Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie wstecznego transportu aksonalnego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego lub BDNF za pomocą obrazowania na żywo. Osiąga się to poprzez montaż komór mikroprzepływowych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną. W drugim etapie zdysocjowane neurony hipokampa szczura E 18 są preparowane i platerowane w przedziale ciała komórki komory mikroprzepływowej.

Następnie neurony są hodowane, aby umożliwić przedłużenie aksonów przez mikrorowki do przedziału aksonalnego komory. W ostatnim kroku do przedziału aksonu dodaje się kropkę kwantową oznaczoną jako BDNF. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny ruchu BDNF w aksonach neuronu hipokampa.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak B-D-F-E-G-I-P lub znakowanie wiśni BDFM, jest to, że znakowanie BDF kropką kwantową umożliwia obrazowanie światłem pojedynczych dimerów BDF w aksonach, co pokazuje, że procedura będzie, będzie. Narysuj kropkę posta z moich trzech lewych trzech, Zacznij od ręcznego umycia komór mikroprzepływowych w 1% aox, a następnie trzy 30-minutowe płukania w wodzie mili Q. Następnie po ręcznym umyciu komór w 70% etanolu, rozłóż je do wyschnięcia na param w okapie z przepływem laminarnym, sterylizuj obie strony komór w świetle UV przez 20 minut, a następnie przechowuj napromieniowane komory w sterylnym 15 centymetrowym naczyniu zamkniętym param w temperaturze pokojowej.

Następnie namocz 24 na 40 milimetrów. Szklana pokrywa numer jeden wsuwa się przez noc w 10% kwas solny na rotatorze, a następnie trzy 30-minutowe mycie wodą po ostatnim praniu. Wysterylizuj każde szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w 100% etanolu, a następnie podpal na palniku Bunsena i przechowuj je w suchym stanie na sterylnej szalce Petriego w temperaturze pokojowej.

Aby pokryć szkiełka nakrywkowe, ułóż je w 15-centymetrowym naczyniu hodowlanym, a następnie ułóż każde z nich warstwami 0,7 mililitra 0,01% poli L lizyny. Po godzinnej inkubacji w kapturze do hodowli tkankowej, ponownie spłucz szkiełka przykrywkowe trzy razy sterylną wodą, a następnie wysusz je odkurzaczem i umieść w sześciocentymetrowym naczyniu hodowlanym. Następnie umieść jedną ze wysterylizowanych komór stroną z mikrorowkiem skierowaną w dół na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli lizyną.

Uważając, aby nie dotknąć mikrorowków i za pomocą końcówki mikropipety delikatnie dociśnij komorę i szczelnie zamknij zmontowaną komorę mikroprzepływową. Teraz umieść dwa szczurze Hippo Campi od E 17 do E 18 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej dwa mililitry buforu do rozwarstwiania i przepłucz tkanki trzykrotnie pięcioma mililitrami buforu do rozwarstwiania za każdym razem. Następnie usuń jak najwięcej płynu do płukania i dodaj 900 mikrolitrów świeżego buforu preparacyjnego, aby strawić tkankę.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 2,5% trypsyny do tkanek i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach trawienia dodaj 100 mikrolitrów DNA jeden i użyj wypolerowanej ogniowo pipety ze szkła PE, aby delikatnie trzykrotnie ocenić tkanki w górę i w dół od pięciu do 10 razy natychmiast po wymieszaniu. Ugasić próbę dwoma mililitrami podłoża galwanicznego i pozostawić zanieczyszczenia na dnie probówki na pięć minut w kapturze do hodowli tkankowej.

Następnie ostrożnie przenieś dwa mililitry supernatantu do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj reus komórek. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach podłoża galwanicznego, a następnie po zliczeniu załadować od 15 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednej komory komory mikroprzepływowej. Inkubuj komorę przez 10 minut, aby komórki mogły przymocować się do szkiełka nakrywkowego, a następnie dodaj więcej podłoża galwanicznego, aby wypełnić obie komory komory.

Po jednym dniu inkubacji należy zastąpić pożywkę galwaniczną pożywką konserwacyjną zarówno w korpusie komórki, jak i w komorach aksonów. Trzeciego dnia aksony z neuronów hipokampa zaczynają przekraczać mikrorowki, docierając do przedziału aksonów między piątym a siódmym dniem. W tym czasie należy wymieniać połowę pożywek hodowlanych na świeże podłoża konserwacyjne co 24 do 48 godzin przed obrazowaniem na żywo znakowanego kwantowo transportu aksonalnego BDNF.

Dokładnie przepłukać obie komory mikroprzepływowej pożywką neuro wolną od BDNF co 30 minut przez dwie godziny podczas wyczerpania BDNF, inkubować 50 nanomolowy mono biotynylowany dimer BDNF z kwantem 50 nanomolowym. Wykonaj 6 5 5 koniugatów strippin w podłożu neuro podstawowym na lodzie przez 60 minut. Następnie zastąp pożywkę w komorze aksonu 300 mikrolitrami kropki kwantowej oznaczonej BDNF przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zminimalizować dyfuzję kropki kwantowej oznaczonej BDNF do komory ciała komórki.

Bardzo ważne jest, aby zawsze utrzymywać wyższy poziom pożywki w komorze korpusu komórki niż w komorze aksonu pod koniec inkubacji, rozgrzewki i mikroskopu odwróconego, wyposażonego w obiektyw olejowy 100 x i komorę środowiskową do stałej temperatury 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla podczas nagrzewania się sprzętu. Zmyj niezwiązaną kropkę kwantową oznaczoną jako BDNF z komory mikroprzepływowej, a następnie użyj zestawu czerwonych sześcianów wzbudzenia i emisji z Teksasu do wizualizacji sygnału kropki kwantowej 6 5 5. Na koniec użyj kamery CCD, aby uchwycić obrazy poklatkowe w środkowych aksonach z prędkością jednej klatki na sekundę przez łącznie dwie minuty.

Użyj mikrorowków bez aksonów, które nie mają QD, jako kontroli infiltracji i przeanalizuj transport BDNF za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu w obrazowaniu poklatkowym transportu sygnału BDNF oznaczonym kropką kwantową Sygnały kropek kwantowych są obserwowane w większości mikrorowków z aksonami, podczas gdy w mikrorowkach bez aksonów nie widać sygnału kwantowego wskazującego na niewielką lub żadną dyfuzję sygnału kropki kwantowej z przedziału aksonu do przedziału korpusu komórki tutaj. Odcinek aksonu neuronu hipokampa o długości 80 mikrometrów rejestrowano fluorescencyjnie przez 100 sekund. W sumie sześć.

Podczas obrazowania wyraźnie zauważono kwantowe sygnały BDNF, z których trzy zaobserwowano poruszające się jednokierunkowo w kierunku ciała komórki. Zaobserwowano, że jeden sygnał płynnie przemieszcza się do ciała komórki, przecinając całe pole w ciągu około 70 sekund. Zaobserwowano, że inny porusza się w kierunku wstecznym przez pierwsze 20 sekund, przełącza się na ruch antrogradiczny na 10 do 20 sekund, a następnie ponownie zmienia kierunek w kierunku ciała komórki przez ostatnie 20 sekund.

Trzecie zdarzenie również poruszało się w kierunku wstecznym, ale potem zatrzymywało się na około 20 sekund w środku ruchu. Na tym pierwszym reprezentatywnym wykresie gongu transportu kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF, kropka kwantowa oznaczona jako BDNF poruszała się szybko i płynnie w kierunku ciała komórki, przecinając pole o średnicy 80 mikrometrów w ciągu około 60 sekund. Z bardzo krótkimi przerwami w tym drugim chronografie, kwantowy BDNF przebył około 50 mikrometrów w ciągu 120 sekund w kierunku wstecznym z co najmniej trzema segmentami dłuższych przerw

Na koniec wykresy punktowe mierzą prędkość ruchu, średnią prędkość i czas pauzy każdej pojedynczej kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF. Prędkości poruszania się kropki kwantowej oznaczonej jako BDNF były stosunkowo szybkie i wahały się od 0,47 do 1,97 mikrometra na sekundę, ze średnią 1,06 plus minus 0,05 mikrometra na sekundę. Ze względu na to, że BDNF zatrzymywał się podczas transportu, średnia prędkość była znacznie niższa niż prędkość ruchu ze średnią 0,48 plus minus 0,03 mikrometra na sekundę przy średnim czasie trwania przerw 15,88 plus minus 1,30 sekundy po rozwinięciu.

Technika ta pozwala naukowcom z dziedziny neurobiologii badać transport neurotrofin i receptorów w zdrowych i chorych neuronach.