Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Celem poniższego eksperymentu jest jednoczesna analiza sekwencji 11 genów za pomocą bardzo łatwego i stosunkowo szybkiego protokołu opartego na technologii opartej na transpozazie. Osiąga się to poprzez działanie transpozazy w celu uzyskania 300 fragmentów DNA par zasad bezpośrednio ligowanych za pomocą adapterów. Pierwsze wychwytywanie przy użyciu specjalnych sond wzbogaca próbki w obszarach zainteresowania.

Ten krok jest powtarzany po raz kolejny, aby uzyskać tylko sekwencje docelowe. Następnie przeprowadza się amplifikację PCR w celu zwiększenia ilości materiałów do sekwencjonowania, uzyskuje się wyniki wykazujące genetyczne wariacje w genach na podstawie dopasowania sekwencji i analizy bioinformatycznej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie Sangera, jest jej ogromna zdolność, która pozwala nam przeanalizować 24 pasje dla 11 kompletnych genów w czasie krótszym niż dwa tygodnie.

Procedurę zademonstruje Sandy, technik z mojego laboratorium. Na początek przygotuj wszystkie odczynniki z zestawu do wzbogacania DNA. Gdy wszystko będzie gotowe, dodaj około 50 nanogramów genomowego DNA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, rozpocznij mentację od dodania 25 mikrolitrów buforu TD, a następnie pięciu mikrolitrów jednego buforu TDE.

Do każdej studzienki ustaw pipetę na 50 mikrolitrów i delikatnie pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy. Krótko odwirować, a następnie umieścić płytkę w termocyklerze, gdy będzie gotowa. Zwirować roztwór ST i dodać 15 mikrolitrów do każdej studzienki zawierającej próbkę.

Ustaw pipetę na 65 mikrolitrów i delikatnie pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy, inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed centrfuzją. Następnie dodaj 52 mikrolitry wcześniej zmieszanych kulek magnetycznych do oczyszczania do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem. Po umyciu kulek etanolem zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 22,5 mikrolitra buforu RSB.

Po wymieszaniu umieść płytkę na stojaku magnetycznym i inkubuj przez dwie minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieś 20 mikrolitrów snat na nową płytkę 96-dołkową.

Aby rozpocząć pierwszą rundę amplifikacji PCR, dodaj do każdego po 20 mikrolitrów LP PMM i po pięć mikrolitrów o indeksie pierwszym i indeksie drugim. Dobrze wymieszaj i przykryj płytkę samoprzylepną folią Micros EAL. Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom pierwszy program.

Po oczyszczeniu i określeniu wydajności z pierwszej rundy PCR, rozpocznij pierwszą hybrydyzację od pobrania do 12 próbek. W nowej 96-dołkowej płytce, upewniając się, że końcowa objętość każdej puli nie przekracza dokładnie 40 mikrolitrów, wymieszaj NCT jeden roztwór i dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki. Po dodaniu 10 mikrolitrów CSO wymieszaj i uszczelnij płytkę.

Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program. Dwa. Do pierwszego mycia hybrydyzacyjnego wyjmij płytkę z termocyklera i odwiruj. Na krótko zdejmij bardzo ostrożnie osłonę samoprzylepną.

Przenieś 100 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej z płytki na nową płytkę MIDI 96 dołków i dodaj 250 mikrolitrów roztworu studzienki Vortex SMB. Wymieszaj i uszczelnij płytkę przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po umyciu i wyrzuceniu supeny, dodać 200 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu WS dwa do studzienek zawierających kulki i dokładnie wymieszać, przenieść całą objętość trans na nową płytkę 96-dołkową.

Uszczelnij płytkę i umieść w termocyklerze. Uruchom termocykler w temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 minut. Po zakończeniu natychmiast umieść płytkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty.

Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Usunąć uszczelkę i natychmiast wyrzucić cały supernatant. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego.

Dodaj 200 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu Ws trzy do studzienek zawierających koraliki i dokładnie wymieszaj. Po umyciu i usunięciu supinatu należy uszczelnić płytkę i na krótko odwirować w celu usunięcia resztek natantu leżącego na wznak. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty.

Odrzucić resztki supinatu. Następnie zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. Dodaj 23 mikrolitry wcześniej przygotowanej mieszanki.

Po wymieszaniu uszczelnij płytkę i pozostaw na pięć minut w temperaturze pokojowej przed odwirowaniem. Po przeniesieniu 21 mikrolitrów satu na nową 96-dołkową płytkę dodaj cztery mikrolitry ET dwa roztwory do każdego. Dobrze wymieszaj i uszczelnij płytkę przed centryfuzją.

Aby rozpocząć drugą hybrydyzację, usuń folię samoprzylepną i dodaj 50 mikrolitrów NCT, 10 mikrolitrów CSO i 15 mikrolitrów wody klasy PCR do 25 mikrolitrów biblioteki. Po odwirowaniu umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program. Dwa. W nowej 96-dołkowej płytce zmieszano 20 mikrolitrów ewolucji z poprzedniego etapu.

Za pomocą 25 mikrolitrów T-C-P-M-M i pięciu mikrolitrów PPC uszczelnij płytkę po wymieszaniu i odwirowaniu. Następnie umieść płytkę w termocyklerze i uruchom program trzeci następnego dnia, odwiruj płytkę i umyj kulki etanolem. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 30 mikrolitrów buforu RSB.

Wymieszaj i inkubuj płytkę przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym i inkubować przez pięć minut lub do momentu, gdy supernatant S stanie się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieś 28 mikrolitrów snat do nowej płytki 96-dołkowej.

Ostatnim krokiem jest określenie jakości biblioteki za pomocą analizatora fragmentów lub QPCR. Podczas przebiegu gęstość klastra powinna wynosić 801 000 K na milimetr kwadratowy. Różne obrazy odpowiadają niskiej gęstości, wysokiej gęstości i idealnej gęstości.

Wyniki uzyskane za pomocą tej technologii są bardzo łatwe do zinterpretowania jako mutacje punktowe lub indel przy użyciu bioinformatyki. Wskazana jest zmiana zasady, a usunięta lub wstawiona sekwencja jest bezpośrednio identyfikowana. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.