Name: Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj analizę RNA-Seq różnicowej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt po elektroporacji in ovo. Metoda obejmuje izolację RNA, sekwencjonowanie i bioinformatyczną analizę danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CYIY jest wspierany przez FAPESP (2012/14421-5), a FMV jest wspierany przez stypendium FAPESP (2009/53695-0). Dziękujemy Rdzeniowi Technologii DNA na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis za przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek RNA-Seq wykorzystanych w tej pracy, zespołowi Galaxy za dostarczenie doskonałego i darmowego interfejsu dla narzędzi do analizy danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości oraz dr Marianne Bronner za umożliwienie nam filmowania w jej przestrzeni laboratoryjnej.

1. Elektroportowanie interesującego konstruktu w cewkach nerwowych zarodków kurcząt HH12-13 In ovo
Użyj fluorescencyjnego reportera, najlepiej w transkryptze bicystronicznym lub połączonego z interesującym nas białkiem za pomocą interkalującego wirusowego peptydu2a 11, aby umożliwić szybką identyfikację osób z zadowalającym poziomem transfekcji. UWAGA: Typowy czas inkubacji na tym etapie wynosi około 48 godzin w temperaturze 37,8 °C.
<ol>
	<li>Otwórz małe okienko w jajach po wyjęciu 3 ml albuminy za pomocą strzykawki połączonej z igłą 18 G x 1 1/2. Aby poprawić wizualizację zarodka, wstrzyknij niewielką ilość tuszu indyjskiego rozcieńczonego w stosunku 1:50 do sterylnego roztworu Ringera pod zarodek1-4.</li>
	<li>Po pokryciu zarodka sterylnym roztworem Ringera, wstrzyknąć 10 mM roztwór Tris-HCl o pH 8,2 i 0,1% barwniku spożywczym (F, D & C) zawierający 2,5 μg/μl DNA przez tylny koniec cewy nerwowej, aż wypełni się do obszaru tyłomózgowia. Aby przeprowadzić elektroporację, należy ustawić elektrody platynowe (o średnicy 0,5 mm) oddalone od siebie o 4 mm1 wzdłuż obszaru bocznego i dostarczyć 5 impulsów o długości 50 ms i 20 V w odstępie 100 ms między nimi4.</li>
	<li>Po elektroporacji inkubuj zmanipulowane zarodki jeszcze przez 48 godzin, aż osiągną stadium HH23 i zidentyfikuj osoby wykazujące wysoki poziom transfekcji w okolicy bocznej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. 
	UWAGA: Czas trwania inkubacji po elektroporacji zależy od celu eksperymentu. Elektroporowane plazmidy mogą generować znaczne poziomy ekspresji po 2 godzinach2. Tak więc, jeśli zainteresowanie leży w genach o wczesnym początku, okres inkubacji po elektroporacji może zostać skrócony.</li>
</ol>
2. Zbierz pomyślnie transfekowane zarodki i przeprowadź sekcję połówek rdzenia kręgowego poddanych elektroporacji
UWAGA: Ta procedura trwa od 2 do 3 godzin na każde 10 zarodków i daje 1-2 μg całkowitego RNA na zarodek. Preparacja cew nerwowych wymaga precyzyjnych ruchów i może być konieczne kilka sesji ćwiczeń przed zastosowaniem jej do próbek eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Odkazić metalowe narzędzia do preparacji roztworem do odkażania RNazy lub przez pieczenie w temperaturze 150 °C przez 4 godziny12 i przygotować PBS poddane działaniu DEPC. Używaj tylko nowych certyfikowanych wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz. 
	UWAGA: Po zbiorach ważne jest, aby przestrzegać standardowej pielęgnacji, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą podczas sekcji.</li>
	<li>Zbierz zarodki za pomocą cienkich nożyczek do preparowania i przesianej łyżki do zbierania. Przechowywać zarodki w zimnym PBS poddanym działaniu DEPC na 100 mm szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety wyciąć cały obszar boczny (między tylną granicą zawiązka kończyny przedniej a przednią granicą zawiązka kończyny tylnej) i przenieść ten odcinek do nowego naczynia zawierającego PBS poddanego działaniu zimnego DEPC.</li>
	<li>Użyj dwóch cienkich szklanych igieł, aby przebić się w trzech różnych punktach po każdej grzbietowo-bocznej stronie zarodka między cewą nerwową a mezodermą przyosiową.</li>
	<li>Wprowadź dwie szklane igły do centralnej perforacji i powoli odsuń jedną z nich wzdłuż osi przednio-tylnej cewy nerwowej. Powtórz to dla perforacji, do których nie dotarły pierwsze ruchy. Usuń oderwaną mezodermę przyosiową za pomocą cienkiej pęsety.</li>
	<li>Obróć zarodek na bok, włóż końcówki pęsety między cewę nerwową a strunę grzbietową i przesuń je w przeciwnych kierunkach wzdłuż osi przednio-tylnej, aby rozdzielić dwie struktury. 
	UWAGA: Powinno to również usunąć większość mezodermy nadal przyczepionej do cewy nerwowej.</li>
	<li>Jeśli to konieczne, usuń wszelkie większe kawałki tkanki mezodermicznej, które pozostają przyczepione, ciągnąc pęsetą, lekko przytrzymując rurkę nerwową inną parą pęset. Po zakończeniu delikatnie przenieś rurkę neuronową do innego naczynia zawierającego PBS poddanego zimnej obróbce DEPC, używając szklanej pipety Pasteura bez RNaz połączonej z ręczną pompką do pipet i trzymaj na lodzie, aż wszystkie probówki zostaną wycięte.</li>
	<li>Podziel cewy nerwowe na dwie połowy. W tym celu włóż ostrą końcówkę zamkniętej pęsety do światła i otwórz płytę dachową, wysuwając przez nią pęsetę. Następnie oddziel połówki, przecinając płytę podłogową końcówkami pęsety.</li>
	<li>Oddzielić wyładowane elektrolacją połówki od nieelektroporowanych połówek pod fluorescencyjnym lunetą sekcyjną i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej lodowatym PBS poddanym działaniu DEPC. W razie potrzeby delikatnie potrząśnij mikroprobówkami, aby uwolnić wszelkie tkanki przyczepione do plastikowych ścianek i pobudzić sedymentację probówek.</li>
	<li>Wirować w tempie 100 x g przez 3 sekundy i bardzo powoli usunąć jak najwięcej PBS za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Zrób to, patrząc na źródło światła, które świeci przez mikrorurkę, aby monitorować, czy jakikolwiek materiał embrionalny jest zasysany do końcówki pipety; Jeśli tak się stanie, powoli rozładowuj i powtórz wirowanie.</li>
	<li>Dodać 70 μl roztworu do lizy do ekstrakcji RNA na połowę rurki nerwowej i przesunąć probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i energicznie wirować. Powtórz 5-minutową inkubację i wirowanie jeszcze dwa razy. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zbierz co najmniej osiem połówek cewy nerwowej na próbkę, aby zapewnić odpowiednią wydajność do następnego kroku. Zebrać mniejsze próbki, jeśli wymaganych jest kilka sesji elektroporacji/preparacji, aby zgromadzić wystarczającą liczbę cewek nerwowych. Przechowywać wystarczającą ilość próbek do duplikatów lub potrójnych próbek dla każdego warunku.</li>
</ol>
3. Oczyść RNA i przygotuj biblioteki do sekwencjonowania Illumina
<ol>
	<li>Wyjąć próbki z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie na 15-30 minut. Wznowić rozmrażanie w temperaturze pokojowej aż do zakończenia.</li>
	<li>Dobrze odwirować i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Ponownie odwirować i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę, aby uzyskać nierozpuszczalny materiał.</li>
	<li>Przenieś supernatant do nowej probówki i przystąp do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji zestawu do całkowitej izolacji RNA. Elutować w minimalnej zalecanej objętości w celu zwiększenia stężenia. 
	UWAGA: Zaleca się leczenie DNazą po oczyszczeniu, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia sekwencji genomowego DNA w zestawach danych RNA-Seq.</li>
	<li>Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i usunąć 5 μl w celu analizy kontroli jakości. Pozostałą próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania biblioteki; próbki te należy rozmrażać tylko raz, aby uniknąć degradacji RNA.</li>
	<li>Uruchom oczyszczone RNA w przyrządzie do bioanalizatora za pomocą zestawu RNA 6000 Nano; Aby kontynuować, wartość RIN musi być co najmniej wyższa niż 7.</li>
	<li>Generuj biblioteki za pomocą zestawu do przygotowywania bibliotek RNA-Seq kompatybilnego z Illumina i multipleksuj do 4 bibliotek na jednym torze zestawu instrumentów HiSeq, aby generować pojedyncze odczyty 100 bp. Jeśli to możliwe, uwzględnij wszystkie próbki w tym samym przebiegu, aby zminimalizować potencjalne artefakty techniczne. 
	UWAGA: Powinno to dać do 50 milionów odczytów na próbkę, co jest więcej niż wystarczające do uzyskania pokrycia dla większości genów13.</li>
</ol>
4. Porównaj zestawy danych sekwencyjnych RNA na serwerze publicznym Galaxy10.
UWAGA: Przestrzeń dyskowa serwera jest ograniczona i eksperymenty porównujące wiele próbek mogą wymagać usunięcia plików pośrednich wygenerowanych w krokach filtrowania.
<ol>
	<li>Utwórz konto użytkownika na publicznym serwerze Galaxy (<a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a>) i prześlij na FTP zestawy danych Illumina w formacie fastq.</li>
	<li>Przygotuj przesłane pliki za pomocą narzędzia FastqGroomer14 w menu NGS:QC i manipulacji; jeśli wyniki jakości są już zakodowane w Phred+33 (Sanger), pomiń ten krok, po prostu zmieniając typ pliku na fastqsanger w obszarze Atrybuty dla każdego zestawu danych.</li>
	<li>Analizuj ogólną jakość każdego zestawu danych za pomocą narzędzia FastQC w menu NGS:QC i manipulacji. 
	UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na wynikową grafikę dla jakości sekwencji podstawowej i zawartości sekwencji podstawowej, ponieważ dostarczą one szacunków dla parametrów używanych do przycinania końców odczytów.</li>
	<li>Trim odczytuje, aby odrzucić końce 3' z danymi o niskiej jakości za pomocą narzędzia FASTQ Quality Trimmer14 w menu NGS:QC i manipulacji. Ustaw narzędzie tak, aby przetwarzało tylko 3-calowe końce, aby uzyskać wynik jakości poniżej 20.</li>
	<li>Usuń sekwencje adapterów z odczytów za pomocą narzędzia Clip (<a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a>) w menu NGS:QC i manipulacja. Ustaw narzędzie tak, aby odrzucało odczyty, których pozostało mniej niż 45 punktów bazowych, wprowadź sekwencję używanego adaptera i wybierz wyjście, aby uwzględnić zarówno sekwencje przycięte, jak i nieprzycięte. Ponadto zdecyduj się nie odrzucać sekwencji z nieznanymi zasadami, ponieważ większość zasad niskiej jakości została już usunięta w ostatnim kroku.</li>
	<li>Korzystając z narzędzia Trim sequences (<a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a>) w menu NGS:QC i manipulacji, przytnij pierwsze bazy odczytów, aby usunąć odchylenie sekwencji 5' wykryte przez FastQC (zwykle 10). 
	UWAGA: W tym momencie dobrym pomysłem jest ponowne uruchomienie FastQC i porównanie z poprzednią analizą, aby określić, czy jakość zestawu danych uległa poprawie.</li>
	<li>Pobierz i rozpakuj najnowszy zestaw genomu kurczaka dla przeglądarki genomu UCSC z Illumina iGenomes (<a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a>) i prześlij plik w formacie fasta całego genomu oraz plik w formacie gtf adnotacji genów do historii galaktyki za pomocą narzędzia Prześlij plik w menu Pobierz dane.</li>
	<li>Mapa odczytuje dla każdej próbki genom kurczaka za pomocą nakładki TopHat215 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz użyć genomu z Historii (wybierz plik fasta przesłany w kroku 4.7).</li>
	<li>Zbuduj przewidywany transkryptom dla każdej próbki za pomocą spinek do mankietów16 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz używać adnotacji referencyjnej jako przewodnika (wybierz plik gtf przesłany w kroku 4.7) i włącz opcje Wykonaj korekcję odchyleń (z Historii, fasta plik z kroku 4.7) i Użyj poprawności wielokrotnego odczytu.</li>
	<li>Scal przewidywane transkryptomy dla wszystkich próbek za pomocą Cuffmerge16 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz użyć adnotacji referencyjnej (plik gtf z kroku 4.7) i danych sekwencji (z Historii, pliku fasta z kroku 4.7).</li>
	<li>Porównaj pliki BAM wygenerowane przez TopHat2 dla każdej próbki za pomocą Cuffdiff16 w menu NGS: Analiza RNA. W polu Transkrypcje wybierz scalony transcriptom wygenerowany przez Cuffmerge i włącz opcje Wykonaj korekcję stronniczości (z Historii, fasta plik z kroku 4.7) i Użyj poprawnego odczytu wielokrotnego.</li>
	<li>Tabele testowe wyrażeń różnicowych można sortować numerycznie rosnąco w kolumnie 13 (wartość q) za pomocą narzędzia Sortuj w menu Filtruj i sortuj. 
	UWAGA: Geny/transkrypty wykazujące znaczącą różnicę ekspresji między warunkami eksperymentalnymi będą miały najniższe wartości q.</li>
	<li>Aby wizualnie sprawdzić wyniki za pomocą wykresów pokrycia, najpierw przekonwertuj pliki BAM do formatu bedGraph za pomocą narzędzia Utwórz wykres BedGraph pokrycia genomu17 w menu BEDTools. Wyłącz raportowanie regionów bez zasięgu, wybierz traktowanie wpisów splicingu jako odrębnych interwałów i skaluj pokrycie o czynnik, który normalizuje głębokość sekwencjonowania dla wszystkich porównywanych zestawów danych.</li>
	<li>Przekonwertuj wynikowy plik bedGraph na format bigWig za pomocą narzędzia Wig/BedGraph-to-bigWig (<a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a>) w menu Konwertuj formaty. Prześlij pliki bigwig jako niestandardowe ścieżki w przeglądarce genomu UCSC (<a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a>) dla zestawu galGal4 i wyszukaj interesujący Cię gen, aby zwizualizować pokrycie w zestawach danych.</li>
</ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+approaches+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo.</a> Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).</li>
<li>Ghadge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+wild-type+SOD1+and+FALS-linked+mutant+SOD1+cause+neural+cell+death+in+the+chick+embryo+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord.</a> Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).</li>
<li>Megason, S. G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mitogen+gradient+of+dorsal+midline+Wnts+organizes+growth+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS.</a> Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.</li>
<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).</li>
<li>Cloonan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+transcriptome+profiling+via+massive-scale+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing.</a> Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy+Team.+Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86(2010).</li>
<li>Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+viral+2A+peptide+for+bicistronic+expression+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.</a> BMC Biol. 6, 40(2008).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning.+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+coverage+and+depth+of+transcriptome+by+RNA-Seq+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens.</a> BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).</li>
<li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), 36(2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+chicken+Scratch2+is+expressed+in+a+subset+of+early+postmitotic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors.</a> Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li>
<li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth.+Differ%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).</li>
<li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).</li>
<li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 141(2009).</li>
<li>Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+novel+players+in+the+cranial+neural+crest+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network.</a> Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy efektów po elektroporacji rdzenia kręgowego kurczaka. Chociaż elektroporacja wektorów DNA jest częściej stosowana do nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, można również użyć konstruktów kodujących dominujące negatywy, białka quimeryczne lub prekursory siRNA do generowania warunków knock-down funkcji genów19-21. W rzeczywistości porównanie profili transkryptomu wynikające zarówno z analizy wzmocnienia, jak i utraty funkcji może wskazać gen...

Badania genetyczne na żywych organizmach często wykorzystują zarodek kurczaka jako model, ponieważ elektroporacja in ovo stanowi szybki i tani sposób na częściowe transfekowanie struktur embrionalnych in vivo za pomocą konstruktów DNA1-5. Dwustronowe wektory ekspresyjne, które kodują jeden transkrypt zawierający fluorescencyjny reporter wraz z genem będącym przedmiotem zainteresowania, takie jak pCIG6 lub pMES7, umożliwiają szybką weryfikację jakości transfekcji w pożądanym regionie pod mikroskopem stereoskopowym przed przetworzeniem zarodków do dalszej analizy.
Dzięki najnowszym postępom w sekwencjonowaniu DNA, teraz możliwe jest uzyskanie cyfrowych profili ekspresji całego transkryptomu z próbek RNA za pomocą RNA-Seq8,9. Dlatego zamiast czasochłonnych metod, które umożliwiają równoległą analizę tylko kilku produktów genowych, takich jak hybrydyzacja in situ, immunohistochemia i qPCR, przygotowanie bibliotek cDNA do sekwencjonowania wysokoprzepustowego może dostarczyć informacji o całym transkryptomie. Obserwacja eksperymentalnego wpływu na poziomy ekspresji każdego pojedynczego genu może z kolei dostarczyć potężnych informacji na temat szlaków zmienionych przez zastosowany konstrukt. Jest to szczególnie łatwe, jeśli dostępny jest zestaw genomowy dla użytego organizmu, a zatem zarodek pisklęcia jest ponownie odpowiednim modelem.
Jeśli użytkownik ma dostęp do wiarygodnego centrum sekwencjonowania genomu, głównym problemem jest uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA. W niniejszej pracy przedstawiono metodę uzyskiwania próbek RNA z transfekowanych rurek neuronowych odpowiednich dla RNA-Seq, a także dalsze etapy analizy in silico otrzymanych zestawów danych. Po elektroporacji w HH12-13, a następnie 48-godzinnej inkubacji, transfekowane połówki rdzenia kręgowego tułowia zostały wycięte w warunkach wolnych od rybonukleazy, natychmiast poddane lizie i dalej chronione przed degradacją przez ultra niskie zamrażanie do czasu oczyszczenia RNA i przygotowania biblioteki.
Publiczny serwer Galaxy10 zapewnia dostęp do darmowych zasobów do analizy danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ilość miejsca oferowana dla zarejestrowanych użytkowników jest wystarczająca do przeprowadzania małych eksperymentów, eliminując w ten sposób potrzebę korzystania z lokalnej infrastruktury obliczeniowej. Analiza danych RNA-Seq obejmuje filtrowanie, dopasowywanie i kwantyfikację/porównywanie ekspresji genów. Chociaż istnieją ogólne wytyczne dotyczące analizy danych RNA-Seq, parametry filtrowania będą w dużej mierze zależeć od jakości sekwencjonowania i powinny być określone po analizie kontroli jakości surowych danych.
Ten protokół opisuje kroki do uzyskania i porównania profili RNA-Seq z rdzenia kręgowego kurczaka transfekowanego in vivo. W rezultacie reprezentatywny wynik porównanie zbiorów danych uzyskanych z dwóch niezależnych próbek kontrolnych transfekowanych pustym wektorem wykazało, że metoda jest odtwarzalna i powinna umożliwić identyfikację transkryptów o zróżnicowanej ekspresji w próbkach doświadczalnych. W związku z tym zastosowanie tej metody ma potencjał, aby znacznie zwiększyć liczbę odkryć po jednym eksperymencie, a tym samym dostarczyć dużego zestawu danych do późniejszych badań.

<table><tbody><tr><td>Atrament indyjski</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 igły</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Niebieski 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Barwnik spożywczy używany do wizualizacji</td></tr><tr><td>roztworu Ringera do wstrzykiwań DNA (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7,2 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.225 g CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,02 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O do 800 ml i dostosować pH do 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O do 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Filtr i autoklaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (roztwór buforowany fosforanem) (1 l)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 8 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1,15 g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O do 800 ml i dostosować pH do 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O do 1 L i filtr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1 ml DEPC (Dietylopirowęglan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Wstrząśnij energicznie i odstaw na noc w temperaturze</td><td></td><td></td><td></td> pokojowej</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Autoklaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łyżka do przesiewania</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki Petriego z polityrynu 60 x 15 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odkażania RNaz RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne z cienkim czubkiem</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta prosta z drobnym czubkiem</td><td>Dowolna dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciągnięta szklana igła wykonana ze szklanych kapilar o wymiarach 1,1 x 75 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9-calowa szklana pipeta Pasteura</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczna pompa do pipet</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste probówki polipropylenowe do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie RNAlater do stabilizacji RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA RNAwodny</td> Life <td>Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Etanol klasy</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Elektroforeza Instrument do bioanalizatora</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek RNA Truseq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza rna-seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo elektroporacja cewy nerwowej pisklęcia jest szybką i tanią metodą identyfikacji funkcji genu podczas rozwoju neuronalnego. Analiza całego genomu transkryptów o zróżnicowanej ekspresji po takiej eksperymentalnej manipulacji może potencjalnie odkryć prawie kompletny obraz dalszych skutków spowodowanych przez transfekowany konstrukt. W pracy opisano prostą metodę porównywania transkryptomów z próbek transfekowanych embrionalnych rdzeni kręgowych, obejmującą wszystkie etapy między elektroporacją a identyfikacją transkryptów o zróżnicowanej ekspresji. Pierwszy etap składa się z wytycznych dotyczących elektroporacji oraz instrukcji dotyczących preparacji transfekowanych połówek rdzenia kręgowego z zarodków HH23 w środowisku wolnym od rybonukleazy oraz ekstrakcji wysokiej jakości próbek RNA nadających się do sekwencjonowania transkryptomu. Kolejnym etapem jest analiza bioinformatyczna wraz z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi filtrowania i porównywania zestawów danych RNA-Seq na publicznym serwerze Galaxy, co eliminuje potrzebę lokalnej struktury obliczeniowej dla eksperymentów na małą i średnią skalę. Reprezentatywne wyniki pokazują, że metody preparacji generują wysokiej jakości próbki RNA i że transkryptomy uzyskane z dwóch próbek kontrolnych są zasadniczo takie same, co jest ważnym wymogiem dla wykrycia genów o zróżnicowanej ekspresji w próbkach eksperymentalnych. Ponadto podano jeden przykład, w którym eksperymentalna nadekspresja konstruktu DNA może być wizualnie zweryfikowana po porównaniu z próbkami kontrolnymi. Zastosowanie tej metody może być potężnym narzędziem ułatwiającym nowe odkrycia dotyczące funkcji czynników nerwowych zaangażowanych we wczesny rozwój rdzenia kręgowego.

Aby zwalidować opisaną metodę, przygotowano dwie próbki kontrolne z embrionów elektroporowanych pustym wektorem pMES7 oraz jedną próbkę z embrionów transfektowanych tym samym wektorem zawierającym konstrukt insercyjny SCRT2-ZNF, który koduje domeny zink-finger kurzego białka SCRT218. Próbki zawierające od 11-22 µg całkowitego RNA uzyskano z pul 8 do 12 embrionów. Wszystkie trzy próbki uzyskały optymalną wartość RIN wynoszącą 10 w kontroli jakości przeprowadzonej za pomocą urządzenia Bioanalyzer (<st...

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena poziomów ekspresji wszystkich genów i próbek z elektroporowanych zarodków rdzenia kręgowego piskląt. Osiąga się to poprzez najpierw in ovo, pobranie prawej strony wczesnych embrionalnych cew nerwowych i ponowną inkubację zarodków do pożądanego etapu. Drugim krokiem procedury jest wypreparowanie pomyślnie przetransfekowanych połówek cewy nerwowej w środowisku wolnym od RNA i przystąpienie do lizy tak szybko, jak to możliwe.Trzecim krokiem jest wyizolowanie RNA i poddanie próbek przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Ostatnim krokiem jest przetworzenie zestawów danych w celu usunięcia artefaktów sekwencjonowania. Mapuj rasy do genomu i przypisz poziomy ekspresji do każdego genu.Ostatecznie wyniki mogą wykazać geny o zróżnicowanej ekspresji poprzez porównanie poziomów ekspresji w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako rozwarstwienie rurki nerwowej. Kroki są trudne do nauczenia, ponieważ wymagamy znajomości manipulacji zarodkami.W celu tej demonstracji zarodki zostały przekształcone za pomocą konstruktu eksprymującego GFP w cewie nerwowej. Przygotuj się

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Poznaj analizę RNA-Seq różnicowej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt po elektroporacji in ovo. Metoda obejmuje izolację RNA, sekwencjonowanie i bioinformatyczną analizę danych.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów