Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysokiej jakości kultur kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych i odpowiednie scharakteryzowanie produktu końcowego za pomocą cytometrii przepływowej. Aby to osiągnąć, generowane są wysokiej jakości jednowarstwowe kultury niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Miogeneza sercowa jest następnie indukowana przez modulację szlaku wiatru za pomocą małych cząsteczek.

Następnie kardiomiocyty są utrwalane, przenikane i barwione w warunkach, które są specjalnie zoptymalizowane dla każdego przeciwciała. Na koniec komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują posiewy, które są wysoce dodatnie dla markerów sercowych, TNNI trzy i IRX cztery oraz wykazują komorowe potencjały czynnościowe.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te w korpusach pracowników i warkoczy, jest to, że jest stosunkowo prosta do wdrożenia i opłacalna. Co więcej, technika ta generuje hodowle komórek, które są wysoce dodatnie na troponinę sercową I. Bez wewnętrznej zmienności i wydajności obserwowanej w innych protokołach, wizualna demonstracja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jakość komórek przed różnicowaniem znacząco wpłynie na wydajność różnicowania. Również niewłaściwe utrwalenie i przepuszczalność przed barwieniem przeciwciał doprowadzi do nieoptymalnych wyników cytometrii przepływowej pokazujących, że procedura zostanie przeprowadzona przez shabo bachara, doktoranta z mojego laboratorium.

Najtrudniejszym aspektem poniższej procedury jest utrzymanie wysokiej jakości niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przed różnicowaniem. Zastosowanie komórek o nieoptymalnej charakterystyce wzrostu znacząco wpłynie na efektywność różnicowania. Rozpocznij tę procedurę od dobrze ugruntowanych HPC wyhodowanych w sześciu dobrze wykwalifikowanych naczyniach pokrytych matrycą.

Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wykazują jednorodną morfologię. Jeśli komórki wykazują morfologię nabłonka nerwowego lub fibroblastów, jak pokazano tutaj, nie należy ich używać. Upewnij się, że komórki rozmnażają się silnie, gdy są osadzone na poziomie 0,75 miliona na studzienkę, przechodząc je mniej więcej co trzy dni przy 75% Przejście konfluencji komórek z dysocjacją do poziomu pojedynczej komórki co najmniej pięć razy przed rozpoczęciem różnicowania Do przejścia.

Komórki najpierw zasysają pożywkę wzrostową E 8 i dwukrotnie myją komórki czterema mililitrami PBS podgrzanym do temperatury pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i pozostaw studzienkę w spokoju, aż granice komórek zaczną się zaokrąglać. Zwykle trwa to od trzech do siedmiu minut i można je zaobserwować makroskopowo i potwierdzić za pomocą mikroskopu.

Następnie za pomocą bawełnianej pipety szklanej z bawełnianą zatyczką przemieszczono komórki i przeniesiono je do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej jeden mililitr pożywki DM EMF 12. Spowoduje to dezaktywację roztworu do odłączania komórek. Usunąć 10 mikrolitrów podwielokrotności roztworu komórkowego i wymieszać ją z 10 mikrolitrami błękitu trianowego w probówce do mikrowirówki.

Policz komórki, a następnie, aby je zebrać, odwiruj 15-mililitrową stożkową probówkę o ciśnieniu 130 GS przez pięć minut. W temperaturze pokojowej podczas wirowania należy policzyć komórki za pomocą automatycznego hemocytometru. Spodziewaj się od 70 do 80% rentowności w przyszłości.

Opieraj wszystkie numery komórek na całkowitej liczbie komórek, a nie na liczbie żywotnych komórek. Po wirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w D-M-E-M-F 12 do końcowego stężenia 0,75 razy 10 do sześciu komórek na 500 mikrolitrów, dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, w której każda studzienka zawiera dwa mililitry pożywki E eight. Za pomocą inhibitora skał delikatnie kołysz płytką od przodu do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzience.

Włóż komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. 24 godziny po zapakowaniu. Rozpocznij codzienną wymianę pożywki, używając dwóch mililitrów na studzienkę E osiem, bez inhibitora skał.

Zoptymalizuj gęstość siewu, aby osiągnąć 100% zbieżność przed rozpoczęciem różnicowania. W dniu zero komórki są w 100% zlewające się ze sobą o zwartej morfologii i minimalnej ilości szczątków komórkowych. Rozpocznij proces różnicowania od zastąpienia pożywki E eight dwoma mililitrami różnicowania. Średni.

Po pierwsze, dodaj 1,2 mikrolitra CHIR do każdego. Cóż, w pierwszym i drugim dniu często obserwuje się znaczną śmierć komórek od 40 do 50%. Jednak przyłączone komórki zachowają zwartą morfologię.

W tym czasie podłoże staje się pomarańczowe i mętne. Jeśli zaobserwuje się różowe podłoże, które wskazuje na nadmierną śmierć komórki, potwierdź żywotność komórek za pomocą błękitu triamowego i przerwij, jeśli śmierć komórki przekroczy 70%W przeciwnym razie pierwszego dnia powtórz proces zastępowania pożywki dwoma mililitrami świeżego różnicowania. Średni. Po pierwsze, dodaj 1,2 mikrolitra CHIR do każdej studzienki, a w dniach od drugiego do trzeciego zastąp świeżą pożywką różnicującą.

Po pierwsze, w dniach od trzeciego do czwartego komórki zregenerują się, a gęstość wzrośnie w czwartym dniu. Zastąp pożywkę w każdym dołku świeżym różnicowaniem. Nośnik numer jeden i jeden mikrolitr IWR jeden.

W dniach od piątego do szóstego następuje minimalna śmierć komórki, a w piątym dniu mogą zacząć pojawiać się gęste plamy, które należy zastąpić pożywką świeżym różnicowaniem. Pożywka numer jeden i dodaj jeden mikrolitr IWR po jednym do każdego dołka w dniu od szóstego do siódmego, zastąp pożywkę świeżym różnicowaniem. Medium numer jeden.

W dniach od siódmego do ósmego uzyskuje się zlewającą się monowarstwę o zwartej morfologii przeplatanej gęstymi plamami. Ósmego dnia komórki zaczną się spontanicznie kurczyć, a pierwsze skurcze będą często widoczne w gęstych plamach. W ósmym dniu zastąp pożywkę świeżym różnicowaniem. Średni.

Po drugie, kontynuuj zastępowanie środkiem różnicującym numer dwa, co drugi dzień przez cały czas trwania kultury. Do 10 dnia obserwuje się silniejszy skurcz, który będzie się rozprzestrzeniał w całej kulturze w kolejnych dniach. Ten film pokazuje komórki w 30 dniu, a tutaj komórki są pokazane w 55 dniu.

Aby zebrać komórki do cytometrii przepływowej, należy przeprowadzić zbieranie i liczenie dysocjacji komórek, tak jak wykonano to wcześniej. Należy pamiętać, że w tym momencie komórki nie muszą być utrzymywane w sterylności. Delikatnie wirując osad komórkowy, dodaj kroplami 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do osadu komórkowego.

Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut. Dodaj trzy mililitry roztworu do płukania komórek, zbierz komórki przez odwirowanie po wirowaniu, odessaj roztwór podczas wirowania. Dodaj 100 mikrolitrów przepuszczalnego roztworu do osadu komórkowego kroplami, tak jak poprzednio.

Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 30 minut. Dodaj trzy mililitry roztworu do płukania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.

Powtórz w sumie dwa prania po przesiąknięciu. Przeprowadzić barwienie przeciwciał zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym za pomocą pipety P 1000 w 400 mikrolitrach roztworu podtrzymującego komórki do komórek i zdezagregować je poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie wstępnie zwilż nasadkę sitka komórkowego na okrągłej probówce z 50 mikrolitrami roztworu do konserwacji komórek.

Ustaw rurkę na lodzie. Nasadka sitka komórkowego zapobiega zatykaniu cytometru przepływowego przez agregaty komórek. Następnie przenieś roztwór komórek do nasadki sitka komórkowego i pozwól, aby zawiesina komórek spłynęła grawitacyjnie.

Delikatnie postukaj w dolną część probówki o blat stołu, aby komórki zostały zebrane w probówce. Umieść probówkę z powrotem na lodzie tak szybko, jak to możliwe. Przepłucz sitko 250 mikrolitrami roztworu do konserwacji komórek, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek.

Utrzymuj komórki na lodzie i chroń je przed światłem, dopóki nie zostaną przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia jakości generowanych kardiomiocytów. Korzystając z tego protokołu, komórki różnicowano przez 10 dni i barwiono przeciwciałami przeciwko TNNI three a, markerowi kardiomiocytów pan, TNNT dwa markerowi mięśni prążkowanych i IRX four Marker kardiomiocytów komorowych. Należy zauważyć, że warunki fiksacji i przepuszczalności zostały zoptymalizowane dla każdego przeciwciała, aby osiągnąć maksymalny odsetek komórek dodatnich.

Histogramy pokazują, że 99% bramkowanych komórek było dodatnich dla TNNI 3, a 96% było dodatnich dla IRX 4. Ponadto komórki były wysoce dodatnie dla innych markerów różnicowania serca, w tym TNNT dwa, MLC dwa V i MLC dwa. Należy zauważyć, że twierdzenie dotyczące czystości kardiomiocytów i tożsamości komórek opiera się na TNNI trzy i IRX cztery.

Barwienie MC dwa V i MC dwa A nie są ograniczone komorowo podczas rozwoju, a TNNT dwa występuje również w mięśniach szkieletowych. Pokazany tutaj potencjał czynnościowy zarejestrowano z pojedynczego spontanicznie kurczącego się kardiomiocytu w 46 dniu różnicowania za pomocą zaciskania całych komórek łatek. Profil potencjału czynnościowego wskazuje, że uzyskano kardiomiocyty komorowe.

Zaobserwowano również niewielki odsetek profili węzłowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysokiej jakości kultury kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych i jak je scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z utrzymaniem komórek macierzystych jako monowarstw wysokiej jakości przed rozpoczęciem różnicowania.

Nie zapominaj, że praca z utrwalaczem może być niebezpieczna i osobista. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny lub rękawice.