Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie mikroskopii oświetlenia jednopłaszczyznowego przy użyciu modułu wzbudzenia arkusza świetlnego dla mikroskopów odwróconych i zastosowanie go do trójwymiarowych sferoid komórkowych. Osiąga się to poprzez użycie pipety w celu przeniesienia sferoidy komórkowej z dołka płytki mikromiareczkowej do drugiego dołka w celu inkubacji po umyciu. Sferoida S jest następnie wprowadzana do prostokątnej kapilary.

Drugim krokiem jest zamontowanie modułu oświetlenia arkusza świetlnego do płyty podstawy stołu pozycjonującego mikroskop odwrócony. Następnie kapilar zawierający steryd umieszcza się w specjalnym uchwycie na próbkę do mikroskopii. Ostatnim krokiem jest ustawienie dopasowania między arkuszem światła a płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu mikroskopu na ścieżce wykrywania.

Ostatecznie, trójwymiarowe pomiary fluorescencji można przeprowadzić poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowej w sferoidzie komórki w celu uzyskania informacji o pojedynczych obrazach lub Zacks dotyczących wchłaniania leków lub struktury sferoidy S. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi mikroskopami z arkuszami świetlnymi jest to, że jest ona ekonomiczna i bardzo wszechstronna, ponieważ składa się z modułu, który można dostosować do istniejącego mikroskopu i zapewnia dużą swobodę badań. Implikacje tej techniki rozciągają się na badania nad lekami i środkami stosowanymi w terapii i diagnostyce, w szczególności dlatego, że adaptacja układu mikroprzepływowego pozwala na badanie szybkich procesów w warunkach przepływu.

Teraz ta metoda wzbudzenia w połączeniu z dowolną techniką wykrywania może zapewnić wgląd w steroidy z żywych komórek w dawkach o słabym oświetleniu. Może być również stosowany do innych żywych systemów, takich jak ryby cipro, zarodki artila, a także optyczne próbki tkanek CLE. Na początek dodaj 50 mikrolitrów podgrzanego 1,5 aerosu w pożywce hodowlanej do każdego dołka 96-dołkowej płytki i pozwól mu zestalić się przez jedną do dwóch godzin.

Następnie wysiewamy około 150 MCF siedmiu komórek raka piersi w każdym dołku przygotowanej 96-dołkowej płytki brutto S przez pięć do siedmiu dni, do średnicy około 200 do 300 mikrometrów w inkubatorze przy 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza. Następnie inkubuj steroidy komórkowe z antybiotykiem antracyklinowym, chlorowodorkiem doksorubicyny przez sześć godzin w stężeniu od dwóch mikromolowców do ośmiu mikromolów w hodowli. Pożywka Po inkubacji przemyj komórki OID hodowlą, pożywką lub roztworem soli równowagi Earla przed mikroskopią.

Użyj odwróconego mikroskopu i zamontuj mikroskopię oświetlenia jednopłaszczyznowego lub moduł wzbudzenia SPM na płycie podstawy stołu pozycjonującego. Wyposaż mikroskop w soczewkę obiektywową mikroskopu powiększającego 10 razy lub 20 razy oraz odpowiedni filtr długoprzepustowy w ścieżce wykrywania mikroskopu. Następnie zamontuj kamerę integrującą w porcie wykrywania mikroskopu.

Użyj równolegle załekwiowanej wiązki lasera lub diody laserowej o długości fali wzbudzenia preferencyjnie 470 nanometrów i zastosuj ją do modułu spinowego. Następnie obróć cylindryczną soczewkę o 90 stopni, co przenosi arkusz świetlny do pozycji pionowej w celu osiowej regulacji talii belki arkusza świetlnego. Umieścić kapilarę zawierającą ciecz z barwnikiem fluorescencyjnym w uchwycie na próbkę.

Przymocuj uchwyt próbki z kapilarą do stołu pozycjonującego mikroskopu. Wyrównaj położenie kapilary tak, aby była wyśrodkowana, a talia wiązki arkusza świetlnego była oznaczona. Dostosuj talię wiązki, zmieniając położenie osiowe samej soczewki cylindrycznej.

Po wyregulowaniu odwróć obiektyw. Umieść steroid komórkowy oddzielnie lub w grupach w prostokątnych kapilarach ze szkła krzemianowego o wewnętrznym przekroju 600 na 600 mikrometrów i grubości ścianki 120 mikrometrów. Aby to osiągnąć, weź pustą kapilarnę pionowo kciukiem i środkowym palcem i uszczelnij górny otwór palcem wskazującym.

Zbliż dolny otwór do sferoidy komórki w otaczającej ją cieczy, uwolnij palec wskazujący z górnego płynu otwierającego ze sterydem w środku. Zostanie natychmiast wchłonięty przez siły kapilarne. Dostosuj położenie sferoidy S w wypełnionej kapilarze za pomocą grawitacji.

Alternatywnie, zastosować steryd do kapilary za pomocą pipetowania. Należy zwrócić uwagę, aby otwór końcówki pipety był z jednej strony wystarczająco duży w stosunku do rozmiaru sferoidy S, a z drugiej strony mniejszy lub równy wewnętrznej średnicy kapilary. Następnie umieść kapilarnę zawierającą sferoidę S w specjalnym uchwycie na próbkę z mikroskopii.

Przymocuj uchwyt próbki z kapilarą do stołu pozycjonującego mikroskopu i wyrównaj położenie steroidu komórkowego tak, aby był wyśrodkowany i skupiony. Ustaw dopasowanie między arkuszem świetlnym a płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu mikroskopu na ścieżce wykrywania, regulując położenie lustra odbiciowego i soczewki cylindrycznej. Napełnij naczynia włosowate płodową surowicą cielęcą lub FCS przez 30 minut, aby wspomóc późniejszą adhezję komórkową steroidu komórkowego do wewnętrznej powierzchni szkła.

Pozostawić pozostałą powłokę FCS w zubożonej kapilarze do wyschnięcia przez co najmniej 12 godzin po wprowadzeniu steroidu komórkowego do kapilary pokrytej FCS. Tak jak poprzednio, pozostaw kapilar w inkubatorze na dodatkowe dwie do czterech godzin, aby spowodować adhezję komórkową sterydu. Następnie skonfiguruj część flx systemu mikroprzepływowego, w tym pułapkę bąbelkową.

Użyj pompy perystaltycznej, aby napełnić flx rurki pożywką hodowlaną zawierającą barwnik fluorescencyjny, lek lub środek. Najpierw zaciśnij kapilę bez pęcherzyków powietrza do rurki odpływowej, a następnie zaciśnij drugą stronę kapilary do rurki odpływowej. Dostosuj temperaturę cieczy w łaźni wodnej do żądanej wartości.

Następnie dostosuj pompę perystaltyczną do żądanej prędkości pompy. Zbierz pompowaną ciecz do odbiornika z konfiguracją otwartej pętli do zbierania i analizy danych. Ustaw moc lasera i czas integracji dla akwizycji obrazu.

Ustaw przyrost stosu ZS na wartość z zakresu od pięciu do 10 mikrometrów, co jest preferowane w przypadku trójwymiarowej analizy danych. Ponieważ grubość arkusza światła wynosi około 10 mikrometrów, przystąp do wykonywania pomiarów pojedynczych obrazów lub Zacksa poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowej w komórce steroidowej. Pokazano skan Zacka siedmiokomórkowego steroidu mc wcześniej inkubowanego z ośmioma mikromolowymi doksorubicynami przez sześć godzin.

Obrazy dostarczają szczegółowych informacji na temat wychwytu i dystrybucji doksorubicyny w komórkach oraz jej degradacji. Produkt w zewnętrznej warstwie komórkowej steroidowej doksorubicyny fluorescencyjnej jest zlokalizowany głównie w jądrze, podczas gdy w wewnętrznych obszarach sphe roid zielona fluorescencyjna dostarczana przez produkt degradacji staje się dominująca w błonie komórkowej. Wychwyt leku chemioterapeutycznego doksorubicyny w natywnej ludzkiej komórce raka piersi mc seven S przedstawiono dla pojedynczej warstwy komórkowej wybranej przez spm.

Po zastosowaniu dwóch mikromolowców i pożywki hodowlanej w układzie przepływowym, czerwona i zielona fluorescencja doksorubicyny i jej produktu degradacji wzrastała w sposób ciągły po zastosowaniu dwóch mikromolowych doksorubicyny w pożywce hodowlanej w systemie przepływowym, czerwona i zielona fluorescencja doksorubicyny i jej produktu degradacji wzrastała w sposób ciągły. Po opanowaniu trwa tylko kilka minut od zamontowania modułu eliminacji arkuszy świetlnych do zarejestrowania obrazów fluorescencyjnych próbek 3D. Podczas pomiaru i warunków przepływu najważniejsze jest, aby upewnić się, że próbka przylega do wewnętrznej powierzchni kapilary i uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do próbki, które mogłyby oderwać ją od kapilary.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć mikroskopię oświetlenia arkuszami świetlnymi dzięki wszechstronnemu modułowi, który można dostosować do różnych mikroskopów.