodowli neuronów hipokampa myszy. Zostały one wygenerowane z CA trzech, CA jednego regionu hipokampa myszy typu dzikiego.14 dni po posiewie na wcześniej ustalonej warstwie żerującej około trzy, około jednego mikrokampa myszy typu dzikiego na obrazach kontrastowych interferencji różnicowej można zaobserwować oznaki dobrego zdrowia, takie jak wyraźny margines ciała komórki neuronalnej, rozszerzone procesy neuronalne i stosunkowo jednolita warstwa komórek glejowych. Dalsze barwienie immunocytochemiczne dla mapy markerów neuronalnych. Po drugie, można również zaobserwować identyfikację neuronów i ich procesów w każdym polu.Korzystając z tego protokołu, genotypowanie w jednej rundzie hodowli można zakończyć w ciągu 67 godzin. Protokół ten jest szczególnie przydatny do hodowli neuronów genetycznie modyfikowanych myszy, które mogą umrzeć kilka dni po urodzeniu.

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Film demonstruje technikę hodowli pierwotnych astrocytów z kory szczura. Kora jest mechanicznie dysocjowana w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek glejowych, która jest następnie powlekana na płytkach pokrytych polipeptydami w celu promowania selektywnej proliferacji astrocytów. Następnie astrocyty są enzymatycznie dysocjowane od płytek i przenoszone na świeże podłoża, co pozwala na hodowlę czystych astrocytów.

Generowanie pierwotnej kultury astrocytów z mózgu szczeniaka szczura

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj szybkie genotypowanie noworodków myszy i tworzenie pierwotnych kultur neuronów na warstwie glejowej. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych modeli z letalnością neonatalną.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Przeglądaj więcej filmów