Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Ogólnym celem tej procedury jest analiza zachowania migracyjnego komórek w środowisku trójwymiarowym. Najpierw osadź interesujące Cię komórki w trójwymiarowej siatce kolagenowej. Następnie rejestruj ruch komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo, następnie wyznaczaj parametry migracji za pomocą wspomaganego komputerowo śledzenia komórek i analizuj dane śledzenia komórek za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego.

Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do zbadania, które czynniki i szlaki transdukcji sygnału regulują migrację komórek rakowych lub normalnych komórek, takich jak leukocyty, limfocyty i komórki macierzyste w kontekście raka. Tak więc wiedza na temat migracji komórek, czynników modulujących i związanych z nimi szlaków transsekcji sygnału może być pomocna w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych mających na celu upośledzenie migracji komórek nowotworowych i rozprzestrzenianie się przerzutów. W przypadku komór migracyjnych szybko wyszczotkuj dwie warstwy stopionego wosku parafinowego, wymieszaj wazelinę do środka szklanego szkiełka, dodaj pokrywę, poślizgnij i uszczelnij dwiema warstwami wosku parafinowego, mieszanki wazeliny.

Następnie umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku na 1,5 mililitra probówek reakcyjnych. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do zawiesiny kolagenu. Połącz dokładnie 50 mikrolitrów 10 XMEM i 27 mikrolitrów 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu.

Następnie dodaj 375 mikrolitrów płynnej zawiesiny kolagenu i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać jasnofioletowy kolor wskazujący pH 7,5. Teraz dodaj 100 mikrolitrów końcowej zawiesiny kolagenu do 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj, zwracając uwagę na inicjację włókna kolagenowego. Polimeryzacja. Przy pH 7,5 przenieś mieszaninę do komór migracyjnych.

Delikatnie postukaj w komorę migracyjną, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę komórek zawiesiny kolagenu na dnie komory łańcucha migracyjnego. Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku i inkubuj przez 30 minut. Gdy spolimeryzowana siatka kolagenowa jest lekko mętna, ale nadal ma jasnofioletowy kolor, należy wypełnić komory migracyjne odpowiednim podłożem i uszczelnić komorę migracyjną woskiem parafinowym.

Mieszanka wazeliny. Ustaw grzałkę stolika mikroskopu na 37 stopni Celsjusza, używając 10-krotnego powiększenia na komorze migracyjnej. Ustaw ostrość na około 50 lub więcej komórek w polu view.

Nagraj migrację komórek w trybie poklatkowym za pomocą aplikacji do nadzoru wideo z wieloma kamerami. Zapisz filmy z migracji komórek w odpowiednim formacie pliku. Połącz pliki filmowe migracji komórek z bazą danych zawierającą informacje pomocnicze, takie jak typ komórki i warunki eksperymentalne.

Następnie przeanalizuj filmy z migracji komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji do śledzenia komórek, aby uzyskać bezstronną analizę. Losowo wybierz komórki do analizy bez wiedzy o tym, czy komórki są w sumie aktywne migracyjnie, określ około 60 współrzędnych XY na komórkę w typowym eksperymencie migracji komórek. W przypadku podziału komórki losowo wybierz jedną komórkę potomną, którą chcesz śledzić w śledzeniu.

Analizuj dane śledzenia komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji, takiej jak arkusz kalkulacyjny, aby obliczyć całkowitą odległość, jaką przeniosła komórka. Pomnóż sumę liczbowych wartości pikseli przez współczynnik korekcyjny w celu przeliczenia na mikrony. Zdefiniuj komórki, które migrowały poniżej progu 25 mikronów, jako komórki nieruchome, a wartości liczbowe zastąp przecinkiem.

Następnie oblicz aktywność lokomotoryczną jako procent komórek śledzonej populacji komórek, które przemieściły się między dwoma punktami czasowymi. Oblicz również czas aktywnego ruchu jako procent całkowitego czasu migracji komórki w stosunku do ram czasowych okresu obserwacji. Następnie oblicz istotność statystyczną za pomocą testu U człowieka Whitneya i wyświetl dane dotyczące migracji komórek.

Typowy plik danych śledzenia komórki przypomina tabelę, w której każda kolumna oznacza jedną śledzoną komórkę. Wiersze zawierają informacje o położeniu ruchu komórki. Z biegiem czasu zachowanie lokomotywy komórek można scharakteryzować na podstawie średniej aktywności lokomotorycznej analizowanej populacji komórek, a także czasu aktywnego ruchu.

Ten przykład pokazuje aktywność migracyjną 120 komórek z czterech niezależnych eksperymentów. Każdy romb oznacza, że komórka przemieściła się między co najmniej dwoma punktami czasowymi. Szare linie odróżniają komórki ruchome i nieruchome.

Parametr aktywności lokomotywy może być wyświetlany jako wykres XY lub wykres skrzynkowy. Aby zobrazować dynamikę analizowanej populacji komórek, histogram skutecznie pokazuje czas aktywny tych samych komórek. Analiza zachowań migracyjnych linii komórkowych raka piersi MDA, HER2 i M-D-A-N-E-O wskazuje, że obie linie komórkowe wykazywały podobną spontaniczną aktywność lokomotoryczną.

Parametr czas aktywny ujawnił nieco większą liczbę spontanicznie poruszających się komórek M-D-A-H-E-R w porównaniu z komórkami raka piersi M-D-A-N-O. Stymulacja 100 nanogramami na mililitr EGF spowodowała znacznie zwiększoną aktywność migracyjną MDA HER2, mierzoną liczbą poruszających się komórek i czasem aktywnego ruchu. Co ciekawe, komórki M-D-A-N-E-O migrowały w odpowiedzi na stymulację EGF i wykazywały przesunięty w czasie aktywny wzorzec leczenia inhibitorem fosfolipazy c gamma one UC 3 1 22 zmniejszyły zarówno spontaniczną, jak i indukowaną przez EGF migrację zarówno M-D-E-E-R dwa, jak i MDAN.

Komórki EEO. Analiza parametru czasu aktywnego wykazała, że leczenie komórek MDAN EEO dwoma mikromolami U 7 3 1 2 2 skutkowało znacznie zmniejszoną aktywnością lokomotoryczną, przypisywaną przede wszystkim zwiększonej liczbie komórek nieporuszających się. Po opanowaniu migracji limfocytów i leukocytów do trójwymiarowego kolagenu litery i menty można zarejestrować w ciągu około dwóch godzin, podczas gdy komórki nowotworowe są rejestrowane przez noc.