Name: Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj analizę migracji komórek w trójwymiarowej matrycy kolagenowej przy użyciu mikroskopii czasowo-przestrzennej. Ta metoda pozwala badać czynniki regulujące ruch komórek nowotworowych i normalnych, co wspiera rozwój nowych strategii terapeutycznych przeciwko przerzutom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Fritz-Bender, Monachium, Niemcy

1. Przygotowanie komór migracyjnych
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę wosku parafinowego i wazeliny (1:1) i podgrzewaj, aż mieszanina się rozpuści. Za pomocą pędzla narysować 2-3 warstwy wosku parafinowego/wazeliny (1:1) wymieszać na środku szkiełka zgodnie z rysunkami 1B-1D. 
	UWAGA: Używamy zwykłych szkiełek szkiełkowych (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (szer./gł./wys.))</li>
	<li>Szybko nałóż stopioną mieszankę wosku parafinowego i wazeliny na szkiełko podstawowe, aby uniknąć zestalenia podczas ciągnięcia. Upewnij się, że warstwa wosku parafinowego/wazeliny ma około 2-2.5 cm długości i 0.3-0.5 cm szerokości. Grubość warstwy wosku parafinowego/wazeliny powinna wynosić około 0,1-0,15 cm.</li>
	<li>Dodaj szkiełko nakrywkowe do zestalonej mieszanki wosku parafinowego i wazeliny i uszczelnij ją dwiema do trzech warstw mieszanki wosku parafinowego i wazeliny (rysunki 1E,1F). Użyj 4-8 komór migracyjnych do wspólnego eksperymentu migracji komórek. Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanki komórek zawiesiny kolagenu
<ol>
	<li>Zbierz (np. z 0,25% trypsyny/EDTA) i policz interesujące Cię komórki. Ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach zawierających płodową surowicę cielęcą (FCS), antybiotyki i zalecane suplementy. Przygotować 4-8 probówek reakcyjnych po 1,5 ml i zawiesinę komórek o objętości 20 μl zawierającą 4-6 x 104 komórek (całkowita liczba komórek zależy od typu komórek, które mają być analizowane) i wypełnić do 50 μl kompletnymi pożywkami. 
	UWAGA: Do zawiesiny komórkowej dodaje się dodatkowe związki (np. czynniki wzrostu, chemokiny, inhibitory itp.). Stosować odpowiednie roztwory podstawowe, tak aby końcowa objętość zawiesiny komórek nie przekraczała 50 μl.</li>
	<li>Przygotuj całkowitą ilość 452 μl końcowej zawiesiny kolagenu do czterech eksperymentów migracji komórek. Dodać 50 μl 10x MEM (pH 5,1-5,5) i 27 μl 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu (pH 9,0-9,5) do 1,5 ml probówki reakcyjnej i dokładnie wymieszać. Obserwuj, jak kolor roztworu zmienia się z żółto-pomarańczowego na intensywnie fioletowy (pH 9,0-9,5). Dodaj 375 μl płynnej zawiesiny kolagenu do 10x roztworu MEM/wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszaj. pH końcowej zawiesiny kolagenu powinno wynosić około 7,5 (wskazane jasnofioletowym kolorem). 
	UWAGA: Sprawdź pH 7.5% roztworu wodorowęglanu sodu. Jeśli pH wynosi około 7,5, umieścić roztwór wodorowęglanu sodu z otwartą pokrywą w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) w celu nasycenia CO2 i zwiększyć pH (około 9,0 - 9,5). pH mieszanki komórek zawiesiny kolagenu ma kluczowe znaczenie dla stabilności sieci kolagenowej. Jeśli jest zbyt niska, siatka kolagenowa zapadnie się podczas eksperymentu migracji komórek. 
	UWAGA: W tym protokole użyj płynnego kolagenu (pH 1,9-2,2) z tylnego bydła (2,9-3,3 mg / ml kolagenu; 95% kolagenu typu I, 5% kolagenu typu IV). Przykłady dalszych protokołów przygotowania sieci kolagenowej z wykorzystaniem kolagenu typu I z innych źródeł, takich jak świnie lub szczury, podano w 32,33. Nie należy zmieniać objętości użytych roztworów, ponieważ zmieni to ostateczne stężenie kolagenu wynoszące 1,67 mg/ml siatki. Wyższe lub niższe stężenie kolagenu ma wpływ na gęstość włókien kolagenowych i średnią odległość między nimi, co towarzyszy zachowaniom migracyjnym komórek34.</li>
	<li>Dodaj 100 μl końcowej zawiesiny kolagenu do 50 μl zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj. Ostateczna zawiesina kolagenu (1,67 mg/ml kolagenu) jest lekko lepka. Aby przenieść odpowiednią ilość (100 μl), należy raz pipetować końcowy roztwór kolagenu w górę i w dół przed przeniesieniem go do zawiesiny komórek. 
	UWAGA: Gdy mieszanina komórek zawiesiny kolagenu zostanie połączona z 10-krotnym roztworem MEM / wodorowęglanu sodu, a wartość pH zmieni się na 7,5, włókna kolagenowe natychmiast zaczynają polimeryzować.</li>
	<li>Przenieś końcową mieszaninę komórek zawiesiny kolagenu z probówek reakcyjnych do komór migracyjnych. Delikatnie postukaj w komorę migracyjną, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę komórek zawiesiny kolagenu na dnie komory migracyjnej (rysunek 1H). Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej na stojaku i inkubuj przez około 30 minut (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić polimeryzację włókien kolagenowych.</li>
	<li>Zauważ, że spolimeryzowana siatka kolagenowa jest lekko mętna, ale nadal ma jasnofioletowy kolor. Napełnić komory migracyjne kompletną pożywką lub kompletną pożywką z interesującymi dodatkami i uszczelnić komorę migracyjną mieszanką wosku parafinowego i wazeliny (rysunki 1I,1J).</li>
</ol>
3. Rejestrowanie i analiza migracji komórek
Ta sekcja opisuje rejestrowanie migracji komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo oraz analizę migracji komórek za pomocą ręcznego śledzenia komórek.
<ol>
	<li>Włączyć mikroskop i grzałkę stolika mikroskopu. Ustaw temperaturę na 37 °C. Użyj obiektywu 10X. Umieść komorę migracyjną pod mikroskopem i skup się na około 50 lub więcej komórkach w polu view.</li>
	<li>Nagrywaj migrację komórek w trybie poklatkowym za pomocą aplikacji do nadzoru wideo z wieloma kamerami. Zapisz filmy z migracją komórek w odpowiednim formacie, np. "*.avi" lub "*.mov". Połącz pliki filmowe migracji komórek z bazą danych zawierającą informacje pomocnicze, takie jak typ komórki i warunki eksperymentalne. 
	UWAGA: Rejestrujemy limfocyty i HSPC przez maksymalnie 2 godziny przy użyciu współczynnika poklatkowego 1:80, co oznacza, że 0,75 sekundy w trybie poklatkowym jest równe 1 minutzie w czasie rzeczywistym. Komórki nowotworowe są komórkami wolno poruszającymi się i dlatego są rejestrowane przez co najmniej 16 godzin przy użyciu współczynnika poklatkowego 1:1,800 (0,5 sekundy w czasie poklatkowym jest równe 15 minutom w czasie rzeczywistym).</li>
	<li>Analizuj filmy z migracją komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji do śledzenia komórek, takiej jak wtyczki oprogramowania ImageJ (przegląd znajduje się w 18). Dla bezstronnej analizy kluczowe znaczenie ma to, że komórki będą wybierane losowo bez wiedzy o tym, czy komórki są aktywne migrująco, czy nie. 
	UWAGA: Używamy samodzielnie opracowanej aplikacji do ręcznego śledzenia ścieżek co najmniej 30 komórek na eksperyment poprzez dokładne podążanie za poruszającymi się komórkami za pomocą kursora myszy (który jest umieszczony na jądrze). Podczas śledzenia współrzędne xy śledzonych komórek są automatycznie określane zgodnie z używanym trybem poklatkowym. Dla limfocytów/HSPC współrzędne xy są określane co 0,75 sekundy (co odpowiada 1 minutie w czasie rzeczywistym), podczas gdy dla komórek nowotworowych współrzędne xy są określane co 0,5 sekundy (równe 15 minutom czasu rzeczywistego).</li>
	<li>Określ łącznie 60 współrzędnych xy na komórkę dla typowego eksperymentu migracji komórek. Jest to równe 1 godzinie w czasie rzeczywistym dla limfocytów/HSPC i 15 godzinom w czasie rzeczywistym dla komórek nowotworowych. Znak "," oznacza, że komórka nie przemieściła się między dwoma punktami czasowymi, natomiast "wartość liczbowa" wskazuje odległość w "pikselach", na jaką komórka przemieściła się między 2 punktami czasowymi (Rysunek 2A). 
	UWAGA: Ręczne śledzenie komórek wymaga doświadczenia. Szczególnie szybko migrujące komórki są trudne do śledzenia, a każdy typ komórki wykazuje odrębne zachowanie migracyjne, które może być wywołane przez czynniki uzupełniające. W przypadku podziału komórki podczas śledzenia, losowo wybierz jedną komórkę potomną do kontynuowania śledzenia. Komórki, które migrują poza pole widzenia lub giną podczas śledzenia, nie są zaniedbywane, ale są brane pod uwagę do analizy.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane śledzenia komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji, np. arkusza kalkulacyjnego.
	<ol>
		<li>Analizuj dane śledzenia komórek, kopiując nieprzetworzone dane śledzenia komórek (Rysunek 2A) do samodzielnie zaprojektowanego szablonu arkusza kalkulacyjnego. Pomnóż sumę "wartości liczbowych", reprezentujących całkowitą odległość, jaką przebyła komórka, za pomocą współczynnika korekcyjnego w celu przekształcenia "piksela" na "μm".</li>
		<li>Określ dwa parametry migracji komórek: aktywność lokomotoryczną (która jest równoważna szybkości migracji) i czas aktywnego ruchu (ryc. 2C,2D).</li>
		<li>Zidentyfikuj komórki, które migrowały poniżej 25 μm (poziom progowy w celu zmniejszenia liczby komórek fałszywie dodatnich) jako komórki nieruchome. Zamień "wartości liczbowe" tych komórek na ",". 
		UWAGA: Parametr "aktywność lokomotoryczna" (lub szybkość migracji) reprezentuje procent komórek w śledzonej populacji komórek, które przemieszczały się między dwoma punktami czasowymi (Rysunek 2D). "Wartość liczbowa" jest zdefiniowana jako ruchoma komórka, podczas gdy "," jest zdefiniowana jako nieruchoma komórka. Parametr "czas aktywnego ruchu" (czas aktywności) reprezentuje procent całkowitego czasu, w jakim komórka migrowała w stosunku do ram czasowych okresu obserwacji (rysunek 2C). "Wartość liczbowa" oznacza, że komórka się przeniosła, natomiast "," oznacza, że komórka się nie przeniosła. Ten parametr jest dalej używany do określania liczby komórek, które się nie przesunęły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie istotności statystycznej i wyświetlanie danych migracji komórek.
	<ol>
		<li>Obliczyć istotność statystyczną średniej aktywności lokomotorycznej komórek (szybkości migracji) za pomocą testu U Manna-Whitneya. Uznaj, że wartość p < 0,05 jest znacząca.</li>
		<li>Wyświetlaj średnią aktywność lokomotoryczną komórek jako diagram xy, diagram BoxPlot lub jako diagram wykresu słupkowego. Wyświetlanie danych opartych na pojedynczych komórkach, takich jak czas aktywnego ruchu lub prędkość, jako diagramu słupkowego lub histogramu. 
		UWAGA: Jeśli wybrana aplikacja do obsługi arkuszy kalkulacyjnych nie zawiera wykresu BoxPlot ani narzędzia do tworzenia wykresów histogramu, należy przeprowadzić wyszukiwanie w Internecie w poszukiwaniu odpowiednich samouczków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zdolność do migracji jest cechą charakterystyczną komórek nowotworowych4. Bez zdolności do odłączenia się od guza pierwotnego i migracji przez otaczającą tkankę łączną, komórki nowotworowe nie będą w stanie zasiać wtórnych zmian, które są główną przyczyną śmierci prawie wszystkich pacjentów z rakiem. Ze względu na ten związek, wiele badań koncentruje się na migracji komórek rakowych. Celem tych badań jest identyfikacja nowych cząsteczek docelowych i szlaków docelowych, które skutecznie blokują migrację komórek...

Podobnie jak fuzja komórek (zobacz przegląd patrz 1,2), migracja komórek jest kolejnym zjawiskiem biologicznym, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran i reakcjach immunologicznych (dla przeglądu patrz 3). Jednak zdolność do migracji jest również warunkiem wstępnym dla komórek nowotworowych do przerzutów (przegląd patrz 3,4).
Migracja komórek to złożony, jeszcze nie w pełni zrozumiany proces, który jest kierowany przez wzajemne oddziaływanie kilku szlaków transdukcji sygnału inicjowanych przez różne ligandy (np. cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu, hormony, składniki macierzy zewnątrzkomórkowej) interakcje (np. receptorowe kinazy tyrozynowe, receptory chemokin, integryny)5 ostatecznie powodując reorganizację cytoszkieletu aktynowego wraz z de- i ponownym składaniem ogniskowych kompleksów adhezyjnych i sygnalizacją za pośrednictwem integryn6.
Aby przeanalizować migrację komórek, w ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka testów migracji komórek in vitro i in vivo, w tym test komory Boydena/transwell7, test zadrapań/test gojenia ran8-10, trójwymiarowy (3D) test migracji macierzy kolagenowej11, jak również obrazowanie/mikroskopia przyżyciowe (dla przeglądu patrz 12). Każdy z tych testów migracji komórek ma swoje plusy i minusy, np. dotyczące kosztów i zapotrzebowania na sprzęt, obsługi czy wiarygodności uzyskanych danych.
Zarówno test komory Boydena/transwell, jak i test zadrapań/test gojenia się ran są łatwymi, tanimi i dobrze rozwiniętymi testami do pomiaru migracji komórek in vitro7-10. W komorze Boydena/teście transwella komórki są wysiewane na wierzchu wkładki zawierającej pory (o średnicy około 8 μm) - tak zwanej górnej komorze7. Opcjonalnie wkładka może być pokryta składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, np. fibronektyną, kolagenem itp., Aby naśladować bardziej fizjologiczne środowisko. Podobnie, komórki śródbłonka mogą być hodowane na wierzchu wkładki, naśladując w ten sposób barierę komórkowąśródbłonka 13. Te komórki, które przeszły przez pory w określonym przedziale czasu do dolnego przedziału zawierającego pożywki i suplementy, takie jak czynniki wzrostu i chemokiny, są wykorzystywane jako odczyt do ilościowego określenia migracji komórek (lub wynaczynienia).
W teście zadrapań/gojenia ran komórki są umieszczane na płytkach i rosną do zbiegu10. W zależności od eksperymentalnego ustawienia, płytki mogą być wstępnie pokryte składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak fibronektyna. Po utworzeniu zadrapania/rany poprzez zeskrobanie jednowarstwowej komórki, pojedyncze komórki z każdej strony zadrapania/rany mogą migrować do szczeliny, wypełniając ją w ten sposób/lecząc10. Odległość między dwiema stronami zadrapania/ran jest określana w zależności od czasu i służy jako odczyt aktywności migracyjnej komórek10. Jednakże, aby rozróżnić między proliferacją komórek (która może również prowadzić do wypełnienia/zagojenia się zadrapania/rany) a migracją komórek, zaleca się połączenie testu z mikroskopią wideo poklatkową i śledzeniem pojedynczych komórek10.
Jednakże, zarówno test komory Boydena/transwell, jak i test zadrapań/test gojenia się ran, są raczej niedoskonałe pod względem fizjologicznego środowiska komórkowego. W teście komory Boydena/transwellu komórki muszą migrować przez plastikowy por, podczas gdy w teście zadrapania/gojeniu się ran komórki są wysiewane na dwuwymiarowej, wstępnie powlekanej płytce z tworzywa sztucznego. Podobnie, dobrze wiadomo, że zachowania migracyjne różnią się znacznie między środowiskiem dwuwymiarowym a trójwymiarowym3. Na przykład trójwymiarowe adhezje matrycowe fibroblastów różnią się od zrostów ogniskowych i fibrylarnych charakteryzowanych na dwuwymiarowych podłożach zawartością integryn α5β1 i αvβ3, paxilliny, innych składników cytoszkieletu oraz fosforylacją tyrozyny ogniskowej kinazy adhezyjnej14. Podobnie, komórki osadzone w środowisku 3D również wykazywały zmienione zachowanie migracyjne15. W związku z tym, aby dokładniej analizować migrację komórek, zaleca się test migracji, który pozwala zmierzyć migrację pojedynczych komórek w środowisku fizjologicznym 3D lub podobnym do fizjologicznego.
Obrazowanie/mikroskopia przyżyciowych to złoty standard pomiaru migracji komórek w kontekście fizjologicznym 3D. Dotyczy to nie tylko interakcji macierz zewnątrzkomórkowa-komórka, ale także interakcji między różnymi typami komórek, takimi jak komórki nowotworowe i komórki śródbłonka podczas wynaczynienia16 lub transport limfocytów w obrębie węzła chłonnego17, co do tej pory było możliwe dzięki ulepszonym technikom mikroskopii fluorescencyjnej, takim jak 2-fotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa, zastosowanie ważnych barwników fluorescencyjnych i transgenicznych szczepów myszy eksprymujących białka fluorescencyjne Instrumenty pochodne12,16,17. Dodatkowo, obrazowanie/mikroskopia przyżyciowe może być połączone z ręcznym i automatycznym śledzeniem komórek18. Jednak ze względu na potrzebę 2-fotonowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, a także zwierząt (i odpowiednich transgenicznych modeli zwierzęcych), obrazowanie/mikroskopia przyżyciowa jest dość kosztowną techniką.
Aby przezwyciężyć ograniczenia testu komory Boydena/transwella i testu zadrapań/testu gojenia się ran oraz przeanalizować migrację różnych typów komórek w środowisku 3D, opracowano test migracji macierzy kolagenowej 3D11,19. W ten sposób migrujące komórki są osadzone w sieci włókien kolagenowych 3D, która bardziej przypomina sytuację in vivo. Jednocześnie, dzięki mikroskopii poklatkowej, mierzona jest rzeczywista migracja komórek, co pozwala na określenie kilku parametrów migracji, a także ich zmian w odpowiedzi na czynniki promigracyjne lub inhibitory. Za pomocą tej techniki można analizować różne typy komórek, w tym limfocyty i leukocyty11,20, hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe21-24 oraz komórki nowotworowe5,25-29. Oprócz pojedynczych komórek w macierzy kolagenowej mogą być osadzone również klastry komórkowe lub sferoidy, co wiąże się z analizą emigracji pojedynczych komórek z klastra komórkowego/sferoidy do sieci kolagenowej30,31.
Ten protokół przedstawia przegląd prostej, ale potężnej techniki analizy zachowań migracyjnych różnych typów komórek w środowisku 3D - metoda in vitro dająca wyniki zbliżone do sytuacji in vivo.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop odwrócony Leica DM IL</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grzałka sceniczna mikroskopu</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera wideo JVC C1431</td><td>JVC, Bad Vilbel, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serwer wideo Axis 241Q</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer Mac G5 Apple</td><td>Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nadzoru wideo z wieloma kamerami (Security Spy)</td><td>Bensoftware, Londyn, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edynburg, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Niemcy</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Lokalna apteka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol (płynny kolagen)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, Holandia</td><td></td><td>zawiera 2,9 - 3,3 mg/ml kolagenu bydlęcego (95% kolagenu typu I, 5% kolagenu typu IV)</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7,5% roztwór wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy</td><td>662035</td><td>najpierw rozpuścić w CHCl3; rozpuścić w DMSO tuż przed użyciem</td></tr></tbody></table>

analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Zdolność do migracji jest cechą charakterystyczną różnych typów komórek i odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran i reakcjach immunologicznych. Jednak migracja komórek jest również kluczowym mechanizmem w raku, umożliwiającym tym komórkom rakowym odłączenie się od guza pierwotnego i rozpoczęcie rozprzestrzeniania się przerzutów. W ciągu ostatnich lat opracowano różne testy migracji komórek w celu analizy zachowań migracyjnych różnych typów komórek. Ponieważ zachowanie lokomotoryczne komórek znacznie różni się między środowiskiem dwuwymiarowym (2D) i trójwymiarowym (3D), można założyć, że analiza migracji komórek osadzonych w środowisku 3D dostarczy bardziej znaczących danych dotyczących migracji komórek. Zaletą opisanego testu migracji macierzy kolagenowej 3D jest to, że komórki są osadzone w fizjologicznej sieci 3D włókien kolagenowych reprezentujących główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzięki wideomikroskopii poklatkowej mierzona jest rzeczywista migracja komórek, co pozwala na określenie kilku parametrów migracji, a także ich zmian w odpowiedzi na czynniki promigracyjne lub inhibitory. Za pomocą tej techniki można analizować różne typy komórek, w tym limfocyty/leukocyty, komórki macierzyste i komórki nowotworowe. Podobnie, również klastry komórkowe lub sferoidy mogą być osadzone w macierzy kolagenowej wraz z analizą emigracji pojedynczych komórek z klastra komórkowego / sferoidy do sieci kolagenowej. Dochodzimy do wniosku, że test migracji macierzy kolagenowej 3D jest wszechstronną metodą analizy migracji komórek w fizjologicznym środowisku 3D.

Zastosowany test migracji w trójwymiarowej matrycy kolagenowej, połączony z wideomikroskopią poklatkową i komputerowym śledzeniem komórek, umożliwia wyznaczenie różnych parametrów migracji komórek, w tym parametrów populacyjnych (np. średnia aktywność lokomotoryczna) oraz parametrów dla pojedynczych komórek (np. czas aktywnego ruchu, prędkość, przebyta odległość). Przykład uzyskanych zestawów danych śledzenia komórek, przetwarzania danych i ich prezentacji przedstawiono na Rysunku 2. Pl...

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza zachowania migracyjnego komórek w środowisku trójwymiarowym. Najpierw osadź interesujące Cię komórki w trójwymiarowej siatce kolagenowej. Następnie rejestruj ruch komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo, następnie wyznaczaj parametry migracji za pomocą wspomaganego komputerowo śledzenia komórek i analizuj dane śledzenia komórek za pomocą aplikacji arkusza kalkulacyjnego.Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do zbadania, które czynniki i szlaki transdukcji sygnału regulują migrację komórek rakowych lub normalnych komórek, takich jak leukocyty, limfocyty i komórki macierzyste w kontekście raka. Tak więc wiedza na temat migracji komórek, czynników modulujących i związanych z nimi szlaków transsekcji sygnału może być pomocna w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych mających na celu upośledzenie migracji komórek nowotworowych i rozprzestrzenianie się przerzutów. W przypadku komór migracyjnych szybko wyszczotkuj dwie warstwy stopionego wosku parafinowego, wymieszaj wazelinę do środka szklanego szkiełka, dodaj pokrywę, poślizgnij i uszczelnij dwiema warstwami wosku parafinowego, mieszanki wazeliny.Następnie umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku na 1,5 mililitra probówek reakcyjnych. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do zawiesiny kolagenu. Połącz dokładnie 50 mikrolitrów 10 XMEM i 27 mikrolitrów 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu.Następnie dodaj 375 mikrolitrów płynnej zawiesiny kolagenu i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać jasnofioletowy kolor wskazujący pH 7,5. Teraz dodaj 100 mikrolitrów końcowej zawiesiny kolagenu do 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj, zwracając uwagę na inicjację włókna kolagenowego. Polimeryzacja. Przy pH 7,5 przenieś mieszaninę do komór migracyjnych.Delikatnie postukaj w komorę migracyjną, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę komórek zawiesiny kolagenu na dnie komory łańcucha migracyjnego. Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku i inkubuj przez 30 minut. Gdy spolimeryzowana siatka kolagenowa jest lekko mętna, ale nadal ma jasnofioletowy kolor, należy wypełnić komory migracyjne odpowiednim podłożem i uszczelnić komorę migracyjną woskiem parafinowym.Mieszanka wazeliny. Ustaw grzałkę stolika mikroskopu na 37 stopni Celsjusza, używając 10-krotnego powiększenia na komorze migracyjnej. Ustaw ostrość na około 50 lub więcej komórek w polu view.Nagraj migrację komórek w trybie poklatkowym za pomocą aplikacji do nadzoru wideo z wieloma kamerami. Zapisz filmy z migracji komórek w odpowiednim formacie pliku. Połącz pliki filmowe migracji komórek z bazą danych zawierającą informacje pomocnicze, takie jak typ komórki i warunki eksperymentalne.Następnie przeanalizuj filmy z migracji komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji do śledzenia komórek, aby uzyskać bezstronną analizę. Losowo wybierz komórki do analizy bez wiedzy o tym, czy komórki są w sumie aktywne migracyjnie, określ około 60 współrzędnych XY na komórkę w typowym eksperymencie migracji komórek. W przypadku podziału komórki losowo wybierz jedną komórkę potomną, którą chcesz śledzić w śledzeniu.Analizuj dane śledzenia komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji, takiej jak arkusz kalkulacyjny, aby obliczyć całkowitą odległość, jaką przeniosła komórka. Pomnóż sumę liczbowych wartości pikseli przez współczynnik korekcyjny w celu przeliczenia na mikrony. Zdefiniuj komórki, które migrowały poniżej progu 25 mikronów, jako komórki nieruchome, a wartości liczbowe zastąp przecinkiem.Następnie oblicz aktywność lokomotoryczną jako procent komórek śledzonej populacji komórek, które przemieściły się między dwoma punktami czasowymi. Oblicz również czas aktywnego ruchu jako procent całkowitego czasu migracji komórki w stosunku do ram czasowych okresu obserwacji. Następnie oblicz istotność statystyczną za pomocą testu U człowieka Whitneya i wyświetl dane dotyczące migracji komórek.Typowy plik danych śledzenia komórki przypomina tabelę, w której każda kolumna oznacza jedną śledzoną komórkę. Wiersze zawierają informacje o położeniu ruchu komórki. Z biegiem czasu zachowanie lokomotywy komórek można scharakteryzować na podstawie średniej aktywności lokomotorycznej analizowanej populacji komórek, a także czasu aktywnego ruchu.Ten przykład pokazuje aktywność migracyjną 120 komórek z czterech niezależnych eksperymentów. Każdy romb oznacza, że komórka przemieściła się między co najmniej dwoma punktami czasowymi. Szare linie odróżniają komórki ruchome i nieruchome.Parametr aktywności lokomotywy może być wyświetlany jako wykres XY lub wykres skrzynkowy. Aby zobrazować dynamikę analizowanej populacji komórek, histogram skutecznie pokazuje czas aktywny tych samych komórek. Analiza zachowań migracyjnych linii komórkowych raka piersi MDA, HER2 i M-D-A-N-E-O wskazuje, że obie linie komórkowe wykazywały podobną spontaniczną aktywność lokomotoryczną.Parametr czas aktywny ujawnił nieco większą liczbę spontanicznie poruszających się komórek M-D-A-H-E-R w porównaniu z komórkami raka piersi M-D-A-N-O. Stymulacja 100 nanogramami na mililitr EGF spowodowała znacznie zwiększoną aktywność migracyjną MDA HER2, mierzoną liczbą poruszających się komórek i czasem aktywnego ruchu. Co ciekawe, komórki M-D-A-N-E-O migrowały w odpowiedzi na stymulację EGF i wykazywały przesunięty w czasie aktywny wzorzec leczenia inhibitorem fosfolipazy c gamma one UC 3 1 22 zmniejszyły zarówno spontaniczną, jak i indukowaną przez EGF migrację zarówno M-D-E-E-R dwa, jak i MDAN.Komórki EEO. Analiza parametru czasu aktywnego wykazała, że leczenie komórek MDAN EEO dwoma mikromolami U 7 3 1 2 2 skutkowało znacznie zmniejszoną aktywnością lokomotoryczną, przypisywaną przede wszystkim zwiększonej liczbie komórek nieporuszających się. Po opanowaniu migracji limfocytów i leukocytów do trójwymiarowego kolagenu litery i menty można zarejestrować w ciągu około dwóch godzin, podczas gdy komórki nowotworowe są rejestrowane przez noc.

analysis-of-cell-migration-within-a-three-dimensional-collagen-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj analizę migracji komórek w trójwymiarowej matrycy kolagenowej przy użyciu mikroskopii czasowo-przestrzennej. Ta metoda pozwala badać czynniki regulujące ruch komórek nowotworowych i normalnych, co wspiera rozwój nowych strategii terapeutycznych przeciwko przerzutom.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Przeglądaj więcej filmów