Name: Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności naczyń krwionośnych w miejscowej anafilaksji u myszy. Technika wykorzystuje barwnik Evans Blue i spektrofotometrię do ilościowej oceny odpowiedzi alergicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Ellen M. Fox za jej pracę dotyczącą tego modelu miejscowej anafilaksji. Prace te zostały wsparte grantem Uniwersytetu Służb Mundurowych Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu nr R073UE.

1. Uwrażliwić myszy
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy OVA, rozcieńczając OVA w 1x PBS do końcowego stężenia 20 mg/ml. Roztwory należy zamrozić w kriowiałach i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Doprowadzić jedną lub więcej podwielokrotności 20 mg/ml materiału wyjściowego OVA do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć OVA w 1x PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml w 5 ml polistyrenowej probówce z okrągłym dnem z nakrętką. Krótko zmieszaj, aby wymieszać.</li>
	<li>Trzymając probówkę z polistyrenu zawierającą 1 mg/ml OVA na wirze ustawionym na średnią prędkość, dodać kroplami równą objętość dokładnie zhomogenizowanego ałunu Imject (40 mg/ml), kontynuując wirowanie probówki, aby uzyskać stosunek ałunu do immunogenu w stosunku 1:1.</li>
	<li>Umieść nasadkę na tubie i przyklej rurkę do wiru. Ustaw wir na najniższym ustawieniu i pozwól OVA adsorbować się do ałunu przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Nie pozwól, aby upłynęła duża ilość czasu między przygotowaniem OVA/Ałunu a uczuleniem myszy. Jeśli uczulenie nie może być zakończone bezpośrednio po przygotowaniu OVA/Ałun, przechowuj OVA/Ałun w temperaturze pokojowej. Wirować przez 1 minutę przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml mieszaniną OVA/Ałun. Nastrzykać strzykawkę igłą o rozmiarze 27.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl OVA/Alum do otrzewnej myszy BALB/c w dawce 50 μg OVA i 2 mg ałunu na mysz.</li>
	<li>W celu kontroli ujemnej należy uczulić inną grupę myszy na PBS. Przygotuj mieszaninę ałunu i PBS w stosunku 1:1 w taki sam sposób, jak podano powyżej, pomijając OVA.</li>
	<li>Uczulaj wszystkie myszy (kontrola OVA i PBS) raz w tygodniu przez 3 tygodnie, w sumie 3 wstrzyknięcia. Po ostatnim wstrzyknięciu należy odczekać co najmniej 2 tygodnie przed wykonaniem miejscowego testu anafilaksji.</li>
</ol>
2. Miejscowy test anafilaksji
<ol>
	<li>Doprowadzić roztwór podstawowy OVA do temperatury pokojowej. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 20 mg/ml materiału OVA do końcowego stężenia 5 mg/ml za pomocą PBS (rozcieńczenie OVA 1:4 w 1X PBS). Krótko zmieszaj, aby wymieszać.</li>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą systemu znieczulenia gryzoni RC2 (lub porównywalnego systemu dostarczania oparów). Napełnij zbiornik izofluranem i włącz przepływ powietrza O2. Umieść myszy w komorze indukcyjnej i ustaw pokrętło sterujące izofluranem na 5%, aby rozpocząć znieczulenie. Gdy myszy są w pełni znieczulone, co wskazuje na brak mobilności, ustaw pokrętło kontrolne izofluranu na 3%, aby utrzymać głębokie znieczulenie. Celem znieczulenia w tej procedurze jest unieruchomienie zwierzęcia. Iniekcje do ucha i żyły ogonowej nie powodują znacznego bólu ani niepokoju u zwierzęcia. 
	UWAGA: Izofluran może mieć negatywny wpływ na układ rozrodczy człowieka. Pamiętaj, aby używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i przymocować kanister przedmuchujący do komory indukcyjnej, aby zneutralizować gazy odlotowe. Jeśli jesteś w ciąży podczas stosowania izofluranu, noś maskę z filtrem węglowym, aby zminimalizować narażenie.</li>
	<li>Załadować 10 μl 5 mg/ml OVA do strzykawki insulinowej o pojemności 3/10 ml z igłą 31 G. Załaduj kolejną strzykawkę insulinową o pojemności 3/10 ml z 10 μl 1x PBS.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wstrzyknąć 10 μl OVA do prawego ucha znieczulonej myszy w celu uzyskania dawki prowokacyjnej 50 μg OVA. Dopuszczalne są również inne dawki, takie jak 20 μg.
	<ol>
		<li>Aby ustabilizować ucho do wstrzykiwań, owinąć taśmę klejącą (lepką stroną do góry) wokół stożkowej rurki o pojemności 15 ml. Przymocuj grzbietową stronę prawego ucha do taśmy. Włóż igłę skośną stroną do góry między dwa listki ucha. Powoli wstrzyknąć OVA w środek tkanki ucha, uważając, aby nie uderzyć w żadne naczynia krwionośne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stosując tę samą metodę opisaną powyżej, wstrzyknąć 10 μl PBS do lewego ucha jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Poczekaj 3 min.
	<ol>
		<li>W tym czasie umieść mysz w uchwycie i trzymaj ogon pod lampą grzewczą lub w ciepłej kąpieli wodnej przez 1 minutę, aby rozszerzyć naczynia krwionośne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml zwieńczonej igłą 27 G, powoli wstrzyknij 200 μl 0,5% barwnika Evans Blue do żyły ogonowej myszy. Szybkie wstrzyknięcie może zniszczyć strukturę naczynia przed podaniem całych 200 μl. Jeśli tak się stanie, spróbuj wstrzyknąć pozostałą objętość barwnika do żyły po przeciwnej stronie ogona.</li>
	<li>Odczekaj 10 min.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji i usuń oba uszy za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych.
	<ol>
		<li>Chwyć krawędzie ucha kleszczami, upewniając się, że nie wywierany jest nacisk na miejsce wstrzyknięcia na środku ucha. Usuń jak najwięcej tkanki ucha, przecinając ją blisko, ale nie przez grzbiet chrząstki znajdujący się u podstawy ucha. Na wyciętym uchu mogą znajdować się niewielkie ilości sierści; Nie będzie to miało wpływu na test.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podaniec 700 μl formamidu do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Przygotuj jedną rurkę na ucho (dwie rurki na mysz). 
	UWAGA: Formamid jest teratogenny, mutagenny i drażniący. Nosić rękawice, okulary ochronne i ochronę twarzy. Kobiety w ciąży powinny zachować ostrożność podczas obchodzenia się z formamidem, ponieważ może być fetotoksyczny.</li>
	<li>Dodać kłosy do formamidu, zakryć probówki i inkubować przez noc w suchej łaźni grzewczej ustawionej na 63 °C. Uszy mogą nadal wydawać się lekko niebieskie po inkubacji, jednak większość barwnika zostanie wyekstrahowana do formamidu.</li>
	<li>Dodać 300 μl każdej próbki, po dwóch kroplach, do płytki 96-dołkowej. Unikaj przenoszenia futra, jeśli jest ono obecne w próbce. Upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków, ponieważ wpłyną one na odczyt absorbancji.</li>
	<li>Dodać 300 μl formamidu, w dwóch odstępach, do płytki 96-dołkowej. Te studnie będą używane jako półfabrykaty.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć absorbancję przy 620 nm. Odejmij studzienki formamidu od każdego odczytu próbki. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Uniwersytecką Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt przy Służbach Mundurowych.</li>
</ol>

<ol><li>Kojima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+Bbasophils+are+selectively+activated+in+vitro+and+in+vivo+through+CD200R3+in+an+IgE-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner.</a> The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).</li>
<li>Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+enzymes+in+mast+cell+granules+and+their+potential+role+in+allergic+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Allergy+and+Asthma+Reports%22%5BJournal%5D)">Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).</li>
<li>Amin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in allergic inflammation.</a> Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).</li>
<li>Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+histamine+receptor+subtypes+in+human+inferior+turbinates%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).</li>
<li>Ramsdell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Trypan+Blue+to+demonstrate+the+immediate+skin+reaction+in+rabbits+and+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs.</a> The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).</li>
<li>Chase, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+sensitization+of+animals+with+simple+chemical+compounds%3A+X.+Antibodies+inducing+immediate-type+skin+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).</li>
<li>Goose, J., Blair, A. M. J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+rat%2C+induced+with+two+homologous+reagin-like+antibodies+and+its+specific+inhibition+with+disodium+cromoglycate%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate.</a> Immunology. 16, 749-760 (1969).</li>
<li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).</li>
<li>Ovary, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+reactions+in+the+skin+of+experimental+animals+provoked+by+antibody-antigen+interactoin%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin.</a> Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitiative+evaluation+of+passive+cutaneous+anaphylaxis+%28PCA%29+using+a+hand-held+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).</li>
<li>Teshima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+spectrophotometric+analysis+of+passive+and+active+ear+cutaneous+anaphylaxis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse.</a> Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Liczne markery choroby alergicznej są wykorzystywane do oceny siły reakcji alergicznych po prowokacji alergenem, w tym zmian poziomu krążącej histaminy, produkcji cytokin Th2 i rekrutacji komórek do płynu oskrzelowo-pęcherzykowego w warunkach prowokacji dróg oddechowych. Chociaż monitorowanie zmian tych parametrów jest ważne dla badania reakcji alergicznych, markery biologiczne nie zawsze korelują z kliniczną chorobą alergiczną. Test miejscowej anafilaksji opisany w tym protokole zapewnia powtarzalny pomiar miejscowej pr...

Nadwrażliwość typu I jest spowodowana przez indukowane antygenem sieciowanie IgE na powierzchni komórek tucznych i bazofilów. Powoduje to degranulację komórkową i uwalnianie mediatorów wazoaktywnych i prozapalnych, takich jak histamina, tryptaza i czynnik aktywujący płytki krwi2. Po uwolnieniu wstępnie uformowanych mediatorów podczas degranulacji, komórki tuczne syntetyzują i uwalniają prostaglandyny i leukotrieny, które dodatkowo zwiększają przepuszczalność naczyńkrwionośnych 3. Początkowa odpowiedź kliniczna pojawia się szybko i jest określana jako "reakcja natychmiastowa". W skórze reakcja bąbla i zaostrzenia jest łatwo widoczna w ciągu kilku minut od prowokacji antygenem. W zależności od dawki prowokacji, możliwe jest zaobserwowanie "odpowiedzi późnej fazy" kilka godzin później. Obrzęk późnej fazy jest spowodowany miejscowym obrzękiem i rekrutacją leukocytów do tkanek2. Histamina, powszechnie uważana za główny mediator biorący udział w natychmiastowych reakcjach alergicznych, działa na receptor histaminowy 1 (HR1) wyrażany na naczyniach i receptor histaminowy 2 (HR2) wyrażany na mięśniach gładkich. Połączone działanie zwiększa przepływ krwi i przepuszczalność naczyń w miejscu zapalenia4.
W celu zbadania mechanizmów związanych z alergicznym zapaleniem opracowano różne modele zwierzęce, w tym modele astmy alergicznej, anafilaksji ogólnoustrojowej i anafilaksji miejscowej. Dożylne podawanie barwnika jest stosowane do pomiaru miejscowych reakcji alergicznych w modelach zwierzęcych od prawie wieku, a publikacje opisujące tę technikę pochodzą z lat dwudziestych XX wieku. Króliki i świnki morskie były pierwszymi modelami zwierzęcymi używanymi do testowania natychmiastowych reakcji nadwrażliwości, a najbardziej czułe reakcje znajdowano na ogół w uchu5,6. Test został później zatwierdzony do stosowania u szczurów7 i myszy8.
Historycznie, stosowano różne metody eksperymentalne, w tym wstrzyknięcie antygenu przed wstrzyknięciem barwnika, wstrzyknięcie barwnika przed wstrzyknięciem antygenu oraz jednoczesne wstrzyknięcie barwnika i antygenu. Dożylne podawanie barwnika jako sposób pomiaru reakcji alergicznych jest wszechstronnym testem, ponieważ może być stosowane do pomiaru aktywnych, biernych i odwrotnych reakcji biernych5,9. Do oceny reakcji alergicznych wykorzystano liczne barwniki, w tym Trypan Blue, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536 i India Ink5,6,9. Roztwór 0,5% Evans Blue jest obecnie standardowym barwnikiem stosowanym do pomiaru reakcji alergicznych w skórze.
Reakcja anafilaktyczna na wyzwanie jest przejściowa; maksymalna intensywność jest osiągana w ciągu 10 - 15 minut od wstrzyknięcia barwnika, a żadna reakcja nie jest widoczna, jeśli barwnik jest podawany później niż 30 minut po prowokacji, niezależnie od użytego gatunku zwierzęcia9. Kwantyfikacja wynaczynienia barwnika została pierwotnie uzyskana przez pomiar wielkości bąbla, jak wskazuje niebieski barwnik7-9. Dodatkowo liczbę zdegranulowanych komórek tucznych można określić ilościowo, wycinając tkankę skórną z miejsca reakcji i barwiąc błękitem toluidynowym7. Degranulacja komórek tucznych jest często stosowana jako marker skórnych odpowiedzi alergicznych zależnych od IgE, ponieważ komórki tuczne są główną lokalną populacją komórek wyrażających receptor IgE o wysokim powinowactwie FcεRI. Techniki spektrofotometryczne do pomiaru wynaczynienia barwnika do tkanki zostały opracowane dla biernej anafilaksji skórnej (PCA) u szczurów10 i myszy11 w latach 90.
Następujący protokół testu anafilaksji miejscowej został zaadaptowany z Kojima et al. 1 i wykorzystuje albuminę jaja kurzego (OVA) jako antygen do wywoływania reakcji alergicznych. Jednak w razie potrzeby można użyć antygenów innych niż OVA. Test następnie wykorzystuje niebieski barwnik Evansa do monitorowania zmian w przepuszczalności naczyń krwionośnych, które występują w wyniku sieciowania komórek tucznych IgE i uwalniania histaminy.

<table><tbody><tr><td>Myszy BALB/c</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Jakość Biologic</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego</td><td>Sigma</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dokładnie wymieszaj przed użyciem</td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>295876</td><td>99%+ Izofluran klasy spektrofotometrycznej</td></tr><tr><td>, USP</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>1cc Strzykawki insulinowe</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Strzykawka insulinowa z igłą 31 G</td><td>Terumo</td><td>NDC 100861</td><td></td></tr><tr><td>27 G Igły</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td> <td>FST.14070-12</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 ml Polistyrenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Partnerzy zaopatrzenia medycznego</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Płytka płaskodenna 96-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td>klejąca</tr><tr><td>RC2 System znieczulenia gryzoni</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Model G560 z 3-calową platformą</td></tr></tbody></table>

pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Reakcje alergiczne są wynikiem aktywacji komórek tucznych i bazofilów, a następnie uwolnienia mediatorów wazoaktywnych i prozapalnych. Narażenie na alergen u osoby uczulonej może powodować objawy kliniczne, które wahają się od niewielkiego rumienia do zagrażającej życiu anafilaksji. W laboratorium opracowano różne modele zwierzęce, aby zrozumieć mechanizmy kierujące reakcjami alergicznymi. W niniejszym artykule opisujemy szczegółową metodę pomiaru zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych w celu ilościowego określenia zlokalizowanych reakcji alergicznych. Test miejscowej anafilaksji został po raz pierwszy opisany w 1920 roku i został zaadaptowany z techniki opublikowanej przez Kojima i wsp. W 2007 r.1. W tym teście myszy uczulone na OVA są prowokowane w lewym uchu z nośnikiem, a w prawym uchu z OVA. Następnie podaje się dożylne wstrzyknięcie barwnika Evans Blue. Dziesięć minut po wstrzyknięciu Evans Blue zwierzę zostaje poddane eutanazji, a barwnik, który wynaczynił się do uszu, jest ekstrahowany przez noc w formamidzie. Absorbancja wyekstrahowanego barwnika jest następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrofotometru. Ta metoda niezawodnie daje wizualny i wymierny objaw miejscowej reakcji alergicznej.

Zwierzęta, u których test przebiegł pomyślnie, będą miały skórę i oczy o niebieskim zabarwieniu. Zwierzęta uczulone na PBS nie powinny reagować ani na wyzwalacz PBS, ani na OVA, w związku z czym oba uszy powinny pozostać białe (Rysunek 1A). U zwierząt uczulonych na OVA ucho poddane wyzwaniu PBS (lewe) powinno być całkowicie białe lub lekko niebieskie w sposób zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia. Ucho poddane wyzwaniu OVA (prawe) powinno stopniowo przybierać ciemniejszy odcień niebieskiego w ciągu 10 mi...

Reakcje alergiczne, charakteryzujące się aktywacją komórek tucznych i bazofilów, są napędzane przez sieciowanie IgE i uwalnianie mediatorów prozapalnych. Ilościową ocenę reakcji alergicznych można uzyskać, stosując barwnik Evans Blue do monitorowania zmian przepuszczalności naczyń krwionośnych po prowokacji alergenem.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zmian w przepuszczalności naczyń krwionośnych, aby określić ilościowo zlokalizowane reakcje alergiczne. Osiąga się to poprzez uprzednie uwrażliwienie zwierząt na alergen, taki jak albumina O. Drugim krokiem jest rzucenie wyzwania uszom za pomocą śródskórnego wstrzyknięcia alergenu.Następnie niebieski barwnik Evana jest wstrzykiwany do żyły ogonowej. Ostatnim krokiem jest ekstrakcja barwnika z kłosów poprzez inkubację przez noc. W postaci amidu ostatecznie fotometria spektrometryczna służy do ilościowego określenia ilości barwnika, który dostał się do ucha.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że wynaczynienie barwnika mierzy się za pomocą spektrometrii. Oznacza to, że test nie jest łatwo poddany stronniczości obserwatora. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ iniekcje śródskórne i do żył ogonowych są technicznie trudne i wymagają dużo praktyki, aby osiągnąć biegłość.Rozpocząć od doprowadzenia porcji roztworu podstawowego komórek jajowych do temperatury pokojowej w celu użycia. W temperaturze pokojowej rozcieńczyć materiał jajowy do stężenia jednego miligrama na mililitr w jednym XPBS.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Ten film demonstruje technikę in vivo oceny testowego antygenu poprzez wywoływanie stanu zapalnego skóry w modelu mysim. Antygen testowy - hapten w roztworze oleju / acetonu - jest miejscowo nakładany na skórę ucha myszy, a stan zapalny skóry ocenia się po odpowiednim czasie.

Technika oceny odpowiedzi immunologicznej na antygen poprzez wywoływanie stanu zapalnego skóry

Utrata odruchu prostowania od dawna służy jako standardowy substytut behawioralny dla utraty przytomności, zwany również hipnozą, u zwierząt laboratoryjnych.  Zmiany wrażliwości na lotne środki znieczulające spowodowane interwencjami farmakologicznymi można wykryć za pomocą starannie kontrolowanego systemu oceny o wysokiej przepustowości, który może być dostosowany do dostarczania dowolnego wziewnego środka terapeutycznego.

Ocena zmian w lotnej wrażliwości na znieczulenie ogólne myszy po miejscowej lub ogólnoustrojowej interwencji farmakologicznej

Elektroniczne pomiary von Freya są skuteczną i ulepszoną alternatywą dla klasycznych filamentów von Freya, ponieważ pozwalają na szybki i precyzyjny pomiar zmian w progach mechanicznego wycofywania gryzoni do stale stosowanych bodźców ciśnieniowych przed i po zdarzeniu zapalnym.

Pomiar zmian wrażliwości dotykowej w tylnej łapie myszy za pomocą elektronicznego aparatu von Freya

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Tutaj prezentujemy nową metodę dokładnego pomiaru różnic temperatur ciała w modelach myszy z pasywną anafilaksją układową (PSA) i alergią pokarmową za pomocą termometru na podczerwień. Procedura ta została dokładnie odwzorowana w poprzednich wynikach PSA.

Pomiar temperatury ciała myszy za pomocą termometru na podczerwień podczas pasywnej ogólnoustrojowej anafilaksji i oceny alergii pokarmowej

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Tutaj opisujemy metody wywoływania alergicznego kontaktowego zapalenia skóry w uszach myszy za pomocą 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (DNFB) i jak ocenić nasilenie alergicznego kontaktowego zapalenia skóry.

Model ucha myszy do oceny alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności naczyń krwionośnych w miejscowej anafilaksji u myszy. Technika wykorzystuje barwnik Evans Blue i spektrofotometrię do ilościowej oceny odpowiedzi alergicznej.

Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Przeglądaj więcej filmów