Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo
2 listopada 2015
Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.
Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie wysokiej wydajności, plazmidu, transfekcji komórek siatkówki, aby umożliwić funkcjonalne badania genetyczne w pierwotnych hodowlach siatkówki. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie zarodków kurczaka na etapie 27 systemu hamburgerów i Hamiltona. Właściwa klasyfikacja ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnej wydajności.
Drugim krokiem jest wypreparowanie oczu embrionalnych i usunięcie pigmentowego nabłonka siatkówki, odsłaniającego siatkówkę nerwową. Następnie miseczkę siatkówki umieszcza się w komorze wypełnionej roztworem plazmidu. Następnie jest poddawany elektroporacji w zoptymalizowanych warunkach przy użyciu łatwych do skonstruowania elektrod wykonanych na zamówienie.
Ostatnim krokiem jest usunięcie ciała szklistego i soczewki oraz dysocjacja siatkówki nerwowej na pojedyncze komórki w celu hodowli pierwotnej o niskiej gęstości. Ostatecznie, transfekowane komórki mogą być wizualizowane przez ekspresję genów reporterowych lub immunohistochemię, a skuteczna manipulacja genetyczna może być oceniona poprzez ocenę ekspresji dalszych genów i/lub fenotypowych zmian w komórkach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak lipofekcja lub transfekcja chemiczna, jest to, że zwiększa szybkość transfekcji komórek siatkówki pięciokrotnie, uzyskując wydajność od 22 do 25% całej populacji komórek.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii fotoreceptorów, ponieważ pozwala na manipulowanie ekspresją genów w pierwotnych kulturach siatkówki na poziomie wydajności, który może dostarczyć biologicznie znaczących spostrzeżeń. Implikacje tej techniki wykraczają poza badania podstawowe, ponieważ można ją łatwo dostosować do technologii o wysokiej przepustowości do opracowywania leków. Zacznij od inkubacji zapłodnionych jaj kurzych z białymi rogami nóg w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 60% przez pięć dni w inkubatorze do jaj.
Przed eksperymentem należy zaopatrzyć się w filament w pudełku, zwykle używany w wyciąganiu mikropipet. Użyj kleszczyków, aby odpiąć kwadratowe pudełko i wyprostować filament w długi pasek. Następnie, używając linijki jako prowadnicy, zegnij żarnik w kwadratowy kształt litery U, o długości trzech milimetrów u podstawy i dwóch milimetrów wysokości z jednej strony z drugiej strony, pozostałą długość włókna użyj kleszczyków, aby zanurzyć elektrodę w 96% etanolu i krótko podpal elektrodę, aby ją wysterylizować.
Następnie przymocuj przewód elektryczny z małym zaciskiem krokodylkowym do długiego ramienia elektrody. Następnie wytrzyj grubą elektrodę ze złotą końcówką za pomocą 70% etanolu. Następnie przygotuj komorę elektroporacyjną, odcinając pokrywkę sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą wysterylizowanych nożyczek i przymocowując ją płaską stroną do 100-milimetrowej szalki Petriego za pomocą taśmy.
Następnie wysterylizuj narzędzia do mikrodysekcji, zanurzając końcówki instrumentów w 96% etanolu i krótko je paląc. Wytrzyj również lunetę sekcyjną za pomocą 70% etanolu. Ogrzej butelkę sterylnego roztworu soli Hanksa bez wapnia i magnezu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po podgrzaniu użyj go do napełnienia 100-milimetrowej sterylnej szalki Petriego do trzech czwartych długości. Następnie umieść komorę elektroporacyjną pod czystym mikroskopem preparacyjnym. Następnie podłącz elektrody do aparatu do elektroporacji, upewniając się, że wykonana na zamówienie elektroda jest podłączona do bieguna ujemnego, a elektroda ze złotą końcówką jest podłączona do bieguna dodatniego maszyny.
Oczyść jajka, przecierając zewnętrzną część skorupek 70% etanolem. Zachowaj ostrożność i utrzymuj sterylność przez pozostałą część protokołu. Aby uniknąć przenoszenia zanieczyszczeń do kultur za pomocą dużych, zakrzywionych kleszczy Maloneya, ostrożnie otwórz otwór w skorupce jajka, delikatnie stukając w zaokrągloną końcówkę jajka bezpośrednio nad komorą powietrzną.
Wyciągnij wszystkie kawałki muszli za pomocą innej pary kleszczy. Usuń błony i zbierz zarodek, ostrożnie wyjmując go z jaja. Umieść zarodek na szalce Petriego z ciepłym roztworem soli Hanks Balance bez wapnia i magnezu.
Po pobraniu odpowiedniej liczby zarodków należy upewnić się, że wszystkie są w odpowiednim stadium. Zgodnie z hamburgerem i systemem stopniowania Hamiltona, aby uzyskać optymalną wydajność, zarodki muszą być w stadium 27. Poddaj zarodki eutanazji przez dekapitację za pomocą kleszczy Maloneya, a następnie użyj pęsety Dumonta, aby ostrożnie i zarodkować oczy.
Przenieś oczy na nową szalkę Petriego z HBSS bez wapnia i magnezu. Zacznij od tylnej części każdego oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego, a następnie wprowadź jedną końcówkę każdej pary pęsety Dumonta między siatkówkę nerwową a nabłonek barwnikowy siatkówki. Pracując od tylnej części oka w kierunku przodu, użyj pęsety, aby ostrożnie wypreparować pigmentowany nabłonek siatkówki.
Uważaj, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej. Ustaw elektro perter tak, aby dostarczał pięć impulsów kwadratowych o napięciu 15 woltów w czasie trwania 50 milisekund i w odstępie 950 milisekund. Następnie napełnij komorę elektroporacyjną 120 mikrolitrami roztworu plazmidu o stężeniu 1,5 mikrograma na mikrolitr w PBS.
Następnie umieść elektrodę ujemną w kształcie litery U w komorze elektroporacyjnej z pokrywą mikrowirówki. Za pomocą pary zakrzywionych pęset Dumont. Przenieś jedną miseczkę siatkówki do komory elektroporacyjnej i umieść ją wewnątrz elektrody w kształcie litery U.
Ustaw siatkówkę tak, aby jej tylna część była skierowana w stronę dolnej części elektrody, a soczewka była skierowana do góry. Następnie umieść anodę tak, aby dotykała przedniej części oka obok soczewki. Następnie użyj pedału nożnego electro raidera, aby dostarczyć pięć impulsów elektrycznych.
Po zakończeniu przenieś elektroporowany kubek siatkówki na nową szalkę Petriego wypełnioną HBSS bez wapnia i magnezu. Powtórz procedurę elektroporacji z każdą dodatkową miseczką siatkówki. Do sześciu bańek siatkówki może być elektroporowanych tym samym roztworem plazmidu bez znacznego spadku wydajności transfekcji.
Następnie użyj kleszczyków zębatych, aby delikatnie usunąć soczewkę i ciało szkliste z każdej elektroporowanej próbki, jednocześnie przytrzymując oko na miejscu tylną częścią zakrzywionej pęsety Dumonta po wyjęciu, przejdź do dysocjacji i hodowli elektroporowanych komórek siatkówki przy użyciu standardowych technik. Pokazane tutaj komórki siatkówki zostały poddane elektroporacji z ekspresją GFP, plazmidem, dysocjacją i hodowlą przez cztery dni. Mikrofotografie fluorescencyjne wykazały dappy stainy kernels i komórki siatkówki wyrażające GFP.
Przeprowadzono barwienie przeciwciałami antywizynowymi w celu identyfikacji komórek fotoreceptorów. Parametry opisane w tym protokole zostały zoptymalizowane w celu uzyskania wydajności transfekcji, która wynosi średnio 22% w porównaniu z całą populacją po czterech dniach. W kulturze miara ta wzrasta średnio do 25% skuteczności, gdy tylko populacja fotoreceptorów jest uważana za uważaną za raz opanowaną.
Ta technika, od pobrania zarodka do operacji elektrycznej, może być wykonana w mniej niż 30 minut dla sześciu oczu, jeśli jest wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że nie powinny upłynąć więcej niż trzy godziny między pobraniem zarodków a posiewem komórek dysocjacyjnych, aby uzyskać dobrej jakości hodowlę. Technika ta może być stosowana do nadekspresji lub korelacji genów, na przykład przy użyciu systemu RNAi.
Ponadto siatkówka, która została przetransfekowana w wyniku tej procedury, może być wykorzystana do organtypowych kultur siatkówki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nową technikę wysokowydajnego transferu genów w hodowlach komórek siatkówki zarodka kurczaka, co usprawnia badanie biologii fotoreceptorów. Metoda ta polega na elektroporacji plazmidowej ex ovo, co znacząco zwiększa stopień transfekcji w porównaniu z istniejącymi protokołami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Inżynieria genetyczna
Wprowadzenie
- Kultury komórek siatkówki embriona kurczaka są istotne dla badań nad fotoreceptorami.
- Techniki transferu genów są niezbędne do prowadzenia badań funkcjonalnych w tych komórkach.
- Obecne metody wykazują ograniczenia w zakresie wydajności transfekcji.
- Optymalizacja etapu rozwojowego oraz warunków elektroporacji może poprawić wyniki.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody transferu genów do komórek siatkówki.
- Umożliwienie funkcjonalnych badań genetycznych w pierwotnych kulturach siatkówki.
- Zwiększenie wydajności transfekcji w stosunku do istniejących protokołów.
Zastosowane metody
- Zbiór zarodków kurzych w stadium 27 według systemu Hamburgera i Hamiltona.
- Disekcja zarodkowych oczu i usunięcie nabłonka pigmentowego siatkówki.
- Umieszczenie kielicha siatkówki w komorze z roztworem plazmidu.
- Wykonanie elektroporacji przy użyciu specjalnie wykonanych elektrod w zoptymalizowanych warunkach.
Główne wyniki
- Wysoka wydajność transfekcji osiągnięta dzięki nowej metodzie.
- Wykazano skuteczną manipulację genetyczną komórek siatkówki.
- Ustalono zoptymalizowane warunki elektroporacji.
- Technika ta jest możliwa do zastosowania w różnych badaniach funkcjonalnych w biologii siatkówki.
Wnioski
- Opracowana technika transferu genów znacząco zwiększa możliwości badawcze w zakresie biologii komórek siatkówki.
- Metoda ta może ułatwić zaawansowane badania nad funkcją fotoreceptorów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie czynników genetycznych w chorobach siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Efektywny transfer genów w pierwotnych kulturach siatkówki rozwiązuje krytyczny problem w walidacji celów terapeutycznych dla fotoreceptorów, umożliwiając funkcjonalną analizę genów istotnych dla rozwoju chorób. Metoda elektroporacji ex ovo pozwala na uzyskanie wydajności transfekcji na poziomie 22-25%, co wspiera skalowalny rozwój testów do wysokoprzepustowego przesiewu leków na choroby siatkówki. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów na leki, dostarczając biologicznie istotnych informacji na temat funkcji genów w systemie odpowiadającym warunkom chorobowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez nadekspresję indukowaną plazmidami lub wyciszanie za pośrednictwem RNAi w pierwotnych kulturach fotoreceptorów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system funkcjonalnej walidacji celu z mierzalną ekspresją transgenu w up do 25% populacji fotoreceptorów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez powiązanie manipulacji genetycznych ze zmianami fenotypowymi komórek lub ekspresją genów poniżej w ścieżce sygnałowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie wydajności transfekcji odpowiedniej do ilościowych pomiarów zmiennych zależnych w kampaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zstandardizowane warunki elektroporacji oraz wykonane na zamówienie elektrody, aby zapewnić powtarzalność analizy w wielu kubkach siatkówkowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w celu adaptacji do wysokoprzepustowej analizy, ponieważ transfekowane kultury siatkówkowe mogą zostać zintegrowane z organotypowymi lub niskogęstościowymi schematami hodowli pierwotnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego, umożliwiając manipulacje genetyczne w systemie istotnym dla danej choroby, który modeluje biologię ludzkiej siatkówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki zastosowaniu spójnych procedur hodowli i dysocjacji.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając ocenę funkcji genu przed badaniami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w biologii fotoreceptorów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie nadekspresji lub wyciszenia genów docelowych w pierwotnych kulturach siatkówki.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analiz dzięki standaryzowanemu stężeniu roztworu plazmidu (1,5 µg/µL) i zoptymalizowanym parametrom elektroporacji (5 impulsów, 15V, 50ms).
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów poprzez ekspresję genu reporterowego (np. GFP) lub immunohistochemię w celu porównania wydajności transfekcji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną dzięki możliwości zastosowania w organotypowych kulturach siatkówki pochodzących z elektroporowanych siatkówek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania, ponieważ do sześciu kopułek siatkówkowych można poddać elektroporacji tym samym roztworem plazmidu bez znaczącej utraty wydajności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dzięki osiągnięciu pięciokrotnie wyższej wydajności transfekcji w porównaniu z lipofekcją lub metodami chemicznymi.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację dzięki szczegółowym protokołom konstrukcji i sterylizacji elektrod z wykorzystaniem wypalania w 96% etanolu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję szumu biologicznego w badaniach funkcjonalnych, co umożliwia lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie danych funkcjonalnych na temat roli genów w przeżywalności lub różnicowaniu fotoreceptorów.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w określaniu stadium rozwoju zarodka kury (stadium 27 według Hamburgera i Hamiltona) oraz w technikach mikrochirurgicznej dyssekcji.
- Konieczne jest posiadanie aparatury do przeprowadzania elektroporacji za pomocą pięciu impulsów prostokątnych oraz przygotowanie specjalnych elektrod w kształcie litery U z drutu wolframowego.
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania roztworu plazmidu (w PBS, 1,5 µg/µL) oraz konfiguracji komory z wykorzystaniem zmodyfikowanych probówek do mikrocentryfugi w ramach całego zespołu.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne w przypadku stosowania różnych stężeń plazmidów lub konstruktów RNAi podczas rozszerzania procedury o badania nad obniżeniem ekspresji genów.
- Istnieją ograniczenia praktyczne, takie jak trzygodzinne okno czasowe między pobraniem zarodka a wysiewem komórek w celu zachowania jakości hodowli.
