Name: Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę SPR do badania interakcji białko-receptor w czasie rzeczywistym bez znakowania. Technika umożliwia pomiar powinowactwa i kinetyki wiązania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Lewinson są wspierane przez granty z Izraelskiej Akademii Nauk, Instytutu Badań Biomedycznych Rappaport, Fundacji Badawczej Meriuex oraz grantu na reintegrację kariery Marie Curie (OL). EV jest wspierany przez stypendium Fine oraz przez Wydział Lekarski Technion. NLL jest wspierany przez granty Izraelskiej Akademii Nauk.

1. Przygotowanie próbki białka i buforu
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki: oczyścić białka będące przedmiotem zainteresowania i upewnić się, że wszystkie agregaty zostały usunięte, poprzez wstrzyknięcie białka przed eksperymentem do kolumny do filtracji żelu lub przez ultrawirowanie (zwykle wystarcza 10 minut przy 100 000 x g). 
	UWAGA: Chociaż pożądane, wysoce czyste preparaty białkowe nie są koniecznością. SPR jest z powodzeniem stosowany z mniej niż idealnymi oczyszczaniami, a nawet z całkowitym ekstraktem8,9.</li>
	<li>Przygotowanie buforu:
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor eksperymentu (nazywany "uruchomionym buforem" lub RB). Do opisanego tutaj protokołu należy użyć 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,05% (w/v) DDM (n-dodecyl β-D-maltozyd). Należy pamiętać, że wybór składu buforu można łatwo modyfikować w zależności od badanego systemu.</li>
		<li>Przefiltruj wszystkie i próbki białek za pomocą filtrów 0,22 μm. Upewnij się wcześniej, że filtry są kompatybilne z białkami. Ogólnie rzecz biorąc, niedawno wprowadzone na rynek platformy SPR zawierają odgazowywacz liniowy; Jeśli tak nie jest, przed użyciem należy odgazować.</li>
		<li>Dializować przez noc lub rozcieńczyć próbki względem RB, aby uniknąć niezgodności. Dializa (lub jakakolwiek inna metoda wymiany buforu) jest szczególnie wskazana w przypadku stosowania substancji chemicznych o dużej lepkości (np. sacharozy, glicerolu, DMSO). Przed podłączeniem butelki RB do wlotu pompy należy odłożyć 10 ml RB w osobnej probówce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć skoncentrowany zapas ligandów w RB do końcowego stężenia ~20 μg/ml. Z reguły, aby uzyskać stabilne unieruchomienie liganda, należy stosować niskie stężenia ligandów z dłuższymi wstrzyknięciami przy niskim przepływie, w przeciwieństwie do wysokich stężeń, wysokiego przepływu i krótszych wstrzyknięć.</li>
	<li>Rozcieńczyć analit w RB do pożądanego stężenia. Zazwyczaj testuje się zakres stężeń dla układu o nieznanym powinowactwie od 10 μM do 10 nM w dziesięciokrotnych rozcieńczeniach. Zawsze najpierw zaczynaj od niższych stężeń.</li>
</ol>
2. Układ czujnika
<ol>
	<li>Wybór chipów: Użyj chipa sprzężonego z kwasem nitrylotrioctowym (NTA) odpowiedniego do wychwytywania białek ze znacznikiem oligo-histydyny.</li>
	<li>Użycie chipów:
	<ol>
		<li>Używając nowego chipa, wyjmij go z pochwy, delikatnie spłucz wodą podwójnie destylowaną (DDW), ostrożnie osusz pozostałe płyny za pomocą delikatnych wycieraczek i uważaj, aby nie dotknąć powierzchni warstwy złota. Umieść chip z powrotem w osłonie we właściwej orientacji (wkładanie jest płynne, gdy chip jest prawidłowo umieszczony).</li>
		<li>Podczas ponownego użycia chipa wyjmij przechowywany chip z bufora, dokładnie spłucz DDW i delikatnie wysusz, jak podano powyżej, a następnie umieść w oryginalnej osłonie. 
		UWAGA: Nagromadzenie niespecyficznych śmieci na chipie może wpłynąć na jego "żywotność". Można to monitorować, porównując RU przed immobilizacją liganda i po strippingu. Chociaż wiele pomiarów można wykonać przy użyciu tego samego chipa NiNTA, kwestia jego trwałości nie jest "jednoznaczna" i różni się znacznie w zależności od różnych chipów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokowanie chipów: Otwórz drzwiczki chipa czujnika i umieść chip w jego osłonie. Korzystając z nowego chipa, wprowadź numer seryjny chipa, aby zachować rejestr użytkowania. Zamknij drzwi i naciśnij "chip dokujący".</li>
</ol>
3. Ustawienia temperatury
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę ogniwa chipowego na 25 °C (lub preferowaną temperaturę eksperymentu).</li>
	<li>Opcjonalnie: ustawić komorę na próbki na 7 °C, aby białka były stabilne przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
4. Rozwiązania do załadunku i strippingu
Przygotuj następujące roztwory do ładowania i usuwania: 0,5 mM NiCl2 w RB, 350 mM EDTA w RB (dodaj detergent do roztworu EDTA do końcowego stężenia jak w RB), 0,25% SDS w H2O i 100 mM HCl w H2O. W przypadku korzystania z probówek do mikrowirówek, a nie probówek przeznaczonych do SPR, nie zapomnij odciąć nakrętek probówek.
5. Zalać instrument SPR RB
6. Rozpocznij nowy bieg
<ol>
	<li>Ustaw natężenie przepływu, które będzie używane podczas eksperymentu. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, należy ustawić przepływ na 50 μl/min. 
	UWAGA: Ten parametr może być modyfikowany podczas eksperymentu.</li>
	<li>Zdefiniuj ścieżki przepływu i odejmowanie odniesień. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, ustaw ścieżki Fc=1 i Fc=2, odejmując Fc=2-1. 
	UWAGA: Program wyświetli w czasie rzeczywistym odejmowanie dwóch mierzonych komórek. Pamiętaj, że tego parametru nie można zmienić podczas eksperymentu.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni stojak na próbki (może to mieć wpływ na zużycie objętości próbki).</li>
	<li>Zapisz plik z wynikami.</li>
</ol>
7. Cykle eksperymentów
Każdy eksperyment składa się z cykli, zachowaj wyraźny zapis wykonanych iniekcji w każdym cyklu i oddziel ładowanie ligandów, ślepe wstrzyknięcie bufora i wstrzyknięcie analitu na różne cykle.
<ol>
	<li>Cykl 1: Przygotowanie wiórów i ładowanie niklu
	<ol>
		<li>Upewnij się, że przepływ i ścieżki są ustawione zgodnie z krokami 6.1 i 6.2.</li>
		<li>Wstrzyknij 350 mM EDTA na 1 minutę, aby zmyć resztki.</li>
		<li>Ustawić przepływ na 10 μl/min.</li>
		<li>Wstrzykiwać 0,5 mM NiCl2 przez 2 min. 
		UWAGA: Teraz żywica wiórowa jest pokryta jonami niklu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 2: Unieruchomienie ligandów
	<ol>
		<li>Ustawić przepływ na 15 μl/min, ścieżka przepływu Fc=2.</li>
		<li>Wstrzykiwać ligand A aż do osiągnięcia wartości RU, które są 10-20 razy większe od jego masy cząsteczkowej. Na przykład załaduj ligand o wartości 50 kDa do 500–1 000 jednostek RU. Prowadź rejestr osiągniętej wartości RU.</li>
		<li>Ustawić przepływ na 15 μl/min, ścieżka przepływu Fc=1.</li>
		<li>Wstrzyknąć ligand B (kontrolny) do tej samej wartości RU, co ligand A. Monitoruj sensogram odejmowania (Fc=2-1) on-line, aby pomóc kontrolować długość wstrzyknięcia.</li>
		<li>Ustawić przepływ na 50 μl/min, ścieżkę przepływu Fc=1 i Fc=2, myć system przez 5-20 minut, aż linia podstawowa (Fc=2-1) się ustabilizuje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 3: Ślepa próba wstrzyknięcia. To wstrzyknięcie będzie służyć do odejmowania ślepej próby, dlatego uwzględnij wszystkie składniki, które zostaną wstrzyknięte z analitem, z wyjątkiem samego analitu. 
	UWAGA: Długość wtrysku może się różnić w zależności od czasu potrzebnego do osiągnięcia równowagi (plateau sygnału).
	<ol>
		<li>Ustawić przepływ na 15 μl/min, ścieżkę przepływu Fc=1 i Fc=2, Fc=2-1 odejmowanie.</li>
		<li>Wstaw polecenie "wait" (zwane dalej "wait") na 30 sekund (aby uzyskać stabilny punkt odniesienia).</li>
		<li>Wstrzyknąć 15 sekund RB. 
		UWAGA: Czas wstrzyknięcia będzie różny w różnych układach, w zależności od ich stałych kinetycznych przed równowagą (głównie ka).</li>
		<li>Poczekaj 120-600 sekund, aby zarejestrować fazę dysocjacji. 
		UWAGA: Długość tego kroku różni się w zależności od d : Im wolniejsza dysocjacja, tym dłuższy musi być ten krok. W przypadku bardzo wolno dysocjujących kompleksów (kd <10-4 sek-1), odczekaj 10-15 minut, a następnie przystąp do regeneracji powierzchni (patrz dalej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 4: Wstrzyknięcie analitu
	<ol>
		<li>Skopiuj/wklej dokładne warunki użyte w iniekcji referencyjnej (cykl 3), aby te dwa wstrzyknięcia można było później odjąć. Zmień położenie szczeliny w stojaku z tej, w której znajduje się roztwór kontrolny, na tę, w której znajduje się roztwór analitu. Wybierz stężenie, które jest nieco wyższe od oczekiwanego K.D. Jeśli nie masz wcześniejszej wiedzy, wybierz 1 μM jako dobry punkt wyjścia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 5: Wstrzykiwanie buforu
	<ol>
		<li>Powtórz cykl 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 6: Wstrzyknięcie analitu
	<ol>
		<li>Powtórz cykl 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cykl 7: Usuwanie wiórów
	<ol>
		<li>Ustawić przepływ na 50 μl/min.</li>
		<li>Wstrzyknij 350 mM EDTA przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Nie należy stosować jednorazowego wstrzyknięcia trwającego 3 minuty, ponieważ może to spowodować uszkodzenie chipa.</li>
		<li>Wstrzykiwać 0,25% SDS przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Nie należy stosować jednorazowego wstrzyknięcia trwającego 3 minuty, ponieważ może to spowodować uszkodzenie chipa.</li>
		<li>Jeśli poziom podstawowy nie zostanie osiągnięty, należy wstrzyknąć 100 mM HCl przez 1 minutę jako dodatkowy etap usuwania izolacji.</li>
		<li>Wstaw polecenie "zakończ bieg", które przełącza się w tryb czuwania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie wiórów
	<ol>
		<li>Odłącz chip czujnika i wyjmij go z urządzenia.</li>
		<li>Wyjmij czujnik z pochwy, unikaj dotykania powierzchni, spłucz DDW i umieść w probówce o pojemności 50 ml zawierającej RB. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych za pomocą wyznaczonego oprogramowania ewaluacyjnego
<ol>
	<li>Wykonaj następujące kroki, aby przetworzyć surowe dane uzyskane przez SPR przed wyprowadzeniem parametrów kinetycznych.
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania ewaluacyjnego otwórz plik z wynikami, wybierz cykle 3-6 Fc= 2-1 (odjęte dane referencyjne).</li>
		<li>Przesunięcie osi:
		<ol>
			<li>Cykle wyświetlania 3-6.</li>
			<li>Wyzeruj wartość osi Y linii bazowej (początkowy 30-sekundowy czas oczekiwania w każdym cyklu) do wszystkich czterech krzywych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyrównaj oś X czterech krzywych. Wybierz wyraźne cechy (np. skoki początku lub końca wtrysku), aby idealnie wyrównać cztery krzywe wzdłuż osi X. Ustawić czas uruchomienia analitu (lub bufora sterującego) na zero.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odejmowanie odwołań
	<ol>
		<li>Odejmij odpowiedź tła, odejmując krzywą cyklu 3 od krzywej cyklu 4 i krzywą cyklu 5 od krzywej cyklu 6. Użyj operacji odejmowania krzywych, którą można znaleźć w menu Przesunięcia osi Y. 
		UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok, ponieważ anuluje on wszelkie niespecyficzne składniki (niezwiązane z analitem), które mogły mieć wpływ na powierzchniowy współczynnik załamania światła.
		<ol>
			<li>Zapisz odjęte krzywe w arkuszu projektu pod inną nazwą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Krzywe te można nazwać "krzywymi podwójnie odejmowanymi": pierwsze odejmowanie to odejmowanie 2-1 wykonywane przy obu iniekcjach, a drugie to odejmowanie jednej krzywej od drugiej. 
		UWAGA: Takie podwójne odniesienie jest złotym standardem w eksperymentach SPR.</li>
		<li>Nałóż odjęte krzywe, wykonując przesunięcie osi, jak wyjaśniono wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie stałych kinetyki i dopasowanie modelu
	<ol>
		<li>Przeprowadzenie eksperymentu kinetycznego
		<ol>
			<li>Wstrzyknąć serię 6-7 stężeń analitu, aby uzyskać wiarygodne dane do wyznaczenia stałych kinetycznych. Wybierz stężenia analitu od 10-krotnie powyżej do 10-krotnie poniżej szacowanego K D, w 2-3-krotnych rozcieńczeniach. Uwzględnij stężenie "zerowe", później użyte do odejmowania podwójnego odniesienia (patrz wyżej). Wstrzyknięcia należy wykonywać trzykrotnie i w kolejności losowej.</li>
			<li>Wyrównaj i odejmij wszystkie krzywe względem osi Y i osi X przed przystąpieniem do dopasowania modelu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dopasowanie modelu
		<ol>
			<li>Wybierz odpowiedni program do analizy. 
			UWAGA: Większość dostępnych programów dopasowania oferuje kilka modeli, które można zastosować do dopasowania i wyznaczania stałych kinetycznych.</li>
			<li>Zastosować najprostszy model (Langmuira) zakładając odwracalną interakcję 1:1 między analitem a ligandem w celu dopasowania. O ile nie ma przekonujących danych z innych metod eksperymentalnych na istnienie bardziej złożonej interakcji, zawsze używaj prostego modelu Langmuira.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+a+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161(2012).</li>
<li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+RNA%E2%80%93protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li>
<li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
<li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li>
<li>Mol, N., Fischer, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMol%2C+N+%22Surface+Plasmon+Resonance+Vol.+627+Methods+in+Molecular+Biology%22">Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology</a>. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).</li>
<li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Merwe%2C+PA+%22Surface+plasmon+resonance.+Protein%E2%80%93+ligand+interactions%3A+hydrodynamics+and+calorimetry%22">Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry</a>. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

SPR jest bardzo czułą metodą badania oddziaływań molekularnych i często jest jedynym podejściem, które zapewnia monitorowanie w czasie rzeczywistym przejściowych (ale ważnych) interakcji. Przykładem jest przedstawione w niniejszym dokumencie oddziaływanie przejściowe, którego nie można było wykryć żadną inną metodą (testy pull-down, testy sedymentacji liposomów6). Co więcej, podczas gdy inne metody ograniczają się do pomiarów równowagi (zarówno ilościowych, jak i jakościowych), SPR jest jedną z niewielu techni...

Interakcje białko-białko (PPI); tworzenie i dysocjacja kompleksów białkowych, są kluczowymi zdarzeniami w wielu procesach biologicznych (np. replikacja, transkrypcja, translacja, sygnalizacja, komunikacja komórka-komórka). Półilościowe badania IPP są często przeprowadzane przy użyciu eksperymentów typu pull-down lub immunoprecypitacji. Jednak te (i podobne) techniki są ograniczone pod względem zakresu powinowactw, które można zmierzyć (niskie powinowactwo mikromolowe i wyższe powinowactwo) ze względu na etapy mycia, które są nieodłącznie związane z takimi technikami. Takie techniki "punktu końcowego" nie są w stanie zidentyfikować interakcji przejściowych lub o niskim powinowactwie, które często mają poważne konsekwencje biologiczne. Ponadto rozdzielczość czasowa takich podejść jest niezwykle ograniczona, zwykle o rzędy wielkości wolniejsza niż tempo reakcji. SPR przezwycięża te niedociągnięcia dzięki zwiększonej czułości i doskonałej rozdzielczości czasowej1,2. SPR jest metodą bezznacznikową i jako taka może być mierzona (o ile można wykryć zmiany masy). Oprócz PPI jest szeroko stosowany do charakteryzowania interakcji białko-ligand, białko-lek (lub mała cząsteczka), białko-DNA i białko-RNA 3-5. Wyniki są rejestrowane i wykreślane w czasie rzeczywistym, co umożliwia szybką modyfikację warunków eksperymentalnych i elastyczne projektowanie eksperymentów.
Fizyczna zasada działania instrumentów opartych na SPR polega na wykorzystaniu systemu optycznego, który mierzy zmianę współczynnika załamania światła na powierzchni czujnika przy zmianach masy 2. Jeden z oddziałujących partnerów (dalej ligand) jest unieruchomiony na chipie matrycy polimerowej, a druga cząsteczka (dalej analit) jest przepływana po powierzchni. Wiązanie analitu z ligandem zmienia masę na powierzchni chipa. Ta zmiana masy jest bezpośrednio i proporcjonalnie związana ze zmianami współczynnika załamania światła powierzchni. Wyniki są wykreślane w czasie rzeczywistym i prezentowane jako jednostki odpowiedzi (RU) w funkcji czasu. Taki wykres nazywa się sensogramem (np. Rysunek 1). Ponieważ SPR podąża za pełnym przebiegiem czasowym oddziaływania, oprócz powinowactwa równowagi wyprowadzane są stałe szybkości kinetycznej przed równowagą. Jak opisano poniżej, zachowanie danego układu przed równowagą zawiera wiele informacji i zapewnia zupełnie inną perspektywę niż sama równowaga. Po skalibrowaniu systemu eksperymenty są bardzo szybkie i wymagają jedynie niewielkich ilości materiału białkowego (ilości od mikrogramów do nanogramów). Zebranie pełnych informacji kinetycznych danego systemu można osiągnąć w ciągu kilku dni. Wysoka czułość SPR pozwala na pomiary, które nie są możliwe przy użyciu żadnej innej techniki 6. Jednak ta wysoka czułość jest "mieczem obosiecznym", ponieważ może być głównym źródłem fałszywych danych dodatnich. Każdy czynnik wpływający na wskaźnik odbicia jest rejestrowany i nanoszony na sensogram. W związku z tym należy zastosować odpowiednie kontrole w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich, a wsparcie w postaci podejść uzupełniających jest wysoce zalecane.
Rysunek 1 ilustruje postęp eksperymentu SPR przy użyciu chipa czujnika pokrytego NTA. Sensogram w panelu A pokazuje wstrzykiwanie jonów niklu przez matrycę NTA (dane nieodejmowane), a panele B-D wyświetlają dane po odjęciu sygnału pochodzącego z komórki kontroli ujemnej. Czerwone i niebieskie strzałki pokazują odpowiednio początek i koniec wtrysku. Unieruchomienie liganda na chipie stopniowo zmienia masę, aż do zakończenia wstrzykiwania. Stabilny plateau obserwowany po zakończeniu iniekcji liganda odzwierciedla stabilne powiązanie liganda z powierzchnią (ryc. 1B, cykl 2). Po osiągnięciu stabilnej linii podstawowej bufor jest wstrzykiwany na ligand i komórkę odniesienia (Rysunek 1B, cykl 3). To wstrzyknięcie służy jako "ślepa kontrola" i zostanie odjęte podczas analizy. Po wstrzyknięciu rejestrowane są drobne zmiany, odzwierciedlające przepływ masy przez chip. Następnie w oddzielnym cyklu (rysunek 1B, cykl 4) analit jest wstrzykiwany; stopniowy wzrost RU reprezentuje związek analitu z ligandem. Miejsca wiązania stają się stopniowo zajęte, aż do osiągnięcia równowagi. Gdy tylko iniekcja się zakończy, spadek RU odzwierciedla dysocjację kompleksu. Z takich sensogramów można wyprowadzić stałe szybkości równowagi wstępnej i równowagi (patrz dalej). Rysunek 1 przedstawia przejściowe oddziaływanie między ligandem a analitem. Gdy interakcja jest bardziej stabilna, spadek poziomu RU jest wolniejszy, co odzwierciedla niższy kd.
Tutaj opisujemy eksperyment SPR, którego celem jest scharakteryzowanie interakcji między transporterem błonowym (detergentem rozpuszczonym) a jego funkcjonalnym partnerem, pokrewnym białkiem wiążącym substrat 6,7. Wybrany model systemu to transporter kasety wiążącej ATP (ABC), ModBC-A firmy Archeaglobus fulgidus. System ten został wybrany ze względu na wysoką powtarzalność wyników, wysoki stosunek sygnału do szumu i klasyczne wskaźniki włączania / wyłączania. Ponadto dostępne są transportery ABC z homologacjami, które mogą służyć jako ważne kontrole negatywne. Transporter ModBC (ligand A) jest ekstrahowany z membrany za pomocą detergentu, oczyszczany i unieruchamiany na chipie. Jego rozpuszczalny partner oddziałujący, ModA, jest analitem. Jako ligand kontroli ujemnej stosuje się inny transporter ABC RbsBC ("ligand B").

<table><tbody><tr><td>Układ czujnika Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>NTA&nbsp;</td><td>Oprogramowanie GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td> Oprogramowanie <td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek niklu</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny wolframian sodu</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Bio-Lab Sp. z o.o.</td><td></td><td></td>19030591</tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylodiamino-tetraoctowego dwuwodna (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltopiranozyd (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dodecylosiarczanu sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy z nylonu (NY)</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>Transporter ABC</td><td>Laboratorium</td><td></td><td></td>Lewinson</tr><tr><td>RbsBC ABC transporter</td><td>Laboratorium</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LewinsonModA Białko wiążące substrat</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (spr)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Interakcje białko-białko są kluczowe dla większości, jeśli nie wszystkich, procesów fizjologicznych, a zrozumienie natury takich interakcji jest centralnym krokiem w badaniach biologicznych. Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to czuła technika detekcji do bezznacznikowego badania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W typowym eksperymencie SPR jeden składnik (zwykle białko, określany jako "ligand") jest unieruchomiony na powierzchni chipa czujnika, podczas gdy drugi ("analit") jest wolny w roztworze i jest wstrzykiwany na powierzchnię. Asocjacja i dysocjacja analitu od liganda są mierzone i wykreślane w czasie rzeczywistym na wykresie zwanym sensogramem, z którego wyprowadzane są dane dotyczące stanu równowagi i równowagi. Brak znaczników, zużywanie niewielkich ilości materiału i dostarczanie danych kinetycznych przed równowagą sprawia, że SPR jest metodą z wyboru podczas badania dynamiki oddziaływań białek. Należy jednak pamiętać, że ze względu na wysoką czułość metody, uzyskane dane muszą być dokładnie przeanalizowane i poparte innymi metodami biochemicznymi. 
SPR jest szczególnie odpowiedni do badania białek błonowych, ponieważ zużywa niewielkie ilości oczyszczonego materiału i jest kompatybilny z lipidami i detergentami. Protokół ten opisuje eksperyment SPR charakteryzujący właściwości kinetyczne interakcji między białkiem błonowym (transporterem ABC) a białkiem rozpuszczalnym (pokrewne białko wiążące substrat transportera).

W opisanym tutaj systemie chip NiNTA służy do unieruchomienia transportera błonowego z tagiem His 6,7. Ponieważ transporter ten jest homodimerem, każdy z nich posiada podwójny tag, co poprawia jego wiązanie z chipem NiNTA. Po załadowaniu niklu ligand A (badany transporter) jest unieruchamiany na Fc=2, aż do poziomu ~3,500 RU (cykl 2 protokołu, Rysunek 2A czarna etykieta). Następnie, przy zastosowaniu tego samego przepływu i czasu iniekcji, ligand B (ligand kontrolny) jest wstrzykiwany na Fc=1,...

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie interakcji receptora białkowego przy użyciu osocza powierzchniowego i rezonansu. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie jonów niklu na kwas nitrotrioctowy lub matrycę NT a. Następnie jedno z białek określanych mianem liganda jest unieruchamiane na chipie czujnika po ślepym wstrzyknięciu.Drugie białko zwane analitem jest wstrzykiwane na unieruchomiony ligand. Aby wykryć interakcję między dwoma białkami, wyniki pokazują, że te dwa białka oddziałują przejściowo, analit asocjuje i oddziela się od liganda. Powinowactwo interakcji można obliczyć na podstawie zmierzonych wskaźników dysocjacji i dysocjacji dwóch białek.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ściąganie lub immunoprecypitacja, jest to, że może ona identyfikować przejściowe lub niskie powinowactwo interakcji, które często mają poważne konsekwencje biologiczne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biochemii, takie jak to, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże się z innym białkiem lub inną małą cząsteczką, można określić charakter interakcji i zmierzyć powinowactwo. W celu przygotowania próbki należy usunąć wszys

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy zjawisko FRET pomiędzy sprzężonym polimerem polidiacetylenem (PDA) a fluorophorem przyczepionym do powierzchni liposomów PDA w celu detekcji biomolekuł. Liposomy PDA zawierały na swojej powierzchni cząsteczki receptorowe dla biomolekuł, które służyły jako sondy. Oddziaływania ligand-receptor prowadzą do zmian w efektywności FRET pomiędzy fluorophorem a PDA, co stanowi podstawę mechanizmu detekcji.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej fluorescencji

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Poznaj metodę SPR do badania interakcji białko-receptor w czasie rzeczywistym bez znakowania. Technika umożliwia pomiar powinowactwa i kinetyki wiązania białek.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Przeglądaj więcej filmów