Name: Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj protokół wzbogacania gDNA z wykorzystaniem technologii opartej na transpozazie do analizy NGS 11 genów naprawy DNA. Ta metoda umożliwia szybkie wykrywanie wariantów genetycznych w mniej niż dwa tygodnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ligue contre le Cancer de Côte d'Or i Centre Georges-François Leclerc za ich wsparcie finansowe. Dziękujemy Philipowi Bastable'owi za redakcję rękopisu.

<ol><li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+responsible+for+familial+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li>
<li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1%2F2+carrier+probability%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Dis%22%5BJournal%5D)">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li>
<li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li>
<li>Maia, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BRCA2+cis-regulation+in+normal+breast+and+cancer+risk+amongst+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers.</a> Breast Cancer Res. 14 (2), 63(2012).</li>
<li>Anczuków, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+deep+intronic+mutation+causing+activation+of+a+cryptic+exon%3A+opening+toward+a+new+preventive+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy.</a> Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).</li>
<li>Brewster, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3%27UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li>
<li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+%28BRIP1%29+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li>
<li>Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82(2013).</li>
<li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+and+breast+cancer%3A+ready+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li>
<li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li>
<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
<li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240(2011).</li>
<li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
<li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li>
<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Powszechne stosowanie urządzeń i technologii NGS stworzyło nowe możliwości w badaniach nad nowotworami i zaburzeniami genetycznymi. Oprócz sekwencjonowania całego genomu lub sekwencjonowania RNA, analiza dużej ilości wybranych sekwencji gDNA u wielu pacjentów jednocześnie daje duże perspektywy diagnostyczne. W tym przypadku opracowaliśmy specjalny projekt (dostępny na żądanie) przy użyciu technologii Nextera do badania 11 kompletnych genów u 24 pacjentów jednocześnie za pomocą urządzenia do sekwencjonowania o średniej pr...

W 2010 roku prawie 1,5 miliona osób (głównie kobiet) zachorowało na raka piersi na całym świecie. Szacuje się, że od 5 do 10% tych przypadków było dziedzicznych. Prawie 20 lat temu BRCA1 i BRCA2 zostały zidentyfikowane jako zaangażowane w dziedziczne raki piersi i jajników1. Od około 15 lat sekwencjonowane są regiony kodujące BRCA1 i BRCA2 w celu określenia genetycznej predyspozycji do raka piersi i jajnika. Zmiany w BRCA1 i BRCA2 wykrywa się u 10 do 20%wybranych rodzin2, co sugeruje, że analiza tych regionów nie jest wystarczająca do przeprowadzenia skutecznych badań przesiewowych. Niedawna analiza sekwencji niekodujących (promotor, introny, 3-'UTR) BRCA1 i BRCA2 wykazała, że nowe mutacje/wariacje mogą być związane z wyższym ryzykiem raka piersi3-6.
Białka BRCA1 i BRCA2 biorą udział w naprawie rekombinacji homologicznej (HHR), która jest realizowana przez wielu partnerów7. Podczas gdy zmiany w BRCA1 lub BRCA2 wywołują defekty w naprawie DNA, inni partnerzy mogą również wpływać na ryzyko raka piersi. Wydaje się, że hipoteza ta została potwierdzona, ponieważ BRIP18 i PALB29 mają udowodniony wpływ odpowiednio na raka szyjki macicy i piersi. Ponadto dwa inne geny podatności na raka piersi "umiarkowanego ryzyka", ATM i CHEK2, mogą być również badane rutynowo.
Kontynuując te badania, zdecydowaliśmy się opracować protokół do analizy 11 genów (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 i TP53) u 24 pacjentów jednocześnie, używając bardzo łatwego i stosunkowo szybkiego protokołu opartego na technologii transpozy, z wzbogacaniem i sekwencjonowaniem na urządzeniu o średniej przepustowości. Dzięki tej technice zsekwencjonowaliśmy kompletne geny od początku promotora do końca 3'-UTR, z wyjątkiem RAP80, dla którego region intronowy 2,500 pz nie został pokryty (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Daje to w sumie około 1 000 300 pz badanych za pomocą 2 734 sond. Zwykle sekwencje egzoniczne BRCA1 i BRCA2 są analizowane za pomocą sekwencjonowania Sangera, które potrzebuje 1,5 miesiąca dla mniej niż 20 pacjentów. Dzięki obecnemu protokołowi (ryc. 1) w tym samym czasie można było przeanalizować 11 kompletnych genów dla ponad 75 pacjentów.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Urządzenie do sekwencjonowania/średniej przepustowości</td></tr><tr><td>Nextera Zestaw wzbogacający Illumina</td><td></td><td>FC-123-1208</td><td>Technologia oparta na transpozazie</td></tr><tr><td>Katridż 300 cykli</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Magnetyczne kulki oczyszczające</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96-dołkowe płytki</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Mikropieczęć A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Ta uszczelka jest niezbędna tylko do amplifikacji PCR. Inne standardowe plomby mogą być używane przez cały czas trwania eksperymentu</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Wyposażony w urządzenie do sekwencjonowania oprogramowanie Experiment Manager Adres internetowy: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Narzędzie do tworzenia stron internetowych producenta</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie gdna za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy ngs całej sekwencji genów brca1, brca2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń dna

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Powszechne stosowanie sekwencjonowania nowej generacji otworzyło nowe możliwości badań i diagnozowania raka. NGS przyniesie ogromne ilości nowych danych na temat raka, a zwłaszcza genetyki nowotworów. Obecna wiedza i przyszłe odkrycia sprawią, że konieczne będzie zbadanie ogromnej liczby genów, które mogą być zaangażowane w genetyczną predyspozycję do raka. W związku z tym opracowaliśmy projekt Nextera do badania 11 kompletnych genów zaangażowanych w naprawę uszkodzeń DNA. Protokół ten został opracowany w celu bezpiecznego badania 11 genów (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 i TP53) od promotora do 3'-UTR u 24 pacjentów jednocześnie. Protokół ten, oparty na technologii transpozazy i wzbogacaniu gDNA, daje ogromną przewagę pod względem czasu diagnozy genetycznej dzięki multipleksowaniu próbek. Protokół ten może być bezpiecznie stosowany z gDNA krwi.

Wyniki kontroli jakości próbek
Zdolność tej metody do określania sekwencji genów docelowych zależy od jakości gDNA (Rysunek 2A) oraz jakości etapu tagmentacji. Jeśli tagmentacja jest niewystarczająca (Rysunek 2B, górny panel), sekwencjonowanie nie będzie satysfakcjonujące. Jak wspomniano powyżej, po oczyszczaniu po tagmentacji, gDNA powinno zostać poddane tagmentacji do fragmentów o długości od 150 bp do 1 000 bp, przy czym większość fragmentów powinna mieć długo...

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Celem poniższego eksperymentu jest jednoczesna analiza sekwencji 11 genów za pomocą bardzo łatwego i stosunkowo szybkiego protokołu opartego na technologii opartej na transpozazie. Osiąga się to poprzez działanie transpozazy w celu uzyskania 300 fragmentów DNA par zasad bezpośrednio ligowanych za pomocą adapterów. Pierwsze wychwytywanie przy użyciu specjalnych sond wzbogaca próbki w obszarach zainteresowania.Ten krok jest powtarzany po raz kolejny, aby uzyskać tylko sekwencje docelowe. Następnie przeprowadza się amplifikację PCR w celu zwiększenia ilości materiałów do sekwencjonowania, uzyskuje się wyniki wykazujące genetyczne wariacje w genach na podstawie dopasowania sekwencji i analizy bioinformatycznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie Sangera, jest jej ogromna zdolność, która pozwala nam przeanalizować 24 pasje dla 11 kompletnych genów w czasie krótszym niż dwa tygodnie.Procedurę zademonstruje Sandy, technik z mojego laboratorium. Na początek przygotuj wszystkie odczynniki z zestawu do wzbogacania DNA. Gdy wszystko będzie gotowe, dodaj około 50 nanogramów genomowego DNA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, rozpocznij mentację od dodania 25 mikrolitrów buforu TD, a następnie pięciu mikrolitrów jednego buforu TDE.Do każdej studzienki ustaw pipetę na 50 mikrolitrów i delikatnie pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy. Krótko odwirować, a następnie umieścić płytkę w termocyklerze, gdy będzie gotowa. Zwirować roztwór ST i dodać 15 mikrolitrów do każdej studzienki zawierającej próbkę.Ustaw pipetę na 65 mikrolitrów i delikatnie pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy, inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed centrfuzją. Następnie dodaj 52 mikrolitry wcześniej zmieszanych kulek magnetycznych do oczyszczania do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem. Po umyciu kulek etanolem zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 22,5 mikrolitra buforu RSB.Po wymieszaniu umieść płytkę na stojaku magnetycznym i inkubuj przez dwie minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieś 20 mikrolitrów snat na nową płytkę 96-dołkową.Aby rozpocząć pierwszą rundę amplifikacji PCR, dodaj do każdego po 20 mikrolitrów LP PMM i po pięć mikrolitrów o indeksie pierwszym i indeksie drugim. Dobrze wymieszaj i przykryj płytkę samoprzylepną folią Micros EAL. Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom pierwszy program.Po oczyszczeniu i określeniu wydajności z pierwszej rundy PCR, rozpocznij pierwszą hybrydyzację od pobrania do 12 próbek. W nowej 96-dołkowej płytce, upewniając się, że końcowa objętość każdej puli nie przekracza dokładnie 40 mikrolitrów, wymieszaj NCT jeden roztwór i dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki. Po dodaniu 10 mikrolitrów CSO wymieszaj i uszczelnij płytkę.Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program. Dwa. Do pierwszego mycia hybrydyzacyjnego wyjmij płytkę z termocyklera i odwiruj. Na krótko zdejmij bardzo ostrożnie osłonę samoprzylepną.Przenieś 100 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej z płytki na nową płytkę MIDI 96 dołków i dodaj 250 mikrolitrów roztworu studzienki Vortex SMB. Wymieszaj i uszczelnij płytkę przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po umyciu i wyrzuceniu supeny, dodać 200 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu WS dwa do studzienek zawierających kulki i dokładnie wymieszać, przenieść całą objętość trans na nową płytkę 96-dołkową.Uszczelnij płytkę i umieść w termocyklerze. Uruchom termocykler w temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 minut. Po zakończeniu natychmiast umieść płytkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty.Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Usunąć uszczelkę i natychmiast wyrzucić cały supernatant. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego.Dodaj 200 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu Ws trzy do studzienek zawierających koraliki i dokładnie wymieszaj. Po umyciu i usunięciu supinatu należy uszczelnić płytkę i na krótko odwirować w celu usunięcia resztek natantu leżącego na wznak. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty.Odrzucić resztki supinatu. Następnie zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. Dodaj 23 mikrolitry wcześniej przygotowanej mieszanki.Po wymieszaniu uszczelnij płytkę i pozostaw na pięć minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem. Po przeniesieniu 21 mikrolitrów satu na nową 96-dołkową płytkę dodaj cztery mikrolitry ET dwa roztwory do każdego. Dobrze wymieszaj i uszczelnij płytkę przed centryfuzją.Aby rozpocząć drugą hybrydyzację, usuń folię samoprzylepną i dodaj 50 mikrolitrów NCT, 10 mikrolitrów CSO i 15 mikrolitrów wody klasy PCR do 25 mikrolitrów biblioteki. Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program. Dwa. W nowej 96-dołkowej płytce zmieszano 20 mikrolitrów ewolucji z poprzedniego etapu.Za pomocą 25 mikrolitrów T-C-P-M-M i pięciu mikrolitrów PPC uszczelnij płytkę po wymieszaniu i odwirowaniu. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program trzeci następnego dnia, odwiruj płytkę i umyj kulki etanolem. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 30 mikrolitrów buforu RSB.Wymieszaj i inkubuj płytkę przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym i inkubować przez pięć minut lub do momentu, gdy supernatant S stanie się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieś 28 mikrolitrów snat do nowej płytki 96-dołkowej.Ostatnim krokiem jest określenie jakości biblioteki za pomocą analizatora fragmentów lub QPCR. Podczas przebiegu gęstość klastra powinna wynosić 801 000 K na milimetr kwadratowy. Różne obrazy odpowiadają niskiej gęstości, wysokiej gęstości i idealnej gęstości.Wyniki uzyskane za pomocą tej technologii są bardzo łatwe do zinterpretowania jako mutacje punktowe lub indel przy użyciu bioinformatyki. Wskazana jest zmiana zasady, a usunięta lub wstawiona sekwencja jest bezpośrednio identyfikowana. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje oparte na GFP testy fluorescencyjne in vivo, które pozwalają na oddzielne ilościowe określenie rekombinacji homologicznej oraz niespecyficznego łączenia końców w komórkach ssaków.

Analiza naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

Opisano metodę identyfikacji nieznanych czynników powodujących kancerogenezę przy użyciu bezstronnego podejścia.  Metoda wykorzystuje transpozon Śpiącej Królewny jako losowy mutagen skierowany do określonych tkanek.  Mapowanie genomowe insercji transpozonów, które napędzają powstawanie nowotworów, identyfikuje nowe onkogeny i geny supresorowe...

Identyfikacja insercji transpozonów Śpiącej Królewny w guzach litych za pomocą PCR za pośrednictwem łącznikera

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj protokół wzbogacania gDNA z wykorzystaniem technologii opartej na transpozazie do analizy NGS 11 genów naprawy DNA. Ta metoda umożliwia szybkie wykrywanie wariantów genetycznych w mniej niż dwa tygodnie.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA (Wideo) | JoVE Journal

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Przeglądaj więcej filmów