Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie prawa dyfuzji lipidów i białek w żywych błonach komórkowych, aby to zrobić. Po pierwsze, funkcja rozpraszania punktowego mikroskopu jest kalibrowana poprzez obrazowanie nanoskopowych kulek fluorescencyjnych. Następnie wektory oparte na liposomach, w tym fluorescencyjnie znakowaną cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, są przygotowywane i wprowadzane do żywych komórek przez transfekcję lub bezpośrednie włączenie.

Szybkie obrazowanie błony plazmatycznej żywej komórki odbywa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Na koniec obliczana jest funkcja korelacji i ekstrahowane jest prawo dyfuzji molekularnej przez dopasowanie Gaussa. Wynikowe dane.

Zidentyfikuj tryb ruchu badanego lipidu lub białka. Główną przewagą tej techniki nad konwencjonalnym odzyskiwaniem fluorescencji po podejściu fotowybielania lub klasyczną jednopunktową spektroskopią korelacji fluorescencji jest to, że umożliwia ona pomiar prawa dyfuzji molekularnej. Wiemy, że znajomość systemu jest priorytetowa.

Jest to również sprzeczne z klasycznymi metodologiami śledzenia pojedynczych cząstek. W tym przypadku przemieszczenie mlekowe jest mierzone bez konieczności wyodrębniania trajektorii cząstek. W związku z tym metal ten może być łatwo stosowany w połączeniu ze stosunkowo uznaną i gęstą cząsteczką, jak na przykład genetycznie kodowane białka fluorescencyjne.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórkowej biologii molekularnej, takie jak to, w jaki sposób ruch białek lub lipidów reguluje strukturę błony plazmatycznej i organizację funkcjonalną, odpowiedź na te i powiązane pytania będzie dostępna dla każdego, a przy użyciu tylko komercyjnego mikroskopu, demonstracja całej procedury zostanie przeprowadzona przez zo, doktorantka z laboratorium. Rozpocznij ten protokół od kalibracji funkcji rozproszenia punktowego systemu obrazowania. Zacznij od rozcieńczenia 10 mikrolitrów roztworu kulek fluorescencyjnych w 90 mikrolitrach wody destylowanej uprzednio dodanej do probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów.

Sonikuj roztwór przez 20 minut w saunie za pomocą skalpela, odetnij centymetrowy kwadratowy kawałek żelu różanego 3% AGA i umieść go na szalce Petriego. Umieść 10 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu kulek fluorescencyjnych na wierzchu żelu. Następnie za pomocą kleszczy odwróć kawałek żelu na dwucentymetrowej szklanej szalce Petriego.

Ponownie, za pomocą kleszczy. Dociśnij kawałek żelu, aby rozproszyć kroplę. Następnie włącz konfigurację akwizycji, która składa się z komercyjnego mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Wyposażony w inkubator i szybką kamerę E-M-C-C-D podłączoną do komputera z uruchomionym pakietem aplikacji, zaawansowanym oprogramowaniem fluorescencyjnym i/lub oprogramowaniem do akwizycji obrazu Solis. Umieścić próbkę w uchwycie na stoliku mikroskopu za pomocą dwuteownika i światła przechodzącego. Skoncentruj się na granicy żelu.

Następnie wyśrodkuj żel nad obiektywem i dostosuj ostrość, aby rozpocząć procedurę wyrównania laserowego w pakiecie aplikacji Leica, zaawansowanym oprogramowaniu fluorescencyjnym, wybierz automatyczne wyrównanie i postępuj zgodnie z procedurą automatycznego wyrównywania. Po ustawieniu lasera w oprogramowaniu do akwizycji i / lub Solis kliknij przycisk ustawień. Otworzy się okno.

Ustaw ekspozycję aparatu na 100 milisekund, wzmocnienie EM na 1000, powtórzenie na 100 i zaznacz pole wyboru transferu klatek. Następnie kliknij okno automatycznego zapisywania i wstaw nazwę eksperymentu. Znajdź pole widzenia z pojedynczymi punktami.

Skoncentruj się na jasnym punkcie, który zwykle reprezentuje agregat koralików. Następnie zdobądź 100 klatek. Powtórz ten krok od pięciu do sześciu razy, aby uzyskać obrazy kilku pojedynczych punktów.

Zaimportuj pozyskane serie do programu do przetwarzania danych, takiego jak MATLAB, i uśrednij stos w czasie. Następnie wyświetl zmierzony obraz o średniej intensywności. Powiększ jasną, małą fluorescencyjną plamkę i z grubsza zidentyfikuj środek jako najjaśniejszy piksel plamki.

Na koniec wybierz rozmiar obszaru zainteresowania, który chcesz narysować wokół cząstki, zwykle jeden mikron obok, aby dopasować wybrany rozkład intensywności do funkcji Gaussa. Wybrać dopasowanie gause polecenia. Sprawdź uzyskane pozostałości, aby zweryfikować dobre dopasowanie.

Na koniec skalibruj kamerę zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Po skalibrowaniu systemu nadszedł czas, aby oznaczyć komórki do akwizycji obrazu. Przygotowanie liposomów wymaganych do włączenia lipidów należy rozpocząć od rozpuszczenia jednego miligrama DOPE, jednego miligrama D-O-T-A-P i jednego miligrama PPE ADO 4 88 w oddzielnej probówce do mikrowirówki zawierającej jeden mililitr chloroformu.

Następnie połącz po 0,5 mililitra roztworów DOPE i D-O-T-A-P z 25 mikrolitrami roztworu PPE ATO 4 88. Umieść rurkę w parowniku odśrodkowym i rozpocznij wirowanie przy 280 gs. Uruchom pompę próżniową i pozwól jej wirować przez 24 godziny.

Następnego dnia dodaj 0,5 mililitra 20-milimolowego buforu heis do probówki i wiruj przez 15 minut. Następnie umieść probówkę w kąpieli sonicznej i sonikuj przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Aby przygotować komórki, umyj naczynie P 100 z zlewającym się jajnikiem chomika chińskiego lub CHOK trzy razy jedną komórkę 10 mililitrami PBS.

Następnie dodaj jeden mililitr trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut. Po inkubacji dodać dziewięć mililitrów D-M-E-M-F 12 uzupełnionych 10% FBS, aby zawiesić komórki w nasionach 150 mikrolitrów tego roztworu zawierającego komórkę. Na szklanej szalce Petriego o średnicy 22 milimetrów zawierającej 800 mikrolitrów tego samego podłoża.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. W celu włączenia lipidów zastąp pożywkę komórkową 500 mikrolitrami pożywki wolnej od surowicy i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji dodaj dwa mikrolitry roztworu liposomu i inkubuj przez kolejne 15 minut.

Następnie umyj komórki PBS i dodaj nowy DM EMF 12. Przed obrazowaniem co najmniej 12 godzin przed eksperymentem włącz inkubator mikroskopu, aby doprowadzić stolik mikroskopu i elementy optyczne do temperatury eksperymentalnej. Najtrudniejszym etapem tej procedury jest nabycie.

Aby zapewnić sukces, pamiętaj o optymalizacji każdego parametru akwizycji dla systemu. W trakcie badania. W dniu eksperymentu włącz mikroskop, poczekaj, aż kamery osiągną temperaturę roboczą.

Do przeprowadzenia eksperymentu wykorzystamy dwie kamery. Kamera pierwsza zostanie użyta do obrazowania, a kamera druga zostanie użyta do wybrania komórki. Taka konfiguracja pozwoli na uzyskanie najszybszego możliwego do osiągnięcia czasu akwizycji w oprogramowaniu.

Ustawianie parametrów obrazowania w świetle przechodzącym. Wprowadź 20 milisekund Jako czas naświetlania wprowadź jeden dla wzmocnienia EM dla obu aparatów. Następnie otwórz okno trybu kontrastu w oprogramowaniu i wyjdź.

Kliknij BF, aby wybrać opcję jasnego pola. Umieść próbki w uchwycie, patrząc na próbkę przez okulary. Ustawić ostrość próbki.

Następnie ręcznie wyślij światło do kamery pierwszej i delikatnie popchnij szczeliny, aby oświetlić tylko ROI, który ma być zobrazowany. Następnie przenieś komórkę do wybranego regionu i za pomocą oprogramowania wyślij światło do kamery drugiej. Następnie w oprogramowaniu narysuj ROI, aby wygenerować odniesienie.

Najpierw, aby wyrównać laser za pomocą oprogramowania, wybierz automatyczne wyrównanie. Następnie, aby rozpocząć procedurę automatycznego wyrównywania, wybierz opcję włącz kolimator. Następnie otwórz inkubator na górze i skolimuj wiązkę laserową.

Gdy laser zostanie wyrównany w lewym dolnym rogu okna oprogramowania po lewej stronie, kliknij przycisk 70, aby ustawić głębokość penetracji na 70 nanometrów. Będzie to odpowiadało kątowi padania lasera na dolną szybę wynoszącemu około 70 stopni w pakiecie aplikacji Leica. Zaawansowane oprogramowanie fluorescencyjne czas naświetlania.

Wprowadź wartość 70 milisekund w polu tekstowym Wzmocnienie EM. Wprowadź 1000, aby zrobić to samo w aparacie drugim. Otwórz okno ustawień i wprowadź te same liczby w odpowiednich polach tekstowych.

Następnie kliknij przycisk na żywo. Fluorescencja zostanie wysłana do pierwszej kamery, a na ekranie pojawi się obraz próbki. Przesuwać próbkę, aż komórka fluorescencyjna dotrze do obszaru odniesienia będącego przedmiotem zainteresowania.

Następnie naciśnij przycisk z przodu korpusu mikroskopu, aby wysłać światło do kamery drugiej i dokładnie przesuń pokrętło pozycyjne Z, aby ustawić ostrość na błonie komórkowej w oprogramowaniu i / lub jedynym. Otwórz okno ustawień i ustaw minimalny możliwy do osiągnięcia czas ekspozycji 1000 EM gain croppped sensor mode 10 na piąte powtórzenia i ustaw opcję automatycznego zapisywania, aby rozpocząć rejestrowanie serii obrazów. Kliknij ikonę aparatu w oprogramowaniu i poczekaj na zakończenie pobierania.

Następnie otwórz okno ustawień, wyłącz wzmocnienie EM i usuń zaznaczenie opcji trybu przyciętego. Podczas akwizycji temperatura kamery zwykle wzrasta o około dwa do trzech stopni. Dlatego przed uzyskaniem obrazów z nowej komórki poczekaj, aż zostanie osiągnięta optymalna temperatura pracy.

Ponownie, po zakończeniu obrazowania, postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, aby obliczyć średnie przemieszczenie kwadratowe z obrazowania w celu uzyskania fluorescencyjnie znakowanego wariantu cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Komórki CHOK one zostały albo znakowane ADO 4 88 PPE, albo transfekowane transferem w receptorze lub T-F-R-G-F-P i zobrazowane przez TIRF, jak opisano w tym filmie. Jak widać tutaj, zmierzone prawo dyfuzji dla ADO 4 88 PPE jest płaskie, co wskazuje na głównie swobodną dyfuzję, jak wcześniej wykazano za pomocą fluorescencji zubożenia emisji wymuszonej, spektroskopii korelacji lub pomiarów FCS po transfekcji z T-F-R-G-F-P, zmierzone prawo dyfuzji dla T-F-R-G-F-P jest początkowo płaskie, pozostając poniżej 100 nanometrów średniego przemieszczenia molekularnego ze średnim pozornym współczynnikiem dyfuzji wynoszącym około 0,7 mikrona do kwadratu na sekundę.

Po tym następuje gwałtowny spadek pozornej dyfuzyjności do 0,2 mikrona do kwadratu na sekundę. Wartość zwykle mierzona za pomocą dyfrakcji ogranicza FCS. Warto zauważyć, że jak pokazuje ten ostatni przykład, obecne podejście może z łatwością zmierzyć średnie przemieszczenie molekularne z rozdzielczością kilkudziesięciu nanometrów, nawet przy użyciu stosunkowo ciemnych i gęstych znaczników, takich jak GFP.

Co więcej, skala przestrzenna, w której pozorny współczynnik dyfuzji zaczyna się zmniejszać, ustala charakterystyczną wielkość częściowego uwięzienia białka przez szkielet błonowy na około 120 nanometrów, zgodnie z wcześniejszymi szacunkami. Po opanowaniu procedury analizy danych i jej akwizycji można dokonać w ciągu kilku minut. Wierzymy, że ta technika utoruje drogę naukowcom z dziedziny biologii komórkowej i molekularnej do łatwego i ilościowego zbadania czasoprzestrzennej regulacji dyfuzji białek i lipidów w próbkach żywych.