Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie glikoprotein otoczkowych RIC HIV lub potwierdzenie ENV za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję komórek adherencji w celu ekspresji chimerycznych białek HIV one E NV na powierzchni komórki. W drugim etapie komórki są inkubowane z przeciwciałami monoklonalnymi anty ENV, które będą wiązać ENV w zależności od ekspozycji na epitopy.

Następnie dodaje się przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP w celu ilościowego określenia interakcji przeciwciał za pomocą testu chemiluminescencyjnego. Uzyskuje się wyniki, które pokazują względne poziomy przeciwciał związanych z VNV w oparciu o względne jednostki świetlne nabyte dla każdego z nich. Cóż, główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wiązanie oparte na faktach, jest to, że technikę tę można wykonać przy małej ilości przeciwciał i przy wysokiej przepustowości, postdoc w laboratorium będzie wykonywał tę technikę.

Ludzkie komórki kostniakomięsaka są używane w tym eksperymencie na dzień przed płytką transfekcyjną, dwa razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. W nieprzezroczystej 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej odpowiedniej do odczytu luminescencji. Użyte zmodyfikowane podłoże delcos eagle uzupełnione płodową surowicą bydlęcą i streptomycyną penicyliny inkubuje komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla następnego dnia.

Przygotować mieszaninę transfekcyjną. Najpierw ustaw dwie rury, dwie przęsła i dwie B do dwóch przęseł. Dodaj pięć mikrolitrów DMEM uzupełnionego 25 milimolowymi hipisami, a następnie 10 nanogramów plazmidu i plazmidu powlekającego oraz 150 nanogramów chimerycznego plazmidu glikoproteiny kodującej jedną otoczkę wirusa HIV.

Należy pamiętać, że plazmid kodujący TAT jest wymagany tylko w przypadku stosowania zależnego od TAT plazmidu glikoproteiny kodującej jedną otoczkę kodującą do dwóch B przy pięciu mikrolitrach DMM i 450 nanogramach polietylenu lub PEI. Ilości odczynników i DNA powinny być dostosowane do liczby studzienek, które mają być transfekowane tą samą glikoproteiną HIV z jedną otoczką. Następnie dodaj zawartość dwóch B do dwóch zatok i dokładnie wymieszaj, wirując przez 10 sekund.

Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach dodać 10 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do dołka z 96-dołkowej płytki inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% tlenku węgla. Ali SA w celu zbadania rozpoznania chimerycznej glikoproteiny HIV z jedną otoczką za pomocą przeciwciał monoklonalnych przeprowadza się dwa dni po transfekcji ludzkich komórek kostniakomięsaka.

Przygotuj 250 mililitrów buforu myjącego na płytkę, która jest używana w tym samym czasie. Przygotuj 125 mililitrów buforu blokującego na płytkę, dodając 1% beztłuszczowego mleka w proszku i pięć milimoli tris pH 8,0 do buforu do mycia. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i mieszaninę transfekcji z płytki 96-dołkowej.

Dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę i inkubować przez 20 minut. W temperaturze pokojowej usunąć supernatant i dodać 50 mikrolitrów przeciwciała na studzienkę rozcieńczoną do odpowiedniego stężenia w buforze blokującym. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu blokującego, a następnie powtórzyć proces mycia trzy razy. Przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu blokującego, a następnie przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu płuczącego po ostatnim praniu. Usuń sat.

Dodać 100 mikrolitrów buforu blokującego i inkubować przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunąć supernatant i dodać 50 mikrolitrów przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w stosunku jeden do 3000 w buforze blokującym. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej po 40 minutach.

Przemyć trzykrotnie 100 mikrolitrami buforu blokującego, a następnie trzykrotnie przepłukać 100 mikrolitrami buforu do mycia. Aby przygotować próbki do akwizycji danych, należy usunąć supernatant z płytki 96-dołkowej i dodać 30 mikrolitrów jednego x wzmocnionego substratu chemiluminescencyjnego na studzienkę. Pobieraj sygnał chemiluminescencji przez jedną sekundę na studzienkę na odpowiednim czytniku płytek.

Zgodnie z instrukcjami producenta, wpływ rozpuszczalnego CD four lub S CD four na ekspozycję epitopów CD four I na glikoproteiny otoczki lub ENV był testowy Interakcja CD 4 z ENV indukuje zmiany potwierdzające ENV, które odsłaniają epitopy 17 B i 48 D, które nakładają się na miejsce wiązania koreceptora, ale nie wpływa na domenę zewnętrzną rozpoznającą przeciwciało dwa G 12. Aby ocenić wpływ mutacji punktowych w potwierdzeniu NV, użyto dwóch mutantów ENV H 66 A, który ma zmniejszoną skłonność do spontanicznego próbkowania potwierdzenia związanego z CD four i S3 75 W, który predysponuje NV do stanu związanego CD cztery. Normalizacja surowych danych zgodnie z poziomami ekspresji ujawnia, że H 66 A zmniejsza rozpoznawanie CD 4 I 17 B, podczas gdy S3 75 W wzmacnia sygnał 17 B i jest wystarczające do przywrócenia fenotypu H 66.

Zmutowane komórki testowe transfekowane coraz większą ilością ekspresora CD cztery. Wraz z NV niebieskie paski ujawniły rosnące sygnały dla przeciwciał monoklonalnych CD four I, A trzy, dwóch i C 11, które rozpoznawały nieciągłe epitopy w wewnętrznej domenie glikoproteiny ENV. Rozpoznawanie GP one 20 ENV przez dwa przeciwciała G 12 nie zostało zakłócone.

Wreszcie, surowe dane zostały znormalizowane do dwóch G 12, brak modulacji 32 i C 11, gdy ENV był transfekowany mutantem CD 4 ze zmniejszoną zdolnością do interakcji z ENV wskazuje, że zwiększone sygnały zależały od interakcji E NV CD four Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu czterech godzin.