Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wolnych od integracji z niewielkiej ilości krwi obwodowej. Osiąga się to poprzez hodowlę izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w określonych czynnikach wzrostu, aby uzyskać populację progenitorów erytrocytów, która jest bardzo wrażliwa na przeprogramowanie. W drugim etapie nieintegrujące plazmidy episomalne przenoszące geny przeprogramowujące są wprowadzane do erytroblastów przez uczucie jądra, aby zainicjować proces przeprogramowywania.

Następnie komórki dotknięte jądrami są umieszczane na warstwie napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych, aby umożliwić dalsze przeprogramowanie, które ostatecznie zakończy się sukcesem. Przeprogramowane indukowane kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych można zidentyfikować na podstawie ich cech morfologicznych, aktywności fosfatazy alkalicznej, dodatniej immunochemii markerów pluripotencji i ekspresji endogennych genów pluripotencji. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przeprogramowanie oparte na wirusach, jest to, że protokół ten zapewnia spójne generowanie IPSC bez integracji.

Technik w laboratorium Zacznij od rozcieńczenia krwi obwodowej w stosunku jeden do jednego w DPBS. Następnie w 15-mililitrowej tubie z polistyrenu o okrągłym dnie, ostrożnie ułóż siedem mililitrów rozcieńczonej krwi na trzech mililitrach opakowania o temperaturze pokojowej. Po oddzieleniu próbki przez 30 minut w temperaturze 400 GS i temperaturze pokojowej, pbmc osiądzie w mętnej białej warstwie interfejsu między plazmą a wysokim pakietem fial.

Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś P BMC do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i zwiększ objętość do 10 mililitrów świeżym DPBS. Następnie po policzeniu komórek przenieś dwa razy 10 do sześciu P BMC do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj pozostałe komórki, zamroź granulowane komórki w stężeniu dwa razy 10 do sześciu pbmc na mililitr w 90% płodowej surowicy bydlęcej z 10% dimetylosulfotlenkiem. Następnie, po odwirowaniu P BMC, które zostały odłożone na bok, zawieszamy osad w dwóch mililitrach świeżo przygotowanej pożywki ekspandacyjnej i umieszczamy je w jednym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, inkubujemy komórki w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 90% azotu.

Następnie w trzecim i szóstym dniu wymień pożywkę, zbierając komórki ze studni. Mycie studni dwoma mililitrami QBSF 60 w celu zebrania pozostałych komórek, granulowanie komórek przez odwirowanie, a następnie ponowne zawieszenie osadu w dwóch mililitrach świeżej pożywki ekspandyjnej. Następnie umieść komórki z powrotem na tej samej 12-dołkowej płytce i kontynuuj inkubację Dziewiątego dnia pipetuj przeprogramowane plazmidy do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki einor, jak opisano w tabeli.

Następnie wymieszaj roztwór nucleo affection z suplementami dostarczonymi przez producenta i przenieś mieszaninę do sterylnej 1,5-mililitrowej odwróconej probówki DPH. Następnie dozuj dwa mililitry pożywki ekspandacyjnej do jednego dołka nowej 12-dołkowej płytki i zrównoważ pożywkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki będą gotowe. Zbierz komórki, dobrze umyj kulturę komórkową, jak właśnie pokazano, i umyj komórki w pięciu mililitrach DPBS.

Następnie zreusuj osad komórkowy w 100 mikrolitrach roztworu Nucle Affection plus suplement, uważając, aby uniknąć generowania pęcherzyków i przenieś zawiesinę komórkową do probówki zawierającej przeprogramowywanie plazmidu. Wymieszaj komórki, pipetując raz w górę i w dół, a następnie przenieś cały roztwór na dno jądra fit. Następnie umieść vete w maszynie do czułości Nucle i uruchom program T 0 1 9.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów pożywki ekspansywnej EQUILIBRATED do vete uczucia jądra i natychmiast zbierz całą próbkę, unikając wszelkich białych pływających resztek martwych komórek i umieść ją w studzience podgrzanego podłoża. Następnie umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze w 10 lub 11 dniu. Pokryć każdą studzienkę sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej żelatyną z jednym mililitrem 0,1% żelatyny w HBSS, a następnie umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze lub co najmniej pięć minut podczas inkubacji przenieść jedną fiolkę rozmrażania, dwa razy po 10 do sześciu napromieniowanych myszy o temperaturze 3000 stopni Celsjusza, embrionalnych, fibroblastów lub mes do 10 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki metamfetaminy, a następnie odwirować komórki, podczas gdy komórki obracają się w dół.

Odessać roztwór żelatyny z płytki sześciodołkowej, a następnie ponownie zawiesić mes w 12 mililitrach świeżej pożywki z metamfetaminą. Natychmiast dozować dwa mililitry OFM do każdej studzienki pokrytej żelatyną. Sześć. Dobrze nanieść płytkę i umieścić ją z powrotem w nawilżonym inkubatorze do 12 dnia.

W dniu 12 zbierz komórki dotknięte jądrem ze studni do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, myjąc studnię i demonstrując, aby zebrać pozostałe komórki. Po odwirowaniu ogniw zawieszamy osad w 12 mililitrach świeżo przygotowanego podłoża przeprogramowującego i dozujemy dwa mililitry komórek do każdej studzienki ogniw zasilających. Następnie na sześciodołkowej płytce odwirować płytkę przez 30 minut w temperaturze 75 GS i temperaturze pokojowej, a następnie umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze, zmieniając pożywkę co drugi dzień przez jeden do dwóch tygodni.

Gdy pojawią się indukowalne kolonie komórek pluripotencjalnych, zacznij karmić komórki świeżo przygotowanym ludzkim embrionalnym podłożem komórek macierzystych zawierającym inhibitory deacetylazy histonowej trzy dni po uczuciu jądra i przed posiewem, komórki dotknięte jądrem na indukowalną metamfetaminę. Skuteczność udanego uczucia jądrowego NU należy oszacować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej Na przykład w przypadku EGFP pokazano tutaj typowy eksperyment z uczuciem jąder, w którym około 5 do 10% całkowitej populacji komórek wyrażających EGFP przeprogramowane indukowalne pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych zaczną pojawiać się około dwa tygodnie po chorobie jądrowej NU. Kolonie są na ogół okrągłe z dobrze zaznaczonymi granicami i można je zidentyfikować na podstawie charakterystycznej morfologii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, w tym małych, ciasno upakowanych komórek o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy i widocznych jąderkach reprezentatywnych linii, które zostały w pełni scharakteryzowane.

Wszystkie dodatnie wyniki testów na aktywność fosfatazy alkalicznej wyrażają standardowe markery pluripotencji i reaktywują endogenne geny pluripotencji po opanowaniu. Ta technika może konsekwentnie generować IPSC bez integracji w ciągu czterech tygodni, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić badania różnicowania, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące dowolnego typu tkanki.