Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus
30 listopada 2014
Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja składników transkrypcyjnych odpowiedzi na fotoperiodyczną diapauzę. W przypadku niemodelowego piktusa łokciowego komara z lat osiemdziesiątych osiąga się to poprzez najpierw wyprodukowanie biologicznie zreplikowanych próbek jaj diapauzy i bez diapauzy za pomocą różnych zabiegów fotoperiodycznych. W drugim etapie RNA jest ekstrahowane z każdej kontrpróby w celu sekwencjonowania RNA o wysokiej przepustowości.
Sekwencje RNA są następnie przetwarzane obliczeniowo w celu złożenia ich w kongi i opisania ich. Ostatecznie różnice w ekspresji genów w odpowiedzi na fotoperiody indukujące diapauzę w porównaniu z fotoperiodami nieindukującymi diapauzę można wywnioskować z Reeds MAP do zespołu RNA. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak analiza mikropromieniowa, jest to, że wcześniejsze zasoby genetyczne, takie jak sekwencja genomu lub mikromacierz, nie są wymagane do uzyskania globalnych szacunków ekspresji genów w odpowiedzi na warunki diapauzy.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki ekologicznej, takie jak jaka jest podstawa transkrypcyjna DPO lub inne kluczowe adaptacje ekologiczne w organizmach niemodelowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ uzyskanie wystarczającej ilości komórek jajowych diapauzy i komórek jajowych innych niż DPO może być trudne, a dalsza analiza bioinformatyczna może być trudna. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że technologie sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości stają się coraz bardziej przystępne cenowo i oferują wykonalną metodę uzyskiwania profili ekspresji całego genomu w organizmach niemodelowych przed rozpoczęciem procedury.
Ustaw dwie szafki fotograficzne z programowalnym oświetleniem o temperaturze 21 stopni Celsjusza, aby uzyskać optymalną ekspresję diapauzy i około 80% wilgotności względnej Zaprogramuj jedną szafkę na okres zdjęciowy bez diapauzy z cyklem 16 osiem jasnych ciemności, a drugą na diapauzę wywołującą osiem 16 ciemnych cykli światła z włączonymi światłami w tym samym czasie, aby obie szafki zsynchronizowały czas dobowy między okresami zdjęciowymi. Następnie zanurz bibułki jajne na odpowiednią liczbę jaj w 500 mililitrach wody dejonizowanej i dodaj jeden mililitr mielonej karmy dla psów i zawiesiny z krewetek solankowych. Przykryj pojemnik siatką, umieszczając gumkę wokół siatki, aby utrzymać go na miejscu.
Następnie wysiaduj jaja w 16 ośmiu jasnych, ciemnych, długich dniach, szafce fotograficznej przez około 24 godziny. Następnego dnia przenieś około 30 wyklutych larw na grupę do indywidualnych szalek Petriego o wymiarach 10 na 10 na dwa centymetry wypełnionych 90 mililitrami dejonizowanej wody. Co 48 do 72 godzin przenosić larwy do czystego naczynia, karmiąc je świeżą gnojowicą przy każdym przeniesieniu.
Po około sześciu dniach wyłóż dno trzech do czterech klatek dla dorosłych dla każdego zabiegu fotoperiodycznego mokrą bibułą filtracyjną i zwilż bibułę filtracyjną wystarczającą ilością wody dejonizowanej, aby zwiększyć lokalną wilgotność w klatce, unikając stojącej wody. Zanotuj okres zdjęciowy, datę rozpoczęcia replikacji klatki numerycznej i inne informacje istotne dla eksperymentu za pomocą trwałego markera z boku klatki. Następnie co drugi dzień przez 10 dni przenosić puy do małych kubków czystej wody w ilości nie większej niż 50 puy na 25 mililitrów wody do odpowiednich klatek dla dorosłych do eksperymentu i umieszczać organiczne rodzynki na górnej siatce klatki, aby zapewnić cukier dla wyłonionych dorosłych Aby stymulować pozycję komórek jajowych cztery do pięciu dni po pierwszym posiłku z krwi, Napełnij ciemne kubki o pojemności 50 mililitrów wyłożone teksturowanym, niebielonym ręcznikiem papierowym do połowy wodą dejonizowaną i umieść jedną filiżankę w każdej klatce, aby zebrać i przechowywać jaja.
Zastąp bibułki jajowe w każdej klatce świeżym papierem, umieszczając ostatnio usunięte papiery na szalkach Petriego i przechowując je w szafce na osiem 16 jasnych ciemnych krótkich dni ze zdjęciem, aby uniknąć mylącego wpływu na przechowywanie jaj. Około 48 godzin po zebraniu wysuszyć bibułki jajowe na świeżym powietrzu, tak aby były wiotkie i lekko wilgotne w dotyku, ale nie na tyle mokre, aby bibułki były ciemne od wody lub stymulowały wylęganie. Aby zmierzyć przypadki diapauzy, zapisz liczbę jaj na każdym papierze jajkowym.
Następnie całkowicie zanurz poszczególne bibułki w 90-mililitrowej szalce Petriego z około 80 mililitrami dejonizowanej wody. Aby stymulować ich wylęg, dodaj około 0,25 mililitra gnojowicy pokarmowej, a następnie po 24 godzinach przenieś szalkę Petriego na czarną powierzchnię. Teraz umieść źródło światła po jednej stronie, larwy odsuną się od światła, co pozwoli na wyraźne zliczenie osobnika jako pierwszego w larwach gwiazdy.
Użyj pipety, aby usunąć każdą larwę po policzeniu, aby zapobiec ponownemu liczeniu osobników. Następnie umieść bibułki jajeczne na nowej szalce Petriego, aby wyschły na czerwono. Po policzeniu drugiej partii piskląt tydzień później, umieść bibułki jajowe z pozostałymi niewyklutymi jajami na nowych 90-mililitrowych szalkach Petriego z około 80 mililitrami świeżego roztworu wybielającego, uważając, że bibułki są całkowicie zanurzone w roztworze bielącym.
Pozostaw papiery pod wyciągiem na noc, a następnego dnia użyj mikroskopu świetlnego, aby policzyć liczbę niewyklutych jaj. Jeśli jajo zostanie zarodkowane, będzie miało białawy kolor, a oczy będą wyglądać jak dwie małe czarne kropki naprzeciwko siebie po stronie grzbietowej. Na początek ostrożnie wyczyść ławkę roztworem do odkażania RNA, aby usunąć wszelkie pozostałości nukleaz i uniknąć degradacji RNA.
Następnie użyj szczotki z włosia wielbłąda, aby wyszczotkować co najmniej 400 jaj komarów zawierających rozwijające się zarodki w czasie rozwoju. Ciekawostka o młynkach do szkła. W dygestorium dodaj jeden mililitr triolu i zmiel jaja, aż zostaną całkowicie sproszkowane, a następnie wykonaj ekstrakcję RNA w triolu, a następnie wytrącić izopropanol zgodnie z instrukcjami producenta.
Teraz użyj do jednego mikrolitra D ns na do 10 mikrogramów RNA w 50 mikrolitrach reakcji przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie inkubuj reakcję w pięciu mikrolitrach zawieszonego odczynnika do inaktywacji DNA przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Delikatne trzykrotne wirowanie zawiesiny w okresie inkubacji.
Następnie odwirować ekstrakty RNA przez 1,5 minuty w temperaturze 10 000 razy G i Eloqua, RNA zawierające supernatanty, do świeżych probówek do sekwencjonowania. Na koniec zapoznaj się z towarzyszącym tekstem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przetwarzania wynikowych danych sekwencjonowania nowej generacji od odczytu, przygotowania, montażu i adnotacji do analizy wyrażeń różnicowych. Na tym pierwszym rysunku fluorometria dwóch reprezentatywnych próbek RNA pokazuje dwa prążki na około 2000 nukleotydów.
Rybosomalny RNA owada 28 składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych połączonych wiązaniami wodorowymi, które łatwo przerywają krótkie ogrzewanie lub czynniki zrywające wiązania wodorowe. Otrzymane dwa składniki są w przybliżeniu tej samej wielkości co 18-s rybosomalny RNA w drugiej próbce RNA, w tym reprezentatywnym eksperymencie można zaobserwować wysoki poziom degradacji. Fotookresowe leczenie reprezentatywnej grupy komarów albopictus skutkowało wysoką liczbą przypadków diapauzy u komarów hodowanych w ciągu dnia krótkiego i niską liczbą przypadków diapauzy u komarów hodowanych w ciągu długiego dnia.
Chociaż istniały pewne różnice między powtórzeniami, na przykład, grupa w krótkim dniu drugim wykazywała mniej incydentów diapauzy niż inne powtórzenia. Zestaw cyfrowo znormalizowanych odczytów Trinity dał wynik 76 377 kontigów o średniej długości conig 1020 3,1 i maksymalnej długości Conti 20 892. Należy zauważyć, że rozkład długości Conti jest mocno przekrzywiony w kierunku krótszych kontigów.
Jest to typowe dla montażu transkryptomu Denovo. Na tym ostatnim wykresie analizy ekspresji różnicowej z podobnego przepływu pracy zarodków hodowanych w warunkach wywołujących diapauzę w 11 i 21 dniu po ułożeniu komórek jajowych ujawniają 3 128 genów o zróżnicowanej ekspresji między tymi dwoma okresami. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu sześciu do ośmiu miesięcy od generacji tkanek i boskiej analizy informatycznej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że sukces na każdym kroku powinien być zweryfikowany przed przejściem do następnego kroku. Na przykład potwierdź, że warunki eksperymentalne wytworzyły DPA i jaja niebędące diapauzą przed badaniem integralności RNA Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak ilościowa analiza R-T-P-C-R lub porównawcza analiza genomiczna, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące specyficznej dla tkanki lub rozwoju ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania i/lub procesów ewolucji molekularnej.
Nie zapominaj, że praca z triolem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i dygestoria.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokół identyfikacji genów o różnym poziomie ekspresji u komarów Aedes albopictus w stanach diapauzy i braku diapauzy. Podejście to obejmuje hodowlę komarów w różnych fotoperiodach, a następnie ekstrakcję RNA i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe w celu analizy zmienności ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genomika
- Ekologia
Wprowadzenie
- Diapauza jest kluczową cechą adaptacyjną u wielu organizmów.
- Aedes albopictus jest organizmem niedobędnym jako model badawczy, wywierającym znaczący wpływ ekologiczny.
- Sekwencjonowanie RNA-Seq jest potężnym narzędziem do badania ekspresji genów bez dostępu do wcześniejszych zasobów genetycznych.
- Zrozumienie ekspresji genów w odpowiedzi na sygnały środowiskowe może dostarczyć istotnych informacji dla badań ekologicznych i ewolucyjnych.
Cel badania
- Identyfikacja komponentów transkrypcyjnych odpowiedzi diapauzy fotoperiodycznej.
- Porównanie ekspresji genów pomiędzy stanem diapauzy a stanem pozadiapauzycznym.
- Pogłębienie wiedzy na temat cech adaptacyjnych u organizmów niedmodelowych.
Zastosowane metody
- Przygotowano biologiczne powtórzenia próbek jaj w stanie diapauzy oraz poza diapauzą.
- Z każdego powtórzenia wyekstrahowano RNA do sekwencjonowania.
- Przeprowadzono wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA.
- W celu złożenia i adnotacji sekwencji RNA zastosowano przetwarzanie obliczeniowe.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne fotoperiody.
- Badanie wykazało skuteczność metody RNA-Seq w organizmach nie modelowych.
- Uzyskano informacje na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw diapauzy.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad cechami adaptacyjnymi u innych gatunków.
Wnioski
- RNA-Seq jest cenną metodą badania ekspresji genów u organizmów niemodelowych.
- Wyniki te przyczyniają się do zrozumienia cech adaptacyjnych związanych ze zmianami środowiskowymi.
- Podejście to można zastosować u innych gatunków mierzących się z podobnymi wyzwaniami ekologicznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia walidację celu w organizmach niemodelowych poprzez powiązanie bodźców środowiskowych z odpowiedziami transkrypcyjnymi, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w fazie wczesnego odkrywania. Przedstawia on skalowalną metodę fenotypowego przesiewu cech adaptacyjnych bez konieczności posiadania wcześniejszych zasobów genomicznych, co zmniejsza zależność od systemów modelowych. Opisany schemat pracy zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji celu poprzez izolację fotoperiodu jako zmiennej niezależnej i pomiar ekspresji genów jako ilościowej zmiennej zależnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie odpowiedzi transkrypcyjnych na bodźce środowiskowe w celu weryfikacji postawionych hipotez.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez identyfikację genów wykazujących różną ekspresję w stanach diauzy i niediauzy.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez powiązanie zabiegów fotoperiodycznych z mierzalnymi wynikami transkrypcyjnymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie zwalidowanych układów biologicznych (jaj w stanie diapauzy i poza nią) do dalszego przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i ekstrakcję RNA w celu zapewnienia powtarzalności wysokoprzepustowego sekwencjonowania.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych gatunków komarów i cech historii życia przy niewielkich modyfikacjach protokołu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia dotyczące ekspresji genów z fazy badawczej z efektami fenotypowymi, takimi jak zahamowanie rozwoju i supresja metaboliczna.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Identyfikuje sieci transkrypcyjne leżące u podstaw diapauzy, co pozwala na dobór biomarkerów do walidacji przedklinicznej.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając ilościowych progów dla ekspresji różnicowej (np. 3 128 DEG w różnych punktach czasowych).
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w ciąg procesu odkrywania, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, szczególnie w odniesieniu do celów zaangażowanych w procesy detekcji środowiskowej i szlaki odpowiedzi na stres.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację fotoperiodu jako zmiennej niezależnej i pomiar zmian transkrypcyjnych jako zmiennych zależnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy poprzez standaryzację hodowli, indukcję diapauzy oraz etapy kontroli jakości RNA.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary ekspresji genów (np. składanie kontigów, ekspresja różnicowa), które pozwalają na porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany transkrypcyjne z fenotypowymi skutkami diapauzy, wspierając dostosowanie biomarkerów w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przepływ pracy można dostosować do innych gatunków komarów i cech ekologicznych, co promuje inwestycje na poziomie platformy zamiast analiz jednorazowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach odpowiedzi środowiskowej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zastosowaniu biologicznych powtórzeń próbek i znormalizowanych protokołów ekstrakcji RNA.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając screening w organizmach niedoświadczalnych bez wcześniejszych inwestycji w sekwencjonowanie genomu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając dowodów transkrypcyjnych dla dalszego rozwoju celu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komarów, kontrolowaniu fotoperiodu oraz pracy z RNA w warunkach wolnych od RNaz.
- Zależy od dostępu do sekwenatorów Illumina oraz infrastruktury obliczeniowej do adnotacji i składania transkryptomu de novo.
- Wymaga standaryzacji działań między zespołami entomologicznymi, biologii molekularnej i bioinformatyki.
- Konieczna jest adaptacja warunków indukcji diapauzy (np. cykle światło:ciemność, temperatura) dla różnych gatunków lub szczepów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czasochłonność indukcji diapauzy (6–8 miesięcy) oraz trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby jaj w stanie diapauzy.
