Name: Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Poznaj prostą metodę enukleacji oka u myszy do badania plastyczności wzrokowej. Technika opiera się na uciskaniu nerwu wzrokowego, minimalizuje krwawienie i trwa mniej niż minutę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ellen Ytebrouck za jej cenne informacje dotyczące stosowania metody u szczurów. Prace te były wspierane przez Radę ds. Badań Naukowych KU Leuven (OT09/22) oraz Fundusz Badań Naukowych Flandrii (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts jest stypendystą Agencji ds. Innowacji poprzez Naukę i Technologię we Flandrii (IWT Vlaanderen), a Julie Nys jest stypendystą doktoranckim FWO Flanders.

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję ds. badań etycznych KU Leuven i były ściśle zgodne z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 22 września 2010 r. (2010/63/UE) oraz z ustawodawstwem belgijskim (KB z 29 maja 2013 r.). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć ich liczbę.
1. Leczenie zwierząt i środki znieczulające
<ol>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny chlorowodorku ketaminy (75 mg/ml) i chlorowodorku medetomidyny (1 mg/kg) w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Sprawdź odruchy, ściskając palce u nóg kleszczami, aby upewnić się, że mysz jest całkowicie uspokojona.</li>
	<li>Nałóż 70% etanolu, aby zdezynfekować powieki i okolice oka za pomocą bawełnianej końcówki. Sprawdź odruch powiekowy, aby dodatkowo ocenić stopień uspokojenia.</li>
</ol>
2. Usuwanie oka
<ol>
	<li>Upewnij się, że zwierzę przebywa na płaskiej, suchej i gładkiej powierzchni.</li>
	<li>Wysterylizuj kleszcze z zakrzywioną, ząbkowaną końcówką (preferowany rozmiar końcówki: 0,5 x 0,4 mm).</li>
	<li>Delikatnie dociśnij kleszczami do kąta oka, aż gałka oczna zostanie wysunięta z oczodołu i nerw wzrokowy będzie dostępny.</li>
	<li>Prowadź kleszcze za okiem. Mocno dociśnij i przytrzymaj nerw wzrokowy, najlepiej na początku krzywej, a nie na samym czubku kleszczy. Pomoże to podnieść gałkę ziemską z oczodołu i zacisnąć cały nerw wzrokowy.</li>
	<li>Wykonuj okrężne ruchy ręką trzymając kleszcze w kierunku o najmniejszym oporze, podczas gdy mysz pozostaje na płaskiej powierzchni. Mysz będzie kołysać się po powierzchni zgodnie z kierunkiem ruchu dłoni.</li>
	<li>Wykonuj tę czynność ze stopniowo rosnącą prędkością, aż nerw wzrokowy zostanie zwężony na dwie części (zwykle od 7 do 15 ruchów okrężnych, około pół do jednego pełnego obrotu na sekundę). W związku z tym oderwana gałka oczna jest usuwana.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>W przypadku krwawienia (rzadko) należy wypełnić orbitę lepkim koagulacją i środkiem hemostatycznym.</li>
	<li>Odwróć znieczulenie, wstrzykując dootrzewnowo 1 mg/kg chlorowodorku atipamezolu do soli fizjologicznej.</li>
	<li>Podawać 1 mg/kg meloksykamu dootrzewnowo co 24 godziny w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu na pozostałe oko, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na płycie grzewczej lub owiń zwierzę materiałem izolacyjnym w osobnej klatce, aby kontrolować temperaturę ciała.</li>
	<li>Mierz wagę myszy każdego dnia przez co najmniej 2 dni. Utrata masy ciała może wskazywać na cierpienie i w takim przypadku należy kontynuować leczenie meloksykamem do czasu całkowitego wyzdrowienia zwierzęcia.</li>
</ol>

<ol><li>Toldi, J., Fehér, O., Wolff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+induced+by+neonatal+monocular+%28and+binocular%29+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation.</a> Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).</li>
<li>Steeves, J. K. E., González, E. G., Steinbach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+with+one+eye%3A+a+review+of+visual+function+following+unilateral+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Spatial+vision%22%5BJournal%5D)">Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation.</a> Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).</li>
<li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cross-modal+plasticity+in+adult+mouse+visual+cortex+following+monocular+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation.</a> Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).</li>
<li>Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cross-modal+aspect+of+mouse+visual+cortex+plasticity+induced+by+monocular+enucleation+is+age-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent.</a> Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e57(2011).</li>
<li>Morales, B., Choi, S. -Y., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+rearing+alters+the+development+of+GABAergic+transmission+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).</li>
<li>Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+input+coincidence+mediates+critical+period+plasticity+in+the+mouse+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).</li>
<li>Konur, S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+and+filopodial+motility+in+primary+visual+cortex%3A+Reduced+effects+of+activity+and+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation.</a> Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
<li>Galindo-Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+adult+mice%3A+Quantitative+and+topographic+time+course+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses.</a> Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).</li>
<li>Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+ocular+dominance+plasticity+and+NMDA+receptor+subunit+expression+in+glutamic+acid+decarboxylase-65+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice.</a> The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).</li>
<li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+functional+subdivisions+in+the+visual+cortex+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).</li>
<li>Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+expression+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+tyrosine+kinase+B+mRNAs+and+distribution+and+ultrastructural+localization+of+their+proteins+in+the+visual+pathway+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat.</a> Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).</li>
<li>Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+the+structural+remodeling+of+the+visual+system+after+ocular+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation.</a> Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).</li>
<li>Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -T., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cell+proliferation+upon+enucleation+in+direct+retinal+brain+targets+in+the+visual+system+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).</li>
<li>Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+binocular+competition+in+the+visual+cortex+begins+at+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent binocular competition in the visual cortex begins at eye opening.</a> Nature Neuroscience. 10 (3), 370-375 (2007).</li>
<li>Toldi, J., Farkas, T., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+enucleation+induces+cross-modal+changes+in+the+barrel+cortex+of+rat.+A+behavioural+and+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neonatal enucleation induces cross-modal changes in the barrel cortex of rat. A behavioural and electrophysiological study.</a> Neuroscience Letters. 167 (1-2), 1-4 (1994).</li>
<li>Newton, J. R., Sikes, R. W., Skavenski, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-modal+plasticity+after+monocular+enucleation+of+the+adult+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-modal plasticity after monocular enucleation of the adult rabbit.</a> Experimental Brain Research. 144 (4), 423-429 (2002).</li>
<li>Lalonde, J., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+CREB+phosphorylation+and+neuroadaptive+gene+expression+in+area+V1+of+adult+monkeys+after+monocular+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in CREB phosphorylation and neuroadaptive gene expression in area V1 of adult monkeys after monocular enucleation.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (1), 24-37 (2007).</li>
<li>You, Y., Gupta, V. K., Graham, S. L., Klistorner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+degeneration+along+the+visual+pathway+after+optic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury.</a> PLoS ONE. 7 (12), e52061(2012).</li>
<li>Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+anterior+visual+system+development+following+early+monocular+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%3A+Clinical%22%5BJournal%5D)">Altered anterior visual system development following early monocular enucleation.</a> NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).</li>
<li>Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+visual+cortex+of+neonatal+monocular+enucleated+rat%3A+a+proton+magnetic+resonance+spectroscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dyer, R. S., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+enucleation+in+retinal+degenerate+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of enucleation in retinal degenerate mice.</a> Physiology & behavior. 14 (2), 207-210 (1975).</li>
<li>Smith, S. A., Bedi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+eye+enucleation+in+adult+rats+causes+neuronal+loss+in+the+contralateral+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus.</a> Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).</li>
<li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monocular+enucleation+on+calbindin-D+28k+and+c-Fos+expression+in+the+lateral+geniculate+nucleus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Okajimas+folia+anatomica+Japonica%22%5BJournal%5D)">Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats.</a> Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).</li>
<li>Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipsilateral+eye+cortical+maps+are+uniquely+sensitive+to+binocular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity.</a> Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).</li>
<li>Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+protein+and+neuronal+activity+markers+define+regional+architectonic+parcellation+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).</li>
<li>Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+in+primate+visual+cortex+assessed+by+immunostaining+for+the+transcription+factor+Zif268%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268.</a> Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby przeprowadzić udaną enukleację zgodnie z naszą metodą, najważniejsze kroki, które należy wziąć pod uwagę, to: 1) użycie kleszczy z zakrzywioną i ząbkowaną końcówką o odpowiednim rozmiarze; 2) wykonanie enukleacji na gładkiej i suchej powierzchni; oraz 3) stopniowe przyspieszanie ruchów okrężnych w kierunku o najmniejszym tarciu.
Dla uzyskania skutecznego efektu niezbędne jest użycie odpowiednich kleszczyków charakteryzujących się zakrzywioną i ząbkowaną końcówką (preferowany rozmiar końcówki: mysz: 0,5 x 0,4 mm; szczur: 2,15 x 1,3 mm). Krzywizna pozwala na łatwy dostęp do nerwu wzrokowego po przemieszczeniu gałki ocznej i jest niezbędna do prawidłowego ułożenia dłoni podczas wykonywania ruchów okrężnych. Gładkie końcówki nie są zalecane, ponieważ brakuje im niezbędnego chwytu podczas trzymania nerwu wzrokowego. Niewłaściwe trzymanie nerwu wzrokowego podczas ruchów okrężnych powoduje pęknięcie tętnicy ocznej, słabe odwarstwienie oka, a tym samym słabą odtwarzalność. Dlatego zaleca się, aby najpierw przećwiczyć tę technikę na zwierzętach poddanych eutanazji w celu optymalizacji obchodzenia się z kleszczami, aby zagwarantować maksymalny dobrostan zwierząt po zastosowaniu metody in vivo. Udane wyłuszczenie oka zostało ostatnio przeprowadzone również na szczurach w naszym laboratorium przy użyciu tej samej techniki, z wyjątkiem ręcznego obracania ciała zwierzęcia i utrzymywania kleszczy nieruchomo.
Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że może ona uszkodzić siatkówkę. Dlatego ta metoda jest mniej odpowiednia do pobierania siatkówki w celu wykonania histologii5. Co więcej, nasza metoda jest ograniczona do wieku po otwarciu oka, ponieważ gałka oczna musi zostać wysunięta z oczodołu bez usuwania lub przecinania powiek.
Wyłuszczenie oczu u różnych gatunków, w tym gryzoni, jest rutynowo wykonywane przy użyciu metod alternatywnych, które często obejmują usunięcie powiek i przecięcie nerwu wzrokowego18,23-25. Metody te są zwykle bardziej inwazyjne i mają wyższą krzywą uczenia się niż technika opisana tutaj. Bez konieczności zdejmowania lub szycia powiek, czas rekonwalescencji po operacji jest zminimalizowany, co skutkuje wyższym dobrostanem zwierząt i bardziej powtarzalnymi wynikami.

Usunięcie oka, a tym samym nieodwracalne zniszczenie powierzchni receptora czuciowego (siatkówki), powoduje znaczną utratę bodźców sensorycznych wzdłuż ścieżki wzrokowej. Model enukleacji w układzie wzrokowym młodocianych i dorosłych okazał się cenny w zrozumieniu rozwoju, plastyczności i funkcji różnych ośrodków wzrokowych1-4. Molekularne, komórkowe i fizjologiczne konsekwencje tej deprywacji sensorycznej mogą dostarczyć wglądu w to, jak regulowany jest normalny rozwój i jak ustalone obwody korowe radzą sobie i zmieniają swoją strukturę i funkcję w odpowiedzi na tak rozległą zmianę w doświadczeniu.
Istnieją różne metody deprywacji wzrokowej i wszystkie mają swoje specyficzne zalety w badaniach związanych ze wzrokiem. Na przykład odchów w ciemności eliminuje aktywność wzrokową, ale nie wpływa na spontaniczną aktywność siatkówki. Podobnie, szwy na powieki lub opaski na oczy usuwają wzorzyste bodźce wzrokowe bez zakłócania spontanicznej aktywności, ale umożliwiają rozproszoną penetrację światła przez zamknięte oczy. Metody te są odwracalne i wykazano, że są cenne w zrozumieniu roli wzorzec widzenia i niskopoziomowej korelacji danych wejściowych obuocznych w rzeźbieniu obwodów korowych podczas rozwoju6-8. W badaniach nad jaskrą model zmiażdżenia nerwu wzrokowego u dorosłych zwierząt jest szeroko stosowany, ponieważ powoduje postępującą utratę danych wejściowych komórek zwojowych siatkówki, które tworzą nerw wzrokowy9,10. Z drugiej strony, enukleacja, w której oko, a tym samym siatkówka, jest całkowicie i natychmiast usunięta, jest właściwym wyborem deprywacji, gdy celem jest nieodwracalne usunięcie zarówno spontanicznego, jak i wzorcowego widzenia jednocześnie. Wywołuje również silne zaburzenie równowagi aktywności wewnątrzgałkowej, co może zwiększyć stosunek sygnału do szumu w badaniach mapowania aktywności11,12. Porównanie zmian funkcjonalnych i strukturalnych w odpowiedzi na enukleację z tymi po deprywacji za pomocą mniej drastycznych metod, takich jak na przykład szew powiekowy, może również ujawnić nowe informacje na temat roli spontanicznej aktywności siatkówki zarówno w homeostatycznych, jak i synaptycznych typach plastyczności.
Wyłuszczenie powoduje utratę wpływów troficznych w bezpośrednich celach siatkówkowych. Na przykład poziomy BDNF są znacznie obniżone w jądrze kolankowatym bocznym (LGN) i wzgórku górnym u dorosłych szczurów wyłuszczonych13. Reaktywne formy tlenu, które działają jako cząsteczki przekaźnikowe pośredniczące w przebudowie strukturalnej, wykryto również w podkorowych strukturach układu wzrokowego dorosłego szczura14. Co więcej, aktywacja mikrogleju i astrogleju w różnych podkorowych wizualnych strukturach docelowych myszy zachodzi w określonym przedziale czasowym po enukleacji wynoszącym jeden tydzień15. Razem, deaferentacja nerwu wzrokowego powoduje różne reakcje podkorowe na poziomie glejowym, strukturalnym i molekularnym. Pomimo tych efektów podkorowych, niekoniecznie implikuje to efekty na poziomie kory16. Godna uwagi jest międzymodalna plastyczność kory mózgowej, w tym modyfikacje w innych obszarach sensorycznych obok wzmocnienia bodźców niewzrokowych do pozbawionej kory wzrokowej, zachodzi zarówno po enukleacji jednoocznej (ME)3,4,17,18, jak i obuocznej (BE)1,17.
Oprócz przyczyniania się do rozwoju neuronauki wizualnej, enukleacja jako rodzaj deaferentacji może być wykorzystana do badania równowagi między neuroprotekcyjnemiwłaściwościami 19 i neurodegeneracyjnymi20-22 ośrodkowego układu nerwowego.
Różne procedury przeprowadzania enukleacji są już opisane w literaturze. Niektóre metodologie ME in vivo u szczurów i myszy są mniej proste ze względu na niepotrzebne sekcje mięśni i tkanek oczodołu23-25. Inne publikacje, takie jak Mahajan i in. (2011)5, zawierają szczegółowy protokół wykorzystujący sekcję w celu uzyskania wysokoprzepustowej kolekcji oczu w celu zbadania korelacji genotyp-fenotyp, prawdopodobnie po sekcji zwłok. Dla ich celów metoda jest wygodna i szybka. Jednak metoda ta jest mniej odpowiednia do enukleacji in vivo, gdy decyduje się na badanie aferentnego szlaku wzrokowego po enukleacji (u żywych zwierząt), a nie samego oka. W takim otoczeniu przeżycie po enukleacji ma duże znaczenie. Korzystne jest również minimalne uszkodzenie in vivo i zachowanie nerwu wzrokowego i tkanki oczodołu. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną metodę enukleacji, bardziej zbliżoną do tej opisanej przez Faguet i wsp. (2008)26, która oferuje pewne korzystne właściwości: wiąże się z szybką rekonwalescencją pooperacyjną i charakteryzuje się bardzo niskim progiem uczenia się dla badaczy. Ogólnie rzecz biorąc, różne metody są komplementarne w zależności od przedmiotu kolejnych badań: morfologii oka lub badania ścieżek wzrokowych.
Podsumowując, enukleacja może być stosowana z badań nad wzrokiem do badań homeostatycznej i międzymodalnej plastyczności mózgu, właściwości odpowiedzi glejowej i stabilności aksonów. W tym wizualizowanym artykule pokazujemy wykonalną i niezawodną metodę enukleacji oka in vivo u myszy.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek ketaminy (Anesketin)</td><td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td><td>BE-V136516</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek medetomidyny (Domitor)</td><td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td><td>BE-V151742</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek atipamezolu (Antisedan)</td><td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td><td>BE-V153352</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki (cefazolin, Kefzol)</td><td>Eurocept Pharmaceuticals</td><td>BE 106267</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu (Fucithalmic)</td><td>Leo Pharma nv-sa</td><td>BE 144654</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 Kleszcze - ząbkowane zakrzywione</td><td>narzędzia naukowe</td><td>11370-31</td><td>Do stosowania w myszy. Można użyć dowolnych kleszczy o podobnych wymiarach, o ile końcówka jest zakrzywiona i ząbkowana.</td></tr><tr><td>Kleszcze o wąskim wzorze - zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td>Do stosowania u szczurów. Można użyć dowolnych kleszczy o podobnych wymiarach, o ile końcówka jest zakrzywiona i ząbkowana.</td></tr><tr><td>Wata hemostatyczna</td><td>Qualiphar</td><td>N/A</td><td>Inne środki hemostatyczne są równie odpowiednie (np. , Viscostat, #649, Ultradent Products)</td></tr></tbody></table>

wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Wyłuszczenie lub chirurgiczne usunięcie oka może być ogólnie uważane za model deaferencji nerwów. Stanowi cenne narzędzie do badania różnych aspektów plastyczności wizualnej, intermodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków1-4.
Tutaj demonstrujemy elegancką i prostą technikę usuwania jednego lub obu oczu u myszy, która jest sprawdzana u myszy w wieku od 20 dni do dorosłych. Krótko mówiąc, zdezynfekowane zakrzywione kleszcze służą do zaciskania nerwu wzrokowego za okiem. Następnie wykonuje się ruchy okrężne w celu zwężenia nerwu wzrokowego i usunięcia gałki ocznej. Zaletami tej techniki są wysoka powtarzalność, minimalne krwawienie lub jego brak, szybka rekonwalescencja pooperacyjna i bardzo niski próg uczenia się dla eksperymentatora. W związku z tym dużą ilością zwierząt można manipulować i przetwarzać przy minimalnym wysiłku. Charakter techniki może powodować niewielkie uszkodzenie siatkówki podczas zabiegu. Ten efekt uboczny sprawia, że ta metoda jest mniej odpowiednia w porównaniu z Mahajan i in. (2011)5, jeśli celem jest pobranie i analiza tkanki siatkówki. Ponadto nasza metoda jest ograniczona do wieku po otwarciu oka (mysz: P10 - 13 i nowsze), ponieważ gałka oczna musi zostać przemieszczona z oczodołu bez zdejmowania powiek. Technika enukleacji in vivo opisana w tym manuskrypcie została ostatnio z powodzeniem zastosowana z niewielkimi modyfikacjami u szczurów i wydaje się przydatna do badania aferentnego szlaku wzrokowego gryzoni w ogóle.

Rycina 1 przedstawia pomyślne usunięcie oka przy zastosowaniu opisanego protokołu, co charakteryzuje się brakiem krwawienia oraz brakiem widocznych uszkodzeń fizycznych tkanki orbitalnej lub oczodołu (Ryciny 1A, 1B). Co więcej, usunięte oko posiada gładką rogówkę, naczyniówkę i tarczę optyczną, co wskazuje na całkowicie nienaruszoną gałkę oczną (Rycina 1C). Ponieważ nasz protokół obejmuje zaciskanie nerwu wzrokowego za okiem oraz obrót mechaniczny, nerw wzrokowy usuniętego oka jest zwężony u podstawy siatkówki (Rycina 1D). Przeprowadzenie opisanego zabiegu skutkuje czystym przecięciem nerwu wzrokowego bez żadnych uszkodzeń sąsiedniego obszaru mózgu (Rycina 1E).
Jednooczna enukleacja w połączeniu z mapowaniem aktywności (Rycina 2) pozwala na precyzyjne wyznaczenie funkcjonalnych lub specyficznych dla oka obszarów wejściowych w przeciwległej korze wzrokowej myszy12,27, a nawet kolumn dominacji ocznej u ssaków wyższego rzędu, takich jak małpy28.
W eksperymentach na myszach zastosowano usunięcie jednego (ME) lub obu oczu (BE) w połączeniu z ukierunkowaną stymulacją wzrokową oraz detekcją poziomów ekspresji mRNA zif268 lub białka c-Fos, aby ujawnić regionalną aktywację neuronów w korze wzrokowej12,27. W przeciwieństwie do grup kontrolnych stymulowanych wzrokowo (Rycina 2A), u myszy BE stwierdzono aktywność podstawową w korze wzrokowej z powodu całkowitego braku dopływu bodźców wzrokowych (Rycina 2B). W ten sposób ujawniono granice między korą wzrokową a korą niewzrokową (t.j. korą somatosensoryczną w przekrojach bardziej przednich i korą słuchową w przekrojach bardziej tylnych). Wyniki uzyskane od myszy ME po tygodniu przeżycia pozwoliły zwizualizować obszary dopływu specyficzne dla oka w przeciwległej korze wzrokowej. Dwa obszary sterowane monokularnie były hypoaktywne i znajdowały się przyśrodkowo oraz bocznie względem centralnej strefy binokularnej (Rycina 2C).
<img alt="Badanie anatomii myszy; obraz przedstawia ekstrakcję oka (A-C) i sekcję mózgu (E)." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Jakościowa ocena stanu oczodołu po enukleacji, usuniętego oka oraz nerwu wzrokowego. Po usunięciu oka za pomocą zakrzywionej pęsety (A) w oczodole nie obserwuje się krwawienia ani uszkodzeń (B). Usunięte oko jest całkowicie nienaruszone, co potwierdza prawidłowy wygląd rogówki i naczyniówki (C,D). Nerw wzrokowy jest zwężony w obrębie tarczy nerwu wzrokowego w miejscu opuszczania oka (D). Badanie brzusznej części mózgu wykazuje czyste cięcie nerwu wzrokowego (gwiazdka) oraz brak widocznych uszkodzeń innych struktur (E). Paski skali w C, D: 1 mm. Pasek skali w E: 5 mm. A: przedni; L: lewy; P: tylny; R: prawy.
<img alt="Schemat łączności neuronalnej, analiza mózgu myszy, szlaki przetwarzania wzrokowego, dane eksperymentalne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Funkcjonalne podziały kory wzrokowej myszy specyficzne dla wkładu z poszczególnych oczu ujawnione poprzez enukleację. Czarne i szare linie łączące oczy z korą reprezentują skrzyżowanie aferentów siatkówkowych oraz regiony wkładu specyficzne dla danego oka. Aktywność neuronalna jest wizualizowana na przekrojach wieńcowych myszy kontrolnych (A), BE (B) i ME (C) za pomocą radioaktywnej hybrydyzacji in situ (ISH) dla zif268 (skala szarości) w obrębie poziomu Bregma -3,40 mm. U zwierząt kontrolnych (A) kora wzrokowa w obu półkulach wykazuje wysoką aktywność po stymulacji wzrokowej. Po usunięciu jednego lub obu oczu widoczny jest wyraźny spadek sygnału aktywności w odpowiadających im pozbawionych wkładu regionach korowych. Myszy po enukleacji monokularnej (C) wykazują strefę wysokiej aktywności w strefie binokularnej kory wzrokowej, otoczoną przez obniżony sygnał w strefach monokularnych przeciwległych do usuniętego oka. Pasek skali: 2 mm. Przedrukowano za zgodą Van Brussel et al12.

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne usunięcie oka znieczulonej myszy w bardzo prosty i powtarzalny sposób. Osiąga się to poprzez uprzednie przemieszczenie gałki ocznej poprzez delikatne naciśnięcie na kant zakrzywionymi kleszczami. Drugim krokiem zabiegu jest poprowadzenie kleszczy za okiem, aby mocno chwycić nerw wzrokowy.Trzecim krokiem jest wykonywanie ruchów okrężnych. Gdy ręka trzyma kleszcze, korpus myszy będzie się poruszał w tym samym kierunku. Ostatnim krokiem jest stopniowe zwiększanie prędkości ruchów, aby zapewnić zwężenie nerwu wzrokowego, co skutkuje odwarstwieniem gałki ocznej.Ostatecznie oko może być wykorzystane do badania podłużnego szlaku wzrokowego AFR, na przykład poprzez ujawnienie różnych procesów plastyczności deprywacji sensorycznej w mózgu myszy. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które często wykorzystują szycie i rozwarstwienie, jest to, że nasza metoda iation opiera się po prostu na zwężeniu nerwu wzrokowego, co skutkuje minimalnym lub zerowym krwawieniem i jest bardzo łatwe do nauczenia. Zacznij od znieczulenia myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i meiny w soli fizjologicznej.Potwierdź sedację, sprawdzając odruch myszy. Ściśnij palce u nóg kleszczami i sprawdź, czy jest reakcja odruchowa. Jeśli nie ma odpowiedzi, użyj aplikatora z bawełnianą końcówką i 70% etanolu, aby oczyścić powieki i okolice oka.Jeśli nie ma reakcji na mruganie oczami, kontynuuj zarodkowanie oka. Połóż mysz na stabilnej, płaskiej, gładkiej i suchej powierzchni. Wysterylizuj końcówki zakrzywionych ząbkowanych kleszczy w sterylizatorze z kulkami szklanymi.Najlepszy rozmiar końcówki to 0,5 na 0,4 milimetra. Następnie delikatnie dociśnij kleszczem do kantu, aż gałka oczna zostanie przemieszczona z oczodołu i nerw wzrokowy będzie osiągalny. Następnie poprowadź kleszcze za okiem i mocno dociśnij i przytrzymaj nerw wzrokowy z uchwyconym nerwem wzrokowym Powoli zacznij przesuwać kleszcze w kółko w kierunku najmniejszego oporu.Trzymając mysz przy stole operacyjnym, mysz powinna być zabezpieczona. Jego ciało również powinno się poruszać. Stopniowo przyspieszaj, aż po siedmiu do 15 okrężnych ruchach nerw wzrokowy zwęża się, a gałka oczna odłącza się.Jeśli obroty są zbyt szybkie lub kleszcze są ciągnięte zbyt mocno, nerw pęknie przedwcześnie i nastąpi błaganie. Zacznij od odwrócenia znieczulenia. Podać myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie chlorowodorku aamaz all w soli fizjologicznej.Następnie podać domięśniowo 0,05. Mililitry przygotowanego leku przeciwbólowego, takiego jak meloksykam i środek przeciwbólowy, należy podawać co 24 godziny. Teraz nałóż maść do oczu na pozostałe oko, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.Gdyby został zastosowany przed operacją, rozsmarowałby się na stole. Przenieś mysz do klatki do trzymania, kontroluj temperaturę ciała myszy za pomocą płyty grzewczej lub koca, podczas gdy dochodzi, gdy zwierzę odzyska kontrolę motoryczną, przenieś ją z powrotem do klatki domowej. Udane usunięcie oka charakteryzuje się brakiem krwawienia lub widocznego fizycznego uszkodzenia tkanki oczodołu lub oczodołu.Wyłuszczone oko powinno mieć cechy nienaruszonej gałki ziemskiej, takie jak gładka rogówka i naczyniówka. Nerw wzrokowy powinien być zwężony u podstawy siatkówki. Pozostała długość nerwu zwierzęcia powinna wykazywać czyste cięcie, a otaczający obszar mózgu nie powinien być uszkodzony.Przeprowadzono eksperyment przy użyciu tych technik, a następnie wykryto mRNA Z 2 68 za pomocą radioaktywnej hybrydyzacji w C-dwóch, aby odkryć wizualnie indukowaną aktywność neuronalną w korze mózgowej. W przeciwieństwie do kontrolnych stymulowanych wizualnie, myszy z obojgiem oczu i jądrami wykazywały podstawową aktywność w lewej i prawej korze wzrokowej z powodu całkowitego braku bodźców wzrokowych. W związku z tym odkryto granice między korą wzrokową a niewzrokową.Wyłuszczenie jednooczne ujawniło, że dwa obszary napędzane przez jednooczny są hipoaktywne w korze wzrokowej przeciwległe do barwnika usuwającego. Obszary te znajdują się przyśrodkowo i bocznie w stosunku do centralnej strefy lornetki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż jedną minutę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Dlatego zapewnia skuteczną metodę badania aktywności, plastyczności lub innych zjawisk w szlaku wzrokowym laryngologów.

a-highly-reproducible-straightforward-method-to-perform-vivo-ocular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł wideo demonstruje sposób tworzenia organotypowych kultur całej siatkówki oraz procedurę cytospinową służącą do analizy efektów indukowanych egzogennie. Organotypowe kultury całej siatkówki odwzorowują warunki in vivo i znacząco ułatwiają dostęp do siatkówek myszy w manipulacjach eksperymentalnych, pozwalając jednocześnie uniknąć wad klasycznych modeli zwierzęcych u myszy.

Organotypowa hodowla całego preparatu siatkówki mysiej typu in vivo

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj prostą metodę enukleacji oka u myszy do badania plastyczności wzrokowej. Technika opiera się na uciskaniu nerwu wzrokowego, minimalizuje krwawienie i trwa mniej niż minutę.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Przeglądaj więcej filmów