Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości
September 18th, 2016
Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja morfologii i dynamiki organelli komórkowych na szeregu mikrojam naśladujących środowisko 3D napotkane w warunkach fizjologicznych. W przypadku komórek o sztywnych ścianach, takich jak drożdże rozszczepieniowe, jamy mogą organizować i orientować struktury komórkowe. Osiąga się to poprzez najpierw wyprodukowanie szeregu filarów PDMS od mistrza, aby uzyskać szereg mikrownęk PDMS, zwanych kubkami na jajka, poprzez formowanie replik
.W drugim etapie bańki jajowe są funkcjonalizowane białkami macierzy zewnątrzkomórkowej i wprowadzane do probówki z cylindrycznym, wykonanym na zamówienie kawałkiem z tworzywa sztucznego, który podtrzymuje próbkę mikrojamy i umożliwia wprowadzenie pojedynczych komórek ssaków do każdej z mikrojam. Następnie kubki jajowe wypełnione komórkami są usuwane i inkubowane z lekiem lub związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w celu zbadania fenotypu i dynamicznych procesów komórek w zamknięciu 3D. Uzyskano wyniki, które pokazują różnice w fenotypie komórki i nowych strukturach dynamicznych obserwowane w porównaniu ze standardowymi testami 2D in vitro opartymi na orientacji komórek.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy hodowli komórkowych 2D, jest to, że komórki ssaków w miseczkach jajowych doświadczają środowiska 3D podobnego do logicznych mikrośrodowisk, ale są ułożone w uporządkowany i znormalizowany gatunek. Porządek i orientacja są również znaczącą poprawą w przypadku drożdży rozszczepialnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad komórkami, szkieletem i odkrywaniem leków, takich jak identyfikacja nowych i przeciwnowotworowych leków z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.
Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób wieloczynnikowych, takich jak rak, ponieważ testy przesiewowe leków można łatwo przeprowadzać i analizować za pomocą kubków na jajka, co czyni tę metodę szczególnie interesującą dla medycyny spersonalizowanej. Metoda ta może zapewnić klucz do zorganizowanych struktur i dynamiki w pojedynczych komórkach ssaków i komórkach drożdży rozszczepialnych, a także może być stosowana do organizowania badań, rozwijania zarodków, takich jak C.elegans i ri-so-flu-a. W tym protokole szereg mikrownęk lub kubków na jajka jest wzorowany na warstwie polidimetylosiloksanu lub PDMS przyklejonej do szkiełka nakrywkowego przez formowanie repliki.
Pierwszym krokiem jest wyprodukowanie wzorca, który nie zostanie pokazany, ale jest opisany w protokole tekstowym. Po wykonaniu mastera, kolejnym krokiem jest wyprodukowanie repliki PDMS. W 50-mililitrowej tubie dokładnie wymieszaj środek sieciujący i prepolimer w stosunku wagowym od jednego do 10 lub objętości do objętości, co daje łącznie 30 gramów.
Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 g przez pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Delikatnie upuść PDMS na urządzenie główne. Jeśli pojawią się bąbelki, odgazuj mieszankę.
Umieść próbkę w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na cztery godziny. Po utwardzeniu PDMS użyj skalpela, aby delikatnie przeciąć obszar zainteresowania o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego, który obejmuje około 10 do piątych mikrojam lub miseczek na jajka. Delikatnie odklej stempel PDMS.
Aby rozpocząć procedurę formowania repliki, aktywuj stempel PDMS za pomocą plazmy tlenowej na 30 sekund. Aktywowany stempel należy tymczasowo przechowywać na zamkniętej szalce Petriego, aby zapobiec osadzaniu się kurzu. Pracując w dygestorium, umieść aktywowany stempel PDMS stroną ze strukturami skierowanymi do góry lub do góry nogami na szalce Petriego obok 15-mililitrowej nasadki.
Napełnij nakrętkę 200 mikrolitrami trimetylochlorosilanu. Zamknij szalkę Petriego i pozwól stemplu zasalinizować się przez siedem minut. Umieść stempel PDMS na powlekarce wirowej strukturami do góry nogami.
Umieść małą kroplę płynnego PDMS na wierzchu konstrukcji. Wiruj warstwę z prędkością 1500 obr./min przez 30 sekund, aby nałożyć cienką warstwę PDMS na wierzch konstrukcji. Umieść stempel w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza na cztery godziny, aby utwardzić osadzoną warstwę PDMS pokrytą wirowo.
Następnie aktywuj cienką warstwę PDMS, umieszczając stempel PDMS do góry nogami wraz ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego na 30 sekund. Natychmiast umieść stempel w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij pęsetą do klejenia dookoła powierzchni stempla. Następnie utrzymuj stały nacisk na stempel przez około 10 sekund.
30 minut później delikatnie oderwij stempel od szkiełka nakrywkowego, aby uwolnić kubki na jajka. Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić próbki. Kubki na jajka dokładnie opłucz etanolem i wysusz.
Jeśli kubki na jajka PDMS nie znajdują się na szkiełku nakrywkowym i nie są odłączone na etapie odpinania, rozważ dostosowanie ustawień odkurzacza plazmowego i ponowne uruchomienie procedury formowania repliki. Aby ułatwić późniejszą manipulację próbką, zaleca się przyklejenie małego kawałka utwardzonego PDMS na krawędzi szkiełka nakrywkowego. W przypadku komórek ssaków przedstawionych w tym filmie, powierzchnia PDMS musi być funkcjonalizowana białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej.
Hydrofilizuj kubki na jajka w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez 30 sekund. Następnie sterylizuj kubki na jajka światłem ultrafioletowym przez pięć minut. Umieść niewielką kroplę roztworu fibronektyny, aby pokryć całą powierzchnię kubka na jajo i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Chronić próbkę przed wysuszeniem. Delikatnie opłucz kubki na jajka około jednym mililitrem PBS za pomocą plastikowej pipety dozującej. Powtórz w sumie trzy razy.
Następnie umieść wykonany na zamówienie cylindryczny plastikowy kawałek w 50-mililitrowej tubie. Dodaj 13 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do probówki. Pożywka powinna sięgać co najmniej dwa centymetry powyżej cylindrycznego elementu, aby zapewnić całkowite zanurzenie próbki.
Używając ostrej i prostej pęsety do przytrzymania próbki za uchwyt PDMS, ostrożnie umieść kubki na jajka w tubie, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe, aż znajdzie się na górnej stronie plastikowego elementu i zostanie całkowicie zanurzone. Komórki, które mają zostać wprowadzone do kubków na jaja, powinny być hodowane do 80 do 100% zbiegu i ponownie zawieszone w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Odpipetuj 200 mikrolitrów komórek na wierzchu kubków na jajka, upuszczając komórki jak najbardziej wyśrodkowane na wierzch kubków na jajka, ale unikając kontaktu fizycznego.
Zapobiegnie to pęknięciu i/lub uszkodzeniu próbki. Odwirować 50-mililitrową probówkę o masie 1 800 razy g przez dwie minuty. Odpipetować kolejne 200 mikrolitrów komórek na wierzchu kubków na jajka i ponownie odwirować w ilości 1 800 g przez dwie minuty.
Powtórz w sumie trzy razy, aby zoptymalizować procent napełnienia. Po ostatnim odwirowaniu sprawdź procent napełnienia kubków na jajka pod mikroskopem. Używając pęsety do przytrzymania uchwytu PDMS, ostrożnie wyjmij próbkę z probówki, nie naruszając komórek w kubkach na jajka, i umieść próbkę na szalce Petriego z pożywką.
Aby usunąć nadmiar komórek, których nie ma w miseczkach na jajka, spłucz, delikatnie pipetując w górę i w dół trzy razy z każdej strony układu mikrostrukturalnego. Na koniec zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Aby obserwować utrwalone organelle komórkowe, umieść kubki na jajka z ustaloną próbką na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego i wybierz obiektyw olejowy 60x.
W tym przykładzie próbka to fibroblasty NIH 3T3, w których wybarwiono aparat Golgiego, jądro i włókna aktynowe. Ustaw ostrość ostrożnie w jasnym świetle pola, aż miseczki jajowe i komórki znajdą się w płaszczyźnie obserwacji. Wybierz i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania, a następnie rozpocznij przechwytywanie obrazu.
Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia kubków na jajka w uchwycie mikroskopu i napełnienia go jednym mililitrem 10% pożywki do hodowli komórkowych FCS L15. Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu. Aby uniknąć parowania, umieść szklaną pokrywkę na uchwycie.
Obserwuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw olejowy o powiększeniu 60x. W tym przykładzie wykorzystano komórki HeLa, które wyrażają fluorescencyjnie znakowaną miozynę i aktynę, dwie kluczowe cząsteczki biorące udział w zamykaniu pierścienia cytokinetycznego podczas mitozy. Wybierz interesujący Cię obszar i poszukaj pierścienia cytokinetycznego, używając kanału GFP lub Texas Red.
Ustaw ostrość dokładnie. Uruchom automatyczną akwizycję w obu kanałach, aż pierścień zostanie całkowicie zamknięty. Obrazy kubków na jajka wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego pokazują, że ich kształt i rozmiar są bardzo regularne.
W przypadku komórek o sztywnych ścianach, takich jak drożdże rozszczepieniowe, kubki jajowe mogą orientować pierścień cytokinekinetyczny. W przypadku komórek ssaków porównanie komórek na miseczkach jajowych 3D i płaskich powierzchniach 2D pokazuje, że te pierwsze tworzą uporządkowaną tablicę z jednorodnym sferycznym fenotypem, podczas gdy te drugie wykazują nieuporządkowaną i niejednorodną morfologię. Komórki na miseczkach jajowych wykazują również zmniejszenie liczby włókien stresowych, na co wskazuje liczba umiarkowanych efektów leczenia Blebbistatyną.
Aparat Golgiego w hodowlach 2D zazwyczaj wykazuje rozszerzony fenotyp, podczas gdy w kubkach jajowych wykazuje bardziej zagęszczony fenotyp. Zostało to potwierdzone przez kwantyfikację fenotypów Golgiego. Wreszcie, na powierzchniach 2D jądro komórkowe jest zorientowane losowo, podczas gdy na kubkach jajowych jest zorientowane ortogonalnie na płaszczyźnie xy, zarówno w komórkach typu dzikiego, jak i leczonych Blebbistatyną.
Określenie wartości kulistości jądra ujawnia, że miseczki jajowe nie wpływają na normalną kulistość jądra komórkowego. Jednak różnica między typem dzikim a komórkami traktowanymi Blebbistatyną na miseczkach jajowych sugeruje, że kubki jajowe ujawniają rzeczywisty efekt leku, który jest zamaskowany w 2D. Badania żywych komórek z wykorzystaniem kubków jajowych umożliwiają identyfikację nowych procesów aktywnych, które nie są widoczne w standardowych hodowlach.
Na przykład w komórkach HeLa zaobserwowano okresowe nagromadzenie miozyny, która porusza się promieniście, gdy pierścień cytokinetyczny zamyka się podczas mitozy. Po opanowaniu kubki na jajka można przygotować z repliki w mniej niż sześć godzin, a napełnianie komórek można wykonać w około 15 minut. Próbując tego procesu, ważne jest, aby mieć rozmiar miseczek jajowych w stosunku do badanych komórek.
Procedura ta może być dalej dostosowana do platform przesiewowych o wysokiej zawartości w firmach farmaceutycznych do masowych badań przesiewowych, a także do spersonalizowanych testów diagnostycznych pacjentów w ocenie poszczególnych specyficznych terapii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać i używać mikrowgłębień w kubkach na jajka. Kubeczki jajowe standaryzują i generują porządek w wielu podobnych systemach, od pojedynczych komórek bez ścian, takich jak komórki ssaków, po systemy ze ścianami, takie jak drożdże i zarodki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nowe urządzenie i metodę do badania morfologii i dynamiki komórek w środowisku 3D. Dzięki wykorzystaniu tablic mikrokawitacji, pojedyncze komórki mogą być precyzyjnie uporządkowane, co pozwala na lepszą orientację organelli i zmniejszenie zmienności w porównaniu ze standardowymi testami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Neuronauki
- 3D hodowla komórek
Tło
- Rozumienie dynamiki komórek jest kluczowe dla badań biologicznych.
- Standardowe testy 2D często nie potrafią odtworzyć warunków fizjologicznych.
- Środowiska 3D mogą poprawić badanie zachowania organelli.
- Tablice mikrokawitacji zapewniają kontrolowane środowisko dla badań nad komórkami.
Cel badania
- Obserwacja morfologii i dynamiki organelli komórkowych.
- Stworzenie środowiska 3D, które naśladuje warunki fizjologiczne.
- Porównanie zachowania komórek w 3D wobec tradycyjnych testów 2D.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie tablic mikrokawitacji PDMS poprzez formowanie replikacyjne.
- Funkcjonalizacja mikrokawitacji białkami macierzy pozakomórkowej.
- Wprowadzenie pojedynczych komórek ssaków do mikrokawitacji.
- Inkubacja z lekami w celu badania reakcji komórkowych.
Główne wyniki
- Różnice w fenotypie komórek obserwowano w 3D ograniczeniu.
- Zidentyfikowano nowe dynamiczne struktury w porównaniu z testami 2D.
- Metoda zminimalizowała zmienność w orientacji komórek.
- Osiągnięto lepsze zrozumienie dynamiki organelli.
Wnioski
- Metoda tablic mikrokawitacji zapewnia znaczący postęp w badaniach nad komórkami.
- Środowiska 3D są niezbędne do dokładnych ocen biologicznych.
- To podejście może prowadzić do lepszego testowania leków i analizy komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standard 2D cell culture assays limit phenotypic reproducibility and obscure organelle dynamics due to non-physiological growth conditions. This microcavity array device enables ordered single-cell confinement in a 3D extracellular matrix-mimicking environment, reducing morphological heterogeneity and enhancing detection of subcellular structures and dynamic processes. The improved phenotypic consistency supports more reliable high-content screening and mechanistic de-risking in early drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by normalizing cell position, shape, polarity, and internal organization in a physiologically relevant 3D context.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell morphologies, improving confidence in target engagement and pathway modulation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates visualization of organelles such as nucleus and Golgi apparatus and detection of novel dynamic structures like periodic myosin accumulations during cytokinetic ring closure.
- Operational Value: Standardizes cell preparation via centrifugation-based filling, achieving up to 80% occupancy with reproducible viability across mammalian cells, yeast, and embryos.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals drug-induced phenotypes masked in 2D, such as Blebbistatin effects on stress fiber reduction and nuclear orientation, enabling mechanistic de-risking.
- Operational Value: Supports adaptation to diverse model systems including fission yeast, budding yeast, and C. elegans, broadening preclinical relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The device bridges early discovery and lead identification by providing standardized 3D-confined cellular systems that improve assay readiness and data consistency before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through ordered arrays that clarify subcellular dynamics and reduce variability in organelle orientation.
- Screening: Enables assay standardization via uniform microcavity dimensions (105 cavities/cm2) and extracellular matrix functionalization with fibronectin.
- Analytics: Generates quantitative morphological and dynamic readouts (e.g., nucleus sphericity, Golgi compaction, actin/myosin ring dynamics) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical by preserving viability and enabling longitudinal observation of active processes like cytokinetic ring closure.
- Enterprise Reuse: Fabricated via replica molding, allowing rapid preparation (<6 hours) and reuse across multiple cell types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced phenotypic variability and enhanced detection of novel subcellular dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via PDMS microcavity arrays and optimized cell loading protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by unmasking drug effects obscured in 2D cultures, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via reliable organelle-level phenotyping in disease-relevant 3D contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, PDMS handling, and oxygen plasma activation for replica molding.
- Depends on access to centrifuge, plasma cleaner, fluorescence microscopy, and fibronectin for extracellular matrix functionalization.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation, filling optimization, and incubation timing across biology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations for varying cell sizes and wall properties (e.g., mammalian vs. yeast vs. embryo) to maintain loading efficiency.
- Practical limitations include the need for careful handling to avoid PDMS detachment and the requirement to match cavity dimensions to target cell size for optimal ordering.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:29
Microfabrication of 'Eggcups'
6:29
Introducing Cells into the 'Eggcups'
9:31
Observation of Fixed Cellular Organelles in 'Eggcups'
11:22
Results: 'Eggcups' Enable Visualization of Cellular Organelles and Study of Dynamic Cell Processes
13:27
Conclusion
