Name: Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów poprzez modulację szlaku Wnt. Naucz się charakteryzować uzyskane komórki za pomocą cytometrii przepływowej z markerami TNNI3 i IRX4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez NIH 4R00HL094708-03, MCW Research Affairs Committee New Faculty Award oraz fundację Kern (fundusze startowe) w Medical College of Wisconsin (RLG); Rada ds. Grantów Badawczych Hongkongu Tematyczny Program Badawczy T13-706/11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 oraz Nagroda Ustanowionego Badacza AHA (JCW); Stypendium podoktorskie AHA 12POST12050254 (PWB). Dziękujemy Hope Campbell z Flow Cytometry Core w Instytucie Badań Krwi w Wisconsin za pomoc w zbieraniu danych i starannej recenzji manuskryptu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu różnicowania ma zastosowanie wysokiej jakości kultur hPSC, które były pasażowane na poziomie pojedynczej komórki przez co najmniej pięć pasaży przed rozpoczęciem różnicowania. Podobną skuteczność różnicowania obserwuje się rutynowo wśród różnych linii hPSC, jeśli są one w 100% zlewające się na początku różnicowania, niezależnie od linii komórkowej. Nieoptymalną wydajność obserwuje się, jeśli zbieg komórek na początku różnicowania wynosi ≤95% lub >100%. Dlatego gęstość siewu i c...

Generacja kardiomiocytów z hPSC, w tym hESC i hiPSC, może funkcjonować jako model in vitro bardzo wczesnych procesów rozwojowych ludzkiego serca, dostarczając wglądu w etapy niedostępne dla badań mechanistycznych. Ten system modelowy zapewnia unikalne możliwości badania szlaków molekularnych, które kontrolują zaangażowanie linii serca i specyfikację losu komórki. W ostatnich latach znacznie poprawiła się zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z hPSC1-15. Jednak wśród protokołów występuje zmienność linii komórkowej w odniesieniu do wydajności w generowaniu komórek kardiomiogennych i czasu, w którym komórki wyrażają markery specyficzne dla komory (np. komora i przedsionki). Idealnie, dla przyszłych zastosowań tego systemu modelowego, pożądane są bardziej jednorodne populacje funkcjonalnie zdefiniowanych komórek. W przeciwieństwie do poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i solidnie generuje kultury wysoce dodatnie dla TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v i MLC2a do 10 dnia komórek we wszystkich testowanych do tej pory liniach hESC i hiPSC. Strategia ta jest technicznie prosta do wdrożenia, zwłaszcza w porównaniu z kulturami trójwymiarowymi, kulturami masowymi lub strategiami opartymi na ciele embrionalnym4-9, a ostatnio została zdefiniowana w badaniu, które opisuje małą cząsteczkę o selektywnej toksyczności dla hPSC (Boheler i wsp.)65. Cechy tego protokołu obejmują różnicowanie hPSC w hodowli jednowarstwowej przy użyciu pojedynczej warstwy matrycy kwalifikowanej do hESC (Matrigel), w pełni zdefiniowane pożywki wykorzystujące małe cząsteczki do modulacji sygnalizacji Wnt (podobne, ale różne od1,2,7,13) oraz zoptymalizowane metody barwienia cytometrii przepływowej do oceny wydajności różnicowania i tożsamości komórki. Podsumowując, zalety tego protokołu w porównaniu z poprzednimi raportami obejmują jego opłacalność, odtwarzalność i wysoką skuteczność w generowaniu kardiomiocytów wśród wielu linii hPSC, w tym linii hESC i hiPSC.
Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji, a przy odpowiednim projekcie eksperymentalnym może dostarczyć pomiarów ilościowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich strategii opartych na przeciwciałach, dokładna interpretacja wyników eksperymentalnych wymaga, aby elementy projektu testu, w tym stężenie przeciwciał oraz warunki wiązania i przenikania (w przypadku celowania w antygeny wewnątrzkomórkowe), zostały dokładnie przetestowane dla każdego przeciwciała, ponieważ warunki nieoptymalne znacząco wpływają na skuteczność wiązania przeciwciał, a tym samym na interpretację wyników. Co ważne, jeśli wymagane jest oznaczanie ilościowe, niezbędne są przeciwciała monoklonalne, ponieważ przeciwciała poliklonalne mogą rozpoznawać wiele epitopów i są podatne na zmiany między partiami. Obecnie opisano różne protokoły przeciwciał (poliklonalnych i monoklonalnych) oraz barwienia do oceny różnicowania in vitro, co utrudnia porównanie skuteczności kardiomiogenezy między protokołami1,2,9,11. Z tego powodu przeciwciała monoklonalne są stosowane, jeśli są dostępne, do wszystkich analiz cytometrii przepływowej. Idąc dalej, oczekuje się, że standaryzacja tych protokołów barwienia, zwłaszcza w odniesieniu do oceny ilościowej, powinna lepiej umożliwić porównanie strategii różnicowania.
Wybór markerów i odpowiadających im przeciwciał, używanych do oceny czystości kardiomiogenezy in vitro, różni się w zależności od raportu. TNNT2 został uznany za wskaźnik komórek zaangażowanych w kardiomiogenny los i jest rutynowo stosowany do oceny skuteczności protokołów różnicowania serca. Jednak TNNT2 ulega również ekspresji w mięśniach szkieletowych podczas wczesnego rozwoju piskląt i szczurów16,17 i jest obecny w mięśniach gładkich człowieka18. Tak więc TNNT2 niekoniecznie jest specyficznym markerem ludzkiej kardiomiogenezy in vitro. MLC2v i MLC2a są rutynowo stosowane jako markery zastępcze odpowiednio podtypów komorowych i przedsionkowych. Jednak wyzwania związane z poleganiem na MLC2v i MLC2a w celu określenia podtypu kardiomiocytów w kontekście różnicowania in vitro wynikają z faktu, że te produkty genów mogą nie być ograniczone do określonej komory przez cały okres rozwoju serca, od cewy serca do osoby dorosłej. W zapętlonym sercu gryzoni mRNA MLC2a dominuje w obszarze dróg przedsionkowych/dopływowych, a mRNA MLC2v dominuje w obszarach dróg komorowych/odpływowych. W zapętlonym sercu koekspresję mRNA MLC2a i MLC2v obserwuje się w przewodzie dopływowym, kanale przedsionkowo-komorowym i drodze odpływu19,20. Do 3 dni po urodzeniu mRNA MLC2v jest ograniczone do komory, a po 10 dniach po urodzeniu MLC2a jest ograniczone do przedsionków w sercu noworodkaszczura 19. W związku z tym interpretacja danych dotyczących skuteczności kardiomiogenezy i tożsamości podtypu musi uwzględniać nie tylko obecność i ilość poziomów markerów referencyjnych, ale także etap (etapy) rozwojowy, któremu odpowiadają analizowane punkty czasowe różnicowania. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę, że etap dojrzewania komórek kardiomiogennych powstałych w wyniku różnicowania hPSC in vitro najbardziej przypomina etap rozwoju embrionalnego/płodowego21-25. W związku z tym poleganie na ekspresji przestrzennej markera w sercu po urodzeniu może nie być odpowiednie do oceny komórek pochodzących z hPSC, przynajmniej w niektórych przypadkach.
W celu ułatwienia opracowania bardziej szczegółowych kryteriów definiowania tożsamości kardiomiocytów in vitro, TNNI3 jest uważany za cenny marker do oceny kardiomiogenezy in vitro, ponieważ jest ograniczony do mięśnia sercowego podczas embriogenezy u piskląt i danio pręgowanego15,20 i nie występuje w ludzkich mięśniach szkieletowych płodu26. Podczas gdy TNNI1 jest obecny w ludzkim sercu płodu, TNNI3 jest jedyną izoformą TNNI obecną w normalnym sercu dorosłegoczłowieka 27,28. Jeśli chodzi o tożsamość podtypu kardiomiocytów, IRX429-31 jest informacyjnym markerem komórek z losem komorowym. Na poziomie białka ostatnio wykazano, że IRX4 jest ograniczony do komory od liniowej rurki serca przez stadium noworodkowe u myszy32. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy TNNI3 i IRX4 za pomocą cytometrii przepływowej. Według naszej wiedzy jest to pierwszy opis metody skutecznego barwienia i analizy poziomów IRX4 w ludzkich kardiomiocytach za pomocą cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>BD Matrigel, matryca z kwalifikacją hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odłączania komórek Accutase</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO, Hybri-Max, sterylnie filtrowany)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek selektywny inhibitor p160ROCK</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy-2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna (Optiferrin &ndash; Zdefiniowany, wolny od zwierząt, rekombinowany człowiek)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGF&beta; 1)</td> <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-Glutaminą</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 Minus Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (z insuliną)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>odczynniki do cytometrii przepływowej</sól fizjologiczna buforowana > silnymfosforanem</td></tr> <tr><td>(10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Bufor do trwałej ondulacji Phosflow III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Mallenckrodt Chemicals&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Materiały</mocny></td></tr><tr><td>5 ml Rurka z polistyrenu o okrągłym dnie (bez nakrętki)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Do przygotowania Komory do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>5 ml Rurka z polistyrenu okrągłodennego (z 35 & mikro; M zatrzaskowa nasadka sitkowa komórek)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Do przygotowania komórek do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>2 ml gumowy gruszki</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>9-calowe borokrzemianowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, zielone</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, czerwony</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 automatyczny licznik komórek</td><td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające do TC20</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka z płaskim dnem poddawana działaniu kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Strzykawki</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td>Do filtracji sterylizacji podwielokrotności</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe, 0,2 i mikro; m polieterosulfon</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Do sterylizacji filtrów podwielokrotności</td></tr><tr><td>250 ml System filtracyjny, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, o niskim stopniu wiązania</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>Do sterylizacji filtracyjnej mediów masowych&nbsp;</td></tr><tr><td>System filtracyjny 500 ml, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, słabo wiążący</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Do sterylizacji filtracyjnej mediów</td></tr><tr> masowych<td colspan="4">Przeciwciała i kontrole izotypów</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))</td><td>Abcam</td><td>ab19615</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-TNNT2 (klon: 1C11)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>310111</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-IRX4&nbsp; &nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie IgG1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Koza anty-mysie IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>A21241</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozioł anty-mysie IgG2b</td><td>Life Technologies</td><td>A21141</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Fikoerytryna(PE) Kozia anty-królicza IgG</td><td>R& D Systems</td><td>F0110</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Mysz IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>Mysz kontrolująca izotyp</td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4724-81</td><td>Kontrola izotypu</td></tr><tr><td>IgG-PE królika</td><td>R& D Systems</td><td>IC105P</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td colspan="4">TaqMan Zestawy sond do qRT-PCR</td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01060665</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury T</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00610080</td><td></td></tr><tr><td>CASQ2</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00154286</td><td></td></tr><tr><td>IRX4</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01100809</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00158126</td><td></td></tr><tr><td>MESP1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01001283</td><td></td></tr><tr><td>MYH11 (SMMHC)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00224610</td><td></td></tr><tr><td>MYH6</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01101425</td><td></td></tr><tr><td>MYL2 (MLC2v)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00166405</td><td></td></tr><tr><td>MYL7 (MLC2a)</td><td>Life Technologies</td><td>HS01085598</td><td></td></tr><tr><td>MYOG</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01072232</td><td></td></tr><tr><td>NKX2.5</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00231763</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01081097</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1</td><td>Life Technologies</td><td>HS04260367</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Life Technologies</td><td>HS00751752</td><td></td></tr><tr><td>TNNI1</td><td>Life Technologies</td><td>HS00913333</td><td></td></tr><tr><td>TNNI2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00268536</td><td></td></tr><tr><td>TNNI3</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165957</td><td></td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165960</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Istnieje pilna potrzeba opracowania metod naprawy uszkodzonego serca, odkrycia nowych leków terapeutycznych, które nie mają toksycznego wpływu na serce, oraz ulepszenia strategii dokładnego modelowania chorób serca. Potencjał wykorzystania technologii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do generowania mięśnia sercowego "w naczyniu" do tych zastosowań nadal wzbudza duże zainteresowanie. W ostatnich latach zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) znacznie się poprawiła, oferując nam nowe możliwości modelowania bardzo wczesnych etapów rozwoju serca człowieka, które nie są dostępne w inny sposób. W przeciwieństwie do wielu poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub BMP4 i solidnie generuje kultury komórek, które są wysoce dodatnie dla sercowej troponiny I i T (TNNI3, TNNT2), białka homeodomeny klasy irokezów IRX-4 (IRX4), regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoformy komór/mięśnia sercowego (MLC2v) i regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoforma przedsionkowa (MLC2a) do 10 dnia we wszystkich przebadanych do tej pory liniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i hiPSC. Komórki mogą być pasażowane i utrzymywane w hodowli przez ponad 90 dni. Strategia jest technicznie prosta do wdrożenia i opłacalna. Charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z komórek pluripotencjalnych często obejmuje analizę markerów referencyjnych, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W przypadku analizy białek cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji. Jednak różnice techniczne w przygotowaniu próbek mogą znacząco wpłynąć na jakość danych z cytometrii przepływowej. W związku z tym standaryzacja protokołów barwienia powinna ułatwić porównania między różnymi strategiami różnicowania. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 i TNNT2 za pomocą cytometrii przepływowej.

W dniu 0 komórki są w 100% konfluencyjne, o zwartej morfologii i z minimalną ilością resztek komórkowych. W dniach 1-2 często obserwuje się znaczną śmierć komórek (40-50%), lecz przytwierdzone komórki zachowują zwartą morfologię (Rysunek 1A). W tym czasie pożywka ma pomarańczowy kolor i jest mętna. Różowa pożywka wskazuje na nadmierną śmierć komórek; w takim przypadku należy potwierdzić to testem z błękitnym trypanem i przerwać proces, jeśli śmierć komórek przekrocza 70%. Komórki regenerują się w dniach ...

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysokiej jakości kultur kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych i odpowiednie scharakteryzowanie produktu końcowego za pomocą cytometrii przepływowej. Aby to osiągnąć, generowane są wysokiej jakości jednowarstwowe kultury niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Miogeneza sercowa jest następnie indukowana przez modulację szlaku wiatru za pomocą małych cząsteczek.Następnie kardiomiocyty są utrwalane, przenikane i barwione w warunkach, które są specjalnie zoptymalizowane dla każdego przeciwciała. Na koniec komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują posiewy, które są wysoce dodatnie dla markerów sercowych, TNNI trzy i IRX cztery oraz wykazują komorowe potencjały czynnościowe.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te w korpusach pracowników i warkoczy, jest to, że jest stosunkowo prosta do wdrożenia i opłacalna. Co więcej, technika ta generuje hodowle komórek, które są wysoce dodatnie na troponinę sercową I. Bez wewnętrznej zmienności i wydajności obserwowanej w innych protokołach, wizualna demonstracja

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów poprzez modulację szlaku Wnt. Naucz się charakteryzować uzyskane komórki za pomocą cytometrii przepływowej z markerami TNNI3 i IRX4.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów