Name: Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów poprzez modulację szlaku Wnt. Naucz się charakteryzować uzyskane komórki za pomocą cytometrii przepływowej z markerami TNNI3 i IRX4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NIH 4R00HL094708-03, MCW Research Affairs Committee New Faculty Award oraz fundację Kern (fundusze startowe) w Medical College of Wisconsin (RLG); Rada ds. Grantów Badawczych Hongkongu Tematyczny Program Badawczy T13-706/11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 oraz Nagroda Ustanowionego Badacza AHA (JCW); Stypendium podoktorskie AHA 12POST12050254 (PWB). Dziękujemy Hope Campbell z Flow Cytometry Core w Instytucie Badań Krwi w Wisconsin za pomoc w zbieraniu danych i starannej recenzji manuskryptu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu różnicowania ma zastosowanie wysokiej jakości kultur hPSC, które były pasażowane na poziomie pojedynczej komórki przez co najmniej pięć pasaży przed rozpoczęciem różnicowania. Podobną skuteczność różnicowania obserwuje się rutynowo wśród różnych linii hPSC, jeśli są one w 100% zlewające się na początku różnicowania, niezależnie od linii komórkowej. Nieoptymalną wydajność obserwuje się, jeśli zbieg komórek na początku różnicowania wynosi ≤95% lub >100%. Dlatego gęstość siewu i c...

Generacja kardiomiocytów z hPSC, w tym hESC i hiPSC, może funkcjonować jako model in vitro bardzo wczesnych procesów rozwojowych ludzkiego serca, dostarczając wglądu w etapy niedostępne dla badań mechanistycznych. Ten system modelowy zapewnia unikalne możliwości badania szlaków molekularnych, które kontrolują zaangażowanie linii serca i specyfikację losu komórki. W ostatnich latach znacznie poprawiła się zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z hPSC1-15. Jednak wśród protokołów występuje zmienność linii komórkowej w odniesieniu do wydajności w generowaniu komórek kardiomiogennych i czasu, w którym komórki wyrażają markery specyficzne dla komory (np. komora i przedsionki). Idealnie, dla przyszłych zastosowań tego systemu modelowego, pożądane są bardziej jednorodne populacje funkcjonalnie zdefiniowanych komórek. W przeciwieństwie do poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4) i solidnie generuje kultury wysoce dodatnie dla TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v i MLC2a do 10 dnia komórek we wszystkich testowanych do tej pory liniach hESC i hiPSC. Strategia ta jest technicznie prosta do wdrożenia, zwłaszcza w porównaniu z kulturami trójwymiarowymi, kulturami masowymi lub strategiami opartymi na ciele embrionalnym4-9, a ostatnio została zdefiniowana w badaniu, które opisuje małą cząsteczkę o selektywnej toksyczności dla hPSC (Boheler i wsp.)65. Cechy tego protokołu obejmują różnicowanie hPSC w hodowli jednowarstwowej przy użyciu pojedynczej warstwy matrycy kwalifikowanej do hESC (Matrigel), w pełni zdefiniowane pożywki wykorzystujące małe cząsteczki do modulacji sygnalizacji Wnt (podobne, ale różne od1,2,7,13) oraz zoptymalizowane metody barwienia cytometrii przepływowej do oceny wydajności różnicowania i tożsamości komórki. Podsumowując, zalety tego protokołu w porównaniu z poprzednimi raportami obejmują jego opłacalność, odtwarzalność i wysoką skuteczność w generowaniu kardiomiocytów wśród wielu linii hPSC, w tym linii hESC i hiPSC.
Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji, a przy odpowiednim projekcie eksperymentalnym może dostarczyć pomiarów ilościowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich strategii opartych na przeciwciałach, dokładna interpretacja wyników eksperymentalnych wymaga, aby elementy projektu testu, w tym stężenie przeciwciał oraz warunki wiązania i przenikania (w przypadku celowania w antygeny wewnątrzkomórkowe), zostały dokładnie przetestowane dla każdego przeciwciała, ponieważ warunki nieoptymalne znacząco wpływają na skuteczność wiązania przeciwciał, a tym samym na interpretację wyników. Co ważne, jeśli wymagane jest oznaczanie ilościowe, niezbędne są przeciwciała monoklonalne, ponieważ przeciwciała poliklonalne mogą rozpoznawać wiele epitopów i są podatne na zmiany między partiami. Obecnie opisano różne protokoły przeciwciał (poliklonalnych i monoklonalnych) oraz barwienia do oceny różnicowania in vitro, co utrudnia porównanie skuteczności kardiomiogenezy między protokołami1,2,9,11. Z tego powodu przeciwciała monoklonalne są stosowane, jeśli są dostępne, do wszystkich analiz cytometrii przepływowej. Idąc dalej, oczekuje się, że standaryzacja tych protokołów barwienia, zwłaszcza w odniesieniu do oceny ilościowej, powinna lepiej umożliwić porównanie strategii różnicowania.
Wybór markerów i odpowiadających im przeciwciał, używanych do oceny czystości kardiomiogenezy in vitro, różni się w zależności od raportu. TNNT2 został uznany za wskaźnik komórek zaangażowanych w kardiomiogenny los i jest rutynowo stosowany do oceny skuteczności protokołów różnicowania serca. Jednak TNNT2 ulega również ekspresji w mięśniach szkieletowych podczas wczesnego rozwoju piskląt i szczurów16,17 i jest obecny w mięśniach gładkich człowieka18. Tak więc TNNT2 niekoniecznie jest specyficznym markerem ludzkiej kardiomiogenezy in vitro. MLC2v i MLC2a są rutynowo stosowane jako markery zastępcze odpowiednio podtypów komorowych i przedsionkowych. Jednak wyzwania związane z poleganiem na MLC2v i MLC2a w celu określenia podtypu kardiomiocytów w kontekście różnicowania in vitro wynikają z faktu, że te produkty genów mogą nie być ograniczone do określonej komory przez cały okres rozwoju serca, od cewy serca do osoby dorosłej. W zapętlonym sercu gryzoni mRNA MLC2a dominuje w obszarze dróg przedsionkowych/dopływowych, a mRNA MLC2v dominuje w obszarach dróg komorowych/odpływowych. W zapętlonym sercu koekspresję mRNA MLC2a i MLC2v obserwuje się w przewodzie dopływowym, kanale przedsionkowo-komorowym i drodze odpływu19,20. Do 3 dni po urodzeniu mRNA MLC2v jest ograniczone do komory, a po 10 dniach po urodzeniu MLC2a jest ograniczone do przedsionków w sercu noworodkaszczura 19. W związku z tym interpretacja danych dotyczących skuteczności kardiomiogenezy i tożsamości podtypu musi uwzględniać nie tylko obecność i ilość poziomów markerów referencyjnych, ale także etap (etapy) rozwojowy, któremu odpowiadają analizowane punkty czasowe różnicowania. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę, że etap dojrzewania komórek kardiomiogennych powstałych w wyniku różnicowania hPSC in vitro najbardziej przypomina etap rozwoju embrionalnego/płodowego21-25. W związku z tym poleganie na ekspresji przestrzennej markera w sercu po urodzeniu może nie być odpowiednie do oceny komórek pochodzących z hPSC, przynajmniej w niektórych przypadkach.
W celu ułatwienia opracowania bardziej szczegółowych kryteriów definiowania tożsamości kardiomiocytów in vitro, TNNI3 jest uważany za cenny marker do oceny kardiomiogenezy in vitro, ponieważ jest ograniczony do mięśnia sercowego podczas embriogenezy u piskląt i danio pręgowanego15,20 i nie występuje w ludzkich mięśniach szkieletowych płodu26. Podczas gdy TNNI1 jest obecny w ludzkim sercu płodu, TNNI3 jest jedyną izoformą TNNI obecną w normalnym sercu dorosłegoczłowieka 27,28. Jeśli chodzi o tożsamość podtypu kardiomiocytów, IRX429-31 jest informacyjnym markerem komórek z losem komorowym. Na poziomie białka ostatnio wykazano, że IRX4 jest ograniczony do komory od liniowej rurki serca przez stadium noworodkowe u myszy32. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy TNNI3 i IRX4 za pomocą cytometrii przepływowej. Według naszej wiedzy jest to pierwszy opis metody skutecznego barwienia i analizy poziomów IRX4 w ludzkich kardiomiocytach za pomocą cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>BD Matrigel, matryca z kwalifikacją hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odłączania komórek Accutase</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO, Hybri-Max, sterylnie filtrowany)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek selektywny inhibitor p160ROCK</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy-2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna (Optiferrin &ndash; Zdefiniowany, wolny od zwierząt, rekombinowany człowiek)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGF&beta; 1)</td> <td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 z L-Glutaminą</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 Minus Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (z insuliną)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>odczynniki do cytometrii przepływowej</sól fizjologiczna buforowana > silnymfosforanem</td></tr> <tr><td>(10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Bufor do trwałej ondulacji Phosflow III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Mallenckrodt Chemicals&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>Materiały</mocny></td></tr><tr><td>5 ml Rurka z polistyrenu o okrągłym dnie (bez nakrętki)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Do przygotowania Komory do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>5 ml Rurka z polistyrenu okrągłodennego (z 35 & mikro; M zatrzaskowa nasadka sitkowa komórek)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Do przygotowania komórek do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>2 ml gumowy gruszki</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>9-calowe borokrzemianowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, zielone</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek, z podziałką, czerwony</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 automatyczny licznik komórek</td><td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zliczające do TC20</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka z płaskim dnem poddawana działaniu kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Strzykawki</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td>Do filtracji sterylizacji podwielokrotności</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe, 0,2 i mikro; m polieterosulfon</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Do sterylizacji filtrów podwielokrotności</td></tr><tr><td>250 ml System filtracyjny, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, o niskim stopniu wiązania</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>Do sterylizacji filtracyjnej mediów masowych&nbsp;</td></tr><tr><td>System filtracyjny 500 ml, 0,22 &mikro; m polieterosulfon, sterylizujący, słabo wiążący</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Do sterylizacji filtracyjnej mediów</td></tr><tr> masowych<td colspan="4">Przeciwciała i kontrole izotypów</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))</td><td>Abcam</td><td>ab19615</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-TNNT2 (klon: 1C11)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>310111</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-IRX4&nbsp; &nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie IgG1&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Koza anty-mysie IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>A21241</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozioł anty-mysie IgG2b</td><td>Life Technologies</td><td>A21141</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Fikoerytryna(PE) Kozia anty-królicza IgG</td><td>R& D Systems</td><td>F0110</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Mysz IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>Mysz kontrolująca izotyp</td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4724-81</td><td>Kontrola izotypu</td></tr><tr><td>IgG-PE królika</td><td>R& D Systems</td><td>IC105P</td><td>Isotype Control</td></tr><tr><td colspan="4">TaqMan Zestawy sond do qRT-PCR</td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01060665</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury T</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00610080</td><td></td></tr><tr><td>CASQ2</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00154286</td><td></td></tr><tr><td>IRX4</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01100809</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00158126</td><td></td></tr><tr><td>MESP1</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01001283</td><td></td></tr><tr><td>MYH11 (SMMHC)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00224610</td><td></td></tr><tr><td>MYH6</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01101425</td><td></td></tr><tr><td>MYL2 (MLC2v)</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00166405</td><td></td></tr><tr><td>MYL7 (MLC2a)</td><td>Life Technologies</td><td>HS01085598</td><td></td></tr><tr><td>MYOG</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01072232</td><td></td></tr><tr><td>NKX2.5</td><td>Life Technologies</td><td>Hs00231763</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Life Technologies</td><td>Hs01081097</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1</td><td>Life Technologies</td><td>HS04260367</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Life Technologies</td><td>HS00751752</td><td></td></tr><tr><td>TNNI1</td><td>Life Technologies</td><td>HS00913333</td><td></td></tr><tr><td>TNNI2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00268536</td><td></td></tr><tr><td>TNNI3</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165957</td><td></td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Life Technologies</td><td>HS00165960</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Istnieje pilna potrzeba opracowania metod naprawy uszkodzonego serca, odkrycia nowych leków terapeutycznych, które nie mają toksycznego wpływu na serce, oraz ulepszenia strategii dokładnego modelowania chorób serca. Potencjał wykorzystania technologii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do generowania mięśnia sercowego "w naczyniu" do tych zastosowań nadal wzbudza duże zainteresowanie. W ostatnich latach zdolność do wydajnego generowania komórek kardiomiogennych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) znacznie się poprawiła, oferując nam nowe możliwości modelowania bardzo wczesnych etapów rozwoju serca człowieka, które nie są dostępne w inny sposób. W przeciwieństwie do wielu poprzednich metod, opisany tutaj protokół różnicowania kardiomiocytów nie wymaga agregacji komórek ani dodawania aktywiny A lub BMP4 i solidnie generuje kultury komórek, które są wysoce dodatnie dla sercowej troponiny I i T (TNNI3, TNNT2), białka homeodomeny klasy irokezów IRX-4 (IRX4), regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoformy komór/mięśnia sercowego (MLC2v) i regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny 2, izoforma przedsionkowa (MLC2a) do 10 dnia we wszystkich przebadanych do tej pory liniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i hiPSC. Komórki mogą być pasażowane i utrzymywane w hodowli przez ponad 90 dni. Strategia jest technicznie prosta do wdrożenia i opłacalna. Charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z komórek pluripotencjalnych często obejmuje analizę markerów referencyjnych, zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W przypadku analizy białek cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem analitycznym do oceny jakości komórek w hodowli i określania jednorodności subpopulacji. Jednak różnice techniczne w przygotowaniu próbek mogą znacząco wpłynąć na jakość danych z cytometrii przepływowej. W związku z tym standaryzacja protokołów barwienia powinna ułatwić porównania między różnymi strategiami różnicowania. W związku z tym opisano zoptymalizowane protokoły barwienia do analizy IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 i TNNT2 za pomocą cytometrii przepływowej.

W dniu 0 komórki są w 100% konfluencyjne, o zwartej morfologii i z minimalną ilością resztek komórkowych. W dniach 1-2 często obserwuje się znaczną śmierć komórek (40-50%), lecz przytwierdzone komórki zachowują zwartą morfologię (Rysunek 1A). W tym czasie pożywka ma pomarańczowy kolor i jest mętna. Różowa pożywka wskazuje na nadmierną śmierć komórek; w takim przypadku należy potwierdzić to testem z błękitnym trypanem i przerwać proces, jeśli śmierć komórek przekrocza 70%. Komórki regenerują się w dniach ...

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wysokiej jakości kultur kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych i odpowiednie scharakteryzowanie produktu końcowego za pomocą cytometrii przepływowej. Aby to osiągnąć, generowane są wysokiej jakości jednowarstwowe kultury niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Miogeneza sercowa jest następnie indukowana przez modulację szlaku wiatru za pomocą małych cząsteczek.Następnie kardiomiocyty są utrwalane, przenikane i barwione w warunkach, które są specjalnie zoptymalizowane dla każdego przeciwciała. Na koniec komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują posiewy, które są wysoce dodatnie dla markerów sercowych, TNNI trzy i IRX cztery oraz wykazują komorowe potencjały czynnościowe.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te w korpusach pracowników i warkoczy, jest to, że jest stosunkowo prosta do wdrożenia i opłacalna. Co więcej, technika ta generuje hodowle komórek, które są wysoce dodatnie na troponinę sercową I. Bez wewnętrznej zmienności i wydajności obserwowanej w innych protokołach, wizualna demonstracja metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jakość komórek przed różnicowaniem znacząco wpłynie na wydajność różnicowania. Również niewłaściwe utrwalenie i przepuszczalność przed barwieniem przeciwciał doprowadzi do nieoptymalnych wyników cytometrii przepływowej pokazujących, że procedura zostanie przeprowadzona przez shabo bachara, doktoranta z mojego laboratorium.Najtrudniejszym aspektem poniższej procedury jest utrzymanie wysokiej jakości niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przed różnicowaniem. Zastosowanie komórek o nieoptymalnej charakterystyce wzrostu znacząco wpłynie na efektywność różnicowania. Rozpocznij tę procedurę od dobrze ugruntowanych HPC wyhodowanych w sześciu dobrze wykwalifikowanych naczyniach pokrytych matrycą.Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wykazują jednorodną morfologię. Jeśli komórki wykazują morfologię nabłonka nerwowego lub fibroblastów, jak pokazano tutaj, nie należy ich używać. Upewnij się, że komórki rozmnażają się silnie, gdy są osadzone na poziomie 0,75 miliona na studzienkę, przechodząc je mniej więcej co trzy dni przy 75% Przejście konfluencji komórek z dysocjacją do poziomu pojedynczej komórki co najmniej pięć razy przed rozpoczęciem różnicowania Do przejścia.Komórki najpierw zasysają pożywkę wzrostową E 8 i dwukrotnie myją komórki czterema mililitrami PBS podgrzanym do temperatury pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu do oddzielania komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i pozostaw studzienkę w spokoju, aż granice komórek zaczną się zaokrąglać. Zwykle trwa to od trzech do siedmiu minut i można je zaobserwować makroskopowo i potwierdzić za pomocą mikroskopu.Następnie za pomocą bawełnianej pipety szklanej z bawełnianą zatyczką przemieszczono komórki i przeniesiono je do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej jeden mililitr pożywki DM EMF 12. Spowoduje to dezaktywację roztworu do odłączania komórek. Usunąć 10 mikrolitrów podwielokrotności roztworu komórkowego i wymieszać ją z 10 mikrolitrami błękitu trianowego w probówce do mikrowirówki.Policz komórki, a następnie, aby je zebrać, odwiruj 15-mililitrową stożkową probówkę o ciśnieniu 130 GS przez pięć minut. W temperaturze pokojowej podczas wirowania należy policzyć komórki za pomocą automatycznego hemocytometru. Spodziewaj się od 70 do 80% rentowności w przyszłości.Opieraj wszystkie numery komórek na całkowitej liczbie komórek, a nie na liczbie żywotnych komórek. Po wirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w D-M-E-M-F 12 do końcowego stężenia 0,75 razy 10 do sześciu komórek na 500 mikrolitrów, dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki, w której każda studzienka zawiera dwa mililitry pożywki E eight. Za pomocą inhibitora skał delikatnie kołysz płytką od przodu do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzience.Włóż komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. 24 godziny po zapakowaniu. Rozpocznij codzienną wymianę pożywki, używając dwóch mililitrów na studzienkę E osiem, bez inhibitora skał.Zoptymalizuj gęstość siewu, aby osiągnąć 100% zbieżność przed rozpoczęciem różnicowania. W dniu zero komórki są w 100% zlewające się ze sobą o zwartej morfologii i minimalnej ilości szczątków komórkowych. Rozpocznij proces różnicowania od zastąpienia pożywki E eight dwoma mililitrami różnicowania. Średni.Po pierwsze, dodaj 1,2 mikrolitra CHIR do każdego. Cóż, w pierwszym i drugim dniu często obserwuje się znaczną śmierć komórek od 40 do 50%. Jednak przyłączone komórki zachowają zwartą morfologię.W tym czasie podłoże staje się pomarańczowe i mętne. Jeśli zaobserwuje się różowe podłoże, które wskazuje na nadmierną śmierć komórki, potwierdź żywotność komórek za pomocą błękitu triamowego i przerwij, jeśli śmierć komórki przekroczy 70%W przeciwnym razie pierwszego dnia powtórz proces zastępowania pożywki dwoma mililitrami świeżego różnicowania. Średni. Po pierwsze, dodaj 1,2 mikrolitra CHIR do każdej studzienki, a w dniach od drugiego do trzeciego zastąp świeżą pożywką różnicującą.Po pierwsze, w dniach od trzeciego do czwartego komórki zregenerują się, a gęstość wzrośnie w czwartym dniu. Zastąp pożywkę w każdym dołku świeżym różnicowaniem. Nośnik numer jeden i jeden mikrolitr IWR jeden.W dniach od piątego do szóstego następuje minimalna śmierć komórki, a w piątym dniu mogą zacząć pojawiać się gęste plamy, które należy zastąpić pożywką świeżym różnicowaniem. Pożywka numer jeden i dodaj jeden mikrolitr IWR po jednym do każdego dołka w dniu od szóstego do siódmego, zastąp pożywkę świeżym różnicowaniem. Medium numer jeden.W dniach od siódmego do ósmego uzyskuje się zlewającą się monowarstwę o zwartej morfologii przeplatanej gęstymi plamami. Ósmego dnia komórki zaczną się spontanicznie kurczyć, a pierwsze skurcze będą często widoczne w gęstych plamach. W ósmym dniu zastąp pożywkę świeżym różnicowaniem. Średni.Po drugie, kontynuuj zastępowanie środkiem różnicującym numer dwa, co drugi dzień przez cały czas trwania kultury. Do 10 dnia obserwuje się silniejszy skurcz, który będzie się rozprzestrzeniał w całej kulturze w kolejnych dniach. Ten film pokazuje komórki w 30 dniu, a tutaj komórki są pokazane w 55 dniu.Aby zebrać komórki do cytometrii przepływowej, należy przeprowadzić zbieranie i liczenie dysocjacji komórek, tak jak wykonano to wcześniej. Należy pamiętać, że w tym momencie komórki nie muszą być utrzymywane w sterylności. Delikatnie wirując osad komórkowy, dodaj kroplami 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do osadu komórkowego.Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut. Dodaj trzy mililitry roztworu do płukania komórek, zbierz komórki przez odwirowanie po wirowaniu, odessaj roztwór podczas wirowania. Dodaj 100 mikrolitrów przepuszczalnego roztworu do osadu komórkowego kroplami, tak jak poprzednio.Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 30 minut. Dodaj trzy mililitry roztworu do płukania komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.Powtórz w sumie dwa prania po przesiąknięciu. Przeprowadzić barwienie przeciwciał zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym za pomocą pipety P 1000 w 400 mikrolitrach roztworu podtrzymującego komórki do komórek i zdezagregować je poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie wstępnie zwilż nasadkę sitka komórkowego na okrągłej probówce z 50 mikrolitrami roztworu do konserwacji komórek.Ustaw rurkę na lodzie. Nasadka sitka komórkowego zapobiega zatykaniu cytometru przepływowego przez agregaty komórek. Następnie przenieś roztwór komórek do nasadki sitka komórkowego i pozwól, aby zawiesina komórek spłynęła grawitacyjnie.Delikatnie postukaj w dolną część probówki o blat stołu, aby komórki zostały zebrane w probówce. Umieść probówkę z powrotem na lodzie tak szybko, jak to możliwe. Przepłucz sitko 250 mikrolitrami roztworu do konserwacji komórek, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek.Utrzymuj komórki na lodzie i chroń je przed światłem, dopóki nie zostaną przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia jakości generowanych kardiomiocytów. Korzystając z tego protokołu, komórki różnicowano przez 10 dni i barwiono przeciwciałami przeciwko TNNI three a, markerowi kardiomiocytów pan, TNNT dwa markerowi mięśni prążkowanych i IRX four Marker kardiomiocytów komorowych. Należy zauważyć, że warunki fiksacji i przepuszczalności zostały zoptymalizowane dla każdego przeciwciała, aby osiągnąć maksymalny odsetek komórek dodatnich.Histogramy pokazują, że 99% bramkowanych komórek było dodatnich dla TNNI 3, a 96% było dodatnich dla IRX 4. Ponadto komórki były wysoce dodatnie dla innych markerów różnicowania serca, w tym TNNT dwa, MLC dwa V i MLC dwa. Należy zauważyć, że twierdzenie dotyczące czystości kardiomiocytów i tożsamości komórek opiera się na TNNI trzy i IRX cztery.Barwienie MC dwa V i MC dwa A nie są ograniczone komorowo podczas rozwoju, a TNNT dwa występuje również w mięśniach szkieletowych. Pokazany tutaj potencjał czynnościowy zarejestrowano z pojedynczego spontanicznie kurczącego się kardiomiocytu w 46 dniu różnicowania za pomocą zaciskania całych komórek łatek. Profil potencjału czynnościowego wskazuje, że uzyskano kardiomiocyty komorowe.Zaobserwowano również niewielki odsetek profili węzłowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wysokiej jakości kultury kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych i jak je scharakteryzować za pomocą cytometrii przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z utrzymaniem komórek macierzystych jako monowarstw wysokiej jakości przed rozpoczęciem różnicowania.Nie zapominaj, że praca z utrwalaczem może być niebezpieczna i osobista. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny lub rękawice.

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów poprzez modulację szlaku Wnt. Naucz się charakteryzować uzyskane komórki za pomocą cytometrii przepływowej z markerami TNNI3 i IRX4.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów