Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka
6 października 2014
Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne usunięcie oka znieczulonej myszy w bardzo prosty i powtarzalny sposób. Osiąga się to poprzez uprzednie przemieszczenie gałki ocznej poprzez delikatne naciśnięcie na kant zakrzywionymi kleszczami. Drugim krokiem zabiegu jest poprowadzenie kleszczy za okiem, aby mocno chwycić nerw wzrokowy.
Trzecim krokiem jest wykonywanie ruchów okrężnych. Gdy ręka trzyma kleszcze, korpus myszy będzie się poruszał w tym samym kierunku. Ostatnim krokiem jest stopniowe zwiększanie prędkości ruchów, aby zapewnić zwężenie nerwu wzrokowego, co skutkuje odwarstwieniem gałki ocznej.
Ostatecznie oko może być wykorzystane do badania podłużnego szlaku wzrokowego AFR, na przykład poprzez ujawnienie różnych procesów plastyczności deprywacji sensorycznej w mózgu myszy. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które często wykorzystują szycie i rozwarstwienie, jest to, że nasza metoda iation opiera się po prostu na zwężeniu nerwu wzrokowego, co skutkuje minimalnym lub zerowym krwawieniem i jest bardzo łatwe do nauczenia. Zacznij od znieczulenia myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy i meiny w soli fizjologicznej.
Potwierdź sedację, sprawdzając odruch myszy. Ściśnij palce u nóg kleszczami i sprawdź, czy jest reakcja odruchowa. Jeśli nie ma odpowiedzi, użyj aplikatora z bawełnianą końcówką i 70% etanolu, aby oczyścić powieki i okolice oka.
Jeśli nie ma reakcji na mruganie oczami, kontynuuj zarodkowanie oka. Połóż mysz na stabilnej, płaskiej, gładkiej i suchej powierzchni. Wysterylizuj końcówki zakrzywionych ząbkowanych kleszczy w sterylizatorze z kulkami szklanymi.
Najlepszy rozmiar końcówki to 0,5 na 0,4 milimetra. Następnie delikatnie dociśnij kleszczem do kantu, aż gałka oczna zostanie przemieszczona z oczodołu i nerw wzrokowy będzie osiągalny. Następnie poprowadź kleszcze za okiem i mocno dociśnij i przytrzymaj nerw wzrokowy z uchwyconym nerwem wzrokowym Powoli zacznij przesuwać kleszcze w kółko w kierunku najmniejszego oporu.
Trzymając mysz przy stole operacyjnym, mysz powinna być zabezpieczona. Jego ciało również powinno się poruszać. Stopniowo przyspieszaj, aż po siedmiu do 15 okrężnych ruchach nerw wzrokowy zwęża się, a gałka oczna odłącza się.
Jeśli obroty są zbyt szybkie lub kleszcze są ciągnięte zbyt mocno, nerw pęknie przedwcześnie i nastąpi błaganie. Zacznij od odwrócenia znieczulenia. Podać myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie chlorowodorku aamaz all w soli fizjologicznej.
Następnie podać domięśniowo 0,05. Mililitry przygotowanego leku przeciwbólowego, takiego jak meloksykam i środek przeciwbólowy, należy podawać co 24 godziny. Teraz nałóż maść do oczu na pozostałe oko, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
Gdyby został zastosowany przed operacją, rozsmarowałby się na stole. Przenieś mysz do klatki do trzymania, kontroluj temperaturę ciała myszy za pomocą płyty grzewczej lub koca, podczas gdy dochodzi, gdy zwierzę odzyska kontrolę motoryczną, przenieś ją z powrotem do klatki domowej. Udane usunięcie oka charakteryzuje się brakiem krwawienia lub widocznego fizycznego uszkodzenia tkanki oczodołu lub oczodołu.
Wyłuszczone oko powinno mieć cechy nienaruszonej gałki ziemskiej, takie jak gładka rogówka i naczyniówka. Nerw wzrokowy powinien być zwężony u podstawy siatkówki. Pozostała długość nerwu zwierzęcia powinna wykazywać czyste cięcie, a otaczający obszar mózgu nie powinien być uszkodzony.
Przeprowadzono eksperyment przy użyciu tych technik, a następnie wykryto mRNA Z 2 68 za pomocą radioaktywnej hybrydyzacji w C-dwóch, aby odkryć wizualnie indukowaną aktywność neuronalną w korze mózgowej. W przeciwieństwie do kontrolnych stymulowanych wizualnie, myszy z obojgiem oczu i jądrami wykazywały podstawową aktywność w lewej i prawej korze wzrokowej z powodu całkowitego braku bodźców wzrokowych. W związku z tym odkryto granice między korą wzrokową a niewzrokową.
Wyłuszczenie jednooczne ujawniło, że dwa obszary napędzane przez jednooczny są hipoaktywne w korze wzrokowej przeciwległe do barwnika usuwającego. Obszary te znajdują się przyśrodkowo i bocznie w stosunku do centralnej strefy lornetki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż jedną minutę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Dlatego zapewnia skuteczną metodę badania aktywności, plastyczności lub innych zjawisk w szlaku wzrokowym laryngologów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prostą metodę wykonywania enukleacji in vivo u myszy, która pozwala badaczom na analizę plastyczności wzrokowej i cross-modalnej. Technika ta minimalizuje krwawienie i jest łatwa do opanowania, co czyni ją odpowiednią dla różnorodnych zastosowań eksperymentalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Układ wzrokowy
- Badania nad plastycznością
Wstęp
- Enukleacja powoduje utratę wzroku, co ułatwia badania nad przetwarzaniem informacji wizualnych.
- Procedura ta umożliwia badanie wpływu deprywacji sensorycznej na mózg.
- Istniejące metody często opierają się na złożonych technikach, które mogą prowadzić do powikłań.
- Niniejsza metoda ma na celu zapewnienie bezpieczniejszej i bardziej wydajnej alternatywy.
Cel badania
- Opisanie powtarzalnej techniki usuwania gałek ocznych u myszy.
- Umożliwienie badania szlaków wzrokowych i plastyczności mózgu.
- Udoskonalenie istniejących metod enukleacji.
Zastosowane metody
- Znieczulenie myszy przy użyciu mieszaniny ketaminy i soli fizjologicznej.
- Wypchnięcie gałki ocznej za pomocą pęsety zakrzywionej.
- Chwycenie i zmiażdżenie nerwu wzrokowego w celu oddzielenia gałki ocznej.
- Opieka pooperacyjna, w tym uśmierzanie bólu i monitorowanie powrotu do sprawności.
Główne wyniki
- Technika ta zapewniła minimalne krwawienie i nienaruszone tkanki otaczające.
- U myszy po enukleacji stwierdzono zmienioną aktywność neuronalną w korze wzrokowej.
- Jednostronna enukleacja ujawniła hypoaktywność w określonych obszarach wzrokowych.
- Procedurę tę można sprawnie przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna minuta.
Wnioski
- Opisana metoda enukleacji jest skuteczna w badaniu plastyczności wzrokowej.
- Zapewnia ona niezawodny sposób badania efektów deprywacji sensorycznej.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w celu pogłębienia wiedzy na temat przetwarzania wzrokowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna enukleacja oka in vivo u myszy umożliwia wysokoprzepustowe badanie plastyczności systemu wzrokowego oraz mechanizmów deprywacji sensorycznej, wspierając wczesną walidację celów w neurobiologii. Powtarzalność i prostota operacyjna tej metody ograniczają zmienność proceduralną, zwiększając pewność prognostyczną w analizach pochodnych. Możliwość ta jest strategicznie istotna dla zespołów biofarmaceutycznych poszukujących solidnych modeli przedklinicznych do badania adaptacji neuronalnej i plastyczności krzyżowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia tworzenie kontrolowanych modeli deaferentacji do mechanistycznych badań nad plastycznością neuronalną.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolowanie zmiennych wejścia sensorycznego in vivo.
- Ułatwia weryfikację hipotez dotyczących adaptacji szlaków wzrokowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane przygotowanie modeli zwierzęcych dla powtarzalnego przesiewania fenotypowego.
- Zapewnia minimalne uszkodzenie tkanek i spójną rekonwalescencję pooperacyjną, co wspiera niezawodność analizy.
- Umożliwia ilościową ocenę zmian w aktywności neuronalnej po deprywacji sensorycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad neuroplastycznością i utratą zmysłów.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów neuronalnych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez umożliwienie generowania odpornych i skalowalnych modeli zwierzęcych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda enukleacji wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc podstawę do mechanistycznego ograniczania ryzyka oraz walidacji celów w badaniach neurobiologicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotezy zerowej poprzez umożliwienie precyzyjnego usunięcia bodźców sensorycznych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne modele zwierzęce do późniejszych analiz ilościowych.
- Analityka: Wspiera pomiary aktywności neuronalnej i plastyczności kory po enukleacji.
- Badania translacyjne: Łączy podstawowe odkrycia z przedklinicznymi modelami deprywacji sensorycznej.
- Zastosowania komercyjne: Oferuje skalowalny protokół o niskiej zmienności, który można zaadaptować do różnych modeli gryzoni.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad adaptacją neuronalną i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie zwierząt, zmniejszając obciążenie szkoleniowe i zmienność procedur.
- Wartość strategiczna: Umożliwia efektywne podejmowanie decyzji go/no-go w portfelach skoncentrowanych na neuroplastyczności.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację celów i szlaków neuronalnych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w znieczulaniu gryzoni oraz w technikach mikrochirurgicznych.
- Niezbędny jest dostęp do sterylnych pęset zakrzywionych oraz infrastruktury do opieki pooperacyjnej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności w badaniach wieloośrodkowych.
- Adaptacja do innych gatunków gryzoni jest możliwa przy niewielkich modyfikacjach.
- Metoda nie nadaje się do analizy tkanki siatkówki ze względu na możliwość uszkodzenia podczas procedury.
