Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie interakcji receptora białkowego przy użyciu osocza powierzchniowego i rezonansu. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie jonów niklu na kwas nitrotrioctowy lub matrycę NT a. Następnie jedno z białek określanych mianem liganda jest unieruchamiane na chipie czujnika po ślepym wstrzyknięciu.

Drugie białko zwane analitem jest wstrzykiwane na unieruchomiony ligand. Aby wykryć interakcję między dwoma białkami, wyniki pokazują, że te dwa białka oddziałują przejściowo, analit asocjuje i oddziela się od liganda. Powinowactwo interakcji można obliczyć na podstawie zmierzonych wskaźników dysocjacji i dysocjacji dwóch białek.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ściąganie lub immunoprecypitacja, jest to, że może ona identyfikować przejściowe lub niskie powinowactwo interakcji, które często mają poważne konsekwencje biologiczne. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biochemii, takie jak to, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wiąże się z innym białkiem lub inną małą cząsteczką, można określić charakter interakcji i zmierzyć powinowactwo. W celu przygotowania próbki należy usunąć wszystkie agregaty z oczyszczonego białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przygotować uruchomiony bufor i przefiltrować wszystkie i próbki białek za pomocą filtrów o temperaturze zerowej 22 mikronów. Upewnij się wcześniej, że filtry są kompatybilne z białkiem przed podłączeniem działającej butelki buforowej do wlotu pompy. Odłóż na bok 10 mililitrów buforu do pracy w osobnej tubie.

Następnie rozcieńczyć próbki w stosunku do uruchomionego buforu, aby uniknąć niezgodności buforu. Z reguły w celu stabilnej demobilizacji ligandów należy stosować niskie stężenia ligandów z dłuższymi wstrzyknięciami przy niskim przepływie, w przeciwieństwie do wysokich stężeń ligandów Przy krótszych iniekcjach przy wysokim przepływie Rozcieńczyć skoncentrowany zapas liganda do buforu roboczego do końcowego stężenia około 20 mikrogramów na mililitr. Na koniec rozcieńczyć analit w pracującym buforze do pożądanego stężenia.

W przypadku układu o nieznanym powinowactwie należy przetestować zakres stężeń analitu od 10 mikromoli do 10 anomolowców w dziesięciokrotnych rozcieńczeniach. W tej demonstracji ponownie wykorzystano chip sprzężony z NTA, odpowiedni do wychwytywania białek ze znacznikiem oli histydyny. Po wyjęciu przechowywanego chipa z bufora należy dokładnie spłukać wodą podwójnie destylowaną, delikatnie wysuszyć i umieścić w oryginalnej osłonie.

Aby zadokować chip na instrumencie SPR, otwórz drzwiczki chipa czujnika i umieść chip w jego osłonie. Zamknij drzwi i naciśnij chip stacji dokującej. Ustaw temperaturę ogniwa chipowego na 25 stopni Celsjusza.

Ustaw komorę na próbki na siedem stopni Celsjusza, aby białko było stabilne przez cały czas trwania eksperymentu. Po przygotowaniu roztworów do załadunku i strippingu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy napełnić instrument SPR buforem roboczym. W następnym kroku ustaw przepływ na 50 mikrolitrów na minutę.

Zdefiniuj ścieżki przepływu i odejmowanie odniesień, aby uzyskać opisane tutaj wyniki. Ustaw ścieżki do komórki przepływu numer jeden i komórki przepływu numer dwa oraz komórki przepływu numer jeden, odjętej od komórki przepływowej numer dwa, po wybraniu odpowiedniego stojaka na próbki, zapisz plik wyników przed rozpoczęciem eksperymentu, aby dane zostały zapisane podczas przebiegu. Każdy eksperyment składa się z cykli.

Prowadzić wyraźny zapis wstrzyknięć wykonanych w każdym cyklu i oddzielić ligandy ładujące ślepe wstrzyknięcie buforu i wstrzyknięcie analitu na różne cykle. Cykl pierwszy to przygotowanie wiórów i ładowanie niklu. Upewnij się, że przepływ i ścieżki są ustawione, a następnie wstrzyknij 350 milimolowy EDTA na jedną minutę, aby zmyć pozostałe cząsteczki.

Następnie ustaw przepływ na 10 mikrolitrów na minutę. Następnie wstrzyknąć 0,5 milimolowy chlorek niklu przez dwie minuty. Teraz żywica wiórowa jest pokryta jonami niklu.

Drugi cykl to unieruchomienie liganda. Ustaw przepływ na 15 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na komórkę przepływową. Po drugie, wstrzyknij ligand A, aż osiągniesz jednostkę odpowiedzi lub wartości R ru, które są od 10 do 20 razy większe od masy cząsteczkowej liganda.

Na przykład załaduj ligand o wartości 50 kilodaltonów do poziomu 501 000 ru. Prowadź rejestr osiągniętej wartości RU. Następnie ustaw przepływ na 15 mikrolitrów na minutę, a ścieżkę przepływu do komórki przepływowej numer jeden, wstrzyknij ligand kontrolny B do tej samej wartości RU, co ligand a, monitoruj odejmowanie, sensori Graham online, aby pomóc kontrolować długość wtrysku.

Następnie ustaw przepływ na 50 mikrolitrów na minutę, a ścieżkę przepływu na komórkę przepływową numer jeden i komórkę przepływową. Po drugie, kontynuuj mycie systemu przez pięć do 20 minut, aż linia podstawowa się ustabilizuje. Cykl trzeci to ślepa próba wtrysku.

To wstrzyknięcie będzie służyć do odejmowania ślepej próby. Dlatego należy uwzględnić wszystkie składniki, które zostaną wstrzyknięte wraz z analitem, z wyjątkiem samego analitu. Długość wtrysku może się różnić w zależności od czasu potrzebnego do osiągnięcia równowagi.

Ustaw przepływ na 15 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na komórkę przepływową numer jeden i komórkę przepływową numer dwa oraz komórkę przepływową numer jeden, odjętą od komory przepływowej. Po drugie, wprowadź polecenie wagi na 30 sekund, aby uzyskać stabilną linię bazową. Następnie wstrzyknij uruchomiony bufor na 13 sekund.

Odczekaj od 120 do 600 sekund, aby nagrać fazę dysocjacji. Długość tego kroku różni się w zależności od kd. Im wolniejsza dysocjacja, tym dłuższy musi być ten krok.

Cykl czwarty to wtrysk analitu. Skopiuj i wklej dokładnie te warunki, które zostały użyte w trzecim cyklu, aby te dwa wstrzyknięcia można było później odjąć. Zmień położenie szczeliny w stojaku z tej, w której znajduje się roztwór kontrolny, na tę, w której znajduje się roztwór analitu.

Wybierz stężenie, które jest nieco powyżej oczekiwanej stałej dysocjacji równowagi. Jeśli nie masz wcześniejszej wiedzy, wybierz jeden mikromolowiec jako dobry punkt wyjścia. Po wykonaniu wstrzyknięcia buforu i wstrzyknięcia analitu po raz drugi, wykonaj cykl siedmiu chipów.

Ustaw przepływ na 50 mikrolitrów na minutę, a następnie wstrzyknij 350 milimolowy EDTA na jedną minutę. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Nie należy stosować jednorazowego wstrzyknięcia trwającego trzy minuty, ponieważ może to spowodować uszkodzenie chipa.

Następnie wstrzyknij 0,25% siarczan sodu dcal na jedną minutę. Powtórz ten krok dwa razy. Nie należy stosować pojedynczego wstrzyknięcia trwającego trzy minuty, ponieważ może to spowodować uszkodzenie chipa po załadowaniu niklem, transporter będący przedmiotem zainteresowania jest unieruchomiony na komorze przepływowej numer dwa do 3 500 R rus.

Następnie, używając tego samego przepływu i czasu wstrzyknięcia, ligand kontrolny jest wstrzykiwany do komórki przepływowej numer jeden, początkowo osiągając tylko do 3000 R, aby upewnić się, że podobne ilości białka są unieruchomione na obu komórkach przepływowych. Ligand kontrolny jest dodatkowo ładowany z krótszym wtryskiem przy jednoczesnym monitorowaniu obciążenia do 3 500 RDU. Kształt schodów reprezentuje stopniowy wzrost masy na komorze przepływowej numer jeden po każdym wstrzyknięciu, pokazanej tutaj jest komórka przepływowa numer jeden, odjęta od komory przepływowej.

Po drugie, ważne jest, aby zmieniać czas wstrzyknięcia ligandów, aby uzyskać równomierne obciążenie. Natomiast czas wstrzyknięcia analitu musi być utrzymywany na stałym poziomie dla wszystkich stężeń stosowanych w celu uzyskania danych ilościowych. Wstrzykiwany jest szereg stężeń analitu.

Pokazano tutaj wtryski o różnych stężeniach analitu ze stałą długością wtrysku. Różne stężenia analitu są wstrzykiwane w kolejności losowej, a podwójnie ślepe sensoryczne gramy są wyrównywane na osi x przed analizą w celu wyprowadzenia powinowactwa i stałej szybkości. Stosowane jest dopasowanie modelu.

Obliczona stała dysocjacji równowagi dla interakcji mod BCA wynosi w przybliżeniu trzy razy 10 do minus sześciu molowców z umiarkowanie szybkim KA i szybkim KD Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu kilku godzin po obejrzeniu tego filmu. Powinieneś dobrze rozumieć, jak zaprojektować i przeprowadzić eksperyment SPR przy użyciu interesującego Cię białka