Elektrofizjologia metodą patch-clamp

Rejestracja metodą patch clamp jest niezwykle użyteczną techniką badania właściwości biofizycznych kanałów jonowych kontrolujących aktywację neuronów.

Procedura ta polega na przyciśnięciu szklanej mikropipety do komórki w celu wyizolowania niewielkiego fragmentu („patcha”) błony, który zawiera jeden lub więcej kanałów jonowych.

Układ eksperymentalny pozwala ponadto naukowcom na „zamknięcie” (clamp) środowiska elektrycznego obszaru patcha poprzez precyzyjną kontrolę napięcia na błonie komórkowej, co, w zależności od obecnych kanałów jonowych, wpływa na przepływ jonów przez błonę i umożliwia szczegółowe badanie tych kanałów.

Niniejszy film prezentuje przegląd zasad leżących u podstaw techniki patch clamp, opis kroków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, a na koniec niektóre zastosowania tej metody.

Najpierw omówmy zasady działania metody patch clamp. rejestracja metodą clampingu.

Liczba jonów naładowanych dodatnio i ujemnie wewnątrz neuronu różni się od liczby jonów znajdujących się na zewnątrz.

Ta nierównowaga generuje różnicę potencjałów, czyli potencjał błonowy, wynoszący około -70 mV, co oznacza, że wnętrze komórki jest bardziej ujemne niż jej zewnętrzna strona.

Kanały jonowe pomagają w utrzymaniu gradientu poprzez kontrolowanie ruchu jonów przez błonę komórkową, co w istocie stanowi prądy elektryczne.

Wykorzystując technikę patch clamp, naukowcy badają naturę potencjału i prądu.

Układ patch-clamp obejmuje szklaną mikropipetę, w której znajduje się zarówno roztwór jonowy, jak i srebrna elektroda w chlorku srebra, służąca do pomiaru napięć i prądów.

Końcówka mikropipety posiada wypolerowany otwór o średnicy jednej mikrona, w którym osadzony jest niewielki fragment membrany.

Aby wyeliminować szum tła pochodzący od jonów w roztworze kąpielowym, pomiędzy pipetą a fragmentem błony (patch) tworzy się uszczelnienie o wysokiej rezystancji. Ponieważ rezystancja tego uszczelnienia mieści się w zakresie gigaomów, określa się je mianem uszczelnienia gigaomowego (gigaohm seal).

Elektroda znajdująca się wewnątrz pipety jest połączona z wzmacniaczem, który może wzmacniać fluktuacje prądu i napięcia będące wynikiem ruchu jonów przez kanały w błonie plazmatycznej.

Za pomocą wzmacniacza naukowcy mogą stabilizować lub sztucznie ustawiać potencjał błonowy na określonych poziomach napięcia.

Wzmacniacz reguluje ilość prądu, jaki musi zostać dostarczony przez elektrodę srebrową, aby utrzymać stałe napięcie.

Ponieważ różne napięciowo zależne kanały jonowe otwierają się przy określonych napięciach, zdarzenia otwarcia są reprezentowane przez zmienność profilów pomiarowych¬ prądy

Alternatywnie naukowcy mogą wymusić przepływ określonego prądu przez elektrodę i rejestrować wynikające z tego zmiany potencjału. W tej konfiguracji „clamp prądowy” można rejestrować potencjały czynnościowe.

Przyjrzyjmy się teraz pięciu głównym typom konfiguracji techniki patch clamp.

Pierwszą z nich jest konfiguracja cell-attached, w której mikropipeta jest po prostu uszczelniona z błoną nienaruszonej komórki.

Drugą jest konfiguracja whole-cell, w której fragment błony wewnątrz mikropipety zostaje przerwany, aby umożliwić dostęp do wnętrza komórki.

Trzecią jest konfiguracja perforated patch. W tym przypadku do mikropipety dodaje się substancje chemiczne, takie jak antybiotyki, aby wytworzyć w błonie małe otwory zapewniające dostęp do cytozolu.

Czwartą konfiguracją jest inside-out patch. Aby ją uzyskać, mikropipeta najpierw tworzy uszczelnienie z komórką, a następnie jest szybko odciągana, co powoduje oderwanie fragmentu błony i odsłonięcie jej wewnętrznej powierzchni na roztwór w kąpieli.

Pozwala to na wystawienie cytoplazmatycznej strony kanałów na działanie różnych substancji chemicznych dodawanych do kąpieli.

Ostatnią konfiguracją, podobnie jak w przypadku inside-out, jest outside-out patch, która rozpoczyna się jako konfiguracja whole-cell. Mikropipeta jest powoli wycofana, aż fragment błony utworzy wypukłe uszczelnienie na jej końcówce.

W takim układzie zewnętrzna strona kanału może być wystawiona na działanie czynników eksperymentalnych.

Po omówieniu zasad, przejdźmy do kroków niezbędnych do przeprowadzenia rejestracji metodą patch-clamp.

Zacznij od dociągnięcia rurki z borokrzemianowego szkła do postaci mikropipet przy użyciu dociągacza do pipet.

Następnie wypal końcówkę, aby uzyskać odpowiednią średnicę i oporność.

Po wypaleniu napełnij mikropipetę roztworem jonowym i delikatnie nią potrząśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Następnie nasuń mikropipetę na elektrodę zamocowaną w uchwycie.

Po zamocowaniu użyj strzykawki, aby przyłożyć do pipety dodatnie ciśnienie, co zapobiegnie dostawaniu się innych roztworów do końcówki.

Teraz umieść badane komórki lub tkankę na stoliku mikroskopu i przesuń mikropipetę w kierunku komórki.

Przy generowaniu impulsów napięcia testowego przez wzmacniacz, rejestruj oporność, która wzrośnie w momencie dotknięcia komórki przez końcówkę.

Aby utworzyć uszczelnienie gigaohmowe, delikatnie zmień ciśnienie z dodatniego na ujemne za pomocą strzykawki. Utworzenie uszczelnienia spowoduje gwałtowny wzrost oporności do wartości przekraczającej 1 gigaohm.

Po ustanowieniu konfiguracji cell-attached przekształćmy ją w konfigurację whole-cell i przeprowadźmy eksperyment!

Przypomnijmy, że konfiguracja whole-cell występuje w momencie przerwania błony.

Przerwanie błony uzyskuje się poprzez przyłożenie podciśnienia do mikropipety.

Po przerwaniu błony kształt impulsu testowego wykaże duże przejściowe skoki prądu, ponieważ błona komórkowa działa teraz jak kondensator ładowany przez impuls testowy.

Właściwości pojedynczego typu kanału jonowego w dowolnym neuronie można badać poprzez farmakologiczne blokowanie aktywności innych typów kanałów.

Protokół skokowy napięcia jest stosowany do badania prądów kanałów jonowych wywoływanych poprzez zmianę napięcia na szereg różnych potencjałów podtrzymujących.

Krzywa prądowo-napięciowa, czyli krzywa IV, obrazuje zależność prądu płynącego przez kanał jonowy od napięcia i pozwala określić, przy jakich napięciach kanał jest otwarty lub zamknięty.

Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom, aby sprawdzić, co neuronaukowcy mogą osiągnąć dzięki tej technice.

Czasami kanały jonowe występujące w neuronach można badać w środowisku pozakomórkowym.

W tym przypadku naukowcy dodali białka kanałów jonowych do sztucznej błony lipidowej, aby móc badać te kanały w izolacji.

Następnie kanały te mogą być eksponowane na cząsteczki eksperymentalne, takie jak pochodząca z papryczek kapsaicyna, w celu zbadania ich wpływu na aktywność kanałów.

Ponieważ kanały jonowe są wystawione na środowisko zewnątrzkomórkowe i znacząco wpływają na funkcje komórkowe, stanowią doskonałe cele terapeutyczne. Gdy do mikropipety lub roztworów w kąpieli dodaje się testowane związki, rejestracje metodą patch clamp mogą być wykorzystane do bezpośredniego badania wpływu leków, takich jak nikotyna, na aktywność neuronalną. Zasada stosowania podciśnienia w celu wytworzenia uszczelnienia o wysokiej rezystancji została nawet wykorzystana do konstrukcji urządzeń wysokoprzepustowych, które mogą rejestrować sygnały z wielu komórek jednocześnie w zastosowaniach do przesiewania leków.

Patch clamp w konfiguracji whole-cell jest cennym narzędziem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych komórek na bodźce.

Ponadto rejestracje sparowane mogą być wykorzystywane do badania wpływu wyładowań neuronów na pobudliwe komórki docelowe, takie jak mięśnie. W tym przykładzie patch clamp w konfiguracji whole-cell służy do stymulacji wyładowania neuronu ruchowego, podczas gdy równocześnie rejestrowane są sygnały z kontrolowanego przez niego włókna mięśniowego. Obserwowane są wyraźne zależności między pobudzeniem neuronów a aktywnością mięśni.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do metody patch clamp, w którym omówiono zasady działania tej techniki oraz etapy przeprowadzania eksperymentu.

Dzięki wyjątkowej czułości czasowej na zmiany napięcia i prądów, metoda patch clamp pozostanie kluczowym narzędziem w zrozumieniu biofizyki kanałów i neuronów.

Dziękujemy za uwagę!