Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim
7 października 2014
Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie przekrojów poprzecznych tętnic i żył krezkowych bydła na wykresie wielomowym, aby umożliwić badanie przesiewowe eksperymentalnych związków pod kątem ich aktywności naczyniowej. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie próbki tkanki krezkowej od zwierzęcia. W drugim etapie próbka jest oczyszczana, a naczynia są dzielone na sekcje.
Następnie sekcje są montowane i równoważone na przeszczepie mięśniowym. W ostatnim etapie izolowane naczynia są wystawione na działanie interesujących ich związków. Ostatecznie ten test biologiczny tętnic i żył może być wykorzystany do oceny aktywności naczyniowej związków i ich wpływu na przepływ krwi w naczyniach krwionośnych krezki bydła.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar przepływu krwi in vivo, jest to, że dzięki tej technice tkanka pojedynczego zwierzęcia może być wystawiona na działanie wielu związków jednocześnie. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w bardzo specyficzne zespoły zwierzęce, które mogą powodować zwężenie naczyń krwionośnych, takie jak kostrzewa, toksykoza lub ergotyzm, można ją również zastosować do innych scenariuszy, które mogą być interesujące dla badaczy, takich jak opracowywane farmaceutyki lub produkty naturalne. Dodatkowo, może być również stosowany nie tylko do unaczynienia bydła, ale także do unaczynienia naprawdę każdego innego gatunku ssaków.
Po usunięciu naczyń krwionośnych z tkanki krezkowej użyj kleszczy, aby umieścić próbkę tkanki na powierzchni cięcia i częściowo zanurzyć ją w lodowatym buforze krebowym henzel hens. Następnie, używając jubilera numer pięć, kleszczyków i hałasu, nożyczki Iris ostrożnie wycinają tłuszcz i tkanki łączne otaczające naczynia. Po oddzieleniu tętnicy i żyły zidentyfikuj otwór naczynia na jednym końcu odcinka i ostrożnie chwyć kleszczami powięź otaczającą naczynie.
Następnie wsuń końcówkę nożyczek pod podniesioną powięzią, aby wykonać cięcie nożyczkami równolegle do naczynia. Po początkowym nacięciu odetnij obie strony naczynia, aby jeszcze bardziej odłączyć tłuszcz i tkankę łączną oraz oczyścić naczynie. Oczyszczone naczynia krwionośne umieścić w świeżej probówce z lekkim buforem Krebs Henzel i przechowywać probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 24 godzin.
Gdy będziesz gotowy, użyj krajalnicy do tkanek, aby uzyskać spójne przekroje poprzeczne interesującego Cię naczynia na żądaną liczbę dwumilimetrowych odcinków, a następnie zbadaj każdą sekcję w powiększeniu 12,5x, aby upewnić się, że każda próbka nie ma nieprawidłowości, gałęzi, zaworów ani powierzchownych uszkodzeń nabytych podczas procesu preparowania i czyszczenia. Dopuszczalne pokrojone w plastry odcinki naczynia należy przechowywać zanurzone w lekkim buforze Krebs Henzel w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do 30 minut. Następnie delikatnie przełóż podpory przez światło każdej próbki i użyj mikropozycjonera na przeszczepie mięśniowym, aby stopniowo zwiększać napięcie, aby zamontować naczynie na przeszczepie mięśniowym.
Uważając, aby nie rozciągać naczyń powyżej odczytu dwóch do trzech gramów. Po przykryciu wszystkich komór odkurz bufor z każdej komory i napełnij je pięcioma mililitrami świeżego buforu. Po tym, jak wszystkie sekcje naczynia zrównoważą się przez 1,5 godziny, aby osiągnąć stabilne napięcie spoczynkowe wynoszące jeden gram przy 500 mikrolitrach 1,32 molowego chlorku potasu do końcowego stężenia 0,12 molowego do 5,5 mililitrowego roztworu, kąpiąc naczynie.
Nie należy regulować napięcia ręcznie, ponieważ do normalizacji danych dotyczących leczenia zostanie wykorzystana maksymalna reakcja na chlorek potasu, roztwór należy zastąpić świeżym buforem świetlnym Krebs Henzel w odstępach 15-minutowych, aż napięcie powróci do wartości wyjściowej wynoszącej jeden gram. Gdy napięcie powróci do wartości podstawowej, dodaj wzorce w podwielokrotnościach po 25 mikrolitrów do każdej komory zgodnie z protokołem doświadczalnym. Po dodaniu ostatniego standardu uruchom dziewięciominutowy timer.
Pod koniec inkubacji usunąć z komór bufor zawierający roztwór i dodać pięć mililitrów świeżego buforu do każdej komory. Następnie uruchom 2.5-minutowy timer po zakończeniu, powtórz to 2.5-minutowe płukanie. Po raz drugi pod koniec drugiego płukania odessać komory.
Następnie, po ponownym dodaniu nowego bufora, uruchom jednominutowy minutnik, aby odliczać czas do rozpoczęcia drugiej edycji standardowej. Jak zaobserwowano w zilustrowanych tutaj dziewięciominutowych okresach inkubacji, następuje stopniowy wzrost odpowiedzi na wzorce, które wraz ze wzrostem stężeń poddawania działaniu substancji, dodanie chlorku potasu na zakończenie eksperymentu jest niezbędne, ponieważ potwierdza żywotność tkanki. Ten test biologiczny można wykorzystać do oceny aktywności naczynio-naczyniowej eksperymentalnych związków na naczyniach krwionośnych, które dostarczają składniki odżywcze do jelita cienkiego, a także na naczyniach krwionośnych, które odprowadzają wchłonięte składniki odżywcze.
Na przykład w tym eksperymencie nie zaobserwowano różnicy w reakcjach skurczowych tętnic lub żył po leczeniu pięcioma hydroksytryptaminami. I odwrotnie, odpowiedź kurczliwa żyły krezkowej na rosnące stężenie noradrenaliny była większa niż tętnicy krezkowej. Zgodnie z tą procedurą, metoda może być dalej modyfikowana w celu uwzględnienia agonistów lub antagonistów w buforze, które były szczególnie interesujące dla badacza.
Pozwoliłoby to badaczowi lepiej zrozumieć udział bardzo specyficznych receptorów i mechanizmy stojące za reakcjami naczyniowymi zaobserwowanymi podczas eksperymentu z mięśniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać, przetwarzać i izolować naczynia krwionośne. Dla mojego eksperymentu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na izolacji tętnic i żył krezkowych bydła w celu oceny aktywności naczyniowej różnych związków. Dzięki zastosowaniu multimyografu badacze mogą ocenić, w jaki sposób związki te wpływają na przepływ krwi oraz wchłanianie składników odżywczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Toksykologia
Wprowadzenie
- Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą zaburzać przepływ krwi.
- Zrozumienie wazoaktywności jest kluczowe dla oceny wchłaniania składników odżywczych.
- Naczynia krwionośne krezkowe odgrywają kluczową rolę w fizjologii przewodu pokarmowego.
- Przesiewowe badania eksperymentalne mogą pomóc w identyfikacji potencjalnych związków terapeutycznych.
Cel badania
- W celu wyizolowania bydlęcych tętnic i żył krezkowych do badań.
- W celu przesiewowego badania związków pod kątem ich właściwości naczynioruchowych.
- W celu oceny wpływu tych związków na przepływ krwi.
Zastosowane metody
- Pobranie próbek tkanki krezkowej z materiału pochodzenia bydlęcego.
- Oczyszczanie i sekcjonowanie naczyń.
- Montaż i ekwilibracja przekrojów w multimyografie.
- Ekspozycja izolowanych naczyń na badane związki w celu ich oceny.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja tętnic i żył krezkowych.
- Identyfikacja związków o istotnym działaniu naczynioruchowym.
- Wykazanie skuteczności metody w ocenie zmian przepływu krwi.
- Potencjalne znaczenie dla zrozumienia dynamiki wchłaniania składników odżywczych.
Wnioski
- Badanie biologiczne skutecznie ocenia wazoaktywność związków.
- Metoda ta może przyczynić się do badań nad zdrowiem przewodu pokarmowego.
- Dalsze badania mogą zgłębić zastosowania terapeutyczne zidentyfikowanych związków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten bioassay in vitro umożliwia wczesną ocenę wpływu związków na napięcie naczyniowe w tętnicy i żyle krezkowej bydlęcej, wspierając walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w farmakologii przewodu pokarmowego. Poprzez izolację naczyń z jednego zwierzęcia i jednoczesne testowanie wielu związków, metoda ta zwiększa wiarygodność predykcyjną i zmniejsza zależność od modeli in vivo podczas identyfikacji związków wiodących. Podejście to ma wartość translacyjną w ocenie potencjalnych działań niepożądanych o charakterze naczyniozwężającym lub rozszerzającym oraz w analizie kandydatów terapeutycznych wpływających na przepływ krwi w jelitach i wchłanianie składników odżywczych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ocenę indukowanej związkami wazoaktywności w naczyniach oporowych i pojemnościowych krążenia krezkowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez profilowanie agonistyczne/antagonistyczne w celu wyjaśnienia receptorowych odpowiedzi naczyniowych.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność predykcyjną i wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez wczesną identyfikację ryzyk lub szans związanych z wazoaktywnością na etapie odkrywania leków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez izolację i montaż przekrojów naczyń na multimiografie w celu pomiaru kurczliwości w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe (np. zmiany napięcia), co umożliwia wiarygodną ocenę związków w różnych warunkach terapeutycznych.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość i skalowalność badań przesiewowych, umożliwiając testowanie wielu związków na jednej próbce tkanki zwierzęcej, co poprawia przepustowość analiz i efektywność wykorzystania zasobów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia modelowanie systemu istotne dla chorób poprzez wykorzystanie naczyń krwionośnych z dopływu i odpływu jelita cienkiego w celu odzwierciedlenia fizjologicznej dynamiki przepływu krwi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez utrzymanie żywotności tkanek i spójnych warunków eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie ekspozycji na związek z funkcjonalnymi wynikami naczyniowymi istotnymi dla zdrowia przewodu pokarmowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza biologiczna wpisuje się w proces odkrywania leków, od etapu potwierdzenia oddziaływania na cel po identyfikację związku wiodącego, oferując funkcjonalny odczyt, który łączy aktywność molekularną z odpowiedziami naczyniowymi na poziomie tkankowym w fizjologicznie istotnym kontekście.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar odpowiedzi naczynioruchowych na interesujące związki, umożliwiając redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku celów naczyniowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testową oraz ilościowe pomiary kurczliwości, które pozwalają na porównanie efektów działania związków w różnych stężeniach i grupach badawczych.
- Analityka: Generuje dane o napięciu w czasie rzeczywistym, znormalizowane do maksymalnej odpowiedzi na chlorek potasu, co umożliwia standaryzowane porównanie siły i skuteczności działania naczynioruchowego.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie naczyń krwionośnych zaangażowanych w wchłanianie składników odżywczych i perfuzję jelit, co jest istotne dla modeli zaburzeń przewodu pokarmowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma przesiewowa dla naczyń, którą można dostosować do różnych związków, gatunków i kampanii profilowania receptorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach naczyniowych dzięki bezpośredniej funkcjonalnej ocenie tkankowej.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności dzięki kontrolowanym procedurom montowania, equilibracji i normalizacji na multimyografie.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach poprzez wczesną identyfikację efektów naczynioaktywnych, co wspiera decyzje o kontynuacji lub zaprzestaniu badań (go/no-go).
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o obciążenia naczyniowe lub potencjał terapeutyczny w wskazaniach gastroenterologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie dyssekcji naczyniowej, obchodzenia się z tkankami oraz obsługi myografu, aby zapewnić powtarzalność przygotowania i montażu naczyń.
- Zależność od dostępu do systemu wielomyograficznego, perfuzji buforu z kontrolą temperatury oraz precyzyjnych mikropozycjonerów do regulacji napięcia.
- Konieczność standaryzacji protokołów pomiędzy zespołami w zakresie wycinania fragmentów naczyń, czasu równoważenia oraz sposobu podawania związków w celu zapewnienia powtarzalności wyników pomiędzy użytkownikami.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy zastosowaniu metody do różnych typów naczyń, gatunków lub modeli chorobowych, szczególnie w odniesieniu do napięcia podstawowego i ekspresji receptorów.
- Ograniczenie wynikające z czasu przeżycia naczyń po izolacji, co wymaga sprawnego przeprowadzenia eksperymentów w zoptymalizowanych warunkach przechowywania w buforze.
