Name: Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj metodę subkomórkowej frakcjonacji tkanki mózgowej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy do wzbogacania białek błon synaptycznych i gęstości postsynaptycznej. Technika ta umożliwia analizę poziomów białek synaptycznych metodą Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Mike'owi Ehlersowi i jego członkom laboratorium za zademonstrowanie protokołu subkomórkowego frakcjonowania synaptycznych błon plazmatycznych. Dziękujemy również Wendy Horsfall za zarządzanie koloniami myszy. Prace te były wspierane przez dotacje operacyjne z CIHR (AJR i AS).

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami i został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Wydziału Medycyny i Farmacji Uniwersytetu w Toronto.
1. Przygotuj wymagane odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 1
<ol>
	<li>Dodać inhibitory proteazy i fosfatazy (jeśli to konieczne) do wszystkich roztworów sacharozy, i ddH2O w stężeniach podanych w tabeli 1. WAŻNE: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C i wstępnie schłodź wszystkie odczynniki i sprzęt przed rozpoczęciem eksperymentu. Oznacz wszystkie probówki, w tym probówki ultrawirówkowe, markerem permanentnym.</li>
</ol>
2. Sekcja odpowiedniego obszaru mózgu
<ol>
	<li>Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy. Trzymanie i eutanazja zwierząt zgodnie z polityką instytucjonalną i rządową dotyczącą opieki nad zwierzętami.</li>
	<li>Szybko usuń mózg z czaszki i umieść go na schłodzonym bloku preparacyjnym</li>.
	<li>Wypreparuj odpowiedni obszar mózgu ze świeżej tkanki i przejdź do kroku 3.</li>
</ol>
3. Homogenizacja tkanek za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego napędzanego silnikiem
<ol>
	<li>Umieścić 50-100 mg (dla SPM) lub 100-200 mg (dla PSD) wyciętej tkanki w znakowanej probówce polipropylenowej o pojemności 13 ml zawierającej 4 ml 0,32 M buforowanego roztworu sacharozy HEPES. Przenieść próbkę do stożkowego młynka/homogenizatora do bibułek szklano-teflonowych o pojemności 15 ml, ustawić napęd silnika na 900 obr./min (ustawienie 7) i homogenizować próbkę za pomocą 12 uderzeń w ciągu 30 sekund. Użyj innego homogenizatora szklano-teflonowego między próbkami lub przepłucz homogenizator zimną wodą destylowaną między próbkami i wytrzyj do sucha chusteczką Kimwipe. UWAGA: Do 4 g tkanki można homogenizować w 4 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES, jednak zaleca się użycie mniejszej ilości tkanki, aby zapewnić prawidłowe frakcjonowanie.</li>
	<li>Przenieść homogenizowaną próbkę z powrotem do tej samej probówki polipropylenowej o pojemności 13 ml. Odłożyć 100 μl homogenatu i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy Western blot całkowitej frakcji białkowej.</li>
</ol>
4. Wirowanie z niską prędkością w celu usunięcia frakcji jądrowej (daje supernatant S1)
<ol>
	<li>Odwirować homogenat w rotorze o stałym kącie nachylenia przy 900 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (S1) do nowej, oznakowanej probówki o pojemności 13 ml i ponownie zawiesić osad frakcji jądrowej (P1) w 500 μl 0,32 M sacharozy buforowanej przez HEPES. UWAGA: Frakcja (P1) może być przechowywana w temperaturze -80 °C i używana do analizy western blot frakcji jądrowej.</li>
</ol>
5. Wzbogacenie surowej frakcji synaptosomalnej (daje osad P2)
<ol>
	<li>Odwirować supernatant (S1) przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (S2) i zarezerwować 500 μl w probówce do mikrowirówki do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy western blot cytozolowej/lekkiej frakcji błonowej. Zawiesić pozostały granulat surowej frakcji synaptosomalnej (P2) w 1 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES, a następnie dodać kolejne 3 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (S2') i zarezerwować 500 μl w probówce do mikrowirówki do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej kwantyfikacji białka i analizy western blot cytozolowej/lekkiej frakcji błonowej. Zachowaj przemyty surowy granulat synaptosomalny (P2') w probówce polipropylenowej.</li>
</ol>
6. Liza (wstrząs hipoosmotyczny) surowej frakcji synaptosomalnej
<ol>
	<li>Poddać lizie surowy osad synaptosomalny (P2') w probówce polipropylenowej, zawieszając go ponownie w 1 ml ddH2O. Dodać kolejne 3 ml ddH2O, przenieść do homogenizatora tkanek szklano-teflonowych i homogenizować ręcznie za pomocą 3 pociągnięć. UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok tak szybko, jak to możliwe i szybko przejść do kroku 6.2.</li>
	<li>Przenieść próbki z homogenizatora z powrotem do tej samej probówki polipropylenowej o pojemności 13 ml i szybko dostosować próbkę z powrotem do 4 mM HEPES z 16 μl 1 M roztworu HEPES, odwrócić w celu wymieszania.</li>
	<li>Obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby zapewnić całkowitą lizę.</li>
</ol>
7. Wzbogacenie frakcji błony synaptosomalnej (P3)
<ol>
	<li>Wirować przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć surowy supernatant frakcji pęcherzykowej (S3) i umieścić go w probówce o pojemności 5 ml do przechowywania w temperaturze -80 °C w celu późniejszej oceny ilościowej białka i analizy Western blot. Zawiesić frakcję błony synaptosomalnej (P3) w 1 ml 0,32 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES.</li>
</ol>
8. Przygotowanie nieciągłego gradientu sacharozy
<ol>
	<li>Odmierzyć dokładnie 3,5 ml 1,2 M roztworu sacharozy z buforem HEPES i dokładnie po 3,0 ml roztworu sacharozy o spulchnieniu 1,0 M i 0,8 M HEPES do oddzielnych probówek z zatrzaskiem o pojemności 6 ml. UWAGA: Ma to na celu wstępne zmierzenie objętości, które są używane do tworzenia gradientu sacharozy. Dokładny pomiar objętości jest ważny, aby zapewnić, że powstałe gradienty zostaną zrównoważone do ultrawirowania.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety i bańki Pasteura przenieść 1,2 M roztworu sacharozy buforowanego przez HEPES do 12 ml probówki ultrawirówki z poliallomera. Ostrożnie nałożyć 1,0 M roztwór sacharozy buforowany przez HEPES na 1,2 M roztworu sacharozy buforowanej przez HEPES. Na koniec ułóż 0,8 M roztwór sacharozy buforowany przez HEPES na 1,0 M roztworze sacharozy buforowanym przez HEPES. Do każdego roztworu sacharozy należy używać świeżej pipety Pasteura i uważać, aby nie zaburzyć gradientu sacharozy. Drgania z wiru stołowego lub mikrowirówki zakłócą integralność gradientu.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura nałożyć zawieszoną frakcję błony synaptosomalnej (P3) na przygotowany nieciągły gradient sacharozy. Upewnij się, że nachylenia są zrównoważone, ważąc je wewnątrz łyżki wahliwego wirnika kubełkowego. Jeśli wiadra nie są wyważone, użyj pipety P200, aby ostrożnie dodać 0,32 M sacharozy buforowanej przez HEPES na szczyt gradientu i zrównoważyć wiadra wirnika.</li>
</ol>
9. Frakcjonowanie błony plazmatycznej synaps (SPM)
<ol>
	<li>Ultrawirować w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 150 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć gradienty sacharozy z wiader ultrawirówek. Za pomocą igły 18 G i strzykawki o pojemności 1 ml nakłuć probówkę na dnie interfazy roztworu sacharozy buforowanego przez 1,0 M / 1,2 M HEPES i usunąć warstwę błony synaptycznej plazmatyki (SPM).</li>
	<li>Zwrócić uwagę na objętość zajmowaną przez każdą próbkę SPM w strzykawce o pojemności 1 ml. Zebraną warstwę SPM umieścić w grubościennych probówkach ultrawirówek o grubości 3,5 ml, dodać dokładnie 2,5 objętości 4 mM HEPES, aby dostosować stężenie sacharozy z 1,2 M do 0,32 M. Po dostosowaniu każdej próbki do 0,32 M sacharozy, zrównoważyć probówki 0,32 M roztworem sacharozy buforowanym przez HEPES.</li>
	<li>Ultrawirować w wirniku o stałym kącie nachylenia 200 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad błony plazmatycznej synaptycznej (SPM) w 300 μl 50 mM roztworu HEPES / 2 mM EDTA. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia w Western Blot.</li>
</ol>
10. Przygotowanie frakcji gęstości postsynaptycznej (PSD)
<ol>
	<li>Próbki SPM rozmrozić na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór 0,54% Triton X-100 w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA.</li>
	<li>W probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml połączyć 2,7 ml roztworu Triton X-100/HEPES/EDTA i 300 μl frakcji SPM i obracać próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Przenieść próbki do grubościennych probówek ultrawirówkowych o pojemności 3,5 ml i odwirować próbki o masie 32 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zachować supernatant (frakcja rozpuszczalna Triton X-100 [TS]) i przechowywać w temperaturze -80 °C. UWAGA: Na tym etapie osad reprezentuje frakcję "PSD-1T". Drugie traktowanie detergentem wytworzy frakcję "PSD-2T". Jeśli pożądana jest frakcja PSD-1T, przejdź do kroku 10.6.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć frakcję PSD-2T, należy ponownie zawiesić granulat w 3 ml 0,5% Triton X-100 w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA. Obracać próbki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odwirowywać próbki o temperaturze 32 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przejść do kroku 10.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad postsynaptyczny (PSD) w roztworze 50 mM HEPES / 2 mM EDTA. UWAGA: Objętość ponownego zawieszenia może zależeć od wielkości granulki; Zalecana objętość 50-75 μl. Ponieważ frakcja PSD jest frakcją nierozpuszczalną w detergentach, często konieczne jest dodanie 1-2 μl 0,5% SDS, aby umożliwić całkowite ponowne zawieszenie białka. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia w Western Blot.</li>
</ol>

<ol><li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li>
<li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li>
<li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li>
<li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li>
<li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li>
<li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li>
<li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+%22major+postsynaptic+density+protein%22+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li>
<li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li>
<li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li>
<li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arc%2FArg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li>
<li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+I+%28protein+I%29%2C+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li>
<li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li>
<li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li>
<li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses%3A+a+more+quantitative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning : a Laboratory Manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li>
<li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li>
<li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198(2007).</li>
<li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li>
<li>Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li>
<li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li>
<li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner%3A+conserved+Pex5p+WXXXF%2FY+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li>
<li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li>
<li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-100B%2C+neuron-specific+enolase+%28NSE%29%2C+myelin+basic+protein+%28MBP%29+and+glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+in+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29+and+blood+of+neurological+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li>
<li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li>
<li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W procedurze jest kilka etapów, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku. W kroku 3 ważne jest, aby osiągnąć stały stopień homogenizacji dla każdej próbki. Podczas homogenizacji tkanek za pomocą homogenizatora napędzanego silnikiem używana jest stała prędkość nie tylko do obracania tłuczka, ale także do liczby uderzeń. Czas inkubacji podczas wstrząsu osmotycznego powinien być precyzyjny, ponieważ przedłużona homogenizacja lub inkubacja w roztworze hipotonicznym spowoduje lizę mitochondriów i zanieczyszczenie p...

Neurony komunikują się za pomocą synaps, a jakość tej komunikacji jest regulowana w dużym stopniu przez zmiany w składzie białek w synapsie. W szczególności białka znajdujące się w gęstości postsynaptycznej uczestniczą w komunikacji neuronalnej poprzez ścisłe rusztowanie receptorów neuroprzekaźników z ich systemami transdukcji sygnału1. Co więcej, trwałe zmiany w sile skuteczności synaptycznej są kontrolowane przez dodawanie lub usuwanie receptorów o gęstości postsynaptycznej1-6. Dlatego izolacja i kwantyfikacja białek synaptycznych jest niezbędną i użyteczną techniką w celu uzyskania wglądu w sposoby, w jakie neurony reagują na bodźce i zmieniają skuteczność synaptyczną7. W artykule opisano powszechną technikę izolowania białek synaptycznych z tkanki mózgowej gryzoni poprzez ultrawirowanie na nieciągłych gradientach sacharozy. Frakcja błony plazmatycznej synaps może być wzbogacona i wyizolowana na podstawie jej gęstości w sacharozy, która została empirycznie określona jako podobna do 1,2 M sacharozy.
W zależności od kwestii biologicznej, subkomórkowe frakcje mogą być oddzielone ciągłymi lub nieciągłymi gradientami sacharozy lub Percollu. Ciągłe gradienty pozwalają na rozdzielenie białek na wiele frakcji; Może to być szczególnie przydatne do wykazania kolokalizacji białek w danej frakcji8. Jednak przygotowanie ciągłych gradientów jest bardziej pracochłonne i nie jest konieczne w przypadku wielu zastosowań. Nieciągłe gradienty są stosunkowo łatwiejsze do przygotowania i mogą być używane do rozdzielania białek na kilka, ogólnie zdefiniowanych frakcji. Nieciągłe gradienty, które składają się z trzech warstw sacharozy o rosnącej molarności, są szeroko stosowane do izolowania białek związanych z synaptyczną błoną plazmatyczną (SPM). Ta frakcja błony plazmatycznej synaps może być dalej przetwarzana do frakcji gęstości postsynaptycznej (PSD) poprzez obróbkę detergentem i izolację frakcji nierozpuszczalnej w detergentach.
Gdy ten proces został po raz pierwszy opisany w latach 60-tych9,10, użyto mikroskopii elektronowej, aby zademonstrować organelle i błony, które z grubsza definiują błonę plazmatyczną synaptyczną i postsynaptyczne frakcjegęstości 9-14. Badania te wykazały włączenie błon pre- i postsynaptycznych oraz pęcherzyków synaptycznych do frakcji SPM; Po obróbce detergentem widoczne były przede wszystkim gęstości postsynaptyczne o dużej gęstości elektronowej. W procedurze wstrząs hipotoniczny służy do uszczypnięcia procesów synaptycznych z ciała komórki10. Ten krok wykorzystuje fakt, że mitochondria są bardziej odporne na szok osmotyczny i pozostają nienaruszone, a więc osadzają się na dnie gradientu sacharozy (ryc. 1).
Korzystając z tej samej techniki wzbogacania, frakcje SPM i PSD zostały najpierw zdefiniowane biochemicznie za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i sekwencjonowania głównych składników białka15-17. Następnie analiza western blot została wykorzystana do wykrycia i ilościowego określenia poziomów białek synaptycznych oraz dalszego zdefiniowania tych frakcji (ryc. 2). Użyliśmy tej techniki w naszych laboratoriach do ilościowego określenia zmian w poziomach synaptycznych transportera dopaminy, które występują, gdy locus Slc6a3 jest zduplikowany u myszy18. Zastosowaliśmy również tę technikę u myszy z niedoborem receptora NMDA, aby odkryć specyficzne dla synaps redukcje białek, które są częścią interaktomu DISC119.
Z analizy western blot jasno wynika, że frakcje SPM zawierają białka błony pęcherzyków synaptycznych, markery endosomów, białka mitochondrialne, syntetyczne enzymy związane z błoną i cząsteczki transdukcji sygnału, a także integralne składniki gęstości postsynaptycznej i błon plazmatycznychsynaptycznych 20-23. Nawet frakcje PSD mogą być zanieczyszczone licznymi białkami mitochondrialnymi i może być konieczne wykonanie drugiej sedymentacji gradientowej lub dodatkowych etapów oczyszczania w celu ich usunięcia13. Ostatnio ilościowa spektrometria mas dostarczyła listę ponad 100 białek w samej gęstości postsynaptycznej, a także wskazanie względnej obfitości tych składników24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7,4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td></td><td>BioShop APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidyna</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &frac12; &rdquo; igła</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 cc</td><td>Homogenizator szklany 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>teflonowy Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło podstawowe IKA Model RW 16</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik o stałym kącie nachylenia Sorvall SM-24</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall RC 6 Plus</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki polialomerowe (13,2 ml)</td>Łyżka wahadłowa <td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti</td><td>Silvers Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka podłogowa Beckman L-80 Beckman</td> Coulter Grubościenne rurki poliwęglanowe <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3,5 ml)</td><td>Rotor</td><td></td> stałokątny Beckman Coulter 349622 <td></td></tr><tr><td>TLA-100.3</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka stołowa Beckman TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Techniki frakcjonowania subkomórkowego neuronów pozwalają na ilościowe określenie białek, które są transportowane do i z synapsy. Jak pierwotnie opisano pod koniec lat sześćdziesiątych, białka związane z błoną plazmatyki synaptycznej można wyizolować przez ultrawirowanie na gradiencie gęstości sacharozy. Po wyizolowaniu błon synaptycznych kompleks makrocząsteczkowy znany jako gęstość postsynaptyczna może być następnie wyizolowany ze względu na jego nierozpuszczalność w detergentach. Techniki stosowane do izolowania błon plazmatycznych synaps i białek o gęstości postsynaptycznej pozostają zasadniczo takie same po 40 latach i są szeroko stosowane w obecnych badaniach neurobiologicznych. Ten artykuł szczegółowo opisuje frakcjonowanie białek związanych z błoną plazmatyczną synaptyczną i gęstością postsynaptyczną przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy. Otrzymane preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Przygotowanie gradientu gęstości sacharozy powinno doprowadzić do wyraźnego rozdzielenia trzech roztworów sacharozy o różnych stężeniach molowych (0.8, 1.0 i 1.2 M sacharozy). Przykład gradientu przed dodaniem próbki białka przedstawiono na Rysunku 3A. Jeśli gradient zostanie przygotowany zbyt wcześnie lub na blacie laboratoryjnym narażonym na wibracje z innych urządzeń, zostanie on naruszony, co uniemożliwi prawidłowe rozdzielenie. W przypadku braku wyraźnego rozdzielenia trzech roztworów zaleca się prz...

Ten artykuł szczegółowo opisuje wzbogacanie białek związanych z błoną plazmatyki synaptycznej przez ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie sacharozy. Opisano również późniejsze przygotowanie białek o gęstości postsynaptycznej. Preparaty białkowe nadają się do western blotting lub analizy 2D DIGE.

Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie subkomórkowego frakcjonowania tkanki mózgowej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy w celu wzbogacenia o białka z błon synaptycznych i gęstości postsynaptycznych. Osiąga się to poprzez uprzednią homogenizację tkanki mózgowej za pomocą homogenizatora z zasilaniem. Następnie następuje szereg etapów wirowania w celu przygotowania surowych ekstraktów białek błonowych.Ekstrakty membranowe są następnie nakładane warstwami na nieciągły gradient sacharozy w celu ultrawirowania. Ostatnim krokiem jest zebranie białek z gradientu. Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w poziomach białek synaptycznych poprzez analizę Western blot.Jest to dobrze znana technika, która jest stosowana przez neurobiologów od ponad 40 lat. Używamy go w naszym laboratorium, aby zrozumieć, jak zmienia się skład białkowy synapsy, gdy zaburzamy różne systemy neuroprzekaźników. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak gradienty na wywołanie lub ciągłe gradienty sacharozy, jest to, że nieciągłe gradienty sacharozy są łatwiejsze do zbudowania ręcznie.Protokół ten wykorzystuje napędzany silnikiem szklany homogenizator teflonowy, zawsze wymieniaj tłuczek między próbkami, a następnie płucz i susz. Homogenizator najpierw załaduj wypreparowaną tkankę do 13-mililitrowej probówki z czterema mililitrami 0,32-molowego buforowanego roztworu sacharozy HEPA. Następnie przenieś tkankę do czystego szklanego homogenizatora.Ustaw silnik na 900 obr./min i homogenizuj próbkę za pomocą 12 uderzeń w ciągu 30 sekund, używając mniej niż czterech gramów tkanki, zapewnia dobre frakcjonowanie, przenieś próbkę z powrotem do probówki i przechowuj podwielokrotność 100 mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy białka. Następnie oddzielić materiał jądrowy, obracając homogenat o masie 900 G przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki.Supernatant zawiera surową frakcję błonową. Teraz, aby wzbogacić do surowej wirówki synaptosomowej, supernatant w ilości 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant. Osad zawiera surową frakcję synaptosomów Resus.Zawiesić go w jednym mililitrze 0,32-molowego roztworu sacharozy. Następnie, przy kolejnych trzech mililitrach roztworu do zawiesiny, odwirować frakcję surową przez 15 minut. W temperaturze 10 000 G w czterech stopniach Celsjusza usunąć supernatant. Teraz szybko spowij pellet, ponownie zawieś pellet w mililitrze czystej wody.Następnie szybko dodaj kolejne trzy mililitry wody. Przenieś to do homogenizatora. Wykonaj ręcznie trzy pociągnięcia i przenieś je z powrotem do 13-mililitrowej tubki.Szybko dostosuj próbkę z powrotem do czterech milimolowych HEA z dodatkiem 16 mikrolitrów jednego molowego HEA i wymieszaj przez inwersję. Teraz umieść próbkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pół godziny. Aby zapewnić lizę próbki, należy zakończyć frakcjonowanie poprzez granulowanie dwóch frakcji głównych Lysed P.Odwirować w temperaturze 25 000 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w mililitrze roztworu sacharozy. Zawiera wzbogacone błony episomalne synap. Najpierw wstępnie zmierz, aby uzyskać nieciągły gradient sacharozy.Załaduj trzy probówki w następujący sposób, jedną z dokładnie 3,5 mililitra 1,2 molowego buforowanego roztworu sacharozy. Drugi z dokładnie trzema mililitrami roztworu 1,0 molowego, a trzeci z trzema mililitrami roztworu 0,8 molowego. Następnie za pomocą szklanej pipety do przelania 1,2-molowego roztworu sacharozy do 12-mililitrowej probówki ultrawirówki polimerowej.Za pomocą nowej pipety ostrożnie nałożyć roztwór 1,0 molowy na roztwór 1,2 molowy. Nie należy naruszać roztworu 1,2 molowego ani wprowadzać pęcherzyków za pomocą pipety. Użyj tej samej techniki, aby nałożyć warstwę 0,8 molowego roztworu na wierzch.Zachowaj ostrożność. Wystarczą niewielkie drgania z wiru stołowego lub mikrowirówki, aby zakłócić integralność gradientu. Ważne jest, aby budować gradienty ostrożnie i wydajnie.Jeśli trwa to zbyt długo lub jeśli gradient jest narażony na wibracje, nie będziesz w stanie odzyskać błon synaptycznych w późniejszych krokach. Teraz za pomocą kolejnej pipety pastora nałóż wzbogaconą frakcję błony episomalnej synapy na przygotowany gradient. Precyzyjnie zrównoważyć nachylenie w ultrawirówce w wahadłowym wirniku kubełkowym.Następnie odwirowuj go w temperaturze 150 000 G przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania gradientu z wiadra po odwirowaniu, powinny być przezroczyste pasma roztworu sacharozy. Przy frakcjach białkowych na każdym granicy faz i osadku frakcje nie powinny być dyfuzyjne.Za pomocą igły o rozmiarze 18 G i strzykawki o pojemności jednego mililitra nakłuj najniższą część granicy między zębami trzonowymi do 1,2 mola i wycofaj biały pasek białka, który zawiera błony plazmatyczne synapty. Zapisz objętość tej warstwy. Przenieś warstwę do grubościennej probówki ultrawirówki o grubości 3,5 mililitra.Dodaj dokładnie 2,5 objętości czterech milimolowych HEA. Następnie przygotować probówkę balansującą z 0,32 molowym buforowanym roztworem sacharozy HEA w wirniku o stałym kącie, ultraodwirować próbkę o stężeniu 200 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć senes i ponownie zawieś osad błony plazmatycznej.W 300 mikrolitrach 50 milimolowych HEA dwa milimolowe roztwory EDTA. Frakcję gęstości postsynaptycznej lub frakcję PSD można teraz zebrać przy użyciu tych samych technik. Kroki są jasno określone w protokole tekstowym.Przeprowadzono western blot z białkiem całkowitym, błoną plazmatyczną synaps i pierwszymi frakcjami białka o gęstości postsynaptycznej. Frakcja PSD została poddana tylko jednemu zabiegowi detergentowemu, a tkanka pochodziła z prążkowia myszy. Białka presynaptyczne, takie jak transporter dopaminy, są wzbogacane we frakcję SPM, ale są eliminowane w kolejnym etapie detergentu w celu wzbogacenia PSD.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich próbek na lodzie oraz o dołączeniu inhibitorów proteazy i fosfatazy Zgodnie z tą procedurą. Można wykonać inne metody, takie jak zachodnia analiza krwi lub dwuwymiarowa elektroforeza żelowa. Następnie możesz odpowiedzieć na pytania, takie jak to, jak leczenie farmakologiczne wpływa na poziom receptorów w synapsie.

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu przygotowania endosomów do recyklingu z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiacji gęstości sacharozy.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Poznaj metodę subkomórkowej frakcjonacji tkanki mózgowej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy do wzbogacania białek błon synaptycznych i gęstości postsynaptycznej. Technika ta umożliwia analizę poziomów białek synaptycznych metodą Western blot.

Otrzymywanie błony plazmatycznej synaps i białek o gęstości postsynaptycznej przy użyciu nieciągłego gradientu sacharozy

Przeglądaj więcej filmów