Name: Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj ocenę konformacji glikoprotein otoczki HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA. Ta metoda umożliwia badanie interakcji przeciwciał monoklonalnych z białkami Env w warunkach wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jamesowi Robinsonowi za hojny dar mAb A32, 17b, 48d i C11. PGT 121 został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Cat#12343). Praca ta była wspierana przez Lidera Programu Kanadyjskiej Fundacji na rzecz Innowacji #29866, przez CIHR działającą #257792, przez grant FRQS Establishment of Young Scientist #24639 dla AF oraz przez grant CRCHUM continuum, a także przez grant katalizatora CIHR #126630 dla AF i MR. AF jest odbiorcą stypendium FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 #24639. MV otrzymał wsparcie w ramach CIHR Doctoral Research Award #291485.

1. Dzień 1 - Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Płytka 2 x 104 komórki ludzkiego kostniakomięsaka (HOS) na studzienkę w nieprzezroczystej, 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej odpowiedniej do odczytu luminescencji. Użyj zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny. Inkubować do następnego dnia w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Dzień 2 – Transfekcja polietyleninu (PEI)
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę transfekcyjną zgodnie z kolejnymi krokami. Dostosuj odczynniki i ilości DNA zgodnie z liczbą studzienek, które mają być transfekowane tym samym Env.</li>
	<li>Rurka A: Dodaj plazmid kodujący 10 ng Tat (taki jak pTat-III27) i plazmid kodujący 150 ng Env do 5 μl DMEM uzupełnionego 25 mM HEPES.</li>
	<li>Plazmid kodujący Tat jest wymagany tylko w przypadku korzystania z plazmidów kodujących Env zależnych od Tat, takich jak pSVIII.</li>
	<li>Probówka B: Dodaj 450 ng PEI (z roztworu 1 μg/μl) do 5 μl DMEM.</li>
	<li>Dodać zawartość probówki B do probówki A. Dokładnie wymieszać przez wirowanie przez 10 sekund i inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22 °C).</li>
	<li>Dodać 10 μl mieszanki transfekcyjnej do dołka płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Dzień 4 – ELISA
<ol>
	<li>Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować możliwą endocytozę kompleksów Env/przeciwciała.</li>
	<li>Przygotować 250 ml buforu myjącego na każdą płytkę, która jest używana w tym samym czasie. Bufor płuczący to 1x sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 150 mM NaCl), uzupełniona 1 mM MgCl2 i 1,8 mM CaCl2.</li>
	<li>Przygotuj 125 ml buforu blokującego na płytkę, dodając 1% beztłuszczowego mleka w proszku i 5 mM Tris pH 8,0 do buforu myjącego.</li>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i mieszaninę transfekcyjną (supernatant) z płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu blokującego do studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 50 μl przeciwciała (lub surowicy) do dołka, rozcieńczonego do odpowiedniego stężenia w buforze blokującym. Zazwyczaj stosuje się stężenie 1 μg/ml. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3x 100 μl buforem blokującym, a następnie powtórzyć proces mycia 3x za pomocą 100 μl buforu myjącego.</li>
	<li>Usunąć supernatant, dodać 100 μl buforu blokującego i inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego w stosunku 1/3 000 w buforze blokującym. Różnią się optymalnym rozcieńczeniem przeciwciał w zależności od różnic producenta. Inkubować 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3x 100 μl buforem blokującym, a następnie powtórzyć proces mycia 3x za pomocą 100 μl buforu myjącego.</li>
</ol>
4. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Usunąć supernatant z płytki i dodać 30 μl 1x substratu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) do dołka.</li>
	<li>Odbierać sygnał chemiluminescencji przez 1 sekundę/studzienkę na odpowiednim czytniku płytek zgodnie z instrukcjami producenta. Czas odczytu może się różnić w zależności od różnic sprzętowych.</li>
</ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
<li>Bonsignori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity-Mediating+Antibodies+from+an+HIV-1+Vaccine+Efficacy+Trial+Target+Multiple+Epitopes+and+Preferentially+Use+the+VH1+Gene+Family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family.</a> J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).</li>
<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ten test jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania interakcji określonych mAb z trimerycznym Env HIV-1 ulegającym ekspresji na powierzchni komórki. Po ustaleniu protokołu można go stosować przy średniej lub wysokiej przepustowości przy niskich całkowitych kosztach materiałów i niewielkiej ilości przeciwciał. Ponieważ test ten jest oparty na transfekcji, można go łatwo dostosować do koekspresji białek komórkowych, takich jak CD4, w celu zbadania ich wpływu na konformację Env.
Jednak baza transf...

Wejście ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), w którym pośredniczą glikoproteiny otoczki wirusa trimerycznego (Env), jest pierwszym etapem cyklu zakaźnego. Będąc jedynym narażonym antygenem wirusowym prezentującym się na powierzchni wirionów, trimer Env wywołuje przeciwciała neutralizujące i nieneutralizujące. W związku z tym stanowi interesującego kandydata do projektowania immunogenów szczepionkowych. Jednak badania szczepień Env w postaci rozpuszczalnej lub rekombinowanej wywołały odpowiedzi z minimalną skutecznością przeciwko większości pierwotnych izolatów HIV-11-3. Niemniej jednak częściowa skuteczność zaobserwowana w badaniu klinicznym szczepionki RV1444 odnowiła zainteresowanie wirusem HIV-1 Env jako kandydatem na immunogen. Zostało to potwierdzone w niedawnym badaniu opisującym, że przeciwciała anty-Env wywołane szczepionką były wystarczające do wytworzenia pewnego stopnia ochrony przed wyzwaniami SIV i HIV5.
Po zsyntetyzowaniu w retikulum endoplazmatycznym, prekursor glikoproteiny Env, gp160, przechodzi różne modyfikacje potranslacyjne, które są kluczowe dla jego zdolności do napędzania procesu fuzji wirusa. Prekursor Env musi prawidłowo się fałdować i łączyć w trimery, zanim zostanie rozszczepiony na swoje pozacytoplazmatyczne podjednostki gp120 i transbłonowe gp416-10, z oddziaływaniami niekowalencyjnymi utrzymującymi związek gp120-gp41. Zainfekowana maszyneria komórkowa jest również odpowiedzialna za silnie glikozylujący Env, stanowiący około 50% jego całkowitej masy11,12. Uzyskana złożona struktura pozwala Env być konformacyjnie elastycznym13,14, zapewniając jednocześnie metastabilność, która, jak się uważa, pozwala Env na adaptację i ukrywanie pewnych wysoce immunogennych epitopów, które w przeciwnym razie zostałyby odsłonięte15-19, podkreślając znaczenie lepszego zrozumienia różnych konformacji pobieranych przez natywny trimer Env.
Do tej pory opracowano kilka technik i z powodzeniem wykorzystano je do badania zmian konformacyjnych Env. Różnią się one jednak swoimi ograniczeniami, często są ograniczone do określonych kontekstów Env. Na przykład testy powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub immunoprecypitacji z wykorzystaniem specyficznych dla konformacji przeciwciał monoklonalnych (mAb) opierają się na monomerycznych rozpuszczalnych lub rozpuszczonych cząsteczkach Env, o których wiadomo, że różnią się immunogenetycznie od ich trimerycznych form20,21. Ostatnie badania sugerują również, że rozszczepienie wpływa na konformacje Env, powodując ekspozycję epitopów rozpoznawanych głównie przez przeciwciała nieneutralizujące14,22,23.
Tutaj szczegółowo opisujemy metodę, która pozwala na szybkie i łatwe określenie konformacji komórkowych trimerów Env18,24-26. Po przejściowej transfekcji Env w ludzkiej przylegającej linii komórkowej wykrywa się wiązanie przeciwciał specyficznych dla Env za pomocą prostej reakcji chemiluminescencyjnej. Technika ta może być również wykorzystana do scharakteryzowania preferencji konformacyjnych przeciwciał zależnych od konformacji. W związku z tym test ten zapewnia solidną i wysoce elastyczną metodę wykrywania.

<table><tbody><tr><td>Komórki HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Biała nieprzezroczysta płytka do hodowli tkankowej, 96-dołkowa, płaskodenna</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina, liniowa, 25 000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Przygotowany w roztworze 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-ludzka IgG, peroksydaza sprzężona</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszony substrat chemiluminescencyjny</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, czytnik płytek</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej hiv-1 przy użyciu komórkowego testu elisa

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Glikoproteiny otoczki HIV-1 (Env) pośredniczą w wnikaniu wirusa do komórek docelowych i są niezbędne w cyklu zakaźnym. Zrozumienie, w jaki sposób te glikoproteiny są w stanie napędzać proces fuzji poprzez zmiany konformacyjne, może doprowadzić do zaprojektowania lepszych, skuteczniejszych immunogenów dla strategii szczepień. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env przez przeciwciała monoklonalne. Po ekspresji trimerycznego Env HIV-1 na powierzchni transfekowanych komórek, z komórkami inkubuje się specyficzne dla konformacji przeciwciała anty-Env. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową i prosta reakcja chemiluminescencyjna są następnie wykorzystywane do wykrywania przeciwciał związanych. System ten jest bardzo elastyczny i może wykrywać zmiany konformacyjne Env indukowane przez rozpuszczalne białka CD4 lub komórkowe. Wymaga minimalnej ilości materiału i nie wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu ani know-how. W związku z tym technikę tę można ustalić dla średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych antygenów i przeciwciał, takich jak nowo wyizolowane przeciwciała.

Wykorzystując opisaną powyżej ogólną procedurę, dostosowaliśmy protokół do oceny wpływu rozpuszczalnego CD4 (sCD4) oraz koekspresji komórkowego CD4 na ekspozycję epitopów CD4i w przypadku Env typu dzikiego (wt) lub zmutowanego, zgodnie z wcześniejszymi opisami18,24,25,28. Rycina 1 schematycznie przedstawia ogólną procedurę oraz ekspozycję epitopów CD4i po traktowaniu sCD4 lub w wyniku koekspresji komórkowego CD418. Na Rycini 2 wykorzystaliśmy sCD4 do wywołania zmian...

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie glikoprotein otoczkowych RIC HIV lub potwierdzenie ENV za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję komórek adherencji w celu ekspresji chimerycznych białek HIV one E NV na powierzchni komórki. W drugim etapie komórki są inkubowane z przeciwciałami monoklonalnymi anty ENV, które będą wiązać ENV w zależności od ekspozycji na epitopy.Następnie dodaje się przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP w celu ilościowego określenia interakcji przeciwciał za pomocą testu chemiluminescencyjnego. Uzyskuje się wyniki, które pokazują względne poziomy przeciwciał związanych z VNV w oparciu o względne jednostki świetlne nabyte dla każdego z nich. Cóż, główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wiązanie oparte na faktach, jest to, że technikę tę można wykonać przy małej ilości przeciwciał i przy wysokiej przepustowości, postdoc w laboratorium będzie wykonywał tę technikę.Ludzkie komórki kostniakomięsaka są używane w tym eksperymencie na dzień przed płytką transfekcyjną, dwa razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. W nieprzezroczystej 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej odpowiedniej

conformational-evaluation-hiv-1-trimeric-envelope-glycoproteins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.

Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Ilustrujemy tutaj test wiązania błon in vitro, w którym interakcje między HIV-1 Gag a błonami lipidowymi są wizualnie analizowane za pomocą znakowanego YFP Gag syntetyzowanego w systemie translacji in vitro opartym na kiełkach pszenicy i GUV przygotowanych techniką elektroformacji.

Wizualizacja wiązania knebla HIV-1 z błonami gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj ocenę konformacji glikoprotein otoczki HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA. Ta metoda umożliwia badanie interakcji przeciwciał monoklonalnych z białkami Env w warunkach wysokiej przepustowości.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Przeglądaj więcej filmów