Name: Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj mikroskopię z oświetleniem płaszczyznowym SPIM dla mikroskopów odwróconych stosowaną do trójwymiarowych sferoidów komórkowych. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie dystrybucji leków fluorescencyjnych w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez Land Baden-Württemberg oraz przez Unię Europejską, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Autorzy dziękują Rainerowi Wittigowi (ILM Ulm) za dostarczenie linii komórkowej U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 oraz Claudii Hintze za umiejętną pomoc techniczną.

1. Hodowla i inkubacja sferoidów komórkowych
<ol>
	<li>Eksperyment 1: Sferoidy komórkowe inkubowane z lekiem chemioterapeutycznym
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5% agarozę w pożywce hodowlanej, dodając 0,45 g agarozy do 30 ml pożywki hodowlanej (ilość wystarczająca na 6 płytek).</li>
		<li>Podgrzać mieszaninę z kroku 1.1.1 do temperatury co najmniej 80 °C, mieszając ją od czasu do czasu.</li>
		<li>Nalać 50 µl podgrzanej mieszaniny z kroku 1.1.2 do każdego dołka płytki 96-dołkowej i pozostawić do zestalenia przez 1–2 h. Płytki przechowywać zamknięte i przykryte w lodówce w temperaturze 5 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Wysiać około 150 komórek raka piersi MCF-7 do każdego dołka przygotowanej płytki 96-dołkowej w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z pożywką Ham’s F-12 uzupełnioną o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Hodować sferoidy przez 5–7 dni do osiągnięcia średnicy około 200–300 µm w inkubatorze przy 5% CO2 i 37 °C.</li>
		<li>Inkubować sferoidy komórkowe z antybiotykiem z grupy antracyklin – chlorowodorkiem doksorubicyny przez 6 h w stężeniu od 2 µM do 8 µM (w pożywce hodowlanej) w inkubatorze przy 5% CO2 i 37 °C.</li>
		<li>Przemyć sferoidy komórkowe pożywką hodowlaną lub zrównoważonym roztworem soli Earle'a (EBSS) przed badaniem mikroskopowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment 2: Proces utleniania w sferoidach eksponujących sensor redox
	<ol>
		<li>Wysiać około 400 komórek glejaka U251-MG-L106 trwale transfekowanych glutationowo-czułym zielonym fluorescencyjnym sensorem redox Grx1-roGFP2 do dołków pokrytych żelem agarozowym (procedura opisana w krokach 1.1.1–1.1.3) płytki 96-dołkowej w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz hygromycynę B (150 µg/ml).</li>
		<li>Hodować sferoidy przez 5–7 dni do osiągnięcia średnicy około 200–300 µm w inkubatorze przy 5% CO2 i 37 °C.</li>
		<li>Dodać 10 µl roztworu nadtlenku wodoru (purum p.a., ≥ 30%) do 990 µl wody bi-destylowanej, aby przygotować 100 mM roztwór stokowy do wykorzystania w ciągu 12 h.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór stokowy z kroku 1.2.3 do stężenia 50 µM w EBSS bezpośrednio przed eksperymentem.</li>
		<li>Podczas pomiaru inkubować sferoidy komórkowe w systemie mikroprzepływowym z nadtlenkiem wodoru 50 µM w EBSS w celu utlenienia sensora redox.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment 3: Inicjacja i znakowanie nekrozy komórkowej w sferoidach
	<ol>
		<li>Wysiać około 400 komórek (np. komórek glejaka U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) do dołków pokrytych żelem agarozowym (procedura opisana w krokach 1.1.1–1.1.3) płytki 96-dołkowej w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz hygromycynę B (150 mg/ml).</li>
		<li>Hodować sferoidy przez 5–7 dni do osiągnięcia średnicy około 200–300 µm w inkubatorze przy 5% CO2 i 37 °C.</li>
		<li>Inkubować sferoidy komórkowe z rotenonem, inhibitorem mitochondrialnego transportu elektronów, przez 3 h w stężeniu 1 µM w pożywce hodowlanej w celu indukowania nekrozy komórkowej. Dodatkowo przeprowadzić wspólną inkubację z zielonym barwnikiem cytotoksycznością przez 3 h w stężeniu 1 µl w 1 ml pożywki hodowlanej, aby oznakować komórki nekrotyczne.</li>
		<li>Przemyć sferoidy komórkowe pożywką hodowlaną lub EBSS przed badaniem mikroskopowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Regulacja płata światła
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy upewnić się, że przerwa wiązki arkusza światła znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Położenie przerwy wiązki można ustawić wyłącznie poprzez obserwację arkusza światła w pozycji pionowej względem kapilary (patrz kroki 2.5 - 2.8).
<ol>
	<li>Używając mikroskopu odwróconego, zamocuj moduł wzbudzenia SPIM do płyty podstawowej stołu pozycjonującego, zgodnie z opisem w Ref. 16 (patrz Rycina 1A).</li>
	<li>Wyposaż mikroskop w obiektyw 10X/0,3 lub 20X/0,5 oraz odpowiedni filtr długoprzepustowy (np. λ ≥ 515 nm) w torze detekcji mikroskopu.</li>
	<li>Zamocuj kamerę integrującą do portu detekcji mikroskopu.</li>
	<li>Wykorzystaj równoległą wiązkę kolimowaną lasera lub diody laserowej z preferencyjną długością fali wzbudzenia 470 nm i wprowadź ją do modułu SPIM.</li>
	<li>Obróć soczewkę cylindryczną o 90 stopni, co ustawi arkusz światła w pozycji pionowej w celu osiowej regulacji przerzewienia wiązki arkusza światła.</li>
	<li>Umieść w uchwycie na próbki kapilarę zawierającą ciecz z barwnikiem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Przymocuj uchwyt z kapilarą do stołu pozycjonującego mikroskopu i wyrównaj położenie kapilary tak, aby była wycentrowana, a przerzewienie wiązki arkusza światła znajdowało się w ognisku.</li>
	<li>Wyreguluj przerzewienie wiązki poprzez zmianę położenia osiowej soczewki cylindrycznej. Po zakończeniu regulacji przykręć soczewkę.</li>
</ol>
3. Aplikacja sferoidów komórkowych i synchronizacja podawania do mikroskopu
<ol>
	<li>Umieść sferoidy komórkowe pojedynczo lub w grupach w prostokątnych kapilarach z borokrztanu szkła16 o przekroju wewnętrznym 600 µm x 600 µm i grubości ścianki 120 µm. Skuteczne okazały się dwie techniki wprowadzania sferoidu komórkowego.
	<ol>
		<li>Chwyć pustą kapilarę pionowo kciukiem i palcem środkowym, a górny otwór zatkaj palcem wskazującym. Zbliż dolny otwór do sferoidu komórkowego znajdującego się w otaczającym go płynie (EBSS lub pożywka hodowlana). Zabierz palec wskazujący z górnego otworu. Płyn wraz ze sferoidem komórkowym zostanie natychmiast zassany dzięki siłom kapilarnym. Dostosuj pozycję sferoidu w wypełnionej kapilarze, wykorzystując grawitację poprzez odpowiednie ustawienie kapilary w pozycji pionowej.</li>
		<li>Alternatywnie, wprowadź sferoid komórkowy do kapilary za pomocą pipetowania. Upewnij się, że otwór końcówki pipety jest z jednej strony wystarczająco duży dla rozmiaru sferoidu, a z drugiej strony mniejszy lub równy średnicy wewnętrznej kapilary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść kapilarę ze sferoidem w specjalnym uchwycie do próbek do mikroskopii.</li>
	<li>Zamocuj uchwyt z kapilarą na stole pozycjonującym mikroskopu i ustaw pozycję sferoidu komórkowego tak, aby był on wycentrowany i w ostrości.</li>
	<li>Dostosuj dopasowanie między arkuszem światła (light sheet) a płaszczyzną ogniskową obiektywu mikroskopu w torze detekcji, regulując pozycję lustra odbijającego i soczewki cylindrycznej (patrz: śruba regulacyjna na Rysunku 1B).</li>
	<li>Wyreguluj śrubę mikrometryczną (patrz: Rysunek 1B) zgodnie z indeksami refrakcji i aperturą numeryczną obiektywu, aby skompensować efekt akwarium (fishtank effect). 
	UWAGA: Różne indeksy refrakcji próbki i mediów otaczających obiektyw prowadzą do różnicy między przesunięciem obiektywu a przesunięciem płaszczyzny ogniskowej. Ponieważ arkusz światła jest przemieszczany przez rewolwer obiektywów, niedopasowanie między przesunięciem arkusza światła (odpowiadające przesunięciu obiektywu) a przesunięciem płaszczyzny ogniskowej jest kompensowane za pomocą ramienia dźwigni (patrz: Rysunek 1B). Śruba mikrometryczna służy do adaptacji odległości między górnym a dolnym pinem w celu dostosowania przesunięcia arkusza światła zgodnie z aperturą numeryczną obiektywu i indeksami refrakcji.</li>
</ol>
<img alt="Układ pułapkowania optycznego oraz schemat przedstawiający wzbudzenie laserowe i elementy mikroskopu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Zdjęcie modułu oświetlenia pojedynczej płaszczyzny zamontowanego na płycie podstawy stołu pozycjonującego mikroskopu odwróconego, (B) układ modułu oświetlenia pojedynczej płaszczyzny oraz synchronizacja zasilania mikroskopu w celu skompensowania niedopasowania wysokości (efekt akwarium) między płaszczyzną ogniskową a płaszczyzną oświetlenia. Δzo oznacza przesunięcie obiektywu, a Δzf przesunięcie płaszczyzny ogniskowej i arkusza światła. Wstawka przedstawia przekroje kapilar zawierających sferoidy. Lewo: kapilara prostokątna o średnicy wewnętrznej 600 µm (ścianka 120 µm). Prawo: Układ używany do rotacji. Wewnętrzna kapilara okrągła (średnica wewnętrzna 400 µm, średnica zewnętrzna 550 µm) jest obracana wewnątrz zewnętrznej kapilary prostokątnej. Przestrzeń między dwiema kapilarami jest wypełniona cieczą imersyjną.
4. Pomiar w dynamicznym środowisku ciekłym
UWAGA: Poprzedni protokół jest stosowany do inkubacji statycznej przed pomiarem, w którym sferoid komórkowy był wcześniej inkubowany, a następnie został utrzymany w kapilarze dzięki zwykłej grawitacji. Dalsza fiksacja nie jest konieczna. Jednak w przypadku pomiarów w płynących mediach, gdzie pożądana jest inkubacja dynamiczna, a co za tym idzie – środowisko dynamiczne w celu pomiaru kinetyki poboru, można przeprowadzić ten podprotokół. Kroki 4.5–4.9 są krytyczne, aby uniknąć przedostania się pęcherzyków powietrza do próbki.
<ol>
	<li>Napełnij kapilarę FCS na 30 min, aby wspomóc późniejszą adhezję sferoidu komórkowego do wewnętrznej szklanej powierzchni.</li>
	<li>Pozostaw pozostałą powłokę z FCS w opróżnionej kapilarze do wyschnięcia przez co najmniej 12 hr.</li>
	<li>Wprowadź sferoid komórkowy do kapilary powleczonej FCS, zgodnie z opisem w kroku 3.2.</li>
	<li>Pozostaw kapilarę w inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez dodatkowe 2–4 hr, aby umożliwić adhezję sferoidu.</li>
	<li>Przygotuj część dopływową systemu mikroprzepływowego (patrz Rysunek 2). Użyj pompy perystaltycznej, aby napełnić przewód dopływowy (średnica wewnętrzna: 0.89 mm) pożywką hodowlaną zawierającą barwnik fluorescencyjny, lek lub czynnik.</li>
	<li>Podłącz część dopływową systemu mikroprzepływowego do pułapki na pęcherzyki powietrza (patrz Rysunek 2).</li>
	<li>Najpierw zamocuj kapilarę bez pęcherzyków powietrza do przewodu dopływowego, a następnie zamocuj drugą stronę kapilary do przewodu odpływowego.</li>
	<li>Ustaw temperaturę cieczy w kąpieli wodnej na pożądaną wartość (np. 37 °C).</li>
	<li>Ustaw pompę perystaltyczną na pożądaną prędkość pompowania (np. szybkość przepływu: 9 µl/min; prędkość przepływu w kapilarze: 25 mm/min).</li>
	<li>Zbieraj pompowaną ciecz do naczynia odbiorczego (układ otwarty), zawracaj ją do źródła (układ zamknięty) lub podawaj bezpośrednio do przewodu pompy perystaltycznej (szczelny układ zamknięty).</li>
</ol>
<img alt="Układ do cytometrii przepływowej, system mikrokapilarny, oświetlenie arkuszem światła, schemat analizy komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Układ mikrofluidyczny (otwarty i szczelnie zamknięty obieg); wstawka: Oświetlenie sferoidu w mikrokapilarze przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszu światła połączonej z mikroskopem odwróconym.
5. Pozyskiwanie i analiza danych
<ol>
	<li>Ustaw moc lasera i czas integracji dla akwizycji obrazu.</li>
	<li>Należy dopilnować, aby parametry określone w kroku 5.1 nie przekraczały wartości dawki światła wynoszącej około 50–100 J/cm2 dla komórek natywnych lub 10–20 J/cm2 dla komórek inkubowanych z barwnikiem fluorescencyjnym lub transfektowanych plazmidem kodującym białko fluorescencyjne, aby uniknąć fototoksyczności (szczegóły w Ref. 12).</li>
	<li>Ustaw przyrost dla stosu z na wartość ∆z = 5–10 µm, co jest preferowane w przypadku trójwymiarowej analizy danych, ponieważ grubość arkusza światła wynosi około 10 µm.</li>
	<li>Wykonaj pomiary pojedynczych obrazów lub stosów z poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowej w obrębie sferoidu komórkowego.</li>
</ol>

<ol><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1990).</li>
<li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>König, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li>
<li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening%3A+the+multi-cellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li>
<li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027(2010).</li>
<li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li>
<li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518(2012).</li>
<li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li>
<li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li>
<li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li>
<li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007(2013).</li>
<li>Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , 7,787,179 B2 (2010).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li>
<li>Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , EP 13 184 931.7 (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Niniejszy manuskrypt opisuje arkusz świetlny lub urządzenie do mikroskopii oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM), które jest zoptymalizowane pod kątem trójwymiarowych systemów komórkowych, np. wielokomórkowych sferoid nowotworowych (MCTS). Trzy przykładowe zastosowania obejmują (1) wychwyt leku cytostatycznego i jego częściową konwersję do produktu degradacji (którego udział w skuteczności chemioterapii nadal wymaga oceny), (2) pomiary stanu redoks za pomocą genetycznie kodowanego czujnika glutationu po dodani...

Oprócz dobrze znanych metod (konfokalna lub wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa1-4, mikroskopia z oświetleniem strukturalnym5,6), arkusz świetlny lub mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM) okazała się wartościową metodą obrazowania 3D7,8,9. Szczególnie interesujące jest jego zastosowanie w trójwymiarowych hodowlach komórkowych, np. wielokomórkowych sferoidach nowotworowych (MCTS), które są coraz częściej wykorzystywane do badań nad odkrywaniem leków10,11. Ponadto SPIM jest metodą preferencyjną, gdy nawet przy długotrwałej ekspozycji lub powtarzających się pomiarach wymagane są niskie dawki światła do utrzymania żywotności próbki, ponieważ do pomiaru każdej płaszczyzny próbki tylko ta płaszczyzna jest wystawiona na działanie światła. Jest to przeciwieństwo innych technik mikroskopowych, w których w celu wykrycia każdej płaszczyzny ogniskowej cała próbka jest oświetlana, tak że po zarejestrowaniu wielu płaszczyzn dawka światła sumuje się i może uszkodzić próbkę12.
Mikroskopia arkuszowa światła lub SPIM opiera się na oświetlaniu próbki w kierunku prostopadłym do ścieżki obserwacji, albo za pomocą soczewki cylindrycznej, albo przez skanowanie wzbudzającej wiązki laserowej (dla przeglądu patrz Ref. 8). Często wymaga to specjalnych komór na próbki13,14 lub matryc, np. agarozy 7,15, stosowanych w specjalnych drogich mikroskopach. Jako alternatywę dla tych systemów opracowano porównywalnie proste urządzenie oświetleniowe do SPIM i dostosowano je do konwencjonalnego mikroskopu odwróconego16 (patrz rysunek 1). Składa się z wiązki laserowej rozprężonej do średnicy 8 mm i zogniskowanej przez soczewkę cylindryczną (ogniskowa: 50 mm, apertura numeryczna: 0,08) na arkuszu światła o grubości 6–10 μm przy głębi ostrości około 100 μm. Próbki umieszcza się w prostokątnej kapilarze o średnicy wewnętrznej 600–900 μm, umieszczonej przed soczewką obiektywu mikroskopu w celu wykrywania fluorescencji. Te główne cechy są obecnie uzupełniane i optymalizowane poprzez zastosowanie zaawansowanych metod mikrokapilarnych do zatrzymywania i obracania próbek, synchroniczną regulację arkusza światła oświetlającego (w kierunku osiowym) i soczewki obiektywu używanego do detekcji fluorescencji (identyczne długości drogi optycznej przemieszczenia wymagają korekty posuwu mechanicznego) oraz adaptację systemu mikroprzepływowego do nakładania barwników fluorescencyjnych. środków farmaceutycznych lub leków, minimalizując w ten sposób wymagane ilości i wydatki.

<table><tbody><tr><td>Płytka do mikromiareczkowania</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>Do hodowli sferoidów komórkowych</td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>Do hodowli sferoidów komórkowych</td></tr><tr><td>Linia komórkowa MCF-7</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Linia komórkowa</td><td></td><td></td> U251-MG-L106 <td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Pożywka</td></tr> <tr>hodowlana<td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Suplement do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Higromycyna B</td><td>PAA Laboratories&nbsp; &nbsp;</td><td>P02-015</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Suplement do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Doksorubicyna</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Barwnik fluorescencyjny (UWAGA: ostra toksyczność)</td></tr><tr><td>Zielony barwnik cytotoksyczności</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescencyjny barwnik cytotoksyczny</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Inhibitor komórkowy (UWAGA: ostra toksyczność)</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Odczynnik do utleniania (UWAGA: toksyczność ostra)</td></tr><tr><td>Kapilar</td><td>VitroCom&nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>Kamera CCD</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych AxioVision</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>wersja 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Dioda laserowa</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Używana ze sterownikiem PDL800-B</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Ponownie skalibrowana w celu zmniejszenia minimalnej prędkości pompy o 1/10&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>IDEX Health & Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Opisany jest moduł do mikroskopii świetlnej lub jednopłaszczyznowej (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych, np. wielokomórkowych sferoid nowotworowych (MCTS). Moduł wzbudzenia SPIM kształtuje i odchyla światło w taki sposób, że próbka jest oświetlona przez arkusz świetlny prostopadły do ścieżki detekcji mikroskopu. System charakteryzuje się zastosowaniem prostokątnej kapilary do przetrzymywania (a w wersji zaawansowanej również podejścia mikrokapilarnego do obracania) próbek, synchroniczną regulacją arkusza światła oświetlającego i soczewki obiektywu służącego do detekcji fluorescencji, a także adaptacją układu mikroprzepływowego do aplikacji barwników fluorescencyjnych, środków farmaceutycznych lub leków w małych ilościach. Podano protokół pracy z tym systemem i podano pewne szczegóły techniczne. Reprezentatywne wyniki obejmują (1) pomiary wychwytu leku cytostatycznego (doksorubicyny) i jego częściowej konwersji do produktu degradacji, (2) pomiary redoks za pomocą genetycznie kodowanego czujnika glutationu po dodaniu środka utleniającego oraz (3) inicjację i znakowanie martwicy komórek po zahamowaniu mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Omówiono różnice i zalety obecnego modułu SPIM w porównaniu z istniejącymi systemami.

Eksperyment 1: Sferoidy komórkowe inkubowane z lekiem chemioterapeutycznym
Skan z-stack wcześniej inkubowanego sferoidu komórek MCF-7 (8 µM doksorubicyny, 6 godz.) przedstawiono na Rysunku 3. Dostarcza on szczegółowych informacji na temat poboru komórkowego i dystrybucji doksorubicyny17 oraz jej produktu degradacji18,19. W zewnętrznej warstwie komórek sferoidu czerwona fluorescencja doksorubicyny jest zlokalizowana głównie w jądrze, podcz...

Opisano moduł do mikroskopii z oświetleniem jednopłaszczyznowym (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych. Próbka znajduje się w prostokątnej kapilarze, a za pomocą układu mikroprzepływowego można w niewielkich ilościach aplikować barwniki fluorescencyjne, środki farmaceutyczne lub leki.

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie mikroskopii oświetlenia jednopłaszczyznowego przy użyciu modułu wzbudzenia arkusza świetlnego dla mikroskopów odwróconych i zastosowanie go do trójwymiarowych sferoid komórkowych. Osiąga się to poprzez użycie pipety w celu przeniesienia sferoidy komórkowej z dołka płytki mikromiareczkowej do drugiego dołka w celu inkubacji po umyciu. Sferoida S jest następnie wprowadzana do prostokątnej kapilary.Drugim krokiem jest zamontowanie modułu oświetlenia arkusza świetlnego do płyty podstawy stołu pozycjonującego mikroskop odwrócony. Następnie kapilar zawierający steryd umieszcza się w specjalnym uchwycie na próbkę do mikroskopii. Ostatnim krokiem jest ustawienie dopasowania między arkuszem światła a płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu mikroskopu na ścieżce wykrywania.Ostatecznie, trójwymiarowe pomiary fluorescencji można przeprowadzić poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowej w sferoidzie komórki w celu uzyskania informacji o pojedynczych obrazach lub Zacks dotyczących wchłaniania leków lub struktury sferoidy S. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi mikroskopami z arkuszami świetlnymi jest to, że jest ona ekonomiczna i bardzo wsz

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Opisano pełną konstrukcję niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z przeskanowaniem w czasie rzeczywistym. System ten, który może być łatwo wykorzystany do mikroskopii i mikroendoskopii w tempie wideo, umożliwia zastosowanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych w standardowych komercyjnych systemach konfokalnych, przy ułamku ich kosztów.

Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Poznaj mikroskopię z oświetleniem płaszczyznowym SPIM dla mikroskopów odwróconych stosowaną do trójwymiarowych sferoidów komórkowych. Ta metoda umożliwia precyzyjne badanie dystrybucji leków fluorescencyjnych w żywych komórkach.

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Przeglądaj więcej filmów