Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy
3 września 2014
Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.
Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie subkomórkowego frakcjonowania tkanki mózgowej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy w celu wzbogacenia o białka z błon synaptycznych i gęstości postsynaptycznych. Osiąga się to poprzez uprzednią homogenizację tkanki mózgowej za pomocą homogenizatora z zasilaniem. Następnie następuje szereg etapów wirowania w celu przygotowania surowych ekstraktów białek błonowych.
Ekstrakty membranowe są następnie nakładane warstwami na nieciągły gradient sacharozy w celu ultrawirowania. Ostatnim krokiem jest zebranie białek z gradientu. Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w poziomach białek synaptycznych poprzez analizę Western blot.
Jest to dobrze znana technika, która jest stosowana przez neurobiologów od ponad 40 lat. Używamy go w naszym laboratorium, aby zrozumieć, jak zmienia się skład białkowy synapsy, gdy zaburzamy różne systemy neuroprzekaźników. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak gradienty na wywołanie lub ciągłe gradienty sacharozy, jest to, że nieciągłe gradienty sacharozy są łatwiejsze do zbudowania ręcznie.
Protokół ten wykorzystuje napędzany silnikiem szklany homogenizator teflonowy, zawsze wymieniaj tłuczek między próbkami, a następnie płucz i susz. Homogenizator najpierw załaduj wypreparowaną tkankę do 13-mililitrowej probówki z czterema mililitrami 0,32-molowego buforowanego roztworu sacharozy HEPA. Następnie przenieś tkankę do czystego szklanego homogenizatora.
Ustaw silnik na 900 obr./min i homogenizuj próbkę za pomocą 12 uderzeń w ciągu 30 sekund, używając mniej niż czterech gramów tkanki, zapewnia dobre frakcjonowanie, przenieś próbkę z powrotem do probówki i przechowuj podwielokrotność 100 mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy białka. Następnie oddzielić materiał jądrowy, obracając homogenat o masie 900 G przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki.
Supernatant zawiera surową frakcję błonową. Teraz, aby wzbogacić do surowej wirówki synaptosomowej, supernatant w ilości 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant. Osad zawiera surową frakcję synaptosomów Resus.
Zawiesić go w jednym mililitrze 0,32-molowego roztworu sacharozy. Następnie, przy kolejnych trzech mililitrach roztworu do zawiesiny, odwirować frakcję surową przez 15 minut. W temperaturze 10 000 G w czterech stopniach Celsjusza usunąć supernatant. Teraz szybko spowij pellet, ponownie zawieś pellet w mililitrze czystej wody.
Następnie szybko dodaj kolejne trzy mililitry wody. Przenieś to do homogenizatora. Wykonaj ręcznie trzy pociągnięcia i przenieś je z powrotem do 13-mililitrowej tubki.
Szybko dostosuj próbkę z powrotem do czterech milimolowych HEA z dodatkiem 16 mikrolitrów jednego molowego HEA i wymieszaj przez inwersję. Teraz umieść próbkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pół godziny. Aby zapewnić lizę próbki, należy zakończyć frakcjonowanie poprzez granulowanie dwóch frakcji głównych Lysed P.
Odwirować w temperaturze 25 000 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w mililitrze roztworu sacharozy. Zawiera wzbogacone błony episomalne synap. Najpierw wstępnie zmierz, aby uzyskać nieciągły gradient sacharozy.
Załaduj trzy probówki w następujący sposób, jedną z dokładnie 3,5 mililitra 1,2 molowego buforowanego roztworu sacharozy. Drugi z dokładnie trzema mililitrami roztworu 1,0 molowego, a trzeci z trzema mililitrami roztworu 0,8 molowego. Następnie za pomocą szklanej pipety do przelania 1,2-molowego roztworu sacharozy do 12-mililitrowej probówki ultrawirówki polimerowej.
Za pomocą nowej pipety ostrożnie nałożyć roztwór 1,0 molowy na roztwór 1,2 molowy. Nie należy naruszać roztworu 1,2 molowego ani wprowadzać pęcherzyków za pomocą pipety. Użyj tej samej techniki, aby nałożyć warstwę 0,8 molowego roztworu na wierzch.
Zachowaj ostrożność. Wystarczą niewielkie drgania z wiru stołowego lub mikrowirówki, aby zakłócić integralność gradientu. Ważne jest, aby budować gradienty ostrożnie i wydajnie.
Jeśli trwa to zbyt długo lub jeśli gradient jest narażony na wibracje, nie będziesz w stanie odzyskać błon synaptycznych w późniejszych krokach. Teraz za pomocą kolejnej pipety pastora nałóż wzbogaconą frakcję błony episomalnej synapy na przygotowany gradient. Precyzyjnie zrównoważyć nachylenie w ultrawirówce w wahadłowym wirniku kubełkowym.
Następnie odwirowuj go w temperaturze 150 000 G przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania gradientu z wiadra po odwirowaniu, powinny być przezroczyste pasma roztworu sacharozy. Przy frakcjach białkowych na każdym granicy faz i osadku frakcje nie powinny być dyfuzyjne.
Za pomocą igły o rozmiarze 18 G i strzykawki o pojemności jednego mililitra nakłuj najniższą część granicy między zębami trzonowymi do 1,2 mola i wycofaj biały pasek białka, który zawiera błony plazmatyczne synapty. Zapisz objętość tej warstwy. Przenieś warstwę do grubościennej probówki ultrawirówki o grubości 3,5 mililitra.
Dodaj dokładnie 2,5 objętości czterech milimolowych HEA. Następnie przygotować probówkę balansującą z 0,32 molowym buforowanym roztworem sacharozy HEA w wirniku o stałym kącie, ultraodwirować próbkę o stężeniu 200 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć senes i ponownie zawieś osad błony plazmatycznej.
W 300 mikrolitrach 50 milimolowych HEA dwa milimolowe roztwory EDTA. Frakcję gęstości postsynaptycznej lub frakcję PSD można teraz zebrać przy użyciu tych samych technik. Kroki są jasno określone w protokole tekstowym.
Przeprowadzono western blot z białkiem całkowitym, błoną plazmatyczną synaps i pierwszymi frakcjami białka o gęstości postsynaptycznej. Frakcja PSD została poddana tylko jednemu zabiegowi detergentowemu, a tkanka pochodziła z prążkowia myszy. Białka presynaptyczne, takie jak transporter dopaminy, są wzbogacane we frakcję SPM, ale są eliminowane w kolejnym etapie detergentu w celu wzbogacenia PSD.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich próbek na lodzie oraz o dołączeniu inhibitorów proteazy i fosfatazy Zgodnie z tą procedurą. Można wykonać inne metody, takie jak zachodnia analiza krwi lub dwuwymiarowa elektroforeza żelowa. Następnie możesz odpowiedzieć na pytania, takie jak to, jak leczenie farmakologiczne wpływa na poziom receptorów w synapsie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyczną synaps za pomocą ultrawirowania na nieciągłym gradiencie sacharozy. Procedura przedstawia frakcjonowanie subkomórkowe tkanki mózgowej w celu wyizolowania i wzbogacenia białek z błon synaptycznych oraz zagęszczeń postsynaptycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Analiza białek
Wstęp
- Zrozumienie poziomów białek synaptycznych ma kluczowe znaczenie dla badań z zakresu neuronauki.
- Membrany synaptyczne i gęstości postsynaptyczne odgrywają kluczową rolę w komunikacji neuronalnej.
- Ultrawirowanie jest standardową techniką wzbogacania białek.
- Western blotting oraz 2D DIGE to powszechnie stosowane metody analizy białek.
Cel badania
- W celu wzbogacenia białek z błon synaptycznych i gęstości postsynaptycznych.
- W celu przygotowania ekstraktów białkowych odpowiednich do dalszych analiz.
- W celu wykazania skuteczności nieciągłego gradientu sacharozy w procesie wzbogacania białek.
Zastosowane metody
- Homogenizacja tkanki mózgowej przy użyciu homogenizatora elektrycznego.
- Seria etapów wirowania w celu przygotowania surowych ekstraktów białek błonowych.
- Nakładanie ekstraktów błonowych na nieciągły gradient sacharozy.
- Ultrawirowanie w celu wyizolowania białek z gradientu.
Główne wyniki
- Skuteczne wzbogacenie białek błony plazmatycznej synaps.
- Przygotowanie białek gęstości postsynaptycznej do analizy.
- Wyniki mogą wskazywać na zmiany w poziomach białek synaptycznych.
- Metoda odpowiednia do analizy Western blot oraz 2D DIGE.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie wzbogaca białka z błon synaptycznych.
- Stanowi podstawę do badania dynamiki białek synaptycznych.
- Może być stosowana w odpowiedzi na różnorodne pytania badawcze z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczenie białek synaptycznych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka podczas walidacji celów terapeutycznych w OUN poprzez powiązanie zmian molekularnych z fenotypami funkcjonalnymi. Ta metoda frakcjonowania subkomórkowego zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez izolację istotnych dla choroby przedziałów synaptycznych. Stanowi ona system adekwatny do przebiegu choroby, pozwalający na ocenę stopnia zaangażowania celu oraz modulacji szlaków sygnałowych w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie transportu białek błony plazmatycznej synaps oraz gęstości postsynaptycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane podejście do izolacji przedziałów synaptycznych w celu ograniczenia ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
- Wartość predykcyjna: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez pomiar zmian w poziomach białek presynaptycznych i postsynaptycznych po modulacji szlaków sygnałowych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane frakcje białek synaptycznych do zastosowania w testach przesiewowych fenotypowych w celu oceny wpływu związków na integralność synaptyczną.
- Wartość operacyjna: Generuje powtarzalne, ilościowe wyniki białkowe odpowiednie do standaryzacji testów i analizy wysokotreściowej.
- Skalowalność: Metoda nieciągłego gradientu sacharozy umożliwia przetwarzanie próbek w partiach, co zapewnia stałą gotowość do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez izolację białek synaptycznych ze specyficznych obszarów mózgu, takich jak prążkowie, w celu badania celów neuropsychiatrycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów, dostarczając mierzalnych odczytów białek synaptycznych skorelowanych z wynikami funkcjonalnymi.
- Minimalizacja ryzyka: Ułatwia ciągłość badań przedklinicznych poprzez powiązanie modulacji celu z mierzalnymi zmianami w składzie białek synaptycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda integruje się z procesem badawczym – od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając ilościowych danych na temat białek synaptycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację przedziałów synaptycznych dotkniętych zaburzeniami układu neuroprzekaźników.
- Screening: Umożliwia przygotowanie analizy poprzez otrzymywanie wzbogaconych frakcji błon plazmatycznych synaps oraz PSD, odpowiednich do analizy Western blot lub 2D DIGE.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (intensywność prążków białkowych), które pozwalają na porównanie poziomów białek synaptycznych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając ocenę zmian w białkach synaptycznych w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę do izolacji białek synaptycznych w wielu projektach dotyczących OUN i różnych klas celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu pomiarowi transportu białek synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki dobrze opracowanemu protokołowi gradientu sacharozy skokowej z określonymi etapami wirowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, ilościowych danych dotyczących białek synaptycznych, co zmniejsza ryzyko rozwoju celów w obrębie OUN.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o mierzalne efekty wpływające na skład białek synaptycznych oraz funkcję synaptyczną.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie frakcjonowania subkomórkowego, ultrawirowania i biologii synaptycznej, aby zapewnić prawidłowe utworzenie gradientu oraz pobranie frakcji.
- Metoda zależy od dostępu do ultrawirowarki z rotorami z ruchomym kątem (swinging bucket) i rotorami stałokątnymi oraz możliwości utrzymania próbek w temperaturze 4°C przez cały proces.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja przygotowania gradientu, homogenizacji tkanki oraz stosowania inhibitorów proteaz i fosfataz, aby zapewnić powtarzalność wyników między ośrodkami.
- W przypadku stosowania metody w różnych obszarach mózgu lub modelach chorób wymagane jest dostosowanie procedur ze względu na różnice w ekspresji białek synaptycznych i wydajności tkanki.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność użycia świeżej lub odpowiednio przechowywanej tkanki oraz ostrożne obchodzenie się z próbkami, aby zapobiec zaburzeniom gradientu spowodowanym wibracjami lub opóźnieniami podczas przygotowań.
