Elektrofizjologia zacisku krosowego
Nagrywanie patch clamp jest niezwykle przydatną techniką do badania biofizycznych właściwości kanałów jonowych, które kontrolują aktywację neuronów.
Procedura polega na dociśnięciu szklanej mikropipety do komórki w celu wyizolowania małego "fragmentu" błony, który zawiera jeden lub więcej kanałów jonowych.
Konfiguracja eksperymentalna pozwala naukowcom "zacisnąć" środowisko elektryczne załatanego obszaru poprzez precyzyjne kontrolowanie napięcia na błonie komórkowej, które, w zależności od obecnych kanałów jonowych, wpływa na przepływ jonów przez błonę i pozwala na skomplikowane badanie tych kanałów.
Ten film przedstawia przegląd zasad stojących za techniką zacisku krosowego, opis kroków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, a na koniec niektóre zastosowania tej metody.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom nagrywania zacisków krosowych.
Liczba dodatnio i ujemnie naładowanych jonów wewnątrz neuronu różni się od liczby znajdujących się na zewnątrz.
Ta nierównowaga powoduje różnicę napięć lub potencjał membrany wynoszący około -70 mV, co oznacza, że wnętrze jest bardziej ujemne niż na zewnątrz.
Kanały jonowe pomagają utrzymać gradient, kontrolując ruch jonów przez błonę komórkową, które są zasadniczo prądami elektrycznymi.
Korzystając z techniki patch clamp, naukowcy zadają pytania o naturę potencjału i prądu.
Zestaw do patch clamp zawiera szklaną mikropipetę, która zawiera zarówno roztwór jonowy, jak i elektrodę z chlorowanego srebra do pomiaru napięć i prądów.
Końcówka mikropipety ma polerowany otwór o grubości jednego mikrona, który zamyka niewielki obszar membrany.
Aby wyeliminować szum tła powodowany przez jony znajdujące się w roztworze kąpieli, między pipetą a łatą membranową tworzy się uszczelnienie o wysokiej rezystancji. Ponieważ rezystancja uszczelki mieści się w zakresie gigaomów, jest ona znana jako uszczelka gigaomowa.
Elektroda w pipecie jest podłączona do wzmacniacza, który może wzmacniać wahania prądu i napięcia, które są wynikiem ruchu jonów przez kanały w błonie plazmatycznej.
Za pomocą wzmacniacza naukowcy mogą zacisnąć lub sztucznie ustawić potencjał membrany na określone napięcia.
Wzmacniacz reguluje, ile prądu należy dodać przez srebrną elektrodę, aby utrzymać stałe napięcie.
Ponieważ różne kanały jonowe bramkowane napięciem otwierają się przy określonych napięciach, zdarzenia otwarcia są reprezentowane przez zmiany w profilach mierzonych prądów.
Alternatywnie, naukowcy mogą wymusić określony prąd przez elektrodę i zarejestrować wynikające z tego zmiany potencjału. W tej konfiguracji "cęgów prądowych" można rejestrować potencjały czynnościowe.
Przyjrzyjmy się teraz pięciu głównym typom konfiguracji zacisków krosowych.
Pierwszą z nich jest konfiguracja z komórką, w której mikropipeta jest po prostu uszczelniona do membrany nienaruszonej komórki.
Druga to konfiguracja całej komórki, w której membrana w mikropipecie jest pęknięta, aby zapewnić dostęp do wnętrza komórki.
Trzecia to konfiguracja perforowanej łaty. W tym przypadku substancje chemiczne, takie jak antybiotyki, są dodawane do mikropipety, aby zrobić małe otwory w membranie zapewniające dostęp do cytozolu.
Czwarta konfiguracja to łatka inside-out. Aby to osiągnąć, mikropipeta najpierw tworzy uszczelnienie z komórką, a następnie jest szybko odciągana, odrywając kawałek membrany i wystawiając wewnętrzną powierzchnię na działanie roztworu kąpieli.
Pozwala to na wystawienie cytoplazmatycznej strony kanałów na działanie różnych substancji chemicznych stosowanych w kąpieli.
Wreszcie, podobnie jak w przypadku inside-out, łatka outside-out zaczyna się jako konfiguracja całej komórki. Mikropipetę powoli wyjmuje się, aż kawałek membrany utworzy wypukłe uszczelnienie w poprzek końcówki.
W tej konfiguracji zewnątrzkomórkowa powierzchnia kanału może być wystawiona na eksperymentalne zabiegi.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad, przejdźmy do kroków wymaganych do nagrania zacisku krosowego.
Zacznij od wciągnięcia rurki ze szkła borokrzemianowego do mikropipet za pomocą ściągacza do pipet.
Następnie wypoleruj końcówkę na gorąco, aby uzyskać odpowiednią średnicę i odporność.
Po wypolerowaniu napełnij mikropipetę roztworem jonowym i delikatnie strzepuj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie nasuń mikropipetę na elektrodę przymocowaną do uchwytu.
Po założeniu użyj strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie na pipetę, co zapobiega przedostawaniu się innych roztworów do końcówki.
Teraz umieść interesujące Cię komórki lub tkankę na stoliku mikroskopu i przesuń mikropipetę w kierunku komórki.
Gdy wzmacniacz generuje impulsy napięcia testowego, zapisz rezystancję, która wzrośnie po dotknięciu ogniwa przez końcówkę.
Aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe, delikatnie przełącz ciśnienie z dodatniego na ujemne za pomocą strzykawki. Utworzenie uszczelki spowoduje szybki wzrost rezystancji do wartości większej niż 1 gigaoma.
Teraz, gdy konfiguracja dołączona do komórki została ustalona, przekształćmy ją w konfigurację całej komórki i przeprowadźmy eksperyment!
Przypomnij sobie, że konfiguracja całej komórki ma miejsce, gdy błona jest pęknięta.
Pęknięcie odbywa się poprzez dodanie podciśnienia do mikropipety.
Gdy membrana pęknie, kształt impulsu testowego będzie miał duże stany przejściowe prądu, ponieważ błona komórkowa działa teraz jak kondensator, który jest ładowany przez impuls testowy.
Właściwości pojedynczego typu kanału jonowego w dowolnym neuronie można badać poprzez farmakologiczne blokowanie aktywności innych typów kanałów.
Protokół krokowy napięcia służy do badania prądów kanału jonowego wywołanych przez stopniowanie napięcia do szeregu różnych potencjałów podtrzymania.
Krzywa prąd-napięcie lub IV pokazuje zależności napięciowe prądu przepływającego przez kanał jonowy i zapewnia wgląd w to, przy jakich napięciach kanał jest otwarty lub zamknięty.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom, aby zbadać, co neuronaukowcy mogą zrobić z tą techniką.
Czasami kanały jonowe znajdujące się w neuronach można badać w środowisku niekomórkowym.
W tym przypadku naukowcy dodali białka kanałów jonowych do sztucznej błony lipidowej, aby zbadać te kanały w izolacji.
Kanały te można następnie wystawić na działanie eksperymentalnych cząsteczek, takich jak kapsaicyna pochodząca z ostrej papryki, w celu zbadania ich wpływu na aktywność kanałów.
Ponieważ są one wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego i znacząco wpływają na funkcję komórkową, kanały jonowe są doskonałymi celami dla leków. Gdy badane związki są dodawane do roztworów mikropipet lub kąpieli, zapisy z patch clamp mogą być wykorzystane do bezpośredniego testowania wpływu leków, takich jak nikotyna, na aktywność neuronalną. Zasada stosowania podciśnienia w celu utworzenia uszczelnienia o wysokiej odporności została nawet zastosowana do konstruowania urządzeń o wysokiej przepustowości, które mogą rejestrować z wielu komórek jednocześnie w celu przeprowadzenia badań przesiewowych leków.
Patch clamp całokomórkowy jest cennym narzędziem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych komórek na bodźce.
Co więcej, sparowane nagrania można wykorzystać do zbadania wpływu wypalania neuronów na pobudliwe komórki docelowe, takie jak mięśnie. W tym przykładzie klamra krosowa całej komórki jest używana do stymulowania wypalania neuronu ruchowego, podczas gdy nagrania są jednocześnie pobierane z kontrolowanego przez niego włókna mięśniowego. Obserwuje się wyraźne zależności między pobudzeniem neuronów a aktywnością mięśni.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do nagrywania zacisków krosowych, w którym omówiono zasady stojące za techniką i etapy prowadzenia eksperymentu.
Dzięki wyjątkowej wrażliwości czasowej na zmiany napięcia i prądów, nagrywanie patch clampów będzie nadal odgrywać kluczową rolę w zrozumieniu biofizyki kanałów i neuronów.
Dzięki za oglądanie!
Błony komórkowe neuronów są wypełnione kanałami jonowymi, które kontrolują ruch ładunku do i z komórki, regulując w ten sposób wypalanie neuronów. Jed…
Nagrywanie patch clamp jest niezwykle przydatną techniką do badania biofizycznych właściwości kanałów jonowych, które kontrolują aktywację neuronów.
Procedura polega na dociśnięciu szklanej mikropipety do komórki w celu wyizolowania małego "fragmentu" błony, który zawiera jeden lub więcej kanałów jonowych.
Konfiguracja eksperymentalna pozwala naukowcom "zacisnąć" środowisko elektryczne załatanego obszaru poprzez precyzyjne kontrolowanie napięcia na błonie komórkowej, które, w zależności od obecnych kanałów jonowych, wpływa na przepływ jonów przez błonę i pozwala na skomplikowane badanie tych kanałów.
Ten film przedstawia przegląd zasad stojących za techniką zacisku krosowego, opis kroków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, a na koniec niektóre zastosowania tej metody.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom nagrywania zacisków krosowych.
Liczba dodatnio i ujemnie naładowanych jonów wewnątrz neuronu różni się od liczby znajdujących się na zewnątrz.
Ta nierównowaga powoduje różnicę napięć lub potencjał membrany wynoszący około -70 mV, co oznacza, że wnętrze jest bardziej ujemne niż na zewnątrz.
Kanały jonowe pomagają utrzymać gradient, kontrolując ruch jonów przez błonę komórkową, które są zasadniczo prądami elektrycznymi.
Korzystając z techniki patch clamp, naukowcy zadają pytania o naturę potencjału i prądu.
Zestaw do patch clamp zawiera szklaną mikropipetę, która zawiera zarówno roztwór jonowy, jak i elektrodę z chlorowanego srebra do pomiaru napięć i prądów.
Końcówka mikropipety ma polerowany otwór o grubości jednego mikrona, który zamyka niewielki obszar membrany.
Aby wyeliminować szum tła powodowany przez jony znajdujące się w roztworze kąpieli, między pipetą a łatą membranową tworzy się uszczelnienie o wysokiej rezystancji. Ponieważ rezystancja uszczelki mieści się w zakresie gigaomów, jest ona znana jako uszczelka gigaomowa.
Elektroda w pipecie jest podłączona do wzmacniacza, który może wzmacniać wahania prądu i napięcia, które są wynikiem ruchu jonów przez kanały w błonie plazmatycznej.
Za pomocą wzmacniacza naukowcy mogą zacisnąć lub sztucznie ustawić potencjał membrany na określone napięcia.
Wzmacniacz reguluje, ile prądu należy dodać przez srebrną elektrodę, aby utrzymać stałe napięcie.
Ponieważ różne kanały jonowe bramkowane napięciem otwierają się przy określonych napięciach, zdarzenia otwarcia są reprezentowane przez zmiany w profilach mierzonych prądów.
Alternatywnie, naukowcy mogą wymusić określony prąd przez elektrodę i zarejestrować wynikające z tego zmiany potencjału. W tej konfiguracji "cęgów prądowych" można rejestrować potencjały czynnościowe.
Przyjrzyjmy się teraz pięciu głównym typom konfiguracji zacisków krosowych.
Pierwszą z nich jest konfiguracja z komórką, w której mikropipeta jest po prostu uszczelniona do membrany nienaruszonej komórki.
Druga to konfiguracja całej komórki, w której membrana w mikropipecie jest pęknięta, aby zapewnić dostęp do wnętrza komórki.
Trzecia to konfiguracja perforowanej łaty. W tym przypadku substancje chemiczne, takie jak antybiotyki, są dodawane do mikropipety, aby zrobić małe otwory w membranie zapewniające dostęp do cytozolu.
Czwarta konfiguracja to łatka inside-out. Aby to osiągnąć, mikropipeta najpierw tworzy uszczelnienie z komórką, a następnie jest szybko odciągana, odrywając kawałek membrany i wystawiając wewnętrzną powierzchnię na działanie roztworu kąpieli.
Pozwala to na wystawienie cytoplazmatycznej strony kanałów na działanie różnych substancji chemicznych stosowanych w kąpieli.
Wreszcie, podobnie jak w przypadku inside-out, łatka outside-out zaczyna się jako konfiguracja całej komórki. Mikropipetę powoli wyjmuje się, aż kawałek membrany utworzy wypukłe uszczelnienie w poprzek końcówki.
W tej konfiguracji zewnątrzkomórkowa powierzchnia kanału może być wystawiona na eksperymentalne zabiegi.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad, przejdźmy do kroków wymaganych do nagrania zacisku krosowego.
Zacznij od wciągnięcia rurki ze szkła borokrzemianowego do mikropipet za pomocą ściągacza do pipet.
Następnie wypoleruj końcówkę na gorąco, aby uzyskać odpowiednią średnicę i odporność.
Po wypolerowaniu napełnij mikropipetę roztworem jonowym i delikatnie strzepuj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie nasuń mikropipetę na elektrodę przymocowaną do uchwytu.
Po założeniu użyj strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie na pipetę, co zapobiega przedostawaniu się innych roztworów do końcówki.
Teraz umieść interesujące Cię komórki lub tkankę na stoliku mikroskopu i przesuń mikropipetę w kierunku komórki.
Gdy wzmacniacz generuje impulsy napięcia testowego, zapisz rezystancję, która wzrośnie po dotknięciu ogniwa przez końcówkę.
Aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe, delikatnie przełącz ciśnienie z dodatniego na ujemne za pomocą strzykawki. Utworzenie uszczelki spowoduje szybki wzrost rezystancji do wartości większej niż 1 gigaoma.
Teraz, gdy konfiguracja dołączona do komórki została ustalona, przekształćmy ją w konfigurację całej komórki i przeprowadźmy eksperyment!
Przypomnij sobie, że konfiguracja całej komórki ma miejsce, gdy błona jest pęknięta.
Pęknięcie odbywa się poprzez dodanie podciśnienia do mikropipety.
Gdy membrana pęknie, kształt impulsu testowego będzie miał duże stany przejściowe prądu, ponieważ błona komórkowa działa teraz jak kondensator, który jest ładowany przez impuls testowy.
Właściwości pojedynczego typu kanału jonowego w dowolnym neuronie można badać poprzez farmakologiczne blokowanie aktywności innych typów kanałów.
Protokół krokowy napięcia służy do badania prądów kanału jonowego wywołanych przez stopniowanie napięcia do szeregu różnych potencjałów podtrzymania.
Krzywa prąd-napięcie lub IV pokazuje zależności napięciowe prądu przepływającego przez kanał jonowy i zapewnia wgląd w to, przy jakich napięciach kanał jest otwarty lub zamknięty.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom, aby zbadać, co neuronaukowcy mogą zrobić z tą techniką.
Czasami kanały jonowe znajdujące się w neuronach można badać w środowisku niekomórkowym.
W tym przypadku naukowcy dodali białka kanałów jonowych do sztucznej błony lipidowej, aby zbadać te kanały w izolacji.
Kanały te można następnie wystawić na działanie eksperymentalnych cząsteczek, takich jak kapsaicyna pochodząca z ostrej papryki, w celu zbadania ich wpływu na aktywność kanałów.
Ponieważ są one wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego i znacząco wpływają na funkcję komórkową, kanały jonowe są doskonałymi celami dla leków. Gdy badane związki są dodawane do roztworów mikropipet lub kąpieli, zapisy z patch clamp mogą być wykorzystane do bezpośredniego testowania wpływu leków, takich jak nikotyna, na aktywność neuronalną. Zasada stosowania podciśnienia w celu utworzenia uszczelnienia o wysokiej odporności została nawet zastosowana do konstruowania urządzeń o wysokiej przepustowości, które mogą rejestrować z wielu komórek jednocześnie w celu przeprowadzenia badań przesiewowych leków.
Patch clamp całokomórkowy jest cennym narzędziem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych komórek na bodźce.
Co więcej, sparowane nagrania można wykorzystać do zbadania wpływu wypalania neuronów na pobudliwe komórki docelowe, takie jak mięśnie. W tym przykładzie klamra krosowa całej komórki jest używana do stymulowania wypalania neuronu ruchowego, podczas gdy nagrania są jednocześnie pobierane z kontrolowanego przez niego włókna mięśniowego. Obserwuje się wyraźne zależności między pobudzeniem neuronów a aktywnością mięśni.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do nagrywania zacisków krosowych, w którym omówiono zasady stojące za techniką i etapy prowadzenia eksperymentu.
Dzięki wyjątkowej wrażliwości czasowej na zmiany napięcia i prądów, nagrywanie patch clampów będzie nadal odgrywać kluczową rolę w zrozumieniu biofizyki kanałów i neuronów.
Dzięki za oglądanie!
Nagrywanie patch clamp jest niezwykle przydatną techniką do badania biofizycznych właściwości kanałów jonowych, które kontrolują aktywację neuronów.
Procedura polega na dociśnięciu szklanej mikropipety do komórki w celu wyizolowania małego "fragmentu" błony, który zawiera jeden lub więcej kanałów jonowych.
Konfiguracja eksperymentalna pozwala naukowcom "zacisnąć" środowisko elektryczne załatanego obszaru poprzez precyzyjne kontrolowanie napięcia na błonie komórkowej, które, w zależności od obecnych kanałów jonowych, wpływa na przepływ jonów przez błonę i pozwala na skomplikowane badanie tych kanałów.
Ten film przedstawia przegląd zasad stojących za techniką zacisku krosowego, opis kroków niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentu, a na koniec niektóre zastosowania tej metody.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom nagrywania zacisków krosowych.
Liczba dodatnio i ujemnie naładowanych jonów wewnątrz neuronu różni się od liczby znajdujących się na zewnątrz.
Ta nierównowaga powoduje różnicę napięć lub potencjał membrany wynoszący około -70 mV, co oznacza, że wnętrze jest bardziej ujemne niż na zewnątrz.
Kanały jonowe pomagają utrzymać gradient, kontrolując ruch jonów przez błonę komórkową, które są zasadniczo prądami elektrycznymi.
Korzystając z techniki patch clamp, naukowcy zadają pytania o naturę potencjału i prądu.
Zestaw do patch clamp zawiera szklaną mikropipetę, która zawiera zarówno roztwór jonowy, jak i elektrodę z chlorowanego srebra do pomiaru napięć i prądów.
Końcówka mikropipety ma polerowany otwór o grubości jednego mikrona, który zamyka niewielki obszar membrany.
Aby wyeliminować szum tła powodowany przez jony znajdujące się w roztworze kąpieli, między pipetą a łatą membranową tworzy się uszczelnienie o wysokiej rezystancji. Ponieważ rezystancja uszczelki mieści się w zakresie gigaomów, jest ona znana jako uszczelka gigaomowa.
Elektroda w pipecie jest podłączona do wzmacniacza, który może wzmacniać wahania prądu i napięcia, które są wynikiem ruchu jonów przez kanały w błonie plazmatycznej.
Za pomocą wzmacniacza naukowcy mogą zacisnąć lub sztucznie ustawić potencjał membrany na określone napięcia.
Wzmacniacz reguluje, ile prądu należy dodać przez srebrną elektrodę, aby utrzymać stałe napięcie.
Ponieważ różne kanały jonowe bramkowane napięciem otwierają się przy określonych napięciach, zdarzenia otwarcia są reprezentowane przez zmiany w profilach mierzonych prądów.
Alternatywnie, naukowcy mogą wymusić określony prąd przez elektrodę i zarejestrować wynikające z tego zmiany potencjału. W tej konfiguracji "cęgów prądowych" można rejestrować potencjały czynnościowe.
Przyjrzyjmy się teraz pięciu głównym typom konfiguracji zacisków krosowych.
Pierwszą z nich jest konfiguracja z komórką, w której mikropipeta jest po prostu uszczelniona do membrany nienaruszonej komórki.
Druga to konfiguracja całej komórki, w której membrana w mikropipecie jest pęknięta, aby zapewnić dostęp do wnętrza komórki.
Trzecia to konfiguracja perforowanej łaty. W tym przypadku substancje chemiczne, takie jak antybiotyki, są dodawane do mikropipety, aby zrobić małe otwory w membranie zapewniające dostęp do cytozolu.
Czwarta konfiguracja to łatka inside-out. Aby to osiągnąć, mikropipeta najpierw tworzy uszczelnienie z komórką, a następnie jest szybko odciągana, odrywając kawałek membrany i wystawiając wewnętrzną powierzchnię na działanie roztworu kąpieli.
Pozwala to na wystawienie cytoplazmatycznej strony kanałów na działanie różnych substancji chemicznych stosowanych w kąpieli.
Wreszcie, podobnie jak w przypadku inside-out, łatka outside-out zaczyna się jako konfiguracja całej komórki. Mikropipetę powoli wyjmuje się, aż kawałek membrany utworzy wypukłe uszczelnienie w poprzek końcówki.
W tej konfiguracji zewnątrzkomórkowa powierzchnia kanału może być wystawiona na eksperymentalne zabiegi.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu zasad, przejdźmy do kroków wymaganych do nagrania zacisku krosowego.
Zacznij od wciągnięcia rurki ze szkła borokrzemianowego do mikropipet za pomocą ściągacza do pipet.
Następnie wypoleruj końcówkę na gorąco, aby uzyskać odpowiednią średnicę i odporność.
Po wypolerowaniu napełnij mikropipetę roztworem jonowym i delikatnie strzepuj, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie nasuń mikropipetę na elektrodę przymocowaną do uchwytu.
Po założeniu użyj strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie na pipetę, co zapobiega przedostawaniu się innych roztworów do końcówki.
Teraz umieść interesujące Cię komórki lub tkankę na stoliku mikroskopu i przesuń mikropipetę w kierunku komórki.
Gdy wzmacniacz generuje impulsy napięcia testowego, zapisz rezystancję, która wzrośnie po dotknięciu ogniwa przez końcówkę.
Aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe, delikatnie przełącz ciśnienie z dodatniego na ujemne za pomocą strzykawki. Utworzenie uszczelki spowoduje szybki wzrost rezystancji do wartości większej niż 1 gigaoma.
Teraz, gdy konfiguracja dołączona do komórki została ustalona, przekształćmy ją w konfigurację całej komórki i przeprowadźmy eksperyment!
Przypomnij sobie, że konfiguracja całej komórki ma miejsce, gdy błona jest pęknięta.
Pęknięcie odbywa się poprzez dodanie podciśnienia do mikropipety.
Gdy membrana pęknie, kształt impulsu testowego będzie miał duże stany przejściowe prądu, ponieważ błona komórkowa działa teraz jak kondensator, który jest ładowany przez impuls testowy.
Właściwości pojedynczego typu kanału jonowego w dowolnym neuronie można badać poprzez farmakologiczne blokowanie aktywności innych typów kanałów.
Protokół krokowy napięcia służy do badania prądów kanału jonowego wywołanych przez stopniowanie napięcia do szeregu różnych potencjałów podtrzymania.
Krzywa prąd-napięcie lub IV pokazuje zależności napięciowe prądu przepływającego przez kanał jonowy i zapewnia wgląd w to, przy jakich napięciach kanał jest otwarty lub zamknięty.
Przyjrzyjmy się teraz kilku zastosowaniom, aby zbadać, co neuronaukowcy mogą zrobić z tą techniką.
Czasami kanały jonowe znajdujące się w neuronach można badać w środowisku niekomórkowym.
W tym przypadku naukowcy dodali białka kanałów jonowych do sztucznej błony lipidowej, aby zbadać te kanały w izolacji.
Kanały te można następnie wystawić na działanie eksperymentalnych cząsteczek, takich jak kapsaicyna pochodząca z ostrej papryki, w celu zbadania ich wpływu na aktywność kanałów.
Ponieważ są one wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego i znacząco wpływają na funkcję komórkową, kanały jonowe są doskonałymi celami dla leków. Gdy badane związki są dodawane do roztworów mikropipet lub kąpieli, zapisy z patch clamp mogą być wykorzystane do bezpośredniego testowania wpływu leków, takich jak nikotyna, na aktywność neuronalną. Zasada stosowania podciśnienia w celu utworzenia uszczelnienia o wysokiej odporności została nawet zastosowana do konstruowania urządzeń o wysokiej przepustowości, które mogą rejestrować z wielu komórek jednocześnie w celu przeprowadzenia badań przesiewowych leków.
Patch clamp całokomórkowy jest cennym narzędziem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych komórek na bodźce.
Co więcej, sparowane nagrania można wykorzystać do zbadania wpływu wypalania neuronów na pobudliwe komórki docelowe, takie jak mięśnie. W tym przykładzie klamra krosowa całej komórki jest używana do stymulowania wypalania neuronu ruchowego, podczas gdy nagrania są jednocześnie pobierane z kontrolowanego przez niego włókna mięśniowego. Obserwuje się wyraźne zależności między pobudzeniem neuronów a aktywnością mięśni.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do nagrywania zacisków krosowych, w którym omówiono zasady stojące za techniką i etapy prowadzenia eksperymentu.
Dzięki wyjątkowej wrażliwości czasowej na zmiany napięcia i prądów, nagrywanie patch clampów będzie nadal odgrywać kluczową rolę w zrozumieniu biofizyki kanałów i neuronów.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:04
Principles Behind Patch Clamping
3:20
Patch Clamp Configurations
4:43
Preparing Micropipettes and Forming a Seal
6:05
Whole-cell Patch Clamp Procedure
7:15
Applications
9:11
Summary
Videos from this collection: