Name: Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji ex ovo do efektywnego transferu genów w siatkówkach piskląt. Technika ta umożliwia funkcjonalne badania genetyczne w hodowlach komórkowych z wydajnością do 25%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi O'Brienowi za jego wsparcie w analizie danych, a wszystkim członkom laboratorium Canto-Soler za ich krytyczne dyskusje. Praca ta była wspierana przez granty NIH EY004859 i EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765 oraz nieograniczony grant wydziałowy od Research to Prevent Blindness, Inc.

Wszystkie procedury opisane w tej pracy zostały wykonane zgodnie z wytycznymi zalecanymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa.
1. Z wyprzedzeniem: Przygotowanie instrumentów, odczynników i potraw
<ol>
	<li>Przygotowanie jaj: Inkubować zapłodnione jaja kurze White Leghorn w temperaturze 37,5 °C i wilgotności względnej 60% przez 5 dni w inkubatorze do jaj. 
	UWAGA: Inkubator o zdolności kołysania może być pomocny w standaryzacji i synchronizacji rozwoju embrionalnego, ale kołysanie nie jest absolutnie konieczne dla wyniku tego protokołu.</li>
	<li>Przygotowanie plazmidu:
	<ol>
		<li>Zaprojektuj konstrukt plazmidu pod kątem nadekspresji lub regulacji w dół genu (na przykład poprzez zastosowanie technologii RNAi1,34) w razie potrzeby. Jeśli to możliwe, uwzględnij gen reporterowy (taki jak EGFP, RFP lub LacZ) w konstrukcie. 
		UWAGA: Niektóre powszechnie stosowane promotory, takie jak CMV, mogą po pewnym czasie ulec wyciszeniu. Promotor CAG (promotor beta-aktyny kurczaka ze wzmacniaczem CMV) jest bardzo dobrą alternatywą, zapewniającą wydajną, długoterminową ekspresję interesującego genu35-37.</li>
		<li>Przygotować roztwór plazmidu o stężeniu 1,5 μg/μl w sterylnym PBS. OPCJONALNIE: Przygotuj wcześniej roztwór plazmidu i przechowuj go w stanie zamrożonym, aż będzie gotowy do użycia. 
		UWAGA: Wyższe stężenia plazmidów nie powodują znacznego wzrostu wydajności, podczas gdy stosowanie niższych stężeń plazmidów obniża wydajność transfekcji1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektrody:
	<ol>
		<li>Do anody należy użyć grubej elektrody ze złotą końcówką (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Wyposażenia). Wytrzyj do czysta 70% etanolem. 
		UWAGA: Zaleca się zaizolowanie elektrody ze złotą końcówką, pozostawiając odsłonięte około 0,5 mm, aby zminimalizować upływ prądu elektrycznego. Informacje dotyczące materiału izolacyjnego można znaleźć w Tabeli Konkretnych Materiałów.</li>
		<li>Wykonaj katodę z kwadratowego żarnika o średnicy 2,5 mm i szerokości 4,5 mm (zwykle używanego w ściągaczach do mikropipet). Za pomocą kleszczyków odkręć kwadratowe pudełko i wyprostuj filament w długi pasek. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym i używając linijki jako prowadnicy, zegnij żarnik w kształt kwadratu w kształcie litery "U" o długości 3 mm u podstawy i 2 mm wysokości z jednej strony, a z drugiej strony pozostałą długość żarnika (ryc. 1, C - D). Za pomocą kleszczy zanurz elektrodę w 96% etanolu i płomieniu, aby wysterylizować. Następnie przymocuj przewód elektryczny z małym zaciskiem krokodylkowym do dłuższego ramienia elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja komory elektroporacyjnej:
	<ol>
		<li>Przygotować komorę elektroporacyjną, przecinając pokrywę sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przymocowując ją płaską stroną do dołu na szalce Petriego o średnicy 100 mm za pomocą taśmy (Rysunek 1E). 
		UWAGA: Inny pojemnik w postaci studni o podobnej wielkości będzie działał; Jednak pokrywka probówki do mikrowirówki jest łatwo dostępna i można ją sterylizować w autoklawie. Studzienka musi być wystarczająco duża, aby pomieścić oko pisklęcia i elektrodę katodową, ale nie na tyle duża, aby spowodować marnotrawstwo roztworu plazmidu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedura elektroporacji ex ovo
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentów:
	<ol>
		<li>Sterylizuj narzędzia do mikropreparacji (2 pary dużych zakrzywionych kleszczy Moloneya do otwierania skorupek jaj i wyjmowania zarodków, 2 pary zakrzywionych pęset Dumont z cienką końcówką do usuwania RPE, jedna para kleszczyków zębatych Bonn do usuwania soczewek i ciała szklistego), zanurzając końcówki w 96% etanolu i paląc. Wyczyść lunetę sekcyjną za pomocą chusteczek nasączonych 70% etanolem. Podgrzej butelkę sterylnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution bez wapnia i magnezu (CMF-HBSS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Napełnij sterylne szalki Petriego o średnicy 100 mm do 3/4 ciepłej płytki CMF-HBSS.</li>
		<li>Umieścić komorę elektroporacyjną pod innym czystym mikroskopem preparacyjnym i napełnić 120 μl roztworu plazmidu. Podłącz elektrody do aparatu do elektroporacji, upewniając się, że wykonana na zamówienie elektroda jest podłączona do bieguna ujemnego, a elektroda ze złotą końcówką do bieguna dodatniego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie zarodków:
	<ol>
		<li>Oczyść jajka, wycierając skorupki chusteczkami zwilżonymi 70% etanolem. Utrzymuj sterylną procedurę przez pozostałą część protokołu, aby uniknąć przenoszenia zanieczyszczenia do kultur. Używając dużych, zakrzywionych kleszczyków Moloneya, ostrożnie otwórz otwór w skorupce jajka, delikatnie stukając w zaokrągloną końcówkę jajka (nad komorą powietrzną), a następnie chwytając i wyciągając kawałki skorupki.</li>
		<li>Za pomocą innej pary kleszczy usuń błony i zbierz zarodek, wyjmując go z jaja (uważając, aby nie uszkodzić zarodka). Umieść go w naczyniu z CMF-HBSS. 
		UWAGA: Zebrać tyle zarodków, ile jest konieczne do uzyskania pożądanej liczby miseczek siatkówki do elektroporacji, jak określono w ppkt 2.4.4</li>
		<li>ETAP KRYTYCZNY: Etap zarodków zgodnie z Hamburgerem i Hamiltonem38 . 
		UWAGA: Aby uzyskać optymalną wydajność, zarodki muszą być w stadium 27 (ryc. 2A).</li>
		<li>Eutanazja embrionów przez dekapitację za pomocą kleszczy Moloneya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskiwanie miseczek siatkówki:
	<ol>
		<li>Za pomocą cienkiej pęsety Dumont ostrożnie wyłuszczej oczy i przenieś do nowej szalki CMF-HBSS.</li>
		<li>Zaczynając od tylnej części każdego oka, w pobliżu głowy nerwu wzrokowego i za pomocą dwóch cienkich pęset Dumonta, wprowadź po jednej końcówce każdej pary pęsety między siatkówkę nerwową a RPE i ostrożnie wypreparuj RPE, uważając, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej (ryc. 2B). 
		UWAGA: Brak Ca2+ i Mg2+ w roztworze pomoże RPE łatwiej odłączyć się od siatkówki nerwowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroporacja:
	<ol>
		<li>Ustaw parametry elektroporatora tak, aby dostarczały 5 impulsów kwadratowych o napięciu 15 woltów, czasie trwania 50 ms i interwale 950 ms. Umieść elektrodę ujemną w kształcie litery "U" w komorze elektroporacyjnej (pokrywa mikrowirówki wypełniona 120 μl roztworu zawierającego plazmid).</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionej pęsety Dumont przenieś jedną miseczkę siatkówki do komory elektroporacyjnej (poprzez nabieranie, a nie prasowanie) i umieść ją wewnątrz elektrody w kształcie litery "U", z tylną częścią siatkówki w kierunku dolnej części elektrody i soczewką skierowaną do góry (ryc. 2D).</li>
		<li>Umieść anodę tak, aby dotykała przedniej części oka, obok soczewki i za pomocą pedału nożnego elektroporatora dostarczaj impulsy elektryczne.</li>
		<li>Przenieść elektroporowany kubek siatkówki na nową szalkę Petriego za pomocą CMF-HBSS i powtórzyć procedurę elektroporacji z każdym z pozostałych kubków siatkówki. 
		UWAGA: Do 6 bańek siatkówki można elektroporować tym samym roztworem plazmidu bez znacznego spadku wydajności transfekcji.</li>
		<li>Usuń soczewkę i ciało szkliste każdej elektroporowanej miseczki siatkówki, chwytając je kleszczami zębatymi Bonn i delikatnie przeciągając przez otwór źrenicy, jednocześnie przytrzymując oko na miejscu tylną częścią zakrzywionej pęsety Dumont.</li>
		<li>Przejdź do dysocjacji i hodowli elektroporowanych komórek siatkówki zgodnie ze standardowymi procedurami. 
		UWAGA: Szczegółowy protokół dotyczący dysocjacji i hodowli komórek siatkówki kurcząt znajduje się w Vergara i Canto-Soler, 2012, Plik dodatkowy 421. W tym protokole komórki są wysiewane z niską gęstością na 6-dołkowych płytkach pokrytych poliornityną lub szalkach 35 mm (6 x 105 komórek/studzienka lub szalka o średnicy 35 mm). Stosowana pożywka to pożywka 199 z penicyliną/glutaminą, 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i kwasem linolowym-BSA w stężeniu 100 μg/ml. Kultury są utrzymywane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Korzystając z tej procedury, można zwykle uzyskać 5 - 6 x 106 komórek na każde oko elektroporowane na 27 etapie. 
		UWAGA: Idealnie, nie powinno upłynąć więcej niż 3 godziny między pobraniem zarodka a posiewem komórek, aby zapewnić dobre przeżycie komórek i zminimalizować stres. Typowy czas obserwacji i dalszej analizy to 4 dni w hodowli, ponieważ w tym momencie komórki osiągnęły dobre różnicowanie morfologiczne i molekularne, a przeżywalność jest nadal wysoka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells%3A+a+novel%2C+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li>
<li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74(2007).</li>
<li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li>
<li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations%3A+characterization+and+partial+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li>
<li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li>
<li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+survival%3A+identification+of+RdCVF%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li>
<li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEDGF%3A+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li>
<li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li>
<li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li>
<li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li>
<li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li>
<li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures%3A+Effects+of+PNPF%2C+a+substratum-bound%2C+neurite-promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li>
<li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li>
<li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li>
<li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li>
<li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+analysis+with+the+%27window-labeling%27+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li>
<li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li>
<li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22(2012).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+types+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li>
<li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li>
<li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies%2C+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li>
<li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li>
<li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li>
<li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11(2001).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li>
<li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li>
<li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transfected+genes+by+differentiated%2C+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li>
<li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li>
<li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Najważniejszym krokiem dla powodzenia tego protokołu jest wybór odpowiedniego stadium zarodków. We wcześniejszych publikacjach dla tych kultur podano zakres stadiów embrionalnych, zwykle definiowanych przez dni inkubacji lub dni embrionalne (ED); w związku z tym zwykle zakłada się, że użycie zarodków ED 5 do ED 6 przyniesie równoważne wyniki. Odkryliśmy jednak, że na etapie 27 (ED 5) skuteczność transfekcji wyniesie około 22% całkowitej populacji komórek, jak wspomniano powyżej; jednak skuteczność spadnie do 16% w przypa...

Zdysocjowane kultury komórkowe z embrionalnych siatek piskląt były szeroko stosowane do badania różnych aspektów biologii komórek fotoreceptorowych, w tym ich przeżywalności2-9, różnicowania10-12, wzrostu neurytów13 i innych. Zalety tego systemu, opracowanego w latach osiemdziesiątych XX wieku przez Rubena Adlera i współpracowników i udoskonalonego przez niego i inne grupy14-20, tkwią w wewnętrznych cechach pisklęciajako modelu zwierzęcego. Duży rozmiar oka pisklęcia, nawet w stadium embrionalnym, dostarcza dużych ilości materiału do hodowli. Ponadto, gdy hodowle są wykonywane przy użyciu siatkówki 5-6 dnia embrionalnego (ED), 55 - 80% ich komórek progenitorowych różnicuje się jako fotoreceptory14,15,18,22,23, a ponieważ około 86% fotoreceptorów u tego zwierzęcia to czopki24, kultury te są szczególnie odpowiednie do badań koncentrujących się na tym typie komórek.
Niedawno opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy prostą technikę, która pozwala na wysokowydajną transfekcję plazmidów komórek w tych hodowlach, zwiększając w ten sposób użyteczność tego systemu, ułatwiając badania genetycznych nieprawidłowych wyrażeń1. Rozwój tej techniki wynikał z luki w literaturze naukowej dotyczącej metod, które zapewniłyby akceptowalny poziom transfekcji, aby umożliwić badanie funkcji genów w sposób autonomiczny komórki. Dzieje się tak po części dlatego, że pierwotne kultury neuronalne są notorycznie trudne do transfekcji25,26. Niektóre z najczęściej stosowanych wcześniej technik dostępnych w tym celu obejmowały metody transfekcji chemicznej, takie jak lipofekcja lub transfekcja za pośrednictwem fosforanu wapnia, które skutkują wydajnością rzędu 3-5% i mogą wywierać znaczną toksyczność27-32. Mimo że zastosowanie plazmidów z enzymatycznym systemem reporterowym może obejść problem słabej wydajności transfekcji poprzez wzmocnienie sygnału, nie dyskryminują one efektów specyficznych dla komórki, a ich wyniki opierają się na małej populacji komórek, która może nie być reprezentatywna dla całości. Inna szeroko stosowana metoda u piskląt, zakażenie wirusem RCAS, ma zastosowanie tylko do komórek proliferujących, a zatem nie nadaje się do tego pierwotnego systemu hodowli siatkówki33.
W obecnym protokole embrionalne oczy piskląt są wyłuszczane na etapie 27 (ED 5), nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) jest usuwany, a miseczka siatkówki jest umieszczana w komorze elektroporacyjnej wypełnionej roztworem zawierającym plazmid i elektroporowana za pomocą specjalnie wykonanych elektrod, a następnie dysocjacja siatkówki i hodowla przy użyciu standardowych technik21. Po zoptymalizowaniu tej procedury byliśmy w stanie konsekwentnie osiągać wydajność transfekcji rzędu 22% całkowitej liczby komórek w hodowli i 25% w samej populacji fotoreceptorów, bez uszczerbku dla charakterystyki przeżycia i różnicowania kultur1. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przedstawiający wszystkie ważne etapy tej procedury, aby zapewnić sukces i powtarzalność tej techniki.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Aparat Harvard</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetroda, w kształcie litery L, 5 mm Złota końcówka</td><td>BTX/ Aparat Harvard</td><td>45-0115 model 512</td><td>Elektroda ze złotą końcówką używana jako anoda</td></tr><tr><td>Rurki poliimidowe</td><td>Vention Medyczne</td><td>na zamówienie</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,5 mm / grubość ścianki: 0,15 - 0,2 mm. Służy do izolacji elektrody</td></tr> <tr><td>ze złotą końcówkąKwadratowy żarnik 2,5 mm, szerokość 4,5 mm</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Używany do produkcji elektrody katodowej</td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Moloney</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Ząbkowane; Niewielka krzywa; 4.5" Długość</td></tr><tr><td>Dumont Pęseta 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Wzór #5, Kąt 45 stopni; .10 x .06mm Rozmiar końcówki; 109mm Długość</td></tr><tr><td>Bonn mikro kleszczyki, 1x2 zęby</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Platforma wiążąca; 1x2 zęby, 0.12 mm zęby; 3.75" Długość; 0.3 mm Szerokość końcówki</td></tr></tbody></table>

efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Kultury wzbogacone w fotoreceptory stożkowe, pochodzące z embrionalnych siatek piskląt, stały się niezastąpionym narzędziem dla badaczy na całym świecie badających biologię neuronów siatkówki, szczególnie fotoreceptorów. Zastosowania tego systemu wykraczają poza badania podstawowe, ponieważ można go łatwo dostosować do technologii o wysokiej przepustowości do opracowywania leków. Jednak manipulacja genetyczna fotoreceptorów siatkówki w tych kulturach okazała się bardzo trudna, co stanowi poważne ograniczenie użyteczności systemu. Niedawno opracowaliśmy i zwalidowaliśmy technikę elektroporacji plazmidowej ex ovo, która zwiększa szybkość transfekcji komórek siatkówki w tych hodowlach pięciokrotnie w porównaniu z innymi obecnie dostępnymi protokołami1. W tej metodzie embrionalne oczy piskląt są wyłuszczane w stadium 27, RPE jest usuwane, a miseczka siatkówki jest umieszczana w roztworze zawierającym plazmid i elektropostowana za pomocą łatwych do skonstruowania, wykonanych na zamówienie elektrod. Siatkówki są następnie dysocjowane i hodowane przy użyciu standardowych procedur. Technika ta może być stosowana do badań nad nadekspresją, a także do obniżania ekspresji genów, na przykład poprzez zastosowanie technologii RNAi sterowanej plazmidem, zwykle osiągając ekspresję transgenu u 25% populacji fotoreceptorów. Format wideo, w którym zamieszczono niniejszą publikację, sprawi, że technologia ta będzie łatwo dostępna dla badaczy w tej dziedzinie, umożliwiając badanie funkcji genów w pierwotnych hodowlach siatkówki. Dołączyliśmy również szczegółowe wyjaśnienia krytycznych etapów tej procedury dla pomyślnego wyniku i odtwarzalności.

W niniejszej pracy przedstawiamy prosty protokół transfekcji plazmidowej do enukleowanych kubków siatkówkowych kurczaka w celu późniejszej hodowli dysocjowanych komórek. Transfekcję przeprowadza się metodą elektroporacji przy użyciu łatwych do wykonania elektrod niestandardowych (Ryc. 1 - 2). Parametry opisane w tym protokole zostały zoptymalizowane w celu uzyskania wydajności transfekcji w zakresie od 20 do 27% (średnio 22%) (Ryc. 3D). Należy zauważyć, że z wyżej wymienionych powodów wy...

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie wysokiej wydajności, plazmidu, transfekcji komórek siatkówki, aby umożliwić funkcjonalne badania genetyczne w pierwotnych hodowlach siatkówki. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie zarodków kurczaka na etapie 27 systemu hamburgerów i Hamiltona. Właściwa klasyfikacja ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnej wydajności.Drugim krokiem jest wypreparowanie oczu embrionalnych i usunięcie pigmentowego nabłonka siatkówki, odsłaniającego siatkówkę nerwową. Następnie miseczkę siatkówki umieszcza się w komorze wypełnionej roztworem plazmidu. Następnie jest poddawany elektroporacji w zoptymalizowanych warunkach przy użyciu łatwych do skonstruowania elektrod wykonanych na zamówienie.Ostatnim krokiem jest usunięcie ciała szklistego i soczewki oraz dysocjacja siatkówki nerwowej na pojedyncze komórki w celu hodowli pierwotnej o niskiej gęstości. Ostatecznie, transfekowane komórki mogą być wizualizowane przez ekspresję genów reporterowych lub immunohistochemię, a skuteczna manipulacja genetyczna może być oceniona poprzez ocenę ekspresji dalszych genów i/lub fenotypowych zmian w komórkach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak lipofekcja lub transfekcja chemiczna, jest to, że zwiększa szybkość transfekcji komórek siatkówki pięciokrotnie, uzyskując wydajność od 22 do 25% całej populacji komórek.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii fotoreceptorów, ponieważ pozwala na manipulowanie ekspresją genów w pierwotnych kulturach siatkówki na poziomie wydajności, który może dostarczyć biologicznie znaczących spostrzeżeń. Implikacje tej techniki wykraczają poza badania podstawowe, ponieważ można ją łatwo dostosować do technologii o wysokiej przepustowości do opracowywania leków. Zacznij od inkubacji zapłodnionych jaj kurzych z białymi rogami nóg w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 60% przez pięć dni w inkubatorze do jaj.Przed eksperymentem należy zaopatrzyć się w filament w pudełku, zwykle używany w wyciąganiu mikropipet. Użyj kleszczyków, aby odpiąć kwadratowe pudełko i wyprostować filament w długi pasek. Następnie, używając linijki jako prowadnicy, zegnij żarnik w kwadratowy kształt litery U, o długości trzech milimetrów u podstawy i dwóch milimetrów wysokości z jednej strony z drugiej strony, pozostałą długość włókna użyj kleszczyków, aby zanurzyć elektrodę w 96% etanolu i krótko podpal elektrodę, aby ją wysterylizować.Następnie przymocuj przewód elektryczny z małym zaciskiem krokodylkowym do długiego ramienia elektrody. Następnie wytrzyj grubą elektrodę ze złotą końcówką za pomocą 70% etanolu. Następnie przygotuj komorę elektroporacyjną, odcinając pokrywkę sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą wysterylizowanych nożyczek i przymocowując ją płaską stroną do 100-milimetrowej szalki Petriego za pomocą taśmy.Następnie wysterylizuj narzędzia do mikrodysekcji, zanurzając końcówki instrumentów w 96% etanolu i krótko je paląc. Wytrzyj również lunetę sekcyjną za pomocą 70% etanolu. Ogrzej butelkę sterylnego roztworu soli Hanksa bez wapnia i magnezu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po podgrzaniu użyj go do napełnienia 100-milimetrowej sterylnej szalki Petriego do trzech czwartych długości. Następnie umieść komorę elektroporacyjną pod czystym mikroskopem preparacyjnym. Następnie podłącz elektrody do aparatu do elektroporacji, upewniając się, że wykonana na zamówienie elektroda jest podłączona do bieguna ujemnego, a elektroda ze złotą końcówką jest podłączona do bieguna dodatniego maszyny.Oczyść jajka, przecierając zewnętrzną część skorupek 70% etanolem. Zachowaj ostrożność i utrzymuj sterylność przez pozostałą część protokołu. Aby uniknąć przenoszenia zanieczyszczeń do kultur za pomocą dużych, zakrzywionych kleszczy Maloneya, ostrożnie otwórz otwór w skorupce jajka, delikatnie stukając w zaokrągloną końcówkę jajka bezpośrednio nad komorą powietrzną.Wyciągnij wszystkie kawałki muszli za pomocą innej pary kleszczy. Usuń błony i zbierz zarodek, ostrożnie wyjmując go z jaja. Umieść zarodek na szalce Petriego z ciepłym roztworem soli Hanks Balance bez wapnia i magnezu.Po pobraniu odpowiedniej liczby zarodków należy upewnić się, że wszystkie są w odpowiednim stadium. Zgodnie z hamburgerem i systemem stopniowania Hamiltona, aby uzyskać optymalną wydajność, zarodki muszą być w stadium 27. Poddaj zarodki eutanazji przez dekapitację za pomocą kleszczy Maloneya, a następnie użyj pęsety Dumonta, aby ostrożnie i zarodkować oczy.Przenieś oczy na nową szalkę Petriego z HBSS bez wapnia i magnezu. Zacznij od tylnej części każdego oka w pobliżu głowy nerwu wzrokowego, a następnie wprowadź jedną końcówkę każdej pary pęsety Dumonta między siatkówkę nerwową a nabłonek barwnikowy siatkówki. Pracując od tylnej części oka w kierunku przodu, użyj pęsety, aby ostrożnie wypreparować pigmentowany nabłonek siatkówki.Uważaj, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej. Ustaw elektro perter tak, aby dostarczał pięć impulsów kwadratowych o napięciu 15 woltów w czasie trwania 50 milisekund i w odstępie 950 milisekund. Następnie napełnij komorę elektroporacyjną 120 mikrolitrami roztworu plazmidu o stężeniu 1,5 mikrograma na mikrolitr w PBS.Następnie umieść elektrodę ujemną w kształcie litery U w komorze elektroporacyjnej z pokrywą mikrowirówki. Za pomocą pary zakrzywionych pęset Dumont. Przenieś jedną miseczkę siatkówki do komory elektroporacyjnej i umieść ją wewnątrz elektrody w kształcie litery U.Ustaw siatkówkę tak, aby jej tylna część była skierowana w stronę dolnej części elektrody, a soczewka była skierowana do góry. Następnie umieść anodę tak, aby dotykała przedniej części oka obok soczewki. Następnie użyj pedału nożnego electro raidera, aby dostarczyć pięć impulsów elektrycznych.Po zakończeniu przenieś elektroporowany kubek siatkówki na nową szalkę Petriego wypełnioną HBSS bez wapnia i magnezu. Powtórz procedurę elektroporacji z każdą dodatkową miseczką siatkówki. Do sześciu bańek siatkówki może być elektroporowanych tym samym roztworem plazmidu bez znacznego spadku wydajności transfekcji.Następnie użyj kleszczyków zębatych, aby delikatnie usunąć soczewkę i ciało szkliste z każdej elektroporowanej próbki, jednocześnie przytrzymując oko na miejscu tylną częścią zakrzywionej pęsety Dumonta po wyjęciu, przejdź do dysocjacji i hodowli elektroporowanych komórek siatkówki przy użyciu standardowych technik. Pokazane tutaj komórki siatkówki zostały poddane elektroporacji z ekspresją GFP, plazmidem, dysocjacją i hodowlą przez cztery dni. Mikrofotografie fluorescencyjne wykazały dappy stainy kernels i komórki siatkówki wyrażające GFP.Przeprowadzono barwienie przeciwciałami antywizynowymi w celu identyfikacji komórek fotoreceptorów. Parametry opisane w tym protokole zostały zoptymalizowane w celu uzyskania wydajności transfekcji, która wynosi średnio 22% w porównaniu z całą populacją po czterech dniach. W kulturze miara ta wzrasta średnio do 25% skuteczności, gdy tylko populacja fotoreceptorów jest uważana za uważaną za raz opanowaną.Ta technika, od pobrania zarodka do operacji elektrycznej, może być wykonana w mniej niż 30 minut dla sześciu oczu, jeśli jest wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że nie powinny upłynąć więcej niż trzy godziny między pobraniem zarodków a posiewem komórek dysocjacyjnych, aby uzyskać dobrej jakości hodowlę. Technika ta może być stosowana do nadekspresji lub korelacji genów, na przykład przy użyciu systemu RNAi.Ponadto siatkówka, która została przetransfekowana w wyniku tej procedury, może być wykorzystana do organtypowych kultur siatkówki.

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj metodę elektroporacji ex ovo do efektywnego transferu genów w siatkówkach piskląt. Technika ta umożliwia funkcjonalne badania genetyczne w hodowlach komórkowych z wydajnością do 25%.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Przeglądaj więcej filmów