Name: Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy. Technika ta umożliwia obserwację egzocytozy i endocytozy pojedynczych pęcherzyków w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez nagrodę (1145581) Narodowej Fundacji Nauki dla LWG.

UWAGA: Cała procedura została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Illinois w Chicago.
1. Roztwory i preparaty pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Wszystkie roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Pożywkę hodowlaną należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 100 ml pożywki hodowlanej, mieszając 1 ml roztworu pen-strep i 1 ml ITSX (suplementacja insuliną-transferyną-selenem) ze 100 ml z DMEM.</li>
	<li>Przygotować roztwór enzymatyczny, mieszając 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl2 i 2,5 ml 50 mM EDTA.</li>
	<li>Przygotować roztwór inaktywacyjny, mieszając 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albuminy i 625 mg inhibitora trypsyny.</li>
	<li>Przygotuj roztwór Locke'a zawierający 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM glukozy. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH.</li>
	<li>Przygotować roztwór poli-d-lizyny (PDL) o stężeniu 50 mg/ml. Do pokrycia szkiełek nakrywkowych użyć końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
	<li>Przygotuj zewnątrzkomórkowy roztwór 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH i 10 mM glukozy. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH o osmolarności ~310 nmol/kg.</li>
	<li>Przygotować roztwór pipet o stężeniu 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH o osmolności ~290 nmol/kg.</li>
</ol>
2. Izolacja nadnerczy
<ol>
	<li>Autoklawuj parę dużych i małych nożyczek preparacyjnych i dwie pary kleszczy. Podczas całego procesu noś rękawiczki i umieść tacę preparacyjną na wiaderku z lodem.</li>
	<li>Użyj myszy pobranych w dniu 0-3. Eutanazja zwierząt za pomocą zbiornika CO2 pod ciśnieniem, a następnie dekapitacja.</li>
	<li>Użyj mniejszego zestawu nożyczek, aby przyciąć tył szczeniaka wzdłuż kręgosłupa od odcinka szyjnego do ogonowego. Pamiętaj, aby ciąć powierzchownie pod skórą i nie przebijać się w jamie ciała.</li>
	<li>Następnie oderwij skórę od kręgosłupa, aby mięśnie były odsłonięte, aby mieć wyraźny widok na kręgosłup. Stąd wykonaj cięcie poprzeczne w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego, a następnie wykonaj dwa równoległe cięcia wzdłuż boków kręgosłupa.</li>
	<li>Z jedną parą kleszczy trzymających główne ciało zwierzęcia, użyj drugiej pary kleszczy, aby chwycić kręgosłup i oderwać kręgosłup, aż nerki zostaną odsłonięte.</li>
	<li>W tym momencie wyobraź sobie nadnercza na szczycie nerek. Następnie ostrożnie umieść dwa gruczoły każdego zwierzęcia w stożkowej probówce wypełnionej roztworem Locke'a. 
	UWAGA: Czasami gruczoły przyklejają się do kleszczy. W takim przypadku delikatnie użyj innej pary kleszczy, aby pomóc w usunięciu gruczołów z kleszczy do roztworu Locke'a. Gruczoły mogą być utrzymywane w tym stanie do 2 godzin.</li>
</ol>
3. Trawienie tkankowe
<ol>
	<li>W międzyczasie bąbelkować roztwór enzymu 5% CO2 + 95% O2 przez 15 minut przed użyciem. Upewnij się, że zrównoważony roztwór zmieni kolor z jasnoróżowego na różowawy/pomarańczowy.</li>
	<li>Dodać papainę do świeżo bąbelkowanego roztworu enzymu o końcowym stężeniu 20-25 jednostek/ml. Inkubować każdą parę gruczołów od każdego zwierzęcia przez 40-60 minut w temperaturze 37 °C w roztworze enzymu z papainą.</li>
	<li>Dodać 75% roztworu inaktywacyjnego do każdej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 10 minut. Ta inkubacja dezaktywuje aktywność enzymatyczną papainy.</li>
	<li>Po 10 minutowej inkubacji z roztworem inaktywacyjnym delikatnie przenieś gruczoły do nowo oznakowanej probówki, a następnie przemyj gruczoły 3x pożywką hodowlaną.</li>
</ol>
4. Dysocjacja komórek i posiewanie
<ol>
	<li>Po umyciu umieść oba gruczoły w 200 μl pożywki hodowlanej, a następnie delikatnie miareczkuj gruczoły w górę i w dół przez końcówkę pipety za pomocą pipety pipetą o pojemności 200 μl, aż w roztworze nie będzie już dużego kawałka tkanki. 
	UWAGA: Podczas miareczkowania utrzymuj gruczoły na dnie probówki z siłą skierowaną w dół od końcówki pipety o pojemności 200 μl i delikatnie i powoli dotykaj tkanki. Upewnij się, że używasz powolnych, ciągłych pociągnięć, nigdy nie pipetując szybko ani gwałtownie.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 250 μl pożywki hodowlanej, aby zwiększyć całkowitą objętość pożywki do 450 μl.</li>
	<li>Umieścić 60 μl tego roztworu zawierającego komórki na każdym z siedmiu 12 mm wstępnie powlekanych szkiełek nakrywkowych PDL, które umieszcza się w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
	<li>Po platerowaniu należy umieścić naczynie w inkubatorze ustawionym na 37 °C i utrzymywanym przy stałym przepływie/dopływie 5% CO2 przez 30 minut, aby zapewnić środowisko dla żywotności komórek. Po inkubacji delikatnie dodaj 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do szalki hodowlanej i włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 24 godziny przed zapisami z komórkami. 
	UWAGA: Zazwyczaj ogniwa mogą być używane do zapisów elektrofizjologicznych przez okres do 4 dni.</li>
</ol>
5. Identyfikacja komórek i tworzenie pieczęci gigaomowej
<ol>
	<li>Umieścić 12 mm szkiełko nakrywkowe w roztworze zewnątrzkomórkowym. Ponieważ całe nadnercza są wykorzystywane do przygotowania komórek, wymieszaj komórki chromochłonne (zwykle bardzo jasne z brązowawo-beżowym zabarwieniem i prawie idealną okrągłą formą (ryc. 1) w hodowli z komórkami korowymi (mniejszymi i ciemniejszymi niż komórki chromofilinowe).</li>
	<li>Wyciągnij pipety z plastrami w czterech etapach za pomocą programowalnego ściągacza P-97. Zanurz końcówkę pipety w stopionym wosku, co pomoże zmniejszyć pojemność szkła, a następnie wypoleruj końcówkę, aby "zdmuchnąć" ten wosk z wnętrza końcówki pipety. 
	UWAGA: Po napełnieniu roztworem do pipet krosowych, pipety krosowe mają zwykle rezystancję ~2 MΩ.</li>
	<li>Zbliżyć pipetę z plastrem do komórki w odległości kilku mikronów. Aby uzyskać konfigurację z podłączoną komórką, należy zwrócić uwagę na jakiekolwiek niewielkie odkształcenia komórek podczas zbliżania pipety z plastrem do ogniwa. Zastosuj delikatne ssanie, aż do uzyskania uszczelnienia GΩ.</li>
</ol>
6. Zapisy pojemnościowe podłączone do komórek
<ol>
	<li>Po ujawnieniu uszczelki GΩ należy dokonać nagrań podłączonych do ogniw za pomocą wzmacniacza patch-clamp EPC-7 plus i dwufazowego analogowego wzmacniacza typu lock-in (patrz załączona tabela wyposażenia). Zastosuj falę sinusoidalną o amplitudzie 50 mV (r.m.s.) i częstotliwości 20 kHz ze wzmacniacza lock-in.</li>
	<li>Ustaw filtr wyjściowy wzmacniacza lock-in na stałą czasową 1 ms i 24 db. Ustaw fazę wzmacniacza typu lock-in w taki sposób, aby przejściowe zmiany pojemności wywołane delikatnymi impulsami ssania pojawiały się tylko w ścieżce pojemności łatki (Im) bez projekcji na ścieżkę przewodności łaty (Re) (ilustracja 2). 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat kalibracji systemu znajdują się w numerze referencyjnym 19.</li>
	<li>Zidentyfikuj typowe zmiany pojemności za pomocą kroków "w dół" (Rysunek 3). 
	UWAGA: Solidne nagranie będzie postrzegane jako podobieństwo typu "schody" z wieloma stopniami w dół, co wskazuje na internalizację pojedynczych pęcherzyków. Proces łatania służy jako stymulacja mechaniczna, ponieważ prąd czynnościowy może być zwykle rejestrowany z większości komórek.</li>
	<li>Nazwij pliki jako osobne foldery, w tym datę: mm/dd/rok i każde nagranie dołączone do komórki jako osobną indywidualną numerację (xx) w tym pliku.</li>
</ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pomiary pojemności przyłączonej do komórki wymagają kilku krytycznych kroków, aby skutecznie uzyskać nagrania o wysokiej jakości: 1) żywotne i zdrowe komórki przygotowane z nadnerczy; 2) Powłoka PDL szkiełek nakrywkowych; 3) tworzenie uszczelnień gigaomowych; 4) poziom hałasu systemu; oraz 5) korekcja fazy.
W przypadku chirurgii zwierząt modyfikacje, które można potencjalnie wprowadzić, polegają na dostosowaniu podejścia chirurgicznego tak, aby jak najlepiej odpowiadało zręczności i zapobiegał...

Transmisja synaptyczna odbywa się za pośrednictwem egzocytozy pęcherzyków synaptycznych zawierających neuroprzekaźniki, a pęcherzyki te muszą być poddawane miejscowemu recyklingowi endocytarnemu w obrębie zakończenia nerwowego, aby utrzymać komunikację neuronalną w dłuższej perspektywie. Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę transmisji synaptycznej w mózgu, zrozumienie maszynerii molekularnej, która składa się na cykl pęcherzyków synaptycznych, jest niezbędną podstawą do lepszego zrozumienia komunikacji komórkowej jako całości. Wśród systemów modeli komórkowych komórka chromochłonna nadnerczy dostarczyła jednych z najbardziej ostatecznych informacji na temat maszynerii molekularnej leżącej u podstaw recyklingu pęcherzyków synaptycznych. Egzocytoza, ostatni etap uwalniania neuroprzekaźników, została dogłębnie zbadana i zbadana za pomocą komórki chromochłonnej nadnerczy1,2. W rzeczywistości większość graczy molekularnych, które koordynują tworzenie, kierowanie, dokowanie i fuzję granulek wydzielniczych, została zidentyfikowana dzięki zastosowaniu różnych technik w komórkach chromochłonnych1. Ponadto, stwarzając możliwość umożliwienia jednopęcherzykowego rozwiązania maszynerii białkowej zaangażowanej w egzocytozę, komórka chromochłonna pozostaje potężnym modelem umożliwiającym rozwiązanie problemów fuzji pęcherzyków3.
Pomiary pojemności przyłączonej do komórek zostały po raz pierwszy wykorzystane do rozwiązania fuzji pojedynczych pęcherzyków podczas egzocytozy3. Wykazano, że egzocytoza pęcherzyków o średnicy zaledwie ~60 nm jest wykrywana za pomocą pomiarów admitancji błony komórkowej techniką patch clamp w konfiguracji przyłączonej do komórki4-7. Admitancja jest definiowana jako miara tego, jak łatwo obwód lub urządzenie pozwoli na przepływ prądu; Jest to odwrotność impedancji. W ten sposób pomiary admitancji pozwalają zrozumieć pojemność membrany. Osiąga się to poprzez włączenie błony pęcherzykowej do błony plazmatycznej; To włączenie ujawnia zmiany w powierzchni8. Każdy pęcherzyk perpulujący powoduje stopniowy wzrost pojemności membrany9,10. Dodatkowo ten pomiar admitancji zapewnia przewodność błony i przewodnictwo porów fuzji podczas zdarzenia egzocytotycznego3. Ponieważ technika ta zapewniła unikalne narzędzie do identyfikacji kinetyki pojedynczych pęcherzyków podczas egzocytozy, nasze laboratorium niedawno zastosowało tę koncepcję do wykrywania endocytozy pojedynczych pęcherzyków11,12.
Naszym szczególnym zainteresowaniem jest endocytoza za pośrednictwem klatryny (CME), która została uznana za podstawowy składnik utrzymania czystości w wielu komórkach13 i jako główny szlak endocytozy pęcherzyków synaptycznych w zakończeniach neuronalnych14,15. Wiadomo, że CME jest ważny biologicznie, jednak jego kinetyka nie jest dobrze poznana ze względu na ograniczenia techniczne w monitorowaniu pojedynczych zdarzeń endocytarnych. Biorąc pod uwagę podobieństwa w mechanizmach egzocytarnych między komórkami chromochłonnymi a neuronami1, prawdopodobne jest, że mechanizmy rozszczepienia w komórkach chromochłonnych mogą prawdopodobnie dotyczyć endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach. Pomiary pojemności przyłączonej do komórki zostały wykorzystane do monitorowania poszczególnych zdarzeń endocytarnych i analizy kinetyki rozszczepienia, których większość metod nie jest w stanie rozwiązać. W naszych nagraniach z ogniwami fala sinusoidalna o częstotliwości 20 kHz jest nakładana na potencjał podtrzymujący, a prąd wyjściowy jest rozdzielany na przewodność membranową w jednym kanale i pojemność membrany w drugim kanale z dwufazowego wzmacniacza lock-in16-18. Na podstawie zmian przewodnictwa i pojemności błony można obliczyć kinetykę porów rozszczepienia, które prawdopodobnie odpowiadają szyjce błony rurkowej, która łączy pęcherzyk internalizujący z błoną plazmatyczną przed ściśnięciem pęcherzyka. Reasumując, technika ta daje nam możliwość zbadania mechanizmów regulacyjnych rozszczepienia pęcherzyków podczas CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Przechowywać z dala od UV</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane szkło osłonowe Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Rozmrażaj tylko na ICE!</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus wzmacniacz krosowy</td><td>Płytka</td> akwizycji danych HEKA <td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>Oprogramowanie do</td> akwizycji danych National Instruments <td></td><td></td></tr><tr><td>Igor</td><td>Ściągacz do pipet Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Sutter Instruments Microforge</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumenty naukowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Średnica zewnętrzna: 1,5 mm 
Średnica wewnętrzna: 1,10 mm 
Długość: 10 cm</td></tr></tbody></table>

metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Transmisja neuronalna jest integralną częścią komunikacji komórkowej w mózgu. Depolaryzacja błony presynaptycznej prowadzi do fuzji pęcherzyków znanej jako egzocytoza, która pośredniczy w transmisji synaptycznej. Późniejsze pobranie pęcherzyków synaptycznych jest konieczne do wytworzenia nowych pęcherzyków wypełnionych neuroprzekaźnikami w procesie identyfikowanym jako endocytoza. Podczas egzocytozy zespolenie błon pęcherzykowych spowoduje zwiększenie powierzchni, a późniejsza endocytoza spowoduje zmniejszenie powierzchni. Tutaj nasze laboratorium demonstruje podstawowe wprowadzenie do zapisów pojemności przyłączonej do komórek pojedynczych zdarzeń endocytarnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy. Ten rodzaj zapisu elektrycznego jest przydatny do zapisów egzocytozy i endocytozy w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczego pęcherzyka. Chociaż ta technika może wykryć zarówno egzocytozę pęcherzyków, jak i endocytozę, nasze laboratorium koncentruje się na endocytozie pęcherzykowej. Co więcej, technika ta pozwala nam analizować kinetykę pojedynczych zdarzeń endocytarnych. Opisano tu metody preparacji tkanki nadnerczy myszy, hodowlę komórek chromochłonnych, podstawowe techniki przyłączania komórek oraz kolejne przykłady indywidualnych śladów mierzących pojedyncze zdarzenie endocytarne.

Żywotność komórek oraz jakość uszczelnienia gigaohmicznego są kluczowe dla jakości zapisów pojemności w konfiguracji cell-attached. Dlatego też przed rozpoczęciem pomiarów elektrofizjologicznych niezbędne jest uzyskanie efektywnej i wydajnej hodowli komórkowej; typowe żywe komórki przedstawiono na Ryc. 1. Praktyka i czas pomogą w uzyskaniu wysokiej jakości uszczelnienia gigaohmicznego. Jeśli podczas zbliżania pipety do komórki, zgodnie z opisem w kroku 5.3 protokołu, wyraźnie widać deformację komórki, zw...

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie pojedynczego pęcherzyka, cytozy i endocytozy. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie czystego i całkowitego trawienia tkanki nadnerczy myszy. Drugim krokiem jest dysocjacja i płytka komórek z nadnerczy.Następnie komórki chrominowe są identyfikowane i zaciskane w celu uzyskania zapisów pojemności przyłączonej do ogniwa. Ostatecznie można zaobserwować pojedynczy pęcherzyk, cytozę i endocytozę. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zapisy pojedynczych kanałów jonowych przyłączonych do komórek, jest to, że jesteśmy w stanie wykryć egzocytozę i endocytozę pojedynczych pęcherzyków.Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ uzyskanie giga pieczęci jest trudne do nauczenia. Ponadto identyfikacja komórek wśród mieszanych typów komórek znajdujących się na płytce może być trudna. Aby przygotować się do operacji, zacznij od autoklawowania pary dużych i małych preparacji, nożyczek i dwóch par kleszczy.Następnie umieść tacę preparacyjną na wiaderku z lodem. Zacznij również bulgotać roztwór enzymatyczny z 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem. Roztwór jest jasnoróżowy przed bulgotaniem. Następny.Po eutanazji i od

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Systemy hodowli komórek chromafinowych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z wydzielaniem w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wykorzystywaną do wycięcia nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinowych.

Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Stres osmotyczny wpływa na egzocytozę i ilość neuroprzekaźników uwalnianych podczas tego procesu. Pokazujemy, w jaki sposób połączenie metod elektrochemicznych z transmisyjną mikroskopią elektronową może być wykorzystane do badania wpływu zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na aktywność egzocytozy, wielkość ilościową pęcherzyków i ilość neuroprzekaźnika uwalnianego podczas egzocytozy.

Monitorowanie wpływu stresu osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i egzocytozę

Komórki enterochromafiniczne (EC) stanowią mały podzbiór komórek nabłonka przewodu pokarmowego. Komórki EC są elektrycznie pobudliwe i uwalniają serotoninę, jednak trudności w hodowli i identyfikacji komórek EC mają ograniczone badania fizjologiczne. Przedstawiona tutaj metoda ustanawia model hodowli pierwotnej, który można badać pojedyncze komórki EC za pomocą elektrofizjologii.

Elektrofizjologia całych komórek pierwotnych hodowanych mysich komórek enterochromafinowych

Tutaj prezentujemy metodę izolowania nadnerczy od myszy, naprawiania tkanek, dzielenia ich na sekcje i przeprowadzania barwienia immunofluorescencyjnego.

Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Poznaj metodę pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy. Technika ta umożliwia obserwację egzocytozy i endocytozy pojedynczych pęcherzyków w czasie rzeczywistym.

Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Przeglądaj więcej filmów