Name: Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania komórek iPS z krwi obwodowej przy użyciu plazmidów episomalnych i inhibitorów HDAC. Protokół ten zapewnia bezpieczną, wolną od integracji alternatywę dla metod wirusowych w biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować następującym grantom z NIH za wsparcie tych badań: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) i K12HL0806406 (SKS); oraz Fundacji JP McCarthy (AR).

Pisemna świadoma zgoda, zatwierdzona przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Fred Hutchinson Cancer Research Center i Children's Hospital of Philadelphia, została uzyskana od pacjentów przed pobraniem próbek krwi obwodowej. Przestrzegano wszystkich wytycznych instytucjonalnych. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach, w tym generowanie MEF i tworzenie potworniaków, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
1. Oddzielenie PBMCS metodą Ficoll i ekspansja erytroblastów – Dzień 0
<ol>
	<li>Rozcieńczyć krew obwodową w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. W okrągłodennej probówce z polistyrenu o pojemności 15 ml ostrożnie nanieść 7 ml rozcieńczonej krwi na 3 ml Ficoll-Hypaque o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 30 minut.</li>
	<li>PBMC osiądą na granicy faz pomiędzy plazmą a Ficoll-Hypaque, widzianą jako mętna, biała warstwa. Za pomocą sterylnej pipety transferowej zebrać PBMC do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 10 ml za pomocą DPBS.</li>
	<li>Za pomocą hemacytometru policz PBMC.</li>
	<li>Odpipetować 2 × 106 PBMC do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut. Pozostałe komórki odwirować i zamrozić w stężeniu 2 × 106 PBMC/ml w 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/10% dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Przygotuj podłoże ekspandacyjne: pożywka wolna od surowicy QBSF-60 (chronić przed światłem) + penicylina/streptomycyna (1%) + kwas askorbinowy (50 ng/ml) + czynnik komórek macierzystych (SCF, 50 ng/ml) + interleukina 3 (IL-3, 10 ng/ml) + erytropoetyna (EPO, 2 U/ml) + insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1, 40 ng/ml) + deksametazon (1 μM; chronić przed światłem; rozmrażać świeżą porcję przy każdej zmianie podłoża).</li>
	<li>Zawiesić 2 × 106 PBMC w 2 ml świeżo przygotowanej pożywki ekspansyjnej i umieścić w jednym dołku na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubować w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5%O2, 5% CO2 i 90% N2 .</li>
	<li>W dniu 3 i 6 wymień nośnik.
	<ol>
		<li>Zebrać komórki i umyć studzienkę 2 ml QBSF-60, aby zebrać pozostałe komórki.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 2 ml nowej pożywki rozprężającej i umieścić je z powrotem na tej samej płytce 12-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprogramowanie komórek przez nukleofekcję – Dzień 9
<ol>
	<li>Odpipetować plazmidy przeprogramowujące do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml (Tabela 1).</li>
	<li>Wymieszać roztwór nukleofekcji z suplementem (dostarczonym przez producenta) i odpipetować do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odpipetować 2 ml pożywki ekspandacyjnej do jednego dołka na płytce 12-dołkowej i umieścić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%O2, 5% CO2 i 90% N2) w celu zrównoważenia przed dodaniem komórek.</li>
	<li>Zebrać wyhodowane komórki i przemyć studzienkę 2 ml QBSF-60 w celu zebrania pozostałych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
	<li>Przemyć komórki poprzez ponowne zamieszanie w 5 ml DPBS i odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu nukleofekcji + suplementu, uważając, aby nie powstawać pęcherzyków.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek do probówki zawierającej plazmidy przeprogramowujące, raz pipetować w górę i w dół, a następnie pipetować próbkę na dno kuwety nukleofekcji.</li>
	<li>Umieść kuwetę w maszynie do nukleofekcji i uruchom program T-019.</li>
	<li>Przenieść 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża ekspandacyjnego (z płytki równoważącej w kroku 2.3) do kuwety nukleofekcji.</li>
	<li>Natychmiast zebrać całą próbkę i umieścić ją w studzience z podgrzanym podłożem eksplatamentacyjnym. Unikaj zbierania białych, unoszących się na wodzie resztek martwych komórek.</li>
	<li>Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%O2, 5% CO2 i 90% N2) do wzrostu.</li>
</ol>
3. Ogniwa poszycia - Dzień 10 lub 11
<ol>
	<li>W dniu 10, komórki podajnika płytek.
	<ol>
		<li>Pokryj jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej żelatyną.
		<ol>
			<li>Odpipetować 1 m 0,1% żelatyny w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) do każdego dołka płytki.</li>
			<li>Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 5 minut.</li>
			<li>Bezpośrednio przed użyciem należy odessać roztwór żelatyny z płytki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę zawierającą 2 × 106 mysich fibroblastów embrionalnych napromieniowanych w temperaturze 3000 cGy w 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki MEF (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicylina/streptomycyna (1%)).</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić komórki w 12 ml pożywki MEF i odpipetować 2 ml do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%O2, 5% CO2 i 90% N2) do 12 dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Posiewanie komórek na komórkach zasilających i zmiana podłoża – Dzień 12
<ol>
	<li>Zebrać komórki nukleofektyczne do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i zebrać wszelkie pozostałe komórki, przemłukując studzienkę 2 ml QBSF-60. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do przeprogramowywania: Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM) + FBS (10%) + L-glutamina pochodzenia niezwierzęcego (1 mM) + aminokwasy endogenne (NEAA, 1%) + penicylina/streptomycyna (1%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, dodawany świeży podczas karmienia, 10 ng / ml) + kwas askorbinowy (dodawany na świeżo podczas karmienia, 50 μg / ml).</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki do przeprogramowywania. Odpipetować pipetą 2 ml zawiesiny komórek na każdą studzienkę do 6-dołkowej płytki komórek zasilających (jak przygotowano w sekcji 3). Odwirować płytkę o masie 50 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%O2, 5% CO2 i 90% N2) do wzrostu. Zmieniaj pożywkę przeprogramowującą co drugi dzień, aż zaczną pojawiać się kolonie iPSC (1-2 tygodnie).</li>
	<li>Przygotowanie pożywki hESC: DMEM/F12 1:1 + wymiana surowicy nokautującej (20%) + penicylina/streptomycyna (1%) + NEAA (1%) + L-glutamina pochodzenia niezwierzęcego (1 mM) + pirogronian sodu (1%) + wodorowęglan sodu (0,12%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (dodawany świeży przy karmieniu, 10 ng/ml)</li>
	<li>Przygotować inhibitory HDAC: maślan sodu (dodany świeży podczas karmienia, 100 μM), kwas suberanilohydroksaminowy (SAHA, dodany świeży podczas karmienia, 200 nM). Po pojawieniu się kolonii iPSC zacznij karmić komórki pożywką hESC + inhibitorami HDAC, zmieniając pożywkę każdego dnia. 
	UWAGA: Maślan sodu to mała cząsteczka, która jest adsorbowana w plastikowych rurkach, dlatego należy ją przechowywać w probówce ze szkła borokrzemianowego w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Izolowanie klonów iPSC
<ol>
	<li>Gdy kolonie iPSC są wystarczająco duże, aby można je było wyizolować (20-25 komórek), należy je pobrać za pomocą pipety P20.</li>
	<li>Przygotowanie inhibitorów HDAC: maślan sodu (dodawany świeży przy karmieniu, 100 μM), SAHA (dodawany świeży podczas karmienia, 200 nM)</li>
	<li>Umieść izolowane kolonie na iMEF w indywidualnych szalkach o średnicy 35 mm zawierających pożywkę hESC + inhibitory HDAC + suplement do klonowania i odzyskiwania.</li>
	<li>Dzień po zerwaniu rodzin należy zmienić pożywkę na pożywkę na pożywkę hESC + inhibitory HDAC.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie iPSC będą gotowe do pasażowania.</li>
	<li>Usunąć inhibitory HDAC z pożywki, gdy kolonie ustabilizują się w pasażu 2-3.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby pomyślnie wygenerować iPSC podczas korzystania z tego protokołu, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych zastrzeżeń. Na etapie ekspansji erytroblastów należy ściśle przestrzegać harmonogramu wymiany pożywki, ponieważ odchylenia mogą prowadzić do nieefektywnej stymulacji docelowej populacji komórek progenitorowych i niższej efektywności wytwarzania iPSC. Ważne jest, aby przy każdej zmianie podłoża wytwarzać nową pożywkę ekspansywną ze świeżym deksametazonem; a podłoże bazowe QBSF-60 i deksametazon należy chronić przed św...

iPSC pochodzą z tkanek somatycznych poprzez ektopową ekspresję minimalnego zestawu genów pluripotencji. Technika ta została początkowo zademonstrowana przez transdukcję retrowirusową ludzkich fibroblastów z OCT4, SOX2, KLF4 i cMYC, które ulegają silnej ekspresji w stanie pluripotencjalnym1. Te przejściowo ulegające ekspresji "czynniki przeprogramowujące" zmieniają krajobraz epigenetyczny komórki docelowej i profil ekspresji genów analogicznie do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych2. Po utworzeniu, iPSC można potencjalnie różnicować w dowolny typ tkanki w celu dalszych badań. W związku z tym są obiecujące do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i zastosowaniach terapii genowej. Jednak zakłócenie genomu poprzez integrację wirusów może potencjalnie zmienić endogenną ekspresję genów, wpłynąć na fenotyp komórkowy i ostatecznie zniekształcić wyniki naukowe. Co więcej, losowe integracje wirusowe mogą prowadzić do szkodliwych skutków komórkowych, w tym możliwości złośliwejtransformacji3 lub ponownej ekspresji onkogennych transgenów4. Przyszłe zastosowania kliniczne będą wymagały generowania nieintegrujących iPSC.
Episomy, które są dodatkowymi chromosomalnymi kolistymi cząsteczkami DNA, oferują strategię generowania efektywnych kosztowo, bezintegracyjnych iPSC5. Kombinacja wektorów epizodycznych przedstawiona w tabeli 1 wyraża czynniki przeprogramowania OCT4, SOX2, KLF4, MYCL i LIN28A. Plazmid pCXLE_hOCT3/4-shp53-F zawiera również shRNA p53 do tymczasowej supresji TP53 w celu usprawnienia przeprogramowania komórkowego6. Wektor pCXWB-EBNA1 z niedoborem replikacji sprzyja amplifikacji czynników przeprogramowywania i zwiększa wydajność przeprogramowywania, zapewniając przejściowy wzrost ekspresji EBNA1 7. Plazmid pCXLE_EGFP można dodać do mieszaniny nukleofekcji w celu określenia wydajności transfekcji lub do zastosowań związanych z sortowaniem komórek. Z wyjątkiem pCXWB-EBNA1, plazmidy episomalne stosowane w tym protokole zawierają wirus Epsteina-Barr pochodzący z replikacji wirusa i gen EBNA1, które pośredniczą w replikacji i podziale episomu podczas podziału komórki gospodarza8. Episomy są spontanicznie tracone wraz z kolejną ekspansją iPSC7. Subklonowanie i charakterystyka iPSC z utratą wektora episomalnego, którą można wywnioskować z utraty ekspresji eGFP, może prowadzić do całkowicie wolnych od integracji iPSC do przyszłych zastosowań klinicznych.
Nieodłącznym elementem procesu generowania iPSC jest tłumienie genów specyficznych dla danej linii i reaktywacja genów związanych z pluripotencją. Regulacja ekspresji genów zachodzi na wielu poziomach w jądrze, w tym modyfikacje DNA i chromatyny, aby umożliwić czynniki transkrypcyjne, regulatorowe elementy DNA i dostęp polimerazy RNA do genów docelowych. Przemodelowanie krajobrazu epigenetycznego poprzez globalne modyfikacje chromatyny jest kluczowym elementem reekspresji programu genetycznego pluripotencji. Specyficzną modyfikacją chromatyny, która jest istotna w regulacji ekspresji genów, jest acetylacja histonów przy określonych resztach lizyny, co umożliwia dostęp do docelowych genów poprzez zmniejszenie napięcia cewki histon-DNA. Inhibitory HDAC to małe cząsteczki, które, jak wykazano, usprawniają przeprogramowanie iPSC i samoodnawianie się hESC9,10, prawdopodobnie ze względu na wspieranie stanu acetylowanego11. Opisany poniżej protokół, zaadaptowany z wcześniejszej publikacji z wykorzystaniem integracji lentiwirusów12, zapewnia metodę krok po kroku do zoptymalizowanego generowania iPSC z krwi obwodowej przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC. Zastosowane tutaj stężenia inhibitorów HDAC są o połowę mniejsze niż opisane przez Ware'a i wsp.9 i rutynowo doprowadziły do 2-krotnego wzrostu w pełni przeprogramowanych kolonii iPSC w porównaniu ze standardowymi protokołami przeprogramowania episomalnego bez inhibitorów HDAC. Ten poziom przeprogramowania jest na równi ze skutecznością, którą obserwujemy w przypadku metod lentiwirusowych. Korzystając z tego protokołu, skutecznie wygenerowaliśmy iPSC od osób w wieku nawet 87 lat.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Przechowywać pod adresem 4 & st. C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Sklep w temperaturze -20 & deg; C, dopóki nie będzie potrzebny. Rozmrozić, podwielokrotność, przechowywać w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>QBSF-60 podłoże bez surowicy</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Zestaw nukleofektorów linii komórkowej V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.</td></tr><tr><td>2% roztwór żelatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, upłynnić w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Iscove's Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Sklep pod adresem 4 & st. C.</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, zamrażać w temperaturze -20 & C.</td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C, z dala od światła.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>pirogronian sodu, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, 7,5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Wytwarzać 10 mg/ml zapasu w DPBS, podwielokrotnie, zamrażać w temperaturze -20 & stopni C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Maślan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Wytwarzaj 2000x zapas (400 mM) w DPBS, podwielokrotność, zamrażanie w temperaturze -20 & st. C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Klonowanie komórek hES i Suplement regeneracyjny</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C, dopóki nie będzie potrzebny. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Certyfikat ESC BD matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Rozmrozić przez noc na lodzie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność do wstępnie schłodzonych probówek za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, dopóki nie będzie potrzebny. Rozmrażanie w 4 & stopni; C, zużyć natychmiast.</td></tr><tr><td>Rozpiętość łodygi SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>kwas askorbinowy, sproszkowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Zrobić 5 mg/ml bulionu w DPBS, sterylny filtr, przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Marka 100 &mu; g/m zapas w SFEM, podwielokrotność, zamrażanie w temperaturze -20 &deg;C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>rekombinowana ludzka interleukina 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Produkcja 100 &mu; g/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>erytropoetyna (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Zrobić 1000 U/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrozić w temperaturze -20 & deg;C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)</td><td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Marka 100 &mu; g/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Wyprodukuj 1000x zapas (100 mM) w DPBS.</td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Make 50x kolba (50 &mu; M) w DPBS, sterylny filtr, przechowywać w temperaturze 4 °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Zrobić 2,000x zapas (400 mM) w DPBS, podwielokrotność, zamrozić w temperaturze -20 & stopni C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka stożkowa</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka Eppendorfa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane tisue 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l końcówki do pipet, końcówki barierowe</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr>pomoc do<td>pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajne wytwarzanie komórek ips z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów hdac

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Ten manuskrypt ilustruje protokół efektywnego tworzenia bezintegracyjnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z krwi obwodowej przy użyciu plazmidów epizodycznych i inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC). Do zalet tego podejścia należą: (1) wykorzystanie minimalnej ilości krwi obwodowej jako materiału źródłowego; (2) niecałkujące wektory przeprogramowania; 3) opłacalną metodę wytwarzania bezwektorowych iPSC; 4) pojedyncza transfekcja; oraz (5) wykorzystanie małych cząsteczek w celu ułatwienia przeprogramowania epigenetycznego. Krótko mówiąc, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są izolowane z rutynowych próbek flebotomii, a następnie hodowane w określonych czynnikach wzrostu, aby uzyskać wysoce proliferacyjną populację komórek progenitorowych erytrocytów, która jest niezwykle podatna na przeprogramowanie. Nieintegrujące, niezakaźne plazmidy episomalne eksprymujące OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A i krótki spinka do włosów (sh) RNA p53 są wprowadzane do pochodnych erytroblastów za pomocą pojedynczego nukleofekcji. Kotransfekcja episomu wyrażającego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) pozwala na łatwą identyfikację transfekowanych komórek. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się również oddzielny plazmid z niedoborem replikacji eksprymujący antygen jądrowy Epsteina-Barr 1 (EBNA1) w celu zwiększenia ekspresji białek episomalnych. Transfekowane komórki są następnie umieszczane na warstwie napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) w celu dalszego przeprogramowania. Gdy tylko kolonie podobne do iPSC pojawią się po około dwunastu dniach od nukleofekcji, inhibitory HDAC są dodawane do pożywki, aby ułatwić przebudowę epigenetyczną. Odkryliśmy, że włączenie inhibitorów HDAC rutynowo zwiększa wytwarzanie w pełni przeprogramowanych kolonii iPSC 2-krotnie. Gdy kolonie iPSC wykazują typową morfologię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), są delikatnie przenoszone na indywidualne płytki do hodowli tkankowych pokrytych iMEF w celu dalszego wzrostu i ekspansji.

Trzy dni po nukleofekcji i przed wysianiem nukleofektowanych komórek na iMEF-y, należy ocenić wydajność nukleofekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pod kątem ekspresji eGFP. Rysunek 1 przedstawia typowy eksperyment z nukleofekcją, w którym około 5-10% całkowitej populacji komórek wykazuje ekspresję eGFP.
Klonie przeprogramowanych iPSC zaczną pojawiać się około dwóch tygodni po nukleofekcji. Kolonie są zazwyczaj okrągłe z wyraźnymi granicami i można je zidentyfikować po...

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wolnych od integracji z niewielkiej ilości krwi obwodowej. Osiąga się to poprzez hodowlę izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w określonych czynnikach wzrostu, aby uzyskać populację progenitorów erytrocytów, która jest bardzo wrażliwa na przeprogramowanie. W drugim etapie nieintegrujące plazmidy episomalne przenoszące geny przeprogramowujące są wprowadzane do erytroblastów przez uczucie jądra, aby zainicjować proces przeprogramowywania.Następnie komórki dotknięte jądrami są umieszczane na warstwie napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych, aby umożliwić dalsze przeprogramowanie, które ostatecznie zakończy się sukcesem. Przeprogramowane indukowane kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych można zidentyfikować na podstawie ich cech morfologicznych, aktywności fosfatazy alkalicznej, dodatniej immunochemii markerów pluripotencji i ekspresji endogennych genów pluripotencji. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przeprogramowanie oparte na wirusach, jest to, że protokół ten zapewnia spójne generowanie IPSC bez integrac

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Amerykański krab podkowy, Limulus polyphemus, jest prawdopodobnie najdogodniejszym źródłem dużych ilości krwi wśród wszystkich bezkręgowców. Krew ma prosty skład, z tylko jednym typem komórek w krążeniu ogólnym – amebocytem ziarnistym – oraz tylko trzema dominującymi białkami w osoczu: hemocyjaniną, białkami reaktywnymi C oraz α2-makroglobuliną. Krew pobierana jest z serca, a komórki krwi i osocze rozdziela się poprzez wirowanie.

Pobieranie krwi z amerykańskiego kraba podkowiastego, Limulus polyphemus

Poznaj metodę wytwarzania komórek iPS z krwi obwodowej przy użyciu plazmidów episomalnych i inhibitorów HDAC. Protokół ten zapewnia bezpieczną, wolną od integracji alternatywę dla metod wirusowych w biologii komórek macierzystych.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Przeglądaj więcej filmów