Name: Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj technikę tworzenia odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu u myszy. Precyzyjna metoda chirurgiczna umożliwia testowanie nowych strategii terapeutycznych z wykorzystaniem obrazowania in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Keating jest finansowany przez CA100335 grantowe Departamentu Obrony i jest stypendystą Fundacji St. Baldrick's.

Wszystkie opisane procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez nasz instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
1. Zaplanuj eksperyment
<ol>
	<li>Wybierz komórki do wstrzyknięcia. Komórki z różnych źródeł są kandydatami do wstrzyknięcia: przylegające linie hodowli komórkowych, genetycznie zmodyfikowane klony, komórki neurosferyczne, hodowle pierwotne lub guzy zdezagregowane. Pożądany rodzaj modelu określi najbardziej odpowiednie miejsce wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Określ liczbę komórek do wstrzyknięcia. Liczba komórek potrzebnych do powstania guzów różni się w zależności od linii komórkowej i musi być określona empirycznie; Tempo wzrostu guza zależy w dużej mierze od typu komórki, liczby komórek i liczby pasaży w kulturze tkankowej. Liczba komórek w zakresie od 1 x 104 do 2 x 105 lub więcej na wstrzyknięcie spowodowała powstanie guzów o różnym tempie wzrostu.</li>
		<li>Należy ograniczyć objętość wstrzykiwanej leku. Komórki powinny być zawieszone w najmniejszej objętości pożywki wolnej od surowicy lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), która pozwala na płynne i łatwe przejście przez igłę 26 G. Im mniejsza objętość faktycznie dostarczana do mózgu, tym bardziej precyzyjny i zdefiniowany jest powstały guz; Optymalne wyniki uzyskuje się poprzez wstrzykiwanie objętości od 3 do 6 μl. Należy zaplanować przygotowanie końcowej całkowitej objętości co najmniej 50 μl zawieszonych komórek, niezależnie od planowanej liczby wstrzyknięć, aby umożliwić dokładny pomiar, wymieszanie i pobranie próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz odpowiednie myszy do modelu. Mysie modele ludzkich nowotworów zazwyczaj wykorzystują młode myszy z obniżoną odpornością, aby uniknąć odrzucenia przeszczepu za pośrednictwem układu odpornościowego. Nie jest konieczne, aby praca odbywała się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, jeśli zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności, w tym dekontaminacja, dezynfekcja i sterylizacja materiałów i sprzętu. Pokazana tutaj praca została wykonana na atymimicznych nagich myszach, samcach i samicach, w wieku od 6 do 12 tygodni. Myszy, które ważą mniej niż 20 g, mogą być trudne do ułożenia na ramie stereotaktycznej i mogą być bardziej podatne na hipotermię.</li>
</ol>
2. Złóż sprzęt
<ol>
	<li>Uzyskaj i odkaż stereotaktyczną ramkę myszy, konsolę wyrównującą i uchwyt głowicy znieczulenia gazem myszy, pompę mikrostrzykawkową, poduszkę grzewczą, maszynę do znieczulenia, światłowodową lampę roboczą i wiertarkę obrotową o zmiennej prędkości. Wyczyść i odkaż cały sprzęt.</li>
	<li>Zaprogramuj parametry wtrysku (w tym objętość wtrysku, natężenie przepływu, jednostki szybkości, typ strzykawki) i inne zmienne niezbędne do działania pompy strzykawkowej. Zoptymalizuj ustawienia dla każdego konkretnego modelu. 
	UWAGA: W tych wstrzyknięciach ustawienia obejmowały 3,000 nl próbek z szybkością 400 nl/min (jednostki szybkości "M") przy użyciu strzykawki 25 μl (typ urządzenia "E") w trybie niegrupowym ("N").</li>
	<li>Oczyścić precyzyjną mikrostrzykawkę igłą 26 G z kilkoma płukaniami sterylnej wody dejonizowanej (diH2O) i 70% etanolu (EtOH), wykonując końcowe płukanie diH2O. Niektóre, ale nie wszystkie modele są przeznaczone do sterylizacji w autoklawie. Upewnić się, że ruch tłoka jest płynny i swobodny.</li>
	<li>Zaopatrz się w sprzęt do podawania znieczulenia. Izofluran jest preferowanym środkiem znieczulającym, ponieważ łatwo jest regulować głębokość i czas trwania znieczulenia. Upewnij się, że jednostka stereotaktyczna jest wyposażona w nasadkę do znieczulenia myszy oraz że niezbędne rurki i złącza są na swoim miejscu, aby dostarczyć mieszaninę gazów z aparatu do znieczulenia do myszy.</li>
	<li>Narzędzia chirurgiczne do autoklawu, w tym nożyczki z cienką końcówką, dwa kleszcze/hemostatyki (z zębami) do szycia, średniej wielkości nożyczki, pęsety ze średnią i cienką końcówką oraz co najmniej dwa wiertła dentystyczne 1 mm. Utrzymuj narzędzia w czystości podczas zabiegu za pomocą 70% EtOH, środka dezynfekującego lub sterylizatora perełkowego.</li>
	<li>Uzyskaj izofluran, środek przeciwbólowy, maść / lubrykant okulistyczny, maść z antybiotykiem, sól fizjologiczną, 30% nadtlenek wodoru (H2O2), środek antyseptyczny i wosk kostny (w razie potrzeby) z zaopatrzenia weterynaryjnego lub medycznego. Przygotować sterylne diH2O i 70% EtOH. Materiały jednorazowego użytku, takie jak gaziki, sterylne opatrunki, szwy, waciki etanolowe, waciki z bawełnianą końcówką, sterylne rękawice chirurgiczne, ostrza chirurgiczne i inne, są wyszczególnione na liście materiałów. Marker permanentny z cienką końcówką do oznaczania czaszki powinien być odkażony i dedykowany do użytku chirurgicznego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>W pokazanych tutaj eksperymentach wybierz unieśmiertelnioną ludzką linię komórkową GBM. Określić empirycznie liczbę komórek (2 x 105) i objętość zawiesiny do wstrzyknięcia (3 μl); Szczegóły mogą się różnić w zależności od typu komórki. Użyj objętości co najmniej 50 μl, aby ułatwić dokładne odmierzanie, mieszanie i wstrzykiwanie.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki i ponownie zamieszaj w pożywce lub PBS. Wykonaj następujące czynności tuż przed wstrzyknięciem komórki:
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z komórek przez aspirację i przepłukać 10 ml PBS na 100 mm płytkę; usunąć PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml trypsyny do każdej płytki o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze pokojowej wystarczająco długo, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
		<li>Zatrzymaj aktywność trypsyny za pomocą 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 100 mm płytkę.</li>
		<li>Komórki osadu przez odwirowanie przy 450 x g i ponownie zawiesić w ~5 ml surowicy DMEM (SF-DMEM) na płytkę 100 mm.</li>
		<li>Policz żywe komórki za pomocą hemekytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Dostosuj gęstość żywych komórek do 2 x 105 komórek/3 μl (lub zgodnie z ustaleniami doświadczalnymi) poprzez granulowanie komórek i ponowne zawieszenie w SF-DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowuj komórki schłodzone na lodzie lub opakowaniu chłodzącym (nie pozwól, aby komórki zamarzły). Delikatnie wymieszaj, przesuwając palcem.</li>
</ol>
4. Znieczulenie i przygotowanie myszy do operacji
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie za pomocą ~5% izofluranu (przepływ tlenu ~2 l/min) lub zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii. Indukcja powinna trwać od 2 do 3 minut. Utrzymuj mysz na odpowiedniej głębokości znieczulenia za pomocą ~3% izofluranu.
	<ol>
		<li>Sprawdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane i kontynuuj monitorowanie oddechu i reakcji na uszczypnięcie palca u nogi przez cały zabieg. Przykryj mysz gazikami, aby uzyskać ciepło i regularnie monitoruj mysz przez cały czas trwania zabiegu, który może trwać od 45 minut do 1 godziny, w zależności od szybkości wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw mysz w ramce stereotaktycznej, ostrożnie przesuwając pasek podniebienia po języku i do ust. Zaczep przednie siekacze w otworze zęba. Użyj pasków nausznych, aby ustabilizować głowę, tak aby powierzchnia od ucha do oka była jak najbardziej pozioma. Nie wciskaj prętów na siłę do kanału słuchowego. Bardzo ważne jest, aby bezpiecznie ustawić głowę: delikatnie sprawdzaj ruchy na boki oraz góra-dół opuszkami palców. Użyj regulowanych elementów sterujących jednostki stereotaktycznej, aby zoptymalizować dopasowanie.</li>
	<li>Nasmaruj oczy maścią okulistyczną. Oczyść skórę między uszami i oczami dwukrotnie, stosując naprzemiennie środek antyseptyczny z jodowidonem i 70% EtOH.</li>
	<li>Wybrany środek przeciwbólowy należy wstrzyknąć podskórnie (SQ) w bok (lub zgodnie z zaleceniami).</li>
</ol>
5. Wykonaj iniekcję
<ol>
	<li>Określić miejsce wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia może się różnić w zależności od wielkości i szczepu myszy oraz rodzaju komórki. Komórki wstrzyknięte zbyt blisko komór mogą prowadzić do rozsiew choroby czaszkowo-rdzeniowej. Komórki wstrzyknięte zbyt płytko mogą wyrastać przez ścieżkę igły. 
	UWAGA: W pokazanych tutaj eksperymentach cel zdefiniowano jako przedni obszar kory mózgowej, w którym wybrano miejsce 2,5 mm boczne (prawe), 1,5 mm przednie i 3,5 mm brzuszne w stosunku do bregmy (ryc. 1), powodując guz śródmózgowia u myszy o masie od 20 do 30 g.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (o długości ~8 mm) sterylną techniką przez skórę głowy, aby odsłonić bregmę i miejsce wstrzyknięcia. Ukośne cięcie, od punktu między osią linii środkowej a prawym okiem w kierunku prawego ucha (ryc. 2) umożliwia dostęp zarówno do bregmy, jak i miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Cofnij skórę i użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wysuszyć powierzchnię czaszki. Osusz kość innym wacikiem zwilżonymH2O2, aby uwidocznić bregmę. H2O2będzie wytwarzać pęcherzyki tlenu, pozostawiając cienkie linie białej piany wzdłuż szwów koronalnych i strzałkowych, które przecinają się w bregmie.</li>
	<li>Zablokować pustą strzykawkę z igłą na mikropompie i manewrować końcówką igły bezpośrednio nad bregmą; ustawić współrzędne na konsoli wyrównującej na 0,0 mm boczny, 0,0 mm przedni/tylny i 0,0 mm brzuszny/grzbietowy.</li>
	<li>Przesuń igłę na 2.5 mm bocznie (w prawo) i 1.5 mm do przodu w stosunku do bregmy (lub żądanej lokalizacji) za pomocą pokręteł sterujących na jednostce stereotaktycznej. Lekko unieść strzykawkę i zaznaczyć dokładne położenie na czaszce dedykowanym flamastrem. Jeśli zewnętrzna powierzchnia czaszki nie znajduje się na płaszczyźnie poziomej z bregma (tj. współrzędna grzbietowa/brzuszna nie wskazuje już zera), zresetuj odczyt brzuszny/grzbietowy do 0,0, aby upewnić się, że głębokość wstrzyknięcia nie zostanie przesunięta.</li>
	<li>Wywierć mały otwór w czaszce za pomocą ręcznego wiertła obrotowego wyposażonego w sterylną końcówkę dentystyczną w odpowiednim miejscu oznaczonym pisakiem w kroku 5.5. Trzymaj wiertło pod kątem do czaszki i bardzo delikatnie dotykaj końcówką kości. Powtórz w razie potrzeby. Przewiercenie prawie, ale nie całkowicie, przez kość, pozostawiając igłę, która faktycznie wniknie w tę warstwę czaszki, skutkuje najczystszym wstrzyknięciem.</li>
	<li>Usuń pył kostny bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS lub solą fizjologiczną. Włożyć strzykawkę z powrotem do pompy i opuścić igłę prosto w dół do otworu w zadziorach, aby potwierdzić lokalizację. Jeśli otwór zadziorowy nie jest wyśrodkowany z igłą, użyj wiertła, aby powiększyć otwór.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek i pobrać je do strzykawki za pomocą sterownika pompy. Unikaj pęcherzyków i grudek i przetrzyj igłę wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć zanieczyszczające komórki z zewnętrznej powierzchni. Jeśli strzykawka/igła jest zatkana lub zamrożona, wyjmij ją i szybko wyczyść sterylną wodą i 70% EtOH.</li>
	<li>Opuścić igłę do poziomu powierzchni czaszki (0,0 mm brzuszna/grzbietowa). Następnie powoli (przez około 1 minutę) opuść igłę, aby przebić się przez całą grubość czaszki i wbić się w mózg na głębokość 4 mm brzuszną. Powoli wycofać igłę do 3,5 mm brzusznej. Jeśli głowa myszy jest bezpiecznie trzymana w jednostce stereotaktycznej, czaszka nie powinna prawie się poruszać.</li>
	<li>Upewnij się, że do sterownika pompy zostały wprowadzone prawidłowe parametry (rozdział 2.2) i naciśnij "RUN/STOP" (lub zgodnie z instrukcją obsługi produktu), aby automatycznie wstrzyknąć komórki. Monitoruj mysz i dostosuj izofluran, jeśli jest to wskazane. Obserwować strzykawkę i upewnić się, że tłok porusza się w cylindrze. Zamrożony lub zatkany ruch może spowodować wygięcie/złamanie tłoka.</li>
	<li>Odczekaj 1 do 2 minut z igłą w mózgu, a następnie bardzo powoli (ponad 3 do 4 minut) wyjmij igłę z tkanki. Całkowity czas potrzebny na usunięcie igły po wykonaniu wstrzyknięcia wynosi 5 minut. Użyj bawełnianego wacika, aby osuszyć obszar wokół otworu na żarna; Pozostaw krawędzie skóry otwarte, aby kość mogła wyschnąć.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę z pompy i szybko spłukać 3x sterylnymH2O, 3x 70% EtOH i 3x sterylnymH2O(lub zgodnie z zaleceniami producenta). Przetrzyj igłę EtOH i odłóż na bok.</li>
	<li>Nałóż sterylny wosk kostny (odpowiednik 1 lub 2 μl) do otworu w zadziorach i użyj drewnianego końca sterylnego bawełnianego wacika, aby ubić wosk na i do kości. Jeśli powierzchnia zostanie odpowiednio wysuszona, powinna się przykleić.</li>
	<li>Rozprowadź sterylną serwetkę na myszy i otaczającym ją obszarze roboczym i zszyj nacięcie; trzy szwy powinny wystarczyć. Alternatywnie można użyć kleju chirurgicznego. Zastosuj miejscowy antybiotyk.</li>
	<li>Zmniejsz poziom izofluranu do 0% i wyjmij mysz z jednostki stereotaktycznej, uważając, aby chronić zęby. Sprawdź uszy, usta i język.</li>
	<li>Należy uważnie obserwować stan myszy po wstrzyknięciu. Umieść mysz na poduszce grzewczej na 5 do 10 minut; Następnie przenieś do klatki (na podkładce grzewczej) i obserwuj, aż mysz się obudzi i zacznie chodzić. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Rozważ zastosowanie dodatkowego leku przeciwbólowego, jeśli zauważysz oznaki bólu.</li>
</ol>
6. Zakończ i monitoruj regenerację i rozwój guza
<ol>
	<li>Wyczyść wszystkie instrumenty i sprzęt za pomocą 70% EtOH, sterylizatora perełkowego lub środka dezynfekującego między myszami.</li>
	<li>Monitoruj wstrzyknięte myszy przez dwa dni po zabiegu pod kątem oznak bólu, infekcji lub innych powikłań. Wstrzyknąć środek przeciwbólowy po 24 i 48 godzinach (lub zgodnie ze wskazaniami) po zabiegu. W razie potrzeby usuń szwy po 7 do 10 dniach.</li>
	<li>Oceń myszy pod kątem klinicznych objawów choroby, paraliżu, zmniejszonej aktywności, utraty wagi, drgawek lub choroby ogólnej.</li>
	<li>Monitoruj rozwój guza odpowiednią metodą [rezonans magnetyczny (MRI), systemy obrazowania in vivo (IVIS) itp.].</li>
</ol>

<ol><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+accurately+inject+tumor+cells+into+the+caudate%2Fputamen+nuclei+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Tokai+journal+of+experimental+and+clinical+medicine%22%5BJournal%5D)">A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain.</a> The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).</li>
<li>Brooks, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+efficient+murine+CNS+gene+delivery+using+a+microprocessor-controlled+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector.</a> Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).</li>
<li>Shankavaram, U. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+indicates+orthotopic+xenograft+of+glioma+cell+lines+simulate+a+subclass+of+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).</li>
<li>Giannini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+tumor+EGFR+and+PDGFRA+gene+amplifications+retained+in+an+invasive+intracranial+xenograft+model+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme.</a> Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+gene+overexpression+retained+in+an+invasive+xenograft+model+by+solid+orthotopic+transplantation+of+human+glioblastoma+multiforme+into+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+investigation%22%5BJournal%5D)">EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice.</a> Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).</li>
<li>Carty, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+AAV+expressing+NEP+but+not+IDE+reduces+amyloid+pathology+in+APP%2BPS1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+ONE%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice.</a> PLos ONE. 8, e59626(2013).</li>
<li>Thaci, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+study+of+neural+stem+cell-based+cell+carrier+for+oncolytic+virotherapy%3A+targeted+delivery+of+the+therapeutic+payload+in+an+orthotopic+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model.</a> Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+orthotopic+glioma+xenografts+recapitulate+infiltrative+growth+and+isocitrate+dehydrogenase+I+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation.</a> J. Vis. Exp. (83), (2014).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurosurgery%22%5BJournal%5D)">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ortotopowe mysie modele ludzkiego raka mózgu mogą być doskonałym narzędziem do oceny skuteczności terapii klinicznych, ale należy zachować ostrożność w celu optymalizacji rozmieszczenia komórek w tkance mózgowej. Badania wykazały, że nadmierne objętości podwielokrotności, nieoptymalna technika wstrzykiwania i pospieszne tempo wstrzykiwania mogą prowadzić do nieszczelności i pojawienia się komórek nowotworowych w niepożądanych miejscach (komory, rdzeń kręgowy, obszary zewnątrzoponowe itp.) oraz dużej zmienności w...

Badania in vitro komórek guza mózgu są nieocenione do analizy molekularnych mechanizmów napędzających wzrost, przeżycie, migrację i inwazję komórek nowotworowych; eksperymenty z hodowlą komórkową mogą zdefiniować szlaki sygnałowe, zasugerować potencjalne cele terapeutyczne i scharakteryzować odpowiedź komórkową na leczenie farmakologiczne. Jednak systemy in vitro są zbyt uproszczone, aby przewidzieć reakcję organizmu na farmaceutyki; Brakuje im reakcji fizjologicznych, odpowiedzi immunologicznych, mikrośrodowiska komórkowego i ogólnej niejednorodności żywych systemów zwierzęcych. Modele modyfikowane genetycznie mogą być nieocenione, jeśli są dostępne, ale istnieją różnice molekularne między gatunkami, a komórki myszy mogą nie podsumowywać wydarzeń w procesach zachodzących u ludzi, co skutkuje znacznymi rozbieżnościami podczas porównywania modeli zwierzęcych z obserwacjami klinicznymi1. Mysie modele ksenoprzeszczepów polegające na podskórnym wstrzyknięciu (SQ) linii komórkowych ludzkiego guza mózgu pod skórę boku są łatwe do wykonania i zmierzenia; Mogą być stosowane do przeciwdziałania skutkom modyfikacji genów i podawania/dostarczania leków, metabolizmu i toksyczności. Istotne wady ograniczają jednak użyteczność modeli SQ. Mikrośrodowisko nie odzwierciedla naturalnie występującego guza mózgu: interakcji różnych typów komórek i tkanek; Miejscowe unaczynienie i niezliczone inne czynniki unikalne dla mózgu nie mogą być odtworzone. Aby dokładniej odtworzyć unikalne środowisko naturalnie występującego guza mózgu i przetestować efekty interwencji farmaceutycznych, należy wykorzystać mysi model ortotopowy. Co więcej, techniki ortotopowe mogą być stosowane jako część podejścia genetycznie modyfikowanego, w którym ludzkie pierwotne komórki nienowotworowe (zróżnicowane lub progenitorowe) są genetycznie modyfikowane i wstrzykiwane w odpowiednie miejsce myszy, z ludzkimi komórkami zrębu lub bez nich, co powoduje nowotworzenie podobne do obserwowanego u ludzi1.
Ten artykuł opisuje metodologię precyzyjnego i powtarzalnego tworzenia guzów mózgu u myszy. Korzystając z tej techniki, użytkownik może dokładnie wstrzyknąć małą porcję zawieszonych komórek w określone miejsce obszaru czołowo-ciemieniowo-skroniowego kory mózgowej myszy. Śmiertelność myszy jest niezwykle niska; W naszych rękach żadna mysz nie zmarła z powodu powikłań chirurgicznych po 185 zabiegach. Charakterystykę powstałego guza można porównać z typowymi ludzkimi nowotworami klinicznymi; Na przykład: szybkość wzrostu, stopień nekrozy, zakres inwazji, niejednorodność typu komórki, obecność komórek mitotycznych, markery proliferacji i apoptozy itp. Linie komórkowe lub zdezagregowane próbki tkanek ludzkich lub guzów można następnie ocenić na podstawie ich zdolności do symulacji rzeczywistego obrazu klinicznego. Farmaceutyki, wybrane na podstawie ich wydajności w hodowli komórkowej, mogą być testowane w kontekście funkcjonującego metabolizmu, układu krążenia i bariery krew-mózg, tak jak występują u zwierzęcia obciążonego nowotworem, a wszystko to w odpowiednim kontekście architektonicznym. Co więcej, komórki wybrane do wstrzyknięcia mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania wpływu określonych knockdownów, delecji, knock-inów, mutacji itp. na wzrost i przeżycie guza.
Wiele publikacji dokumentuje badania nad nowotworami przy użyciu różnych technik wewnątrzczaszkowych. Yamada i wsp. przeprowadzili szczegółowe badanie wstrzykiwania barwnika i komórek U87 i stwierdzili, że minimalizacja objętości i szybkości wstrzykiwania dała najlepszy guz2. Brooks i in. stwierdzili lepszą odtwarzalność i wydajność przy użyciu wtryskiwacza sterowanego mikroprocesorem, a nie metody ręcznej dostarczania wektorów wirusowych; Ich wnioski dotyczące optymalnych parametrów iniekcji mają zastosowanie do dostarczania komórek3. Shankavaram i wsp. wykazali, że linie komórkowe glejaka wielopostaciowego (GBM) wstrzykiwane ortotopowo (przy użyciu metody ręcznej) do mózgu odzwierciedlały profil ekspresji genów guzów klinicznych dokładniej niż ksenoprzeszczepy in vitro lub SQ, co potwierdza zastosowanie modeli wewnątrzczaszkowych w badaniach przedklinicznych4. Giannini i in. wstrzyknęli komórki z ludzkich próbek chirurgicznych, które zostały utrzymane w bokach nagich myszy przez seryjne pasażowanie do mózgów dodatkowych myszy i wykazali, że to podejście zachowało zmiany w genach guza pacjenta w modelu5. Podobne wyniki uzyskali Yi i wsp.6. Korzystając z konfiguracji stereotaktycznej, starannie zdefiniowanego miejsca wstrzyknięcia oraz powolnej i stałej dawki wstrzyknięcia, uzyskali powtarzalne guzy mózgu o stałym tempie wzrostu i wysokim (100%) wskaźniku wszczepienia. Słuszność tej techniki została zatem dobrze ugruntowana; Z przeszukania literatury wynika, że zastosowania tej techniki są szerokie. Carty i wsp. zastosowali iniekcje wewnątrzczaszkowe, aby skutecznie dostarczyć wektory wirusowe eksprymujące geny terapeutyczne do kory czołowej transgenicznego modelu choroby Alzheimera7. Thaci i wsp. opisali zastosowanie wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych w celu dostarczenia terapeutycznego adenowirusa onkolitycznego w nośniku opartym na nerwowych komórkach macierzystych do nagich myszy już noszących ortotopowo wstrzyknięte guzy GBM8. Nie ulega wątpliwości, że zastrzyki wewnątrzczaszkowe są wszechstronnym i skutecznym narzędziem do badań przedklinicznych. Wcześniejsze publikacje w The Journal of Visualized Experiments opisują podstawowe podejścia9-11, ale my przenosimy koncepcję iniekcji guza wewnątrzczaszkowego i modelowania ortotopowego na wyższy poziom precyzji przy użyciu łatwej do opanowania technologii.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczem Konsola</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Mysz do znieczulenia gazem Uchwyt na głowę</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy</td><td></td> Kopf Medel 922 <td></td> Fisher 12-562-36 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprocesor Micro4</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>Ręczna wiertarka obrotowa o zmiennej prędkości</td><td>Dremel</td><td>Model 300</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne, 1,0 mm</td><td>Adapter</td><td>514554 do</td><td></td></tr><tr><td>wiertła dentystycznego: tuleja zaciskowa 3/32 cala</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka</td><td></td><td></td> grzewcza <td>dla myszy</td></tr><tr>System <td></td><td></td><td>waporyzatora Isoflurane</td><td>dla myszy</td></tr><tr><td>Rurki medyczne</td><td></td><td></td> i złącza <td>do połączenia parownika izofluranu ze stereotaktyczną ramą</td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>Precision 25 &mu; l mikrostrzykawka</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7636-01</td><td>Model 702, bez igły</td></tr><tr><td>Igły do mikrostrzykawek, 26s G</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7804-04</td><td>RN, końcówka 25 mm</td></tr> 2 <tr><td>Nożyczki z cienką końcówką (proste, ostre/ostre)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki standardowe średniej wielkości Standardowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>ząbkowane Hemotyty ząbkowane</tr><tr><td>(2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Kleszcze <td></td><td></td><td></td><td>z cienką końcówką</td></tr><tr><td colspan="4">Kieszonkowe materiały</ mocne></td></tr><tr><td>szwy 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne #10, nierdzewne (Feather)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Fluriso)&nbsp;</td><td>VetOne&nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>Pozycja #502017. Płynny środek znieczulający wziewny. Prawo federalne ogranicza ten lek do stosowania przez lub na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.</td></tr><tr><td>Karprofen (Rimadyl do wstrzykiwań 50 mg / ml)</td> <td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>rozcieńczony w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna (sztuczne łzy)</td> <td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk miejscowy (AK-Poly-Bac )</td> <td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod miejscowy środek antyseptyczny, 10% (Betadina)</td> <td>Betadina</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>H325-100</td><td>do wizualizacji punktów orientacyjnych czaszki</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>VetOne&nbsp; &nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>do rozcieńczania roztworów, chusteczki czyszczącej</td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>WPI</td><td>Pozycja #501771</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne serwety</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>McKesson</td><td>(do dopasowania)</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gaziki, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td></td><td></td>22028556</tr><tr><td>Sterylne gaziki, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Płatki nasączone alkoholem (średnie)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna probówka z nakrętką 0,5 ml z nakrętkami do komórek</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>do komórek</td></tr><tr><td>Indywidualnie pakowane sterylne pipety jednorazowe</td><td>Fisher</td><td>BD 357575</td><td>do roztworów do czyszczenia igieł</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe BD z igłami&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>na środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>do czyszczenia</td></tr><tr><td>Sterylne diH2O</td><td></td><td></td><td>do czyszczenia</td></tr><tr><td>Probówki Microfuge do roztworów</td><td></td><td></td> czyszczących <td>do roztworów do czyszczenia igieł</td></tr><tr><td>Pisak (dedykowany)</td><td></td><td></td> <td>do oznaczania czaszki</td></tr></tbody></table>

tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Ortotopowe modele nowotworów są obecnie najlepszym sposobem na badanie cech typu nowotworu, z interwencją i bez interwencji, w kontekście żywego zwierzęcia - szczególnie w miejscach o unikalnych cechach fizjologicznych i architektonicznych, takich jak mózg. Modele in vitro i ektopowe nie są w stanie uwzględnić takich cech, jak układ naczyniowy, bariera krew-mózg, metabolizm, dostarczanie leków i toksyczność oraz wiele innych istotnych czynników. Modele ortotopowe również mają swoje ograniczenia, ale przy odpowiedniej technice interesujące nas komórki nowotworowe mogą być dokładnie wszczepione w tkankę, która najbardziej naśladuje warunki panujące w ludzkim mózgu. Dzięki zastosowaniu metod, które dostarczają precyzyjnie zmierzone objętości do dokładnie zdefiniowanych miejsc ze stałą szybkością i ciśnieniem, mysie modele ludzkich guzów mózgu o przewidywalnym tempie wzrostu mogą być odtwarzalne i nadają się do wiarygodnej analizy różnych interwencji. Opisany tutaj protokół koncentruje się na technicznych szczegółach projektowania i przygotowania do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, wykonywania operacji oraz zapewnienia udanego i powtarzalnego wzrostu guza oraz zapewnia punkty wyjścia dla różnych schorzeń, które można dostosować do wielu różnych modeli guza mózgu.

Dzięki opisanej technice możliwe jest stworzenie wiarygodnych wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów. Identyfikacja krytycznych struktur czaszki myszy (Rysunek 1) pozwoli na rozpoznanie punktu bregma i poprowadzi badacza do precyzyjnego i powtarzalnego miejsca wstrzyknięcia. W tych badaniach linię rodzicielską U251, komórki U251 transfekowane lucyferazą (U251-Luc) lub unieśmiertelnione ludzkie komórki hodowli tkankowej GBM U87 zawieszono w 4 do 6 µl SF-DMEM i wstrzyknięto 2,5 mm bocznie (prawo), 1,5 mm pr...

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie spójnego i powtarzalnego modelu guza ludzkiego mózgu, który może być wykorzystany do dokładnego testowania i porównywania nowych strategii terapeutycznych. Osiąga się to poprzez przygotowanie zwierzęcia do operacji i zlokalizowanie właściwego miejsca do wstrzyknięcia. Po zlokalizowaniu wierci się otwór w czaszce i strzykawkę opuszcza się na odpowiednią głębokość.Aby uzyskać wzrost guza, komórki są następnie wstrzykiwane w powolny, kontrolowany sposób, po czym następuje opóźnione i stopniowe wycofywanie igły. Ostatecznie można opracować spójny model mysi ze wzrostem guza histopatologicznie podobnym do stanu ludzkiego, a tempo wzrostu można zmierzyć za pomocą obrazowania in vivo Lucciego. Precyzja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia nowych strategii terapeutycznych w przypadku guzów mózgu u ludzi.Zmienna lokalizacja wstrzyknięcia guza może prowadzić do zmian we wzroście guza, które są spowodowane mikrośrodowiskiem, dostarczaniem leków lub innymi rzeczami, które różnią się znacznie w różnych obszarach mózgu. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ etapy związane z pozycjonowaniem myszy i lokalizacją miejsca wstrz

creating-anatomically-accurate-reproducible-intracranial-xenografts

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Aby ocenić nowe paradygmaty terapeutyczne w leczeniu glejaka, niezbędne są modele istotne fizjologicznie. Wykorzystujemy procedurę z implantowalną śrubą prowadzącą do tworzenia ksenograftów wewnątrzczaszkowych, która jest szybsza i bezpieczniejsza niż podejścia stereotaktyczne.

Prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj technikę tworzenia odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu u myszy. Precyzyjna metoda chirurgiczna umożliwia testowanie nowych strategii terapeutycznych z wykorzystaniem obrazowania in vivo.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Przeglądaj więcej filmów