Name: Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Poznaj metodę porządkowania pojedynczych komórek w mikrojamkach PDMS, która umożliwia badanie dynamiki organelli w warunkach 3D. Technika ta redukuje zmienność i poprawia orientację komórek ssaków oraz drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy L. Brino (IGBMC High Content Screening facility, Illkirch, Francja) za dostarczenie nam przeciwciała anty-Giantin, M. Labouesse Lab. Lab. dla C. elegans (IGBMC) i B. Séraphin Lab. dla pączkujących drożdży (IGBMC), E. Paluch i A. Hyman za fluorescencyjne komórki HeLa (MPI-CBG, Drezno), J. Moseley (Dartmouth Medical School) i J.Q. Wu (Ohio State University) za rozszczepienie komórek drożdży; A. Hoël i F. Evenou za pomoc eksperymentalną, C. Rick (IBMC, Strasburg, Francja) za pomoc techniczną oraz J.C. Jeannot (Femto-st, Francja) za pomoc w mikrowytwarzaniu. Prace te były wspierane przez fundusze CNRS, Uniwersytetu w Strasburgu, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale oraz CI-FRC w Strasburgu.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+Micropatterned+Substrates+for+Single+Cell+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies.</a> PLoS ONE. 7, e37548(2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cell+spreading+within+3D-micropatterned+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments.</a> Lab Chip. 11, 805-812 (2010).</li>
<li>Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Engineered+3D+Scaffolds+for+Cell+Culture+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies.</a> Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 12, 458-465 (2013).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat Meth. 7, 969-971 (2010).</li>
<li>Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).</li>
<li>Ochsner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-well+arrays+for+3D+shape+control+and+high+resolution+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells.</a> Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).</li>
<li>Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).</li>
<li>Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotech%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfe%2C+D+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).</li>
<li>Mehling, M., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Biotech%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture.</a> Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).</li>
<li>Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Still+and+rotating+myosin+clusters+determine+cytokinetic+ring+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction.</a> Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+single+cells+identifies+a+rare+subset+of+circulating+tumor+cells+with+malignant+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits.</a> Integr Biol. 6, 388-398 (2014).</li>
<li>Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">The promise of single-cell sequencing.</a> Nat Meth. 11, 25-27 (2014).</li>
<li>Allen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell-free+extracts+of+Xenopus+eggs+and+demembranated+sperm+chromatin+for+the+assembly+and+isolation+of+in+vitro-formed+nuclei+for+Western+blotting+and+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM).</a> Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).</li>
<li>Robbins, E., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotically+Synchronized+Mammalian+Cells%3A+a+Simple+Method+for+Obtaining+Large+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations.</a> Science. 144, (1964).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein%2C+the+protein+that+binds+the+3%26%2334%3B+end+of+histone+mRNA%2C+is+cell+cycle+regulated+by+both+translational+and+posttranslational+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3&#34; end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Temporal+and+Spatial+Control+of+Cytokinesis+with+a+Myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor.</a> Science. 299, 1743-1747 (2003).</li>
<li>Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoint+kinase+1+%28Chk1%29+is+required+for+mitotic+progression+through+negative+regulation+of+polo-like+kinase+1+%28Plk1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1).</a> Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).</li>
<li>Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRT-1%2FCalreticulin+and+the+E3+Ligase+EEL-1%2FHUWE1+Control+Hemidesmosome+Maturation+in+C.+elegans+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development.</a> Curr Biol. 20, 322-327 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> JoVE. , e4019(2012).</li>
<li>Saha, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin-related+protein+Mid1p+coordinates+the+assembly+of+the+cytokinetic+contractile+ring+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).</li>
<li>Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Drug+Efficacy+and+Toxicology+in+Three+Dimensions%3A+Using+Synthetic+Extracellular+Matrices+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery.</a> Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).</li>
<li>Futamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphobase%2C+an+Encyclopedic+Cell+Morphology+Database%2C+and+Its+Use+for+Drug+Target+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification.</a> Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Do wytworzenia "kubków na jajka" użyto odlewania replik. Proces produkcji nie wymaga czystego pomieszczenia; Jest to łatwe i proste, chociaż może być wymagana pewna praktyka. W szczególności uwolnienie stempla PDMS jest najważniejszym krokiem w celu wyprodukowania dużej powierzchni wysokiej jakości "kubków na jajka". Z tego powodu należy zachować szczególną ostrożność na tym etapie. Jeśli ten krok wielokrotnie kończy się niepowodzeniem, należy rozważyć optymalizację parametrów czyszczenia plazmowego przed silanizacją i w...

Obecne testy in vitro oparte na komórkach są dwuwymiarowe (2D). Ta konfiguracja nie jest naturalna dla komórek ssaków i dlatego nie jest fizjologicznie istotna 1; Komórki wykazują różnorodność kształtów, rozmiarów i niejednorodnych fenotypów. Stwarzają one dodatkowe poważne ograniczenia w zastosowaniu do zastosowań przesiewowych, takie jak nieuporządkowany rozkład w płaszczyźnie i ekstremalne fenotypy organelli komórkowych (w szczególności włókien stresowych). Jest to szczególnie ważne w badaniach klinicznych dotyczących testowania leków, gdzie każdego roku wydawane są duże budżety. Większość z tych leków zawodzi jednak po zastosowaniu na modelach zwierzęcych z powodu sztucznego stanu hodowli 2D we wczesnych stadiach badań przesiewowych leków. Ponadto, stosując to podejście, nie można prawidłowo uwidocznić określonych organelli komórkowych, takich jak cytokinetyczny pierścień aktomiozyny podczas mitozy komórkowej i ogólnie struktury, które ewoluują w płaszczyźnie prostopadłej do płaszczyzny obserwacji. Zaproponowano kilka nowych testów 2D w celu przezwyciężenia wyżej wymienionych wad i zaobserwowano ważne spostrzeżenia na temat organizacji cytoszkieletu 2,3. Jednak testy te nadal mają jedno poważne ograniczenie: komórki wykazują bardzo rozproszony fenotyp w przeciwieństwie do tego, co obserwuje się in vivo, gdzie komórki prezentują architekturę 3D. Te artefakty związane z metodą hodowli mogą wyzwalać cechy niefizjologiczne, takie jak wzmocnione włókna stresowe 1,4,5.
Trójwymiarowe testy hodowli komórkowych oferują wiele zalet w porównaniu do środowisk 2D 6,7. Są one fizjologicznie bardziej istotne, a zatem wyniki są znaczące. Na przykład komórki osadzone w hydrożelach wykazują struktury podobne do 3D, ale ich morfologia różni się w zależności od komórki 8,9 . Jednak ich morfologia różni się w zależności od komórki, co komplikuje zastosowania badań przesiewowych. Alternatywną strategią jest osadzanie pojedynczych komórek w mikroprefabrykowanych wnękach 10,11. Pozycja komórki, kształt, polaryzacja i wewnętrzna organizacja komórek mogą się wtedy znormalizować. Oprócz zapewnienia komórkom architektury podobnej do 3D, mikrojamy pozwalają również na badania przesiewowe o wysokiej zawartości 10,12-14; Pojedyncze komórki można uporządkować w mikromacierze i organelle komórkowe, a ich ewolucję można obserwować równolegle. Ta regularność zapewnia dobre statystyki z małą liczbą komórek i lepszymi rozdzielczościami czasowymi/przestrzennymi. Przydatne związki są łatwiejsze do niezawodnej identyfikacji.
W tym badaniu pokazujemy produkcję i zastosowanie nowego systemu hodowli pojedynczych komórek podobnego do 3D do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości 10,12,13. Urządzenie składa się z szeregu mikrowgłębień elastomerowych (105 wgłębień/cm2), zwanych "kubkami na jajka" (EC). Wymiary i całkowita objętość EC w tej pracy są zoptymalizowane do typowej objętości poszczególnych komórek NIH3T3 i HeLa podczas podziału komórkowego. Morfologia wnęk – cylindryczna – jest dobierana tak, aby odpowiednio zorientować kształt komórki w celu wizualizacji procesów aktywnych. Formowanie replik służy do modelowania układu EC na cienkiej warstwie polidimetylosiloksanu (PDMS) przyklejonej do szklanego szkiełka nakrywkowego 15,16. Komórki wprowadza się do EC przez odwirowanie. Przedstawiamy tutaj obserwację i normalizację organelli komórkowych (włókien stresu aktynowego, aparatu Golgiego i jądra) w 3D (EC) w porównaniu z tymi samymi komórkami na powierzchniach 2D (płaskich). Opisujemy również obserwację aktywnych procesów dynamicznych, takich jak zamknięcie cytokinetycznego pierścienia aktomiozyny podczas mitozy komórkowej 17. Na koniec pokazujemy wyniki tej metodologii na innych systemach o sztywnych ścianach, takich jak drożdże pączkujące, drożdże rozszczepienia i zarodki C. elegans, co potwierdza możliwość zastosowania naszej metodologii do szerokiego zakresu systemów modelowych.
Następnie przedstawiamy szczegółowy i wyczerpujący protokół w celu wytworzenia i zastosowania 'jajek' do mikroprodukcji 3D. Nasze podejście jest proste i nie wymaga czystego pomieszczenia. Przewidujemy, że ta nowa metodologia będzie szczególnie interesująca dla testów przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej, zastępując szalki Petriego. Wreszcie, nasze urządzenie będzie przydatne do badania rozkładu reakcji komórek na bodźce zewnętrzne, na przykład w nowotworach 18 lub w badaniach podstawowych 19.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultraczysty)</td><td>Millipore-Używaj</td><td></td> <td>zawsze świeżej wody.</td></tr><tr><td>Parafilm (folia z tworzywa sztucznego)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Przyklej Parafilm do stołu laboratoryjnego za pomocą kropelek wody i zapewnij idealną płaskość powierzchni.</td></tr><tr><td>Maska fotograficzna</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="ZASIĘG! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td>2000 series</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>praca w dygestorii jest wymagana; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programista SU-8</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>praca w oparach jest wymagana; więcej informacji</td><td></td><td></td><td></td>można znaleźć w karcie katalogowej producenta</tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>Dostępne w wielu firmach.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (odczynnik silikonowy)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a>szkodliwe</td></tr><tr><td>, wymagana jest praca w oparach; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrimetylosilan (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS powoduje ostre wdychanie i toksyczność skórną, jest wysoce łatwopalny (z możliwością cofnięcia się zapłonu na znaczne odległości), dlatego powinien być używany w dygestorium z dala od źródeł zapłonu</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/PPE/rękawice-ręczne/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-niebieskie-rękawice-nitrylowe-m</a></td></tr><tr><td>Dostępne w wielu firmach.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane #0</td><td>Szkło Knittel</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Bardzo kruche. Manipuluj delikatnie.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta prosta Sharp</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>tubka 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Dostępne w wielu firmach.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 zestaw</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Opakowanie zawiera zarówno bazę PDMS, jak i utwardzacz. Podobne elastomery są dostępne w wielu firmach.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Dostępne w wielu firmach.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Surowica cielęca bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>0.25% Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS jest na poziomie 10x i powinien być rozcieńczony do 1x za pomocą ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium dla atmosfer bez kontroli</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>Fibronektyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Penicylina & Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>szalka Petriego P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>Petri szalka P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>szalka Petriego P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>Działa szkodliwie zwłaszcza na oczy, wymagana jest praca w oparach; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin = 93443-100ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin = 93443-100ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green Fluorescencyjny Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=szukaj-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=szukaj-a12379&nbsp; </a></td></tr><tr><td>rozpuścić proszek w 1,5 ml metanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>rozcieńczenie 1:200 w PBS 1x</td></tr><tr><td>królik poliklonalny anty-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>1:500 rozcieńczenie w PBS</td></tr> <tr><td>1x<a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>królik antyanilina</td><td>Dzięki uprzejmości M. Glotzera, opublikowane w Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillina jest białkiem rusztowania, które łączy RhoA, aktynę i miozynę podczas cytokinezy. Aktualna biologia 18, 30&ndash; 6 (2008).</td><td></td><td>Rozcieńczenie 1:500 w PBS 1x</td></tr><tr><td>Laboratorium transdukcji</td><td>antyfosfotyrozyny</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 kozia anty-królicza&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1:1,000 rozcieńczenie w PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1 mg/ml przez 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=G2025& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=G2025& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termin = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td></td><td></td> <td>- Komórki ssaków są dostępne w wielu firmach. Zobacz także Tabela 1</td></tr><tr><td>Komórki NIH3T3</td><td>ATCC-Mammalian</td><td></td> <td>są dostępne w wielu firmach. Zobacz również Tabela 1</td></tr><tr><td>Drożdże rozszczepienia&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat szczepów, skontaktuj się z autorem korespondencyjnym.&nbsp; Zobacz także Tabela 1</td></tr><tr><td>C. elegans robaki</td><td>-</td><td>-Aby</td> <td>uzyskać szczegółowe informacje, skontaktuj się z autorem korespondencyjnym.&nbsp; Zobacz także Tabela 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 Suplementy w zestawie</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Szukaj">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Szukaj&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAK (Media) + 5 Suplementy w zestawie</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Szukaj">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Szukaj&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Szukaj">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Szukaj&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Do przygotowania: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr sterylizowany EMM (Media) - Tylko do obrazowania</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku. Filtruj sterylizację mediów za pomocą 0,22 &mikro; m zamiast autoklawowania. Daje to przezroczystość mediów i zmniejsza autofluorescencję.</td></tr><tr><td>Suplementy (dla EMM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Szukaj">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Szukaj</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( Dodać 225 mg/L do pożywki EMM przed autoklawowaniem lub filtrowaniem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup i Steritop Sterylne filtry sterowane próżnią</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3d: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Komórki biologiczne są zazwyczaj obserwowane na płaskich (2D) powierzchniach. Ten stan nie jest fizjologiczny, a fenotypy i kształty są bardzo zmienne. Badania przesiewowe oparte na komórkach w takich środowiskach mają zatem poważne ograniczenia: organelle komórkowe wykazują ekstremalne fenotypy, morfologie i rozmiary komórek są niejednorodne i/lub nie można prawidłowo zobrazować określonych organelli komórkowych. Ponadto komórki in vivo znajdują się w środowisku 3D; W tej sytuacji komórki wykazują różne fenotypy, głównie ze względu na ich interakcję z otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową tkanki. W celu standaryzacji i wygenerowania kolejności pojedynczych komórek w fizjologicznie istotnym środowisku 3D dla testów komórkowych, przedstawiamy tutaj mikrofabrykację i zastosowania urządzenia do hodowli komórek 3D in vitro. To urządzenie składa się z matrycy 2D mikrownęk (zwykle 105 wnęk/cm2), z których każda wypełniona jest pojedynczymi komórkami lub zarodkami. Pozycja komórki, kształt, polaryzacja i wewnętrzna organizacja komórki zostają następnie znormalizowane, pokazując architekturę 3D. Użyliśmy formowania replik, aby uformować szereg mikrowgłębień, "miseczek jajowych", na cienkiej warstwie polidimetylosiloksanu (PDMS) przyklejonej na szkiełku nakrywkowym. Ubytki pokryto fibronektyną, aby ułatwić adhezję. Komórki wprowadzano przez odwirowanie. Procent napełnienia został zoptymalizowany dla każdego systemu, co pozwoliło na osiągnięcie do 80%. Potwierdzono żywotność komórek i zarodków. Zastosowaliśmy tę metodologię do wizualizacji organelli komórkowych, takich jak jądro i aparat Golgiego, oraz do badania procesów aktywnych, takich jak zamknięcie pierścienia cytokinetycznego podczas mitozy komórki. Urządzenie to pozwoliło na zidentyfikowanie nowych cech, takich jak okresowe akumulacje i niejednorodności miozyny i aktyny podczas zamykania pierścienia cytokinetycznego oraz zagęszczone fenotypy dla wyrównania Golgiego i jądra. Scharakteryzowaliśmy metodę dla komórek ssaków, drożdży rozszczepialnych, drożdży pączkujących, C. elegans ze specyficzną adaptacją w każdym przypadku. Wreszcie, charakterystyka tego urządzenia sprawia, że jest ono szczególnie interesujące dla testów przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej.

„Koszyczki” (eggcups, EC) to nowatorska metodologia wysokoprzepustowego screeningu, która umożliwia wizualizację zorientowanych komórek i embrionów w środowisku 3D. Ponadto za pomocą tej nowej metody można obserwować niektóre procesy komórkowe, które są trudne do zaobserwowania w standardowych kulturach 2D (płaskich). Rysunek 1a przedstawia podsumowanie procedury mikrofabrykacji EC (patrz również sekcja 1 w opisanym powyżej protokole). Metoda ta jest prosta, szybka, wydajna i nie wymaga specjalistycznego...

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja morfologii i dynamiki organelli komórkowych na szeregu mikrojam naśladujących środowisko 3D napotkane w warunkach fizjologicznych. W przypadku komórek o sztywnych ścianach, takich jak drożdże rozszczepieniowe, jamy mogą organizować i orientować struktury komórkowe. Osiąga się to poprzez najpierw wyprodukowanie szeregu filarów PDMS od mistrza, aby uzyskać szereg mikrownęk PDMS, zwanych kubkami na jajka, poprzez formowanie replik.W drugim etapie bańki jajowe są funkcjonalizowane białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i wprowadzane do probówki z cylindrycznym, wykonanym na zamówienie kawałkiem z tworzywa sztucznego, który podtrzymuje próbkę mikrojamy i umożliwia wprowadzenie pojedynczych komórek ssaków do każdej z mikrojam. Następnie kubki jajowe wypełnione komórkami są usuwane i inkubowane z lekiem lub związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w celu zbadania fenotypu i dynamicznych procesów komórek w zamknięciu 3D. Uzyskano wyniki, które pokazują różnice w fenotypie komórki i nowych strukturach dynamicznych obserwowane w porównaniu ze standardowymi testami 2D in vitro opartymi na orientacji komórek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy hodowli komórkowych 2D, jest to, że komórki ssaków w miseczkach jajowych doświadczają środowiska 3D podobnego do logicznych mikrośrodowisk, ale są ułożone w uporządkowany i znormalizowany gatunek. Porządek i orientacja są również znaczącą poprawą w przypadku drożdży rozszczepialnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad komórkami, szkieletem i odkrywaniem leków, takich jak identyfikacja nowych i przeciwnowotworowych leków z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób wieloczynnikowych, takich jak rak, ponieważ testy przesiewowe leków można łatwo przeprowadzać i analizować za pomocą kubków na jajka, co czyni tę metodę szczególnie interesującą dla medycyny spersonalizowanej. Metoda ta może zapewnić klucz do zorganizowanych struktur i dynamiki w pojedynczych komórkach ssaków i komórkach drożdży rozszczepialnych, a także może być stosowana do organizowania badań, rozwijania zarodków, takich jak C.elegans i ri-so-flu-a. W tym protokole szereg mikrownęk lub kubków na jajka jest wzorowany na warstwie polidimetylosiloksanu lub PDMS przyklejonej do szkiełka nakrywkowego przez formowanie repliki.Pierwszym krokiem jest wyprodukowanie wzorca, który nie zostanie pokazany, ale jest opisany w protokole tekstowym. Po wykonaniu mastera, kolejnym krokiem jest wyprodukowanie repliki PDMS. W 50-mililitrowej tubie dokładnie wymieszaj środek sieciujący i prepolimer w stosunku wagowym od jednego do 10 lub objętości do objętości, co daje łącznie 30 gramów.Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 g przez pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Delikatnie upuść PDMS na urządzenie główne. Jeśli pojawią się bąbelki, odgazuj mieszankę.Umieść próbkę w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na cztery godziny. Po utwardzeniu PDMS użyj skalpela, aby delikatnie przeciąć obszar zainteresowania o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego, który obejmuje około 10 do piątych mikrojam lub miseczek na jajka. Delikatnie odklej stempel PDMS.Aby rozpocząć procedurę formowania repliki, aktywuj stempel PDMS za pomocą plazmy tlenowej na 30 sekund. Aktywowany stempel należy tymczasowo przechowywać na zamkniętej szalce Petriego, aby zapobiec osadzaniu się kurzu. Pracując w dygestorium, umieść aktywowany stempel PDMS stroną ze strukturami skierowanymi do góry lub do góry nogami na szalce Petriego obok 15-mililitrowej nasadki.Napełnij nakrętkę 200 mikrolitrami trimetylochlorosilanu. Zamknij szalkę Petriego i pozwól stemplu zasalinizować się przez siedem minut. Umieść stempel PDMS na powlekarce wirowej strukturami do góry nogami.Umieść małą kroplę płynnego PDMS na wierzchu konstrukcji. Wiruj warstwę z prędkością 1500 obr./min przez 30 sekund, aby nałożyć cienką warstwę PDMS na wierzch konstrukcji. Umieść stempel w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na cztery godziny, aby utwardzić osadzoną warstwę PDMS pokrytą wirowo.Następnie aktywuj cienką warstwę PDMS, umieszczając stempel PDMS do góry nogami wraz ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego na 30 sekund. Natychmiast umieść stempel w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij pęsetą do klejenia dookoła powierzchni stempla. Następnie utrzymuj stały nacisk na stempel przez około 10 sekund.30 minut później delikatnie oderwij stempel od szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić kubki na jajka. Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić próbki. Kubki na jajka dokładnie opłucz etanolem i wysusz.Jeśli kubki na jajka PDMS nie znajdują się na szkiełku nakrywkowym i nie są odłączone na etapie odpinania, rozważ dostosowanie ustawień odkurzacza plazmowego i ponowne uruchomienie procedury formowania repliki. Aby ułatwić późniejszą manipulację próbką, zaleca się przyklejenie małego kawałka utwardzonego PDMS na krawędzi szkiełka nakrywkowego. W przypadku komórek ssaków przedstawionych w tym filmie, powierzchnia PDMS musi być funkcjonalizowana białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej.Hydrofilizuj kubki na jajka w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 30 sekund. Następnie sterylizuj kubki na jajka światłem ultrafioletowym przez pięć minut. Umieść niewielką kroplę roztworu fibronektyny, aby pokryć całą powierzchnię kubka na jajo i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej.Chronić próbkę przed wysuszeniem. Delikatnie opłucz kubki na jajka około jednym mililitrem PBS za pomocą plastikowej pipety dozującej. Powtórz w sumie trzy razy.Następnie umieść wykonany na zamówienie cylindryczny plastikowy kawałek w 50-mililitrowej tubie. Dodaj 13 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do probówki. Pożywka powinna sięgać co najmniej dwa centymetry powyżej cylindrycznego elementu, aby zapewnić całkowite zanurzenie próbki.Używając ostrej i prostej pęsety do przytrzymania próbki za uchwyt PDMS, ostrożnie umieść kubki na jajka w tubie, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe, aż znajdzie się na górnej stronie plastikowego elementu i zostanie całkowicie zanurzone. Komórki, które mają zostać wprowadzone do kubków na jaja, powinny być hodowane do 80 do 100% zbiegu i ponownie zawieszone w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Odpipetuj 200 mikrolitrów komórek na wierzchu kubków na jajka, upuszczając komórki jak najbardziej wyśrodkowane na wierzch kubków na jajka, ale unikając kontaktu fizycznego.Zapobiegnie to pęknięciu i/lub uszkodzeniu próbki. Odwirować 50-mililitrową probówkę o masie 1 800 razy g przez dwie minuty. Odpipetować kolejne 200 mikrolitrów komórek na wierzchu kubków na jajka i ponownie odwirować w ilości 1 800 g przez dwie minuty.Powtórz w sumie trzy razy, aby zoptymalizować procent napełnienia. Po ostatnim odwirowaniu sprawdź procent napełnienia kubków na jajka pod mikroskopem. Używając pęsety do przytrzymania uchwytu PDMS, ostrożnie wyjmij próbkę z probówki, nie naruszając komórek w kubkach na jajka, i umieść próbkę na szalce Petriego z pożywką.Aby usunąć nadmiar komórek, których nie ma w miseczkach na jajka, spłucz, delikatnie pipetując w górę i w dół trzy razy z każdej strony układu mikrostrukturalnego. Na koniec zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Aby obserwować utrwalone organelle komórkowe, umieść kubki na jajka z ustaloną próbką na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego i wybierz obiektyw olejowy 60x.W tym przykładzie próbka to fibroblasty NIH 3T3, w których wybarwiono aparat Golgiego, jądro i włókna aktynowe. Ustaw ostrość ostrożnie w jasnym świetle pola, aż miseczki jajowe i komórki znajdą się w płaszczyźnie obserwacji. Wybierz i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania, a następnie rozpocznij przechwytywanie obrazu.Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia kubków na jajka w uchwycie mikroskopu i napełnienia go jednym mililitrem 10% pożywki do hodowli komórkowych FCS L15. Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu. Aby uniknąć parowania, umieść szklaną pokrywkę na uchwycie.Obserwuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw olejowy o powiększeniu 60x. W tym przykładzie wykorzystano komórki HeLa, które wyrażają fluorescencyjnie znakowaną miozynę i aktynę, dwie kluczowe cząsteczki biorące udział w zamykaniu pierścienia cytokinetycznego podczas mitozy. Wybierz interesujący Cię obszar i poszukaj pierścienia cytokinetycznego, używając kanału GFP lub Texas Red.Ustaw ostrość dokładnie. Uruchom automatyczną akwizycję w obu kanałach, aż pierścień zostanie całkowicie zamknięty. Obrazy kubków na jajka wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego pokazują, że ich kształt i rozmiar są bardzo regularne.W przypadku komórek o sztywnych ścianach, takich jak drożdże rozszczepieniowe, kubki jajowe mogą orientować pierścień cytokinekinetyczny. W przypadku komórek ssaków porównanie komórek na miseczkach jajowych 3D i płaskich powierzchniach 2D pokazuje, że te pierwsze tworzą uporządkowaną tablicę z jednorodnym sferycznym fenotypem, podczas gdy te drugie wykazują nieuporządkowaną i niejednorodną morfologię. Komórki na miseczkach jajowych wykazują również zmniejszenie liczby włókien stresowych, na co wskazuje liczba umiarkowanych efektów leczenia Blebbistatyną.Aparat Golgiego w hodowlach 2D zazwyczaj wykazuje rozszerzony fenotyp, podczas gdy w kubkach jajowych wykazuje bardziej zagęszczony fenotyp. Zostało to potwierdzone przez kwantyfikację fenotypów Golgiego. Wreszcie, na powierzchniach 2D jądro komórkowe jest zorientowane losowo, podczas gdy na kubkach jajowych jest zorientowane ortogonalnie na płaszczyźnie xy, zarówno w komórkach typu dzikiego, jak i leczonych Blebbistatyną.Określenie wartości kulistości jądra ujawnia, że miseczki jajowe nie wpływają na normalną kulistość jądra komórkowego. Jednak różnica między typem dzikim a komórkami traktowanymi Blebbistatyną na miseczkach jajowych sugeruje, że kubki jajowe ujawniają rzeczywisty efekt leku, który jest zamaskowany w 2D. Badania żywych komórek z wykorzystaniem kubków jajowych umożliwiają identyfikację nowych procesów aktywnych, które nie są widoczne w standardowych hodowlach.Na przykład w komórkach HeLa zaobserwowano okresowe nagromadzenie miozyny, która porusza się promieniście, gdy pierścień cytokinetyczny zamyka się podczas mitozy. Po opanowaniu kubki na jajka można przygotować z repliki w mniej niż sześć godzin, a napełnianie komórek można wykonać w około 15 minut. Próbując tego procesu, ważne jest, aby mieć rozmiar miseczek jajowych w stosunku do badanych komórek.Procedura ta może być dalej dostosowana do platform przesiewowych o wysokiej zawartości w firmach farmaceutycznych do masowych badań przesiewowych, a także do spersonalizowanych testów diagnostycznych pacjentów w ocenie poszczególnych specyficznych terapii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać i używać mikrowgłębień w kubkach na jajka. Kubeczki jajowe standaryzują i generują porządek w wielu podobnych systemach, od pojedynczych komórek bez ścian, takich jak komórki ssaków, po systemy ze ścianami, takie jak drożdże i zarodki.

ordering-single-cells-single-embryos-3d-confinement-new-device-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Poznaj metodę porządkowania pojedynczych komórek w mikrojamkach PDMS, która umożliwia badanie dynamiki organelli w warunkach 3D. Technika ta redukuje zmienność i poprawia orientację komórek ssaków oraz drożdży.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów