Name: Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę śledzenia transportu aksonalnego BDNF w neuronach pierwotnych szczura przy użyciu obrazowania w czasie rzeczywistym z kropkami kwantowymi. Technika ta pozwala obserwować dynamikę czynników neurotroficznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit za ich pomoc techniczną. Badanie jest wspierane przez grant NIH (PN2 EY016525) oraz przez fundusze z Down Syndrome Research and Treatment Foundation i Larry L. Hillblom Foundation.

Zabiegi chirurgiczne i na zwierzętach są przeprowadzane ściśle według Przewodnika NIH dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt są zatwierdzane przez UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Klonowanie plazmidu, ekspresja i oczyszczanie monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF)
UWAGA: Skonstruuj pre-proBDNFavi i BirA cDNA do wektora pcDNA3.1 i koekspresji w HEK293FT komórkach10. Oczyszczać mBtBDNF za pomocą kulek Ni-NTA zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą wytwarzania dojrzałego i biologicznie aktywnego monobiotynylowanego czynnika wzrostu nerwów (mBtNGF)10.
2. Przygotowanie komór mikroprzepływowych
Mikroprzepływowe urządzenie do hodowli neuronów umożliwia płynne izolowanie aksonów od ciał komórek neuronów. Zmontuj komory ze świeżo pokrytymi szkiełkami nakrywkowymi tuż przed każdym rozwarstwieniem. Komory mikroprzepływowe stosowane w tym protokole są kupowane komercyjnie (patrz tabela materiałów i wyposażenia). Mycie ręczne i ponownie używane komory zakupione komercyjnie do 5-6 razy.
<ol>
	<li>Komory mikroprzepływowe do mycia ręcznego w 1% Alconox. Spłucz trzy razy wodą Milli-Q przez 30 minut każdy. Ponownie umyj komory do mycia rąk w 70% etanolu.</li>
	<li>Rozłóż komory do wyschnięcia na Parafilm w okapie z przepływem laminarnym. Naświetlaj i sterylizuj obie strony komór przez 20 minut w promieniowaniu UV. Wysterylizowane komory przechowywać w sterylnym naczyniu o średnicy 15 cm zamkniętym parafilmem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe 24 x 40 mm nr 1 w szklanym pojemniku. Namocz szkiełka nakrywkowe w 35% kwasie chlorowodorkowym przez noc na rotatorze. Następnego dnia spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy po 30 minut wodą.</li>
	<li>Sterylizuj szkiełka nakrywkowe jeden po drugim, zanurzając każde szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu i paląc nad palnikiem Bunsena. Przechowuj suche szkiełka nakrywkowe na sterylnej szalce Petriego i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu powlekania.</li>
	<li>Ułóż szkiełka nakrywkowe w naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm. Pokryj każde szkiełko nakrywkowe 0,7 ml 0,01% poli-L-lizyny (PLL) i inkubuj w kapturze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 1 godzinie spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylną wodą. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe w próżni i umieścić każde szkiełko nakrywkowe w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Aby zmontować komorę mikroprzepływową, umieść komorę stroną z mikrorowkami u dołu na szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL, uważając, aby nie dotykać mikrorowków. Delikatnie dociśnij komorę końcówką pipety, aby upewnić się, że komora jest szczelnie zamknięta.</li>
</ol>
3. Sekcja kultur neuronalnych i płytki na komorach
<ol>
	<li>Umieścić dwa hipokampy szczurów E17-E18 (jeden mózg) wycięte w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu do rozwarstwiania (HBSS, bez wapnia, bez magnezu, z 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami i 10 mM HEPES. Za każdym razem płukać tkanki 3x 5 ml buforu do wypreparowania. Usunąć bufor do preparacji w jak największym stopniu i dodać 900 μl świeżego buforu do rozwarstwiania.</li>
	<li>Aby strawić tkankę, dodaj 100 μl 10x trypsyny (2,5%) do buforu rozwarstwiającego, aby uzyskać 1x stężenie robocze. Umieścić rurkę stożkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po 10 minutach trawienia dodać 100 μl 10 mg/ml DNazy I do końcowego stężenia około 1 mg/ml.</li>
	<li>Używając wypolerowanej na gorąco szklanej pipety Pasteura, delikatnie rozcieraj tkanki, pipetując w górę i w dół 5-10 razy. Bezpośrednio po roztarciu wygaź trypsynę 2 ml pożywki galwanicznej (Neurobasal z 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27).</li>
	<li>Pozostawić próbkę w kapturze na 5 minut, aby wszelkie zanieczyszczenia tkanek opadły na dno. Ostrożnie wyjąć 2 ml supernatantu do czystej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Zawiesić osad w pożywce galwanicznej o pojemności 50 μl</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Załaduj 15-20 μl zawiesiny komórek (~ 40 000 komórek) do jednej komory komory mikroprzepływowej. Umieść komorę w inkubatorze na 10 minut, aby komórki mogły przyczepić się do szkiełka nakrywkowego. Po 10 minutach dodaj więcej mediów galwanicznych, aby wypełnić obie komory komory.</li>
	<li>W drugim dniu preparacji należy całkowicie wymienić pożywkę galwaniczną na pożywkę podtrzymującą (Neurobasal z 2 mM GlutaMax, 2% B27) zarówno w ciele komórki, jak i w przedziale aksonu. Aksony z neuronów hipokampa zaczynają przekraczać mikrorowki w 3 dniu i docierają do przedziału aksonów między 5-7 dniem. W tym czasie należy wymieniać połowę pożywek hodowlanych na świeże podłoża konserwacyjne co 24 ~ 48 godzin.</li>
</ol>
4. Transport aksonalny QD-BDNF
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem na żywo transportu aksonalnego QD-BDNF, należy zubożyć BDNF zarówno z korpusu komórki, jak i przedziałów aksonów komory mikroprzepływowej, dokładnie przepłukując oba przedziały pożywką neuropodstawową bez BDNF, surowicy co 30 minut przez 2 godziny.</li>
	<li>Podczas wyczerpania BDNF przygotuj koniugaty QD-BDNF. Zmieszać 50 nM monobiotynylowanego dimeru BDNF z 50 nM koniugatami QD655-streptawidyny w pożywkach neuropodstawowych i inkubować na lodzie przez 60 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komory aksonu i dodać 300 μl QD-BDNF o końcowym stężeniu 0,25 nM przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Aby zminimalizować dyfuzję QD-BDNF do przedziału ciała komórki, bardzo ważne jest, aby zawsze utrzymywać wyższy poziom pożywki w komorze ciała komórki niż w komorze aksonowej. Zmyć niezwiązany QD-BDNF po inkubacji przed obrazowaniem na żywo.</li>
	<li>Przeprowadzaj obrazowanie na żywo transportu QD-BDNF za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewkę obiektywu olejowego 100X. Rozgrzej lunetę i dołączoną do niej komorę środowiskową do stałej temperatury (37 °C) i CO2 (5%). Użyj zestawu czerwonych kostek wzbudzenia/emisji z Teksasu, aby zobrazować sygnał QD655.</li>
	<li>Rejestruj i rejestruj zdjęcia poklatkowe w środkowych osiach z prędkością 1 klatki/s przez łącznie 2 minuty za pomocą kamery CCD. Używaj mikrorowków bez aksonów, które nie mają QD, a tym samym nie mają sygnału, jako kontroli infiltracji.</li>
	<li>Analizuj transport BDNF za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu lub NIH ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym badaniu informujemy o opracowaniu nowej techniki wytwarzania biologicznie aktywnego, monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF), który można wykorzystać do śledzenia transportu aksonalnego BDNF. Poprzez sprzężenie białka ze streptawidyną w kropce kwantowej i zastosowanie komory mikroprzepływowej, metoda ta pozwala na wykrycie aksonalnego transportu BDNF w neuronach pierwotnych z czułością pojedynczej cząsteczki, w czasie rzeczywistym oraz z rozdzielczością przestrzenną i czasową. Narzędzia użyte w niniejszym dokumencie zap...

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, których długie i często bardzo skomplikowane procesy są fundamentalne dla ustanowienia i utrzymania struktury i funkcji obwodów neuronowych. Akson odgrywa istotną rolę w przenoszeniu ładunków do i z synaps. Białka i organelle syntetyzowane w somie komórki muszą być transportowane przez aksony, aby dotrzeć do zakończenia presynaptycznego w celu wsparcia funkcji neuronalnych. W związku z tym sygnały odbierane w dystalnych aksonach muszą być transdukowane i przekazywane do somy. Procesy te są niezbędne do przetrwania, różnicowania i utrzymania neuronów. Ponieważ transport aksonalny w niektórych neuronach musi odbywać się na odległość ponad 1000 razy większą niż średnica ciała komórki, łatwo można sobie wyobrazić, że nawet niewielkie deficyty mogą znacząco wpłynąć na funkcjonowanie neuronów i obwodów.
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF), członek rodziny neurotrofin, jest obecny w wielu obszarach mózgu, w tym w hipokampie, korze mózgowej i podstawie przodomózgowia. BDNF odgrywa kluczową rolę w tworzeniu funkcji poznawczych i pamięci, wspierając przetrwanie, różnicowanie i funkcję neuronów uczestniczących w obwodach poznawczych. BDNF wiąże się ze swoim receptorem, kinazą tyrozynową TrkB, na końcu aksonu, gdzie aktywuje szlaki sygnałowe, w których pośredniczy TrkB, w tym kinazę białkową aktywowaną mitogenem / zewnątrzkomórkową kinazę białkową regulowaną sygnałem (MAPK / ERK), kinazę fosfatydyloinozytolo-3 (PI3K) i fosfolipazę C-gamma (PLCγ). Białka, które uczestniczą w tych szlakach sygnałowych, są upakowane w endocytarnych strukturach pęcherzykowych, tworząc endosom sygnalizacyjny BDNF / TrkB1-6, który jest następnie transportowany wstecznie do somy neuronalnej.
Komora hodowli mikroprzepływowej jest bardzo użyteczną platformą do badania biologii aksonów w normalnych warunkach, jak również w warunkach urazów i chorób7,8. Izolując aksony od ciał komórkowych, urządzenie pozwoliło na zbadanie transportu w aksonach8-10. Platformy mikroprzepływowe oparte na PDMS z barierami mikrorowkowymi 450 μm użyte w tym badaniu zostały zakupione komercyjnie (patrz tabela materiałów). Aby zbadać transport BDNF, opracowaliśmy nowatorską technologię produkcji monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF). Skorzystaliśmy z peptydu akceptora biotyny, AP (znanego również jako AviTag). Jest to sekwencja 15 aminokwasów, która zawiera resztę lizyny, która może być specyficznie ligowana do biotyny przez enzym Escherichia coli ligazę biotyny, BirA. Połączyliśmy AviTag z C-końcem mysiego cDNA pre-pro-BDNF metodą PCR (Figura 1A). Konstrukt został sklonowany do wektora ekspresji ssaków, wektora pcDNA3.1 myc-his. Sklonowaliśmy również bakteryjne DNA BirA do wektora pcDNA3.1 myc-his. Dwa plazmidy były przejściowo kotransfekowane do komórek HEK293FT celu ekspresji obu białek. BirA katalizował ligację biotyny specyficznie do lizyny znajdującej się w AviTag na C-końcu BDNF w stosunku 1:1 w celu wytworzenia monobiotynylowanego monomeru BDNF. Biotynylowany, dojrzały BDNF o masie cząsteczkowej ~18 kDa odzyskano i oczyszczono z pożywki za pomocą żywicy Ni (ryc. 1C). Biotynylacja BDNF była całkowita, co oceniano na podstawie niemożności wykrycia niezmodyfikowanego BDNF za pomocą immunoblottingu (Figura 1D). Sprzężone ze streptawidyną kropki kwantowe, QD 655, użyto do oznaczenia mBtBDNF w celu wytworzenia QD-BDNF. Obecność AviTag nie zakłócała aktywności BDNF, ponieważ mBtBDNF był w stanie aktywować fosforylowany TrkB (Figura 1E) i stymulować wzrost neurytów (Figura 1F) do stopnia rekombinowanego ludzkiego BDNF (rhBDNF). Barwienie immunologiczne wykazało, że QD-BDNF kolokalizował się z TrkB w aksonach hipokampa, co wskazuje, że QD-BDNF jest bioaktywny (Figura 1G). Aby zbadać transport BDNF, QD-BDNF dodano do dystalnego przedziału aksonu kultur mikroprzepływowych zawierających neurony hipokampa E18 szczura (Figura 2A). Transport wsteczny QD-BDNF w aksonach został uchwycony przez obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym czerwonego znacznika fluorescencyjnego (filmy pomocnicze S1, S2). Analizując wygenerowany kimograf, zaobserwowano, że QD-BDNF jest transportowany wstecznie z prędkością ruchu około 1,06 μm / s (ryc. 3A). GFP lub BDNF oznaczone mCherry-tagged zostały użyte do śledzenia ruchu aksonów BDNF. Główną wadą jest to, że nie są wystarczająco jasne do badań pojedynczych cząsteczek. Ponadto obecność zarówno następczych, jak i wstecznych ruchów BDNF utrudnia ocenę, czy transportowany wstecznie BDNF znajdował się w kompleksie neurotrofina/receptor.
W tym filmie pokazujemy techniki używane do badania na żywo transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych za pomocą pierwotnych neuronów. Ultrajasność i doskonała fotostabilność kropek kwantowych umożliwia długoterminowe śledzenie transportu BDNF. Techniki te mogą być wykorzystane do wzbogacenia badań nad funkcją aksonów w chorobie Alzheimera, Huntingtona i innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA platyny pfx&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT komórki</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-podłoże o wysokim poziomie glukozy</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Żywice Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>koktajl Sigma</td><td>&nbsp; S8820</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory mikroprzepływowe</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe szklane nr 1&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptawidyna koniugaty</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>przeciwciało anty-Avi tag</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>paciorkowce streptawidyny-agarozy&nbsp;</td><td>Technologia życiowa</td><td>&nbsp; SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptawidyna&nbsp;</td><td>Przeciwciało anty-pTrkB Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>hojny prezent od dr M. Chao z NYU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-TrkB</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego bdnf znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF odgrywa ważną rolę w wielu aspektach przetrwania, różnicowania i funkcjonowania neuronów. Strukturalne i funkcjonalne deficyty aksonów są coraz częściej postrzegane jako wczesna cecha chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD) i choroby Huntingtona (HD). Jak dotąd nie jest jasne, jaki jest mechanizm (mechanizmy), za pomocą którego wywoływane jest uszkodzenie aksonów. Informowaliśmy o opracowaniu nowej techniki wytwarzania biologicznie aktywnego, monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF), który można wykorzystać do śledzenia transportu aksonalnego BDNF. BDNF (QD-BDNF) znakowany kropką kwantową został wytworzony przez sprzężenie kropki kwantowej 655 z mBtBDNF. Urządzenie mikroprzepływowe wykorzystano do wyizolowania aksonów z ciał komórek neuronów. Dodanie QD-BDNF do przedziału aksonalnego umożliwiło obrazowanie na żywo transportu BDNF w aksonach. Wykazaliśmy, że QD-BDNF poruszał się zasadniczo wyłącznie wstecz, z bardzo nielicznymi przerwami, z prędkością ruchu około 1,06 μm / s. System ten może być wykorzystany do badania mechanizmów zaburzonej funkcji aksonów w chorobie Alzheimera lub HD, a także innych zaburzeń zwyrodnieniowych.

Produkcja i oczyszczanie biologicznie aktywnego mono-biotynilowanego BDNF
Wektor ekspresyjny BDNF połączony z sekwencją AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) został stworzony zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem10. Masę cząsteczkową pełnej białka fuzji przewidywano na ~32 kDa (<a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a>). Monobiotynowany dojrzały BDNF o przewidywanej masie cząsteczkowej 18 kDa (Rycina 1A...

Axonalny transport BDNF, czynnika neurotroficznego, jest krytyczny dla przetrwania i funkcjonowania kilku populacji neuronów. Niektóre zaburzenia zwyrodnieniowe charakteryzują się zaburzeniem struktury i funkcji aksonów. Zademonstrowaliśmy techniki stosowane do badania żywego transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych przy użyciu neuronów pierwotnych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie wstecznego transportu aksonalnego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego lub BDNF za pomocą obrazowania na żywo. Osiąga się to poprzez montaż komór mikroprzepływowych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną. W drugim etapie zdysocjowane neurony hipokampa szczura E 18 są preparowane i platerowane w przedziale ciała komórki komory mikroprzepływowej.Następnie neurony są hodowane, aby umożliwić przedłużenie aksonów przez mikrorowki do przedziału aksonalnego komory. W ostatnim kroku do przedziału aksonu dodaje się kropkę kwantową oznaczoną jako BDNF. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny ruchu BDNF w aksonach neuronu hipokampa.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak B-D-F-E-G-I-P lub znakowanie wiśni BDFM, jest to, że znakowanie BDF kropką kwantową umożliwia obrazowanie światłem pojedynczych dimerów BDF w aksonach, co pokazuje, że procedura będzie, będzie. Narysuj kropkę posta z moich trzech lewych trzech, Zacznij od ręcznego umycia komór mikroprzepływowych w 1% aox, a następnie trzy 30-minutowe płukania w wodzie mili Q. Następnie po ręcznym umyciu komór w 70% etanolu, rozłóż je do wyschnięcia na param w okapie z przepływem laminarnym, sterylizuj obie strony komór w świetle UV przez 20 minut, a następnie przechowuj napromieniowane komory w sterylnym 15 centymetrowym naczyniu zamkniętym param w temperaturze pokojowej.Następnie namocz 24 na 40 milimetrów. Szklana pokrywa numer jeden wsuwa się przez noc w 10% kwas solny na rotatorze, a następnie trzy 30-minutowe mycie wodą po ostatnim praniu. Wysterylizuj każde szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w 100% etanolu, a następnie podpal na palniku Bunsena i przechowuj je w suchym stanie na sterylnej szalce Petriego w temperaturze pokojowej.Aby pokryć szkiełka nakrywkowe, ułóż je w 15-centymetrowym naczyniu hodowlanym, a następnie ułóż każde z nich warstwami 0,7 mililitra 0,01% poli L lizyny. Po godzinnej inkubacji w kapturze do hodowli tkankowej, ponownie spłucz szkiełka przykrywkowe trzy razy sterylną wodą, a następnie wysusz je odkurzaczem i umieść w sześciocentymetrowym naczyniu hodowlanym. Następnie umieść jedną ze wysterylizowanych komór stroną z mikrorowkiem skierowaną w dół na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli lizyną.Uważając, aby nie dotknąć mikrorowków i za pomocą końcówki mikropipety delikatnie dociśnij komorę i szczelnie zamknij zmontowaną komorę mikroprzepływową. Teraz umieść dwa szczurze Hippo Campi od E 17 do E 18 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej dwa mililitry buforu do rozwarstwiania i przepłucz tkanki trzykrotnie pięcioma mililitrami buforu do rozwarstwiania za każdym razem. Następnie usuń jak najwięcej płynu do płukania i dodaj 900 mikrolitrów świeżego buforu preparacyjnego, aby strawić tkankę.Następnie dodaj 100 mikrolitrów 2,5% trypsyny do tkanek i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach trawienia dodaj 100 mikrolitrów DNA jeden i użyj wypolerowanej ogniowo pipety ze szkła PE, aby delikatnie trzykrotnie ocenić tkanki w górę i w dół od pięciu do 10 razy natychmiast po wymieszaniu. Ugasić próbę dwoma mililitrami podłoża galwanicznego i pozostawić zanieczyszczenia na dnie probówki na pięć minut w kapturze do hodowli tkankowej.Następnie ostrożnie przenieś dwa mililitry supernatantu do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj reus komórek. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach podłoża galwanicznego, a następnie po zliczeniu załadować od 15 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednej komory komory mikroprzepływowej. Inkubuj komorę przez 10 minut, aby komórki mogły przymocować się do szkiełka nakrywkowego, a następnie dodaj więcej podłoża galwanicznego, aby wypełnić obie komory komory.Po jednym dniu inkubacji należy zastąpić pożywkę galwaniczną pożywką konserwacyjną zarówno w korpusie komórki, jak i w komorach aksonów. Trzeciego dnia aksony z neuronów hipokampa zaczynają przekraczać mikrorowki, docierając do przedziału aksonów między piątym a siódmym dniem. W tym czasie należy wymieniać połowę pożywek hodowlanych na świeże podłoża konserwacyjne co 24 do 48 godzin przed obrazowaniem na żywo znakowanego kwantowo transportu aksonalnego BDNF.Dokładnie przepłukać obie komory mikroprzepływowej pożywką neuro wolną od BDNF co 30 minut przez dwie godziny podczas wyczerpania BDNF, inkubować 50 nanomolowy mono biotynylowany dimer BDNF z kwantem 50 nanomolowym. Wykonaj 6 5 5 koniugatów strippin w podłożu neuro podstawowym na lodzie przez 60 minut. Następnie zastąp pożywkę w komorze aksonu 300 mikrolitrami kropki kwantowej oznaczonej BDNF przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zminimalizować dyfuzję kropki kwantowej oznaczonej BDNF do komory ciała komórki.Bardzo ważne jest, aby zawsze utrzymywać wyższy poziom pożywki w komorze korpusu komórki niż w komorze aksonu pod koniec inkubacji, rozgrzewki i mikroskopu odwróconego, wyposażonego w obiektyw olejowy 100 x i komorę środowiskową do stałej temperatury 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla podczas nagrzewania się sprzętu. Zmyj niezwiązaną kropkę kwantową oznaczoną jako BDNF z komory mikroprzepływowej, a następnie użyj zestawu czerwonych sześcianów wzbudzenia i emisji z Teksasu do wizualizacji sygnału kropki kwantowej 6 5 5. Na koniec użyj kamery CCD, aby uchwycić obrazy poklatkowe w środkowych aksonach z prędkością jednej klatki na sekundę przez łącznie dwie minuty.Użyj mikrorowków bez aksonów, które nie mają QD, jako kontroli infiltracji i przeanalizuj transport BDNF za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu w obrazowaniu poklatkowym transportu sygnału BDNF oznaczonym kropką kwantową Sygnały kropek kwantowych są obserwowane w większości mikrorowków z aksonami, podczas gdy w mikrorowkach bez aksonów nie widać sygnału kwantowego wskazującego na niewielką lub żadną dyfuzję sygnału kropki kwantowej z przedziału aksonu do przedziału korpusu komórki tutaj. Odcinek aksonu neuronu hipokampa o długości 80 mikrometrów rejestrowano fluorescencyjnie przez 100 sekund. W sumie sześć.Podczas obrazowania wyraźnie zauważono kwantowe sygnały BDNF, z których trzy zaobserwowano poruszające się jednokierunkowo w kierunku ciała komórki. Zaobserwowano, że jeden sygnał płynnie przemieszcza się do ciała komórki, przecinając całe pole w ciągu około 70 sekund. Zaobserwowano, że inny porusza się w kierunku wstecznym przez pierwsze 20 sekund, przełącza się na ruch antrogradiczny na 10 do 20 sekund, a następnie ponownie zmienia kierunek w kierunku ciała komórki przez ostatnie 20 sekund.Trzecie zdarzenie również poruszało się w kierunku wstecznym, ale potem zatrzymywało się na około 20 sekund w środku ruchu. Na tym pierwszym reprezentatywnym wykresie gongu transportu kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF, kropka kwantowa oznaczona jako BDNF poruszała się szybko i płynnie w kierunku ciała komórki, przecinając pole o średnicy 80 mikrometrów w ciągu około 60 sekund. Z bardzo krótkimi przerwami w tym drugim chronografie, kwantowy BDNF przebył około 50 mikrometrów w ciągu 120 sekund w kierunku wstecznym z co najmniej trzema segmentami dłuższych przerw.Na koniec wykresy punktowe mierzą prędkość ruchu, średnią prędkość i czas pauzy każdej pojedynczej kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF. Prędkości poruszania się kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF były stosunkowo szybkie i wahały się od 0,47 do 1,97 mikrometra na sekundę, ze średnią 1,06 plus minus 0,05 mikrometra na sekundę. Ze względu na to, że BDNF zatrzymywał się podczas transportu, średnia prędkość była znacznie niższa niż prędkość ruchu ze średnią 0,48 plus minus 0,03 mikrometra na sekundę przy średnim czasie trwania przerw 15,88 plus minus 1,30 sekundy po rozwinięciu.Technika ta pozwala naukowcom z dziedziny neurobiologii badać transport neurotrofin i receptorów w zdrowych i chorych neuronach.

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania na żywo z wykorzystaniem mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji rozgałęzień aksonalnych w czasie rzeczywistym w neuronach korowych. Filmy poklatkowe ukazują efekty leczenia netryną-1, cząsteczką sygnałową, która indukuje...

Obrazowanie in vitro w czasie rzeczywistym rozgałęzień aksonalnych w neuronach korowych myszy

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę śledzenia transportu aksonalnego BDNF w neuronach pierwotnych szczura przy użyciu obrazowania w czasie rzeczywistym z kropkami kwantowymi. Technika ta pozwala obserwować dynamikę czynników neurotroficznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów