Obrazowanie wapnia w neuronach

Obrazowanie wapnia jest niezwykle użyteczną techniką badania różnorodnych funkcji, jakie jony wapnia pełnią w działających neuronach. Jony wapnia generują wielość sygnałów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują kluczowe funkcje, takie jak uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych. Metody obrazowania wapnia umożliwiają bezpośredni pomiar dynamicznego przepływu wapnia wewnątrz neuronów i tkanki neuronalnej. Niniejszy film przedstawia przegląd działania barwników wskaźnikowych wapnia, opisuje przebieg eksperymentu obrazowania wapnia, a na koniec omawia niektóre zastosowania tej techniki.

Najpierw przyjrzyjmy się zasadom biochemicznym działania barwników wskaźnikowych wapnia.

Barwniki wskaźnikowe wapnia są zmodyfikowanymi cząsteczkami chelatującymi, takimi jak Fura-2, które składają się z dwóch głównych komponentów. Pierwszym jest miejsce chelatujące, które w sposób selektywny wiąże wapń. Drugim jest miejsce fluorescencyjne, które emituje światło o określonej długości fali po naświetleniu światłem ultrafioletowym o długości fali pobudzenia.

Wiązanie wapnia z barwnikiem zmienia jego właściwości fluorescencyjne , co umożliwia ilościowe określenie zmian stężenia wapnia, co w tym przypadku jest reprezentowane przez różnicę w intensywności fluorescencji emitowanej przez ten neuron przy dwóch różnych długościach fal pobudzenia.

Większość barwników wskaźnikowych wapnia jest dodatkowo modyfikowana, aby mogły one łatwo przenikać przez błonę komórkową, i są wprowadzane albo do roztworu kąpieli z neuronami, albo wstrzykiwane do tkanki mózgowej w badaniach całego organizmu.

Niektóre barwniki posiadają właściwości podwójnego pobudzenia lub podwójnej emisji, w zależności od tego, czy wapń jest związany. Przykładem jest barwnik Fura-2, który posiada różną długość fali pobudzenia w zależności od tego, czy wapń jest związany, czy nie. Obliczając stosunek intensywności emisji przy dwóch długościach fal pobudzenia, można uzyskać znacznie dokładniejszą szacunkową wartość stężenia wapnia.

Barwniki o podwójnym pobudzeniu lub emisji, takie jak Fura-2, nazywane są ratiometrycznymi wskaźnikami wapnia. Istnieją również barwniki nieratiometryczne, które mają pojedyncze długości fal pobudzenia i emisji. Są one jednak bardziej podatne na fotobleaching, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji przy przedłużonej ekspozycji na światło.

Kluczowym krokiem przed użyciem barwnika w eksperymencie jest kalibracja pomiarów fluorescencji barwnika przy użyciu roztworów o znanych stężeniach wapnia. Pozwoli to naukowcom na dokładne oszacowanie wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia na podstawie zmierzonych intensywności emisji podczas eksperymentów.

Po zapoznaniu się z zasadą działania wskaźników wapnia, przejdźmy do obrazowania przepływu wapnia w neuronach hodowlanych.

W pierwszej kolejności należy przygotować wybrany barwnik będący wskaźnikiem wapnia, np. Fura-2, i zmieszać go z odpowiednimi roztworami fizjologicznymi. Roztwór należy wymieszać w wstrząsarku wirówkowym (vortex), aby zapewnić jego jednorodność. Po wymieszaniu należy przelać go do naczynia. Następnie do naczynia z roztworem barwnika należy wprowadzić szkiełko nakrywki z hodowlą neuronów. Następnie neurony należy inkubować w ciemności przez wymagany czas w odpowiedniej temperaturze, co w tym przypadku wynosi 30 minut w 37 ˚C. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść szkiełko nakrywki do naczynia bez barwnika.

Kolejnym krokiem jest zamocowanie szkiełka nakrywki w komorze obrazowania mikroskopu. Po zamocowaniu należy podłączyć linię doprowadzającą systemu perfuzyjnego i powoli napełnić komorę. Komorę należy przytwierdzić do stolika mikroskopu i zainstalować linie odpływowe perfuzji, zapewniając ciągły przepływ w całym systemie.

Po przygotowaniu stolika mikroskopu należy ustawić ostrość na neuronach, korzystając ze światła widzialnego. Barwnik należy przetestować, naświetlając komórki falami o długości 340 i 380 nm. Należy pamiętać, że w przypadku Fura-2 nieaktywne neurony powinny emitować więcej światła przy pobudzeniu 380 nm, ponieważ wapń nie jest związany.

Następnie, przed rozpoczęciem eksperymentu, należy dostosować ustawienia kamery w celu optymalizacji zakresu dynamicznego. Należy zebrać obraz dla każdej długości fali, a następnie za pomocą narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI) zmierzyć intensywność tła dla każdej długości fali. Wartości tła należy wprowadzić do oprogramowania sterującego, aby można było je odjąć od kolejnych obrazów.

Po zakończeniu wstępnej konfiguracji należy wybrać około pięciu pól widzenia przeznaczonych do obrazowania w eksperymencie i zapisać ich współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Podczas eksperymentu zautomatyzowany stolik przesuwa się do danego pola, zbiera stosunek intensywności pola dla długości fali 340 i 380 nm, a następnie przechodzi do kolejnego pola, aż do momentu zarejestrowania wszystkich wybranych obszarów.

W niektórych eksperymentach do płynu perfuzyjnego dodaje się czynnik farmakologiczny, który wywołuje zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Roztwór o wysokim stężeniu potasu, który depolaryzuje neurony, może spowodować wzrost wewnątrzkomórkowej koncentracji wapnia, co pokazano na tej serii obrazów time-lapse; służy on jako dobra kontrola pozytywna. Po zakończeniu zbierania danych należy przejść do analizy.

Aby przeanalizować wyniki, należy za pomocą oprogramowania zaznaczyć obszary zainteresowania obejmujące neurony lub ich części. Następnie, przy użyciu oprogramowania, należy zmierzyć ratiometryczne informacje o intensywności obrazu dla obu długości fal w każdym ROI we wszystkich zebranych obrazach. Na podstawie tych informacji można przeprowadzić ilościową ocenę zmian wewnątrzkomórkowych koncentracji wapnia w czasie.

Teraz, gdy rozumieją Państwo, w jaki sposób przeprowadza się obrazowanie wapnia w neuronach, przyjrzyjmy się sposobom, w jakie ta cenna metoda jest obecnie wykorzystywana w badaniach.

Przede wszystkim obrazowanie wapnia służy do badania zmian stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w odniesieniu do aktywności neuronalnej.

W tym badaniu poszczególne neurony wypełniono barwnikiem wskaźnikowym wapnia podczas rejestracji metodą patch-clamp. Precyzyjna kontrola potencjału błonowego, możliwa dzięki technice patch-clamp, pozwala na wgląd w dynamikę przepływu wapnia.

Obrazowanie wapnia umożliwia badaczom analizę wysoce synchronicznej aktywności sieciowej neuronów.

W tym przypadku neuronaukowcy wykorzystali obrazowanie wapnia do oceny sygnału fluorescencyjnego 40 neuronów. Na podstawie tych informacji można określić właściwości sieci, takie jak propagacja sygnału i korelacje neuronalne.

Dynamika wapnia może również ujawnić, w jaki sposób neurony przetwarzają sygnały ze świata zewnętrznego, na przykład zapachy.

W tym eksperymencie organy wykrywające feromony, pobrane z nosa myszy, hodowano in vitro. Neurony w obrębie tkanki inkubowano z Fura-2 i obrazowano podczas prezentacji substancji zapachowych, takich jak mocz lub oczyszczone feromony. Poprzez manipulację ekspresją białek receptorów zapachowych w neuronach węchowych możliwe jest bezpośrednie zobrazowanie, w jaki sposób pojedyncze białko wpływa na zdolność komórki do reagowania na konkretne zapachy.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do obrazowania wapnia w neuronach. W tym filmie omówiliśmy właściwości leżące u podstaw tej techniki oraz przeanalizowaliśmy typowy eksperyment.

Biorąc pod uwagę wiele istotnych funkcji wapnia, obrazowanie wapnia pozostanie kluczowym narzędziem w zrozumieniu neuronów oraz sposobów, w jakie oddziałują one na siebie nawzajem.

Dziękujemy za uwagę!