Pomiar miejscowej anafilaksji u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zmian w przepuszczalności naczyń krwionośnych, aby określić ilościowo zlokalizowane reakcje alergiczne. Osiąga się to poprzez uprzednie uwrażliwienie zwierząt na alergen, taki jak albumina O. Drugim krokiem jest rzucenie wyzwania uszom za pomocą śródskórnego wstrzyknięcia alergenu.

Następnie niebieski barwnik Evana jest wstrzykiwany do żyły ogonowej. Ostatnim krokiem jest ekstrakcja barwnika z kłosów poprzez inkubację przez noc. W postaci amidu ostatecznie fotometria spektrometryczna służy do ilościowego określenia ilości barwnika, który dostał się do ucha.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że wynaczynienie barwnika mierzy się za pomocą spektrometrii. Oznacza to, że test nie jest łatwo poddany stronniczości obserwatora. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ iniekcje śródskórne i do żył ogonowych są technicznie trudne i wymagają dużo praktyki, aby osiągnąć biegłość.

Rozpocząć od doprowadzenia porcji roztworu podstawowego komórek jajowych do temperatury pokojowej w celu użycia. W temperaturze pokojowej rozcieńczyć materiał jajowy do stężenia jednego miligrama na mililitr w jednym XPBS. Użyj pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu.

Wirować probówkę ze średnią prędkością i ostrożnie dodać równą objętość dokładnie zhomogenizowanego. Wstrzykiwać ałun do roztworu komórek jajowych kroplami. Równolegle przy użyciu tej samej techniki należy przygotować ujemny roztwór kontrolny ałunu zmieszanego z PBS w stosunku jeden do jednego.

Następnie zakryj rurki i przymocuj je do wiru. Uruchom wir na najniższym ustawieniu na pół godziny z podłączonymi rurkami. Gdy roztwory będą gotowe, natychmiast przystąp do uwrażliwiania myszy BAB.

Załaduj mieszankę ałunu jajowego do jednomililitrowej strzykawki. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknij 100 mikrolitrów do otrzewnej każdej myszy. Powtórz to dla myszy z kontrolą ujemną, używając roztworu ałunu bez komórek jajowych przez następne trzy tygodnie.

Powtórzyć ten proces, w sumie trzy wstrzyknięcia na mysz po ostatnim wstrzyknięciu, odczekać co najmniej dwa tygodnie przed wykonaniem miejscowego testu anafilaksji z zamrożonych komórek jajowych. Zacznij od przygotowania roztworu roboczego w ilości pięciu miligramów na mililitr w PBS. Krótko go przemieszaj, używając 5% fluoru ISO.

Znieczul uwrażliwioną mysz, a gdy stanie się nieruchoma, zmniejsz ISO fluoru do 3%Teraz załaduj trzy strzykawki insulinowe 10 mikrolitrów preparatu z komórek jajowych i zakryj ją igłą o rozmiarze 31 i załaduj drugą strzykawkę 10 mikrolitrami jednego XPBS. Następnie owiń 15-mililitrową stożkową rurkę przezroczystą taśmą samoprzylepną lepką stroną pod mikroskopem preparacyjnym, przymocuj grzbietową stronę lewego ucha znieczulonej myszy do rurki. Włóż igłę strzykawki PBS skośnie do góry między dwa liście ucha i powoli wstrzyknij pełne 10 mikrolitrów.

Unikaj uderzania w naczynia krwionośne. Udane wstrzyknięcie spowoduje oczywisty impuls śródskórny. Bardzo ważne jest, aby wstrzyknąć całą objętość do ucha.

Jeśli z miejsca wstrzyknięcia wycieknie płyn, zwierzę nie może być wykorzystane w analizie. Ponadto, jeśli igła całkowicie przejdzie przez ucho lub zarysuje powierzchnię ucha, test jest nieważny, ponieważ te urazy zakłócą wyniki do prawego ucha. Tę samą metodę należy stosować do wstrzykiwania komórek jajowych w ciągu trzech minut.

Przenieś mysz do ogranicznika i umieść ją pod lampą grzewczą. Następnie powoli wstrzyknij 200 mikrolitrów 0,5% niebieskiego barwnika Evansa do żyły ogonowej. Użycie igły o rozmiarze 27 może być szkodliwe, jeśli naczynie zostanie zniszczone przed wstrzyknięciem całego barwnika.

Kontynuować wstrzykiwanie po przeciwnej stronie ogona. Teraz odczekaj 10 minut, a następnie poddaj mysz eutanazji dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięciu szyjki macicy. Po eutanazji zwierzęcia użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć uszy.

Chwycić krawędź ucha kleszkami, nie wywierając nacisku na miejsce wstrzyknięcia. Następnie przeciąć blisko, ale nie przez grzbiet chrząstki u podstawy uszu. Zbierz jak najwięcej tkanki.

Teraz, zachowując odpowiednie środki ostrożności, przelej 700 mikrolitrów amidu formy na każde ucho do mikroprobówki wirówkowej. Przenieś ucho do każdej rurki i inkubuj je przez noc w temperaturze 63 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym, następnego dnia większość barwnika zostanie wyekstrahowana, ale uszy mogą wydawać się lekko niebieskie. Dodaj 300 mikrolitrów każdej próbki w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej.

Unikaj przenoszenia futra i nie twórz żadnych bąbelków na półfabrykaty. Załaduj dwie studzienki 300 mikrolitrami amidu formy. Następnie zmierz absorbancję przy 620 nanometrach.

Odejmij wartości od tła i przeanalizuj wyniki. Zwierzęta uczulone na PBS nie reagowały na prowokację komórkami jajowymi ani prowokację PBS. Zgodnie z oczekiwaniami oba uszy pozostały białe.

Rok, w którym podano prowokację PBS u zwierząt uczulonych na OVA, był albo całkowicie biały, albo jasnoniebieski, zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia, gdzie jego uszy otrzymujące prowokację komórkami jajowymi stawały się stopniowo ciemniejsze przez 10 minut po podaniu barwnika, tkanka ucha traktowana IDE zwierząt uczulonych PBS miała znikome odczyty absorbancji po prowokacji PBS i OVA. Podczas gdy w przypadku zwierząt uczulonych na komórki jajowe, wstrzyknięcie PBS na ogół powodowało średni odczyt absorbancji 0,13. I odwrotnie, prowokacja komórkami jajowymi o wielkości 50 mikrogramów dała średni odczyt absorbancji wynoszący 0,58.

Ilość komórek jajowych używanych do wyzwania może być dostosowywana w ramach limitów. Na przykład 20 mikrogramów prowokacji dawało średnią absorbancję 0,30. Jednak prowokacja mniejsza niż 20 mikrogramów nie dała wiarygodnych wyników.

Chociaż jest to trudne, gdy dana osoba jest biegła w wstrzykiwaniach śródskórnych i dożylnych, technikę tę można wykonać na jednym zwierzęciu w około 15 minut Przy dwóch osobach współpracujących ze sobą, jedna wykonuje zastrzyki do ucha, a druga wykonuje zastrzyki do żyły ogonowej. Zabieg można wykonać na 10 zwierzętach w ciągu około godziny. Ten test jest bardzo wszechstronny, ponieważ może być stosowany zarówno w aktywnej, jak i biernej anafilaksji skórnej.

Może być również stosowany w przypadku szerokiej gamy alergenów. Nie zapominaj, że fluor może mieć negatywny wpływ na układ rozrodczy człowieka. Używaj go tylko w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i miej pojemnik na śmieci przymocowany do komory indukcyjnej, aby zneutralizować gazy odpadowe, jeśli jesteś w ciąży.

Podczas używania izofluoru należy nosić maskę z filtrem węglowym, aby zminimalizować narażenie.