Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji
1 listopada 2014
Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena poziomów ekspresji wszystkich genów i próbek z elektroporowanych zarodków rdzenia kręgowego piskląt. Osiąga się to poprzez najpierw in ovo, pobranie prawej strony wczesnych embrionalnych cew nerwowych i ponowną inkubację zarodków do pożądanego etapu. Drugim krokiem procedury jest wypreparowanie pomyślnie przetransfekowanych połówek cewy nerwowej w środowisku wolnym od RNA i przystąpienie do lizy tak szybko, jak to możliwe.
Trzecim krokiem jest wyizolowanie RNA i poddanie próbek przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Ostatnim krokiem jest przetworzenie zestawów danych w celu usunięcia artefaktów sekwencjonowania. Mapuj rasy do genomu i przypisz poziomy ekspresji do każdego genu.
Ostatecznie wyniki mogą wykazać geny o zróżnicowanej ekspresji poprzez porównanie poziomów ekspresji w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie jako rozwarstwienie rurki nerwowej. Kroki są trudne do nauczenia, ponieważ wymagamy znajomości manipulacji zarodkami.
W celu tej demonstracji zarodki zostały przekształcone za pomocą konstruktu eksprymującego GFP w cewie nerwowej. Przygotuj się na spędzenie dwóch godzin na pracy na maksymalnie 10 zarodkach, aby zebrać od jednego do dwóch mikrogramów całkowitego RNA na zarodek. W RNA, w warunkach wolnych, zbierz zarodki za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i łyżki do pobierania SVE, przenieś każdy zarodek do zimna.
Traktowany DEPC. PBS zastosował rozwiązanie dla wszystkich etapów izolacji cewy nerwowej, postępując przy użyciu cienkiej pęsety, aby usunąć cały obszar boku zarodka między zawiązkami kończyn. Przenieś tę sekcję do świeżego zimnego roztworu tkanką grzbietową stroną do góry.
Użyj dwóch cienkich szklanych igieł, aby przebić trzy miejsca na każdej grzbietowej bocznej stronie zarodka między cewą nerwową a mezodermą parialną. Teraz wprowadź dwie szklane igły do centralnej perforacji i rozsuń je wzdłuż osi AP. Zrób to przez każdą perforację w razie potrzeby, aby ostatecznie oderwać mezodermę paralną, usunąć i wyrzucić tę tkankę.
Następnie obróć zarodek na bok i wprowadź końcówki dwóch pęset między cewę nerwową a pępowinę. Rozsuń je wzdłuż osi AP, aby podzielić konstrukcje. Zakończ usuwanie większych kawałków tkanki meder z cewy nerwowej, delikatnie zabezpieczając ją pęsetą, jednocześnie usuwając nadmiar mezodermy.
Następnie delikatnie przenieś cewę nerwową do świeżego zimnego roztworu. Za pomocą szklanej pipety z ręczną pompką zbierz wszystkie potrzebne rurki nerwowe i trzymaj je na lodzie przed kontynuowaniem. Teraz podziel każdą z cewek nerwowych na dwie połowy.
Włóż pęsetę z ostrą końcówką do światła i przebij płytę dachową. Następnie za pomocą pęsety przeciąć płytę podłogową i podzielić tkankę na pół. Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego posortuj elektroporowane połówki od nieelektroporowanych.
Przenieś posortowane połówki cewy nerwowej do 1,5 mililitrowej rurki ze świeżym roztworem. Przesuń te rurki, aby cała tkanka opadła na dno. Następnie przez kilka sekund obracaj rurki z prędkością 100 GS.
Następnie bardzo ostrożnie w jasnym świetle zassać snat. Jeśli tkanka zostanie pobrana, powoli ją wysuń i powtórz wirowanie. Gdy połówki cewy neuronowej zostaną oczyszczone z roztworu, dodaj 70 mikrolitrów na rurkę neuronową, połowę buforu do lizy do probówki.
Przesuń probówkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 15 minut co pięć minut, energicznie wiruj probówkę i kontynuuj zbieranie RNA w celu oczyszczenia RNA Do sekwencjonowania należy mieć co najmniej osiem połówek rurki nerwowej na próbkę. Inne kolekcje cew neuronowych przechowywanych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza mogą być łączone w kolekcji. Zacznij od rozmrażania ich na lodzie przez 15 do 30 minut, a następnie zakończ rozmrażanie w temperaturze pokojowej.
Po rozmrożeniu energicznie zwiruj wszystkie próbki i pozostaw je na pięć minut. Następnie ponownie zwirować próbki i odwirować je w temperaturze 15 000 GS przez jedną minutę. Aby pozbyć się nierozpuszczalnego materiału, przenieś supernatant do nowej probówki i kontynuuj ekstrakcję.
Korzystając z zestawu do izolacji RNA, zakończ proces, unikając RNA w największym możliwym stężeniu. Ten protokół wymaga konta na stronie internetowej Galaxy, aby zapewnić wymagany limit miejsca. Po pierwsze, FTP przesyła pliki FASTQ do witryny, chyba że wyniki jakości są już zakodowane w Shred plus 33.
Najpierw przygotuj przesłane zestawy danych za pomocą narzędzia FASTQ groomer w menu NGS QC and Manipulation. W przeciwnym razie w obszarze atrybuty zmień typ pliku na nadawcę FASTQ. Następnie, w menu NGS QC and Manipulation (Kontrola jakości i manipulacja NGS), użyj narzędzia FAST QC, aby przeanalizować ogólną jakość zestawów danych.
Wybierz trymer jakości FASTQ w tym samym menu, aby odrzucić trzy główne końcówki, które są niskiej jakości. Należy przetworzyć wynik jakości 20 lub wyższy. Teraz przejdź do narzędzia klipu w tym samym menu.
Ustaw to narzędzie tak, aby odrzucało odczyty z mniej niż 45 parami zasad. Wprowadź sekwencję adaptera. Wyłącz opcję odrzucania odczytów z nieznanymi podstawami i wybierz dane wyjściowe, aby uwzględnić sekwencje przycięte i nieprzycięte.
Kontynuuj korzystanie z narzędzia do przycinania sekwencji. Użyj go, aby przyciąć pierwsze bazy odczytu w celu usunięcia odchylenia pięciu sekwencji głównych, które jest wykrywane przez FAST qc. Następnym krokiem jest pobranie i rozpakowanie najnowszego zestawu genomu kurczaka ze strony genomu Illumina I.
Następnie prześlij plik w formacie Entire Genome Faster Format i plik w formacie GTF z adnotacją genu do Historii Galaktyki. Teraz zmapuj odczyty dla każdej próbki do genomu, uzyskując dostęp do menu analizy N-G-S-R-N-A i wybierając narzędzie top hat two. Wybierz przesłany plik fasta z Historii Galaktyki jako genom referencyjny.
Następnie wybierz narzędzie do spinek do mankietów w tym samym menu, aby zbudować przewidywany transkryptom. Dla każdego przykładu wybierz plik GTF, który ma być używany jako przewodnik adnotacji referencyjnej. Wybierz opcję Wykonaj korekcję odchylenia przy użyciu pliku FASTA dla danych sekwencji i włącz opcję Użyj korekcji wielokrotnego odczytu.
Następnie połącz wszystkie transkryptomy montażowe za pomocą narzędzia do scalania mankietów. Za pomocą tego narzędzia wybierz plik GTF dla adnotacji referencyjnej i plik FASTA dla danych sekwencji. Teraz porównaj pliki BAM wygenerowane przez cylinder two dla każdej próbki za pomocą narzędzia TIFF mankietu, które nadal znajduje się w menu analizy RNA.
W polu transkrypcje wybierz transkryptom scalania wygenerowany przez scalanie mankietów i włącz opcje. Użyj korekcji wielokrotnego odczytu i wykonaj korekcję odchylenia przy użyciu pliku FASTA dla danych sekwencji. Następnym krokiem jest posortowanie tabel różnicowych Korzystając z kolumny Wartość Q, wybierz narzędzie sortowania z menu filtrów i sortowania.
Sekwencje ze znaczącą różnicą między warunkami eksperymentalnymi będą miały najniższe wartości Q w kolumnie 13. Teraz spójrz na wykresy zasięgu. Najpierw przekonwertuj pliki BAM na pliki wykresu łóżka za pomocą narzędzia do konwersji w menu narzędzi łóżka w opcjach, wyłącz raportowanie regionów bez pokrycia i wybierz traktowanie wpisów splicingowych jako odrębnych interwałów.
Przeskaluj również pokrycie według współczynnika, który normalizuje wszystkie pokrycia w eksperymencie. Następnie przekonwertuj wynikowy plik wykresu łóżka na format dużej peruki za pomocą narzędzia w menu konwersji formatów i prześlij plik dużej peruki jako niestandardową ścieżkę na serwer UCSE. Na stronie przeglądarki genomu USCS użyj czterech zestawów GAL i wyszukiwań genów w celu wizualnego pokrycia zestawów danych przy użyciu opisanych metod Rurki neuronowe wyrażające puste wektory PS zostały zebrane dla ich RNA.
Zostało to zrobione w dwóch egzemplarzach, a uzyskany RNA był bardzo wysokiej jakości z optymalną wartością RIN 10, zgodnie z oczekiwaniami. Globalne porównanie transkryptomów zduplikowanych pustych kontroli wektorowych nie wykazało wyraźnej różnicy, a współczynnik korelacji Pearsona wynosił punkt 99. Nastąpił również wyraźny wzrost liczby odczytów zmapowanych do sekwencji genu scratch two w próbce eksperymentalnej wyrażającej domeny dwóch palców cynkowych scratch
.W związku z tym metody były wystarczająco czułe, aby wykryć przewidywane wzbogacenie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować embrionalną rurkę nerwową i dobrze zrozumieć, jak przetwarzać i porównywać zestaw danych IC w celu znalezienia genów o zróżnicowanej ekspresji, postępując zgodnie z krokami analizy krzemu w sekcji czwartej protokołu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To wideo demonstruje procedurę analizy całej transkryptomu próbek rdzenia kręgowego z embrionów piskląt po elektroporacji in ovo. Metoda ma na celu ocenę poziomów ekspresji genów w elektroporowanych rdzeniach kręgowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ekspresja genów
- Biologia rozwoju
Tło
- Analiza całej transkryptomu zapewnia wgląd w ekspresję genów.
- Elektroporacja in ovo to technika stosowana do transfekcji tkanek embrionalnych.
- Embriony kurcząt służą jako model do badania rozwoju rdzenia kręgowego.
- Izolacja RNA jest krytyczna dla dokładnej analizy transkryptomu.
Cel badania
- Ocenić poziomy ekspresji wszystkich genów w rdzeniach kręgowych embrionów kurcząt.
- Ocenić skuteczność elektroporacji in ovo w dostarczaniu genów.
- Dostarczyć protokół dla naukowców zainteresowanych transkryptomiką.
Stosowane metody
- Elektroporacja in ovo embrionów kurcząt.
- Rozcinanie połówek rury nerwowej w środowisku wolnym od RNA.
- Izolacja RNA i przygotowanie biblioteki.
- Sekwencjacja wysokoprężnościowa i przetwarzanie danych.
Główne wyniki
- Udana izolacja RNA z elektroporowanych rdzeni kręgowych.
- Wysokiej jakości dane sekwencyjne uzyskane od próbek.
- Mapowanie poziomów ekspresji różnych genów na genom.
- Identyfikacja artefaktów sekwencjonowania i ich usuwanie.
Wnioski
- Protokół skutecznie ocenia ekspresję genów w rdzeniach kręgowych kurcząt.
- Elektroporacja in ovo to wykonalna metoda transfekcji genów.
- To badanie zapewnia podstawę dla przyszłych badań transkryptomu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in early neuroscience discovery by linking genetic manipulation to transcriptome-wide functional readouts. It supports mechanistic de-risking of neural factor hypotheses through quantitative differential expression analysis. The approach provides predictive confidence for prioritizing targets in spinal cord development pathways before committing to lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring genome-wide transcriptional responses to electroporated constructs in embryonic spinal cord.
- Operational Value: Uses chick embryo model to functionally validate neural targets in a disease-relevant system with high transcriptional fidelity.
- Predictive Value: Enables detection of differentially expressed genes to clarify pathway involvement and de-risk target mechanisms prior to assay development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality RNA-seq data suitable for establishing baseline transcriptomes in control and experimental conditions.
- Operational Value: Produces reproducible gene expression measurements that support assay standardization for downstream screening campaigns.
- Scalability Value: Leverages public Galaxy server for bioinformatic processing, eliminating need for local computational infrastructure in small-to-medium scale target validation studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects early discovery findings to preclinical continuity by identifying differentially expressed genes relevant to spinal cord development pathways.
- Mechanistic De-risking: Confirms construct overexpression (e.g., scratch two zinc finger domains) through transcriptomic enrichment, supporting target engagement validation.
- Predictive Confidence: Uses replicate control samples with Pearson correlation of 0.99 to ensure detection sensitivity for true differential expression in experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing transcriptome-scale functional readouts that inform target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by comparing transcriptomes of control and experimental spinal cord halves following electroporation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized RNA isolation and library preparation under RNase-free conditions, yielding sequencing-ready samples.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression measurements via RNA-seq, allowing comparison of expression levels and identification of significantly differentially expressed transcripts using Q-value thresholds.
- Translational Research: Connects early target validation to preclinical relevance by identifying differentially expressed genes in neural development pathways with visual verification of construct overexpression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptome analysis workflow for neural target validation that can be applied across multiple constructs and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through genome-wide expression profiling and reduction of mechanistic ambiguity in neural development models.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via RNase-free dissection, high-quality RNA isolation (RIN 10), and public server-based bioinformatic processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of transcriptional responses, reducing late-stage biological risk in neuroscience target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering quantitative differential expression data that informs advancement decisions in lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo manipulation, in ovo electroporation, and RNase-free tissue handling for successful neural tube dissection.
- Depends on access to high-throughput sequencing and public bioinformatic platforms (Galaxy) for RNA-seq data processing and differential expression analysis.
- Necessitates standardization across teams for embryo staging (HH23), dissection consistency, and library preparation to ensure reproducible transcriptome comparisons.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different embryonic stages, constructs, or model systems beyond chick spinal cord.
- Practical limitations include the technical difficulty of neural tube dissection and the requirement for biological replicates to achieve sufficient statistical power for differential expression detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Harvesting Neural Tubes for RNA Collection
4:32
Pooling Tissue to Purify RNA for Illumina Sequencing
5:34
Comparing RNA-Seq Datasets on the Galaxy Public Server
9:52
Transcriptome Analysis Quality
9:52
Results: Transcriptome Analyis Quality
10:42
Conclusion
