Obrazowanie wapnia jest niezwykle przydatną techniką do badania różnorodności ról, jakie jony wapnia odgrywają w funkcjonowaniu neuronów. Jony wapnia generują wiele sygnałów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują kluczowe funkcje, takie jak uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych. Metody obrazowania wapnia umożliwiają bezpośredni pomiar dynamicznego przepływu wapnia w neuronach i tkance neuronalnej. Ten film zawiera przegląd działania barwników wskaźnikowych wapnia, jak przeprowadza się eksperyment obrazowania wapnia, a na koniec omawia niektóre zastosowania tej techniki.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom biochemicznym barwników wskaźnikowych wapnia.
Barwniki wskaźnikowe wapnia to zmodyfikowane cząsteczki chelatora, takie jak Fura-2, które składają się z dwóch głównych składników. Pierwszym z nich jest miejsce chelatora, które wiąże wapń w sposób selektywny. Drugi to miejsce fluorescencyjne, które emituje światło o określonej długości fali, gdy jest oświetlone długością fali wzbudzenia światła ultrafioletowego.
Wiązanie wapnia z barwnikiem zmienia jego właściwości fluorescencyjne, co pozwala na ilościowe określenie zmian stężenia wapnia, które jest tutaj reprezentowane przez różnicę w intensywności fluorescencji emitowanej przez ten neuron przy dwóch różnych długościach fal wzbudzenia.
Większość barwników wskaźnikowych wapnia jest dalej modyfikowana, aby umożliwić im łatwe przenikanie przez błonę komórkową i jest wprowadzana do roztworu kąpieli z neuronami lub wstrzykiwana do tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia badań na całych zwierzętach.
Niektóre barwniki mają właściwości podwójnego wzbudzenia lub podwójnej emisji w zależności od tego, czy wapń jest związany, czy nie. Weźmy na przykład barwnik Fura-2, który ma inną długość fali wzbudzenia, gdy wapń jest związany, a inaczej, gdy nie jest. Biorąc pod uwagę stosunek intensywności emisji na dwóch długościach fal wzbudzenia, można dokonać znacznie dokładniejszego oszacowania stężenia wapnia.
Barwniki o podwójnym wzbudzeniu lub emisji, takie jak Fura-2, nazywane są ratiometrycznymi wskaźnikami wapnia. Istnieją barwniki nieratiometryczne, które mają pojedyncze długości fal wzbudzenia i emisji. Są jednak bardziej podatne na fotowybielanie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji przy długotrwałej ekspozycji na światło.
Kluczowym krokiem przed użyciem barwnika w eksperymencie jest kalibracja pomiarów fluorescencji pobranych z barwnika roztworami o znanych stężeniach wapnia. Umożliwi to naukowcom dokładne oszacowanie wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia na podstawie zmierzonych intensywności emisji podczas eksperymentów.
Teraz, gdy dowiedzieliśmy się, jak działają wskaźniki wapnia, przyjrzyjmy się, jak obrazować strumień wapnia w posiekanych neuronach.
Zacznij od przygotowania wybranego barwnika wskaźnikowego wapnia, takiego jak Fura-2, i wymieszania go z dodatkowymi roztworami fizjologicznymi. Odwiruj roztwór, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Po odpowiednim wymieszaniu przełóż do naczynia. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe z wyhodowanymi neuronami w naczyniu z roztworem barwnika. Następnie inkubuj neurony w ciemności przez wymagany czas w odpowiedniej temperaturze, która w tym przypadku wynosi 30 minut w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji przenieść szkiełko nakrywkowe do naczynia bez barwnika.
Następnym krokiem jest zamontowanie szkiełka nakrywkowego na komorze obrazowania mikroskopu. Po zamontowaniu podłącz linię wejściową systemu perfuzyjnego i powoli napełniaj komorę. Przymocuj komorę do stolika mikroskopu i zainstaluj wyjściowe linie perfuzyjne, zapewniając ciągły przepływ w całym systemie perfuzyjnym.
Teraz, gdy stolik mikroskopu jest gotowy, ustaw ostrość neuronów za pomocą światła widzialnego. Przetestuj barwnik, oświetlając komórki długościami fal 340 i 380 nm. Przypomnijmy, że w przypadku Fura-2 nieaktywowane neurony powinny emitować więcej światła, gdy są wzbudzone przez 380 nm, ponieważ wapń nie jest związany.
Następnie dostosuj ustawienia kamery, aby zoptymalizować zakres dynamiki przed rozpoczęciem eksperymentu. Zbierz obraz na każdej długości fali, a następnie użyj obszaru zainteresowania lub narzędzia ROI, aby zmierzyć intensywność tła na każdej długości fali. Wprowadź wartości tła do oprogramowania sterującego, aby można je było odjąć od kolejnych obrazów.
Po zakończeniu wstępnej konfiguracji wybierz około pięciu pól widzenia, które mają zostać zobrazowane na potrzeby eksperymentu i zapisz współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Podczas eksperymentu zautomatyzowany stolik przenosi się na pole, zbiera stosunek natężenia pola przy długościach fal 340 i 380 nm i przechodzi do następnego pola, aż wszystkie pola zostaną zebrane.
W niektórych eksperymentach do płynu perfuzyjnego dodaje się środek farmakologiczny, który powoduje zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Roztwór o wysokiej zawartości potasu, który depolaryzuje neurony, może powodować wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, jak pokazano na tej serii zdjęć poklatkowych i służy jako dobra kontrola pozytywna. Po zakończeniu zbierania danych przejdź do analizy.
Aby przeanalizować wyniki, wybierz interesujące obszary, które obejmują neurony lub części neuronów za pomocą oprogramowania. Następnie użyj oprogramowania do pomiaru proporcji intensywności obrazu z obu długości fal przy każdym ROI we wszystkich zebranych obrazach. Dzięki tym informacjom można dokonać ilościowej oceny zmian wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia w czasie.
Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób uzyskuje się obrazowanie wapnia w neuronach, przyjrzyjmy się niektórym sposobom, w jakie ta cenna metoda jest obecnie stosowana w badaniach.
Przede wszystkim obrazowanie wapnia służy do zbadania, w jaki sposób wewnątrzkomórkowy przepływ wapnia w stosunku do aktywności neuronalnej.
W tym badaniu poszczególne neurony wypełniono barwnikiem wskaźnikowym wapnia podczas rejestrowania patch-clamp. Precyzyjna kontrola potencjału błony, możliwa dzięki technice patch-clamp, zapewnia wgląd w dynamikę strumienia wapnia.
Obrazowanie wapnia umożliwia naukowcom zbadanie wysoce synchronicznej aktywności sieciowej neuronów.
W tym przypadku neuronaukowcy wykorzystali obrazowanie wapnia do oceny sygnału fluorescencyjnego 40 neuronów. Dzięki tym informacjom można określić właściwości sieci, takie jak propagacja sygnału i korelacje neuronalne.
Dynamika wapnia może również ujawnić, w jaki sposób neurony przetwarzają sygnały ze świata zewnętrznego, takie jak zapachy.
W tym eksperymencie narządy wyczuwające feromony pobrane z nosa myszy zostały wyhodowane w kulturze. Neurony w tkance inkubowano z Fura-2 i obrazowano podczas prezentacji z substancjami zapachowymi, takimi jak mocz lub oczyszczone feromony. Manipulując ekspresją białek receptora zapachowego w neuronach węchowych, możliwe jest bezpośrednie zobrazowanie, w jaki sposób pojedyncze białko wpływa na zdolność komórki do reagowania na unikalne zapachy.
Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do obrazowania wapnia w neuronach. W tym filmie omówiliśmy właściwości stojące za tą techniką i przyjrzeliśmy się typowemu eksperymentowi.
Biorąc pod uwagę wiele ważnych ról wapnia, obrazowanie wapnia pozostanie istotnym narzędziem w zrozumieniu neuronów i ich wzajemnych interakcji.
Dzięki za oglądanie!
Jony wapnia odgrywają integralną rolę w funkcjonowaniu neuronów: działają jak sygnały wewnątrzkomórkowe, które mogą wywoływać reakcje, takie jak zmien…
Obrazowanie wapnia jest niezwykle przydatną techniką do badania różnorodności ról, jakie jony wapnia odgrywają w funkcjonowaniu neuronów. Jony wapnia generują wiele sygnałów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują kluczowe funkcje, takie jak uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych. Metody obrazowania wapnia umożliwiają bezpośredni pomiar dynamicznego przepływu wapnia w neuronach i tkance neuronalnej. Ten film zawiera przegląd działania barwników wskaźnikowych wapnia, jak przeprowadza się eksperyment obrazowania wapnia, a na koniec omawia niektóre zastosowania tej techniki.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom biochemicznym barwników wskaźnikowych wapnia.
Barwniki wskaźnikowe wapnia to zmodyfikowane cząsteczki chelatora, takie jak Fura-2, które składają się z dwóch głównych składników. Pierwszym z nich jest miejsce chelatora, które wiąże wapń w sposób selektywny. Drugi to miejsce fluorescencyjne, które emituje światło o określonej długości fali, gdy jest oświetlone długością fali wzbudzenia światła ultrafioletowego.
Wiązanie wapnia z barwnikiem zmienia jego właściwości fluorescencyjne, co pozwala na ilościowe określenie zmian stężenia wapnia, które jest tutaj reprezentowane przez różnicę w intensywności fluorescencji emitowanej przez ten neuron przy dwóch różnych długościach fal wzbudzenia.
Większość barwników wskaźnikowych wapnia jest dalej modyfikowana, aby umożliwić im łatwe przenikanie przez błonę komórkową i jest wprowadzana do roztworu kąpieli z neuronami lub wstrzykiwana do tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia badań na całych zwierzętach.
Niektóre barwniki mają właściwości podwójnego wzbudzenia lub podwójnej emisji w zależności od tego, czy wapń jest związany, czy nie. Weźmy na przykład barwnik Fura-2, który ma inną długość fali wzbudzenia, gdy wapń jest związany, a inaczej, gdy nie jest. Biorąc pod uwagę stosunek intensywności emisji na dwóch długościach fal wzbudzenia, można dokonać znacznie dokładniejszego oszacowania stężenia wapnia.
Barwniki o podwójnym wzbudzeniu lub emisji, takie jak Fura-2, nazywane są ratiometrycznymi wskaźnikami wapnia. Istnieją barwniki nieratiometryczne, które mają pojedyncze długości fal wzbudzenia i emisji. Są jednak bardziej podatne na fotowybielanie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji przy długotrwałej ekspozycji na światło.
Kluczowym krokiem przed użyciem barwnika w eksperymencie jest kalibracja pomiarów fluorescencji pobranych z barwnika roztworami o znanych stężeniach wapnia. Umożliwi to naukowcom dokładne oszacowanie wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia na podstawie zmierzonych intensywności emisji podczas eksperymentów.
Teraz, gdy dowiedzieliśmy się, jak działają wskaźniki wapnia, przyjrzyjmy się, jak obrazować strumień wapnia w posiekanych neuronach.
Zacznij od przygotowania wybranego barwnika wskaźnikowego wapnia, takiego jak Fura-2, i wymieszania go z dodatkowymi roztworami fizjologicznymi. Odwiruj roztwór, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Po odpowiednim wymieszaniu przełóż do naczynia. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe z wyhodowanymi neuronami w naczyniu z roztworem barwnika. Następnie inkubuj neurony w ciemności przez wymagany czas w odpowiedniej temperaturze, która w tym przypadku wynosi 30 minut w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji przenieść szkiełko nakrywkowe do naczynia bez barwnika.
Następnym krokiem jest zamontowanie szkiełka nakrywkowego na komorze obrazowania mikroskopu. Po zamontowaniu podłącz linię wejściową systemu perfuzyjnego i powoli napełniaj komorę. Przymocuj komorę do stolika mikroskopu i zainstaluj wyjściowe linie perfuzyjne, zapewniając ciągły przepływ w całym systemie perfuzyjnym.
Teraz, gdy stolik mikroskopu jest gotowy, ustaw ostrość neuronów za pomocą światła widzialnego. Przetestuj barwnik, oświetlając komórki długościami fal 340 i 380 nm. Przypomnijmy, że w przypadku Fura-2 nieaktywowane neurony powinny emitować więcej światła, gdy są wzbudzone przez 380 nm, ponieważ wapń nie jest związany.
Następnie dostosuj ustawienia kamery, aby zoptymalizować zakres dynamiki przed rozpoczęciem eksperymentu. Zbierz obraz na każdej długości fali, a następnie użyj obszaru zainteresowania lub narzędzia ROI, aby zmierzyć intensywność tła na każdej długości fali. Wprowadź wartości tła do oprogramowania sterującego, aby można je było odjąć od kolejnych obrazów.
Po zakończeniu wstępnej konfiguracji wybierz około pięciu pól widzenia, które mają zostać zobrazowane na potrzeby eksperymentu i zapisz współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Podczas eksperymentu zautomatyzowany stolik przenosi się na pole, zbiera stosunek natężenia pola przy długościach fal 340 i 380 nm i przechodzi do następnego pola, aż wszystkie pola zostaną zebrane.
W niektórych eksperymentach do płynu perfuzyjnego dodaje się środek farmakologiczny, który powoduje zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Roztwór o wysokiej zawartości potasu, który depolaryzuje neurony, może powodować wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, jak pokazano na tej serii zdjęć poklatkowych i służy jako dobra kontrola pozytywna. Po zakończeniu zbierania danych przejdź do analizy.
Aby przeanalizować wyniki, wybierz interesujące obszary, które obejmują neurony lub części neuronów za pomocą oprogramowania. Następnie użyj oprogramowania do pomiaru proporcji intensywności obrazu z obu długości fal przy każdym ROI we wszystkich zebranych obrazach. Dzięki tym informacjom można dokonać ilościowej oceny zmian wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia w czasie.
Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób uzyskuje się obrazowanie wapnia w neuronach, przyjrzyjmy się niektórym sposobom, w jakie ta cenna metoda jest obecnie stosowana w badaniach.
Przede wszystkim obrazowanie wapnia służy do zbadania, w jaki sposób wewnątrzkomórkowy przepływ wapnia w stosunku do aktywności neuronalnej.
W tym badaniu poszczególne neurony wypełniono barwnikiem wskaźnikowym wapnia podczas rejestrowania patch-clamp. Precyzyjna kontrola potencjału błony, możliwa dzięki technice patch-clamp, zapewnia wgląd w dynamikę strumienia wapnia.
Obrazowanie wapnia umożliwia naukowcom zbadanie wysoce synchronicznej aktywności sieciowej neuronów.
W tym przypadku neuronaukowcy wykorzystali obrazowanie wapnia do oceny sygnału fluorescencyjnego 40 neuronów. Dzięki tym informacjom można określić właściwości sieci, takie jak propagacja sygnału i korelacje neuronalne.
Dynamika wapnia może również ujawnić, w jaki sposób neurony przetwarzają sygnały ze świata zewnętrznego, takie jak zapachy.
W tym eksperymencie narządy wyczuwające feromony pobrane z nosa myszy zostały wyhodowane w kulturze. Neurony w tkance inkubowano z Fura-2 i obrazowano podczas prezentacji z substancjami zapachowymi, takimi jak mocz lub oczyszczone feromony. Manipulując ekspresją białek receptora zapachowego w neuronach węchowych, możliwe jest bezpośrednie zobrazowanie, w jaki sposób pojedyncze białko wpływa na zdolność komórki do reagowania na unikalne zapachy.
Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do obrazowania wapnia w neuronach. W tym filmie omówiliśmy właściwości stojące za tą techniką i przyjrzeliśmy się typowemu eksperymentowi.
Biorąc pod uwagę wiele ważnych ról wapnia, obrazowanie wapnia pozostanie istotnym narzędziem w zrozumieniu neuronów i ich wzajemnych interakcji.
Dzięki za oglądanie!
Obrazowanie wapnia jest niezwykle przydatną techniką do badania różnorodności ról, jakie jony wapnia odgrywają w funkcjonowaniu neuronów. Jony wapnia generują wiele sygnałów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują kluczowe funkcje, takie jak uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych. Metody obrazowania wapnia umożliwiają bezpośredni pomiar dynamicznego przepływu wapnia w neuronach i tkance neuronalnej. Ten film zawiera przegląd działania barwników wskaźnikowych wapnia, jak przeprowadza się eksperyment obrazowania wapnia, a na koniec omawia niektóre zastosowania tej techniki.
Najpierw przyjrzyjmy się zasadom biochemicznym barwników wskaźnikowych wapnia.
Barwniki wskaźnikowe wapnia to zmodyfikowane cząsteczki chelatora, takie jak Fura-2, które składają się z dwóch głównych składników. Pierwszym z nich jest miejsce chelatora, które wiąże wapń w sposób selektywny. Drugi to miejsce fluorescencyjne, które emituje światło o określonej długości fali, gdy jest oświetlone długością fali wzbudzenia światła ultrafioletowego.
Wiązanie wapnia z barwnikiem zmienia jego właściwości fluorescencyjne, co pozwala na ilościowe określenie zmian stężenia wapnia, które jest tutaj reprezentowane przez różnicę w intensywności fluorescencji emitowanej przez ten neuron przy dwóch różnych długościach fal wzbudzenia.
Większość barwników wskaźnikowych wapnia jest dalej modyfikowana, aby umożliwić im łatwe przenikanie przez błonę komórkową i jest wprowadzana do roztworu kąpieli z neuronami lub wstrzykiwana do tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia badań na całych zwierzętach.
Niektóre barwniki mają właściwości podwójnego wzbudzenia lub podwójnej emisji w zależności od tego, czy wapń jest związany, czy nie. Weźmy na przykład barwnik Fura-2, który ma inną długość fali wzbudzenia, gdy wapń jest związany, a inaczej, gdy nie jest. Biorąc pod uwagę stosunek intensywności emisji na dwóch długościach fal wzbudzenia, można dokonać znacznie dokładniejszego oszacowania stężenia wapnia.
Barwniki o podwójnym wzbudzeniu lub emisji, takie jak Fura-2, nazywane są ratiometrycznymi wskaźnikami wapnia. Istnieją barwniki nieratiometryczne, które mają pojedyncze długości fal wzbudzenia i emisji. Są jednak bardziej podatne na fotowybielanie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji przy długotrwałej ekspozycji na światło.
Kluczowym krokiem przed użyciem barwnika w eksperymencie jest kalibracja pomiarów fluorescencji pobranych z barwnika roztworami o znanych stężeniach wapnia. Umożliwi to naukowcom dokładne oszacowanie wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia na podstawie zmierzonych intensywności emisji podczas eksperymentów.
Teraz, gdy dowiedzieliśmy się, jak działają wskaźniki wapnia, przyjrzyjmy się, jak obrazować strumień wapnia w posiekanych neuronach.
Zacznij od przygotowania wybranego barwnika wskaźnikowego wapnia, takiego jak Fura-2, i wymieszania go z dodatkowymi roztworami fizjologicznymi. Odwiruj roztwór, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Po odpowiednim wymieszaniu przełóż do naczynia. Teraz umieść szkiełko nakrywkowe z wyhodowanymi neuronami w naczyniu z roztworem barwnika. Następnie inkubuj neurony w ciemności przez wymagany czas w odpowiedniej temperaturze, która w tym przypadku wynosi 30 minut w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji przenieść szkiełko nakrywkowe do naczynia bez barwnika.
Następnym krokiem jest zamontowanie szkiełka nakrywkowego na komorze obrazowania mikroskopu. Po zamontowaniu podłącz linię wejściową systemu perfuzyjnego i powoli napełniaj komorę. Przymocuj komorę do stolika mikroskopu i zainstaluj wyjściowe linie perfuzyjne, zapewniając ciągły przepływ w całym systemie perfuzyjnym.
Teraz, gdy stolik mikroskopu jest gotowy, ustaw ostrość neuronów za pomocą światła widzialnego. Przetestuj barwnik, oświetlając komórki długościami fal 340 i 380 nm. Przypomnijmy, że w przypadku Fura-2 nieaktywowane neurony powinny emitować więcej światła, gdy są wzbudzone przez 380 nm, ponieważ wapń nie jest związany.
Następnie dostosuj ustawienia kamery, aby zoptymalizować zakres dynamiki przed rozpoczęciem eksperymentu. Zbierz obraz na każdej długości fali, a następnie użyj obszaru zainteresowania lub narzędzia ROI, aby zmierzyć intensywność tła na każdej długości fali. Wprowadź wartości tła do oprogramowania sterującego, aby można je było odjąć od kolejnych obrazów.
Po zakończeniu wstępnej konfiguracji wybierz około pięciu pól widzenia, które mają zostać zobrazowane na potrzeby eksperymentu i zapisz współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Podczas eksperymentu zautomatyzowany stolik przenosi się na pole, zbiera stosunek natężenia pola przy długościach fal 340 i 380 nm i przechodzi do następnego pola, aż wszystkie pola zostaną zebrane.
W niektórych eksperymentach do płynu perfuzyjnego dodaje się środek farmakologiczny, który powoduje zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Roztwór o wysokiej zawartości potasu, który depolaryzuje neurony, może powodować wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, jak pokazano na tej serii zdjęć poklatkowych i służy jako dobra kontrola pozytywna. Po zakończeniu zbierania danych przejdź do analizy.
Aby przeanalizować wyniki, wybierz interesujące obszary, które obejmują neurony lub części neuronów za pomocą oprogramowania. Następnie użyj oprogramowania do pomiaru proporcji intensywności obrazu z obu długości fal przy każdym ROI we wszystkich zebranych obrazach. Dzięki tym informacjom można dokonać ilościowej oceny zmian wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia w czasie.
Teraz, gdy już wiesz, w jaki sposób uzyskuje się obrazowanie wapnia w neuronach, przyjrzyjmy się niektórym sposobom, w jakie ta cenna metoda jest obecnie stosowana w badaniach.
Przede wszystkim obrazowanie wapnia służy do zbadania, w jaki sposób wewnątrzkomórkowy przepływ wapnia w stosunku do aktywności neuronalnej.
W tym badaniu poszczególne neurony wypełniono barwnikiem wskaźnikowym wapnia podczas rejestrowania patch-clamp. Precyzyjna kontrola potencjału błony, możliwa dzięki technice patch-clamp, zapewnia wgląd w dynamikę strumienia wapnia.
Obrazowanie wapnia umożliwia naukowcom zbadanie wysoce synchronicznej aktywności sieciowej neuronów.
W tym przypadku neuronaukowcy wykorzystali obrazowanie wapnia do oceny sygnału fluorescencyjnego 40 neuronów. Dzięki tym informacjom można określić właściwości sieci, takie jak propagacja sygnału i korelacje neuronalne.
Dynamika wapnia może również ujawnić, w jaki sposób neurony przetwarzają sygnały ze świata zewnętrznego, takie jak zapachy.
W tym eksperymencie narządy wyczuwające feromony pobrane z nosa myszy zostały wyhodowane w kulturze. Neurony w tkance inkubowano z Fura-2 i obrazowano podczas prezentacji z substancjami zapachowymi, takimi jak mocz lub oczyszczone feromony. Manipulując ekspresją białek receptora zapachowego w neuronach węchowych, możliwe jest bezpośrednie zobrazowanie, w jaki sposób pojedyncze białko wpływa na zdolność komórki do reagowania na unikalne zapachy.
Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do obrazowania wapnia w neuronach. W tym filmie omówiliśmy właściwości stojące za tą techniką i przyjrzeliśmy się typowemu eksperymentowi.
Biorąc pod uwagę wiele ważnych ról wapnia, obrazowanie wapnia pozostanie istotnym narzędziem w zrozumieniu neuronów i ich wzajemnych interakcji.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How do calcium indicator dyes work to measure neuronal calcium levels?
Calcium indicator dyes like Fura-2 are modified chelator molecules with two main components: a chelator site that selectively binds calcium ions and a fluorescent site that emits light when illuminated. When calcium binds to the dye, it alters the fluorescence properties, allowing scientists to quantify changes in calcium concentration by measuring differences in fluorescent intensity at specific wavelengths.
Q2: What is the difference between ratiometric and non-ratiometric calcium indicators?
Ratiometric calcium indicators like Fura-2 have dual excitation or emission properties that change depending on whether calcium is bound, enabling precise calcium concentration estimates by taking the ratio of emission intensities at two wavelengths. Non-ratiometric dyes with single excitation and emission wavelengths are simpler but more susceptible to photobleaching, the weakening or loss of fluorescence with prolonged light exposure.
Q3: Why is calibration important before conducting a calcium imaging experiment?
Calibration involves measuring fluorescence from solutions with known calcium concentrations, establishing a standard curve that allows scientists to accurately estimate intracellular calcium concentrations based on measured emission intensities during experiments. This critical step ensures that the fluorescent signals collected directly correlate to actual calcium levels within neurons.
Q4: What are the key steps in preparing neurons for calcium imaging?
Prepare the calcium indicator dye and mix it with physiological solutions, then incubate cultured neurons in the dye solution in the dark at appropriate temperature, typically 30 minutes at 37°C. After incubation, transfer the coverslip to a dish without dye, mount it onto the microscope imaging chamber, connect the perfusion system, and optimize camera settings before data collection begins.
Q5: How does patch clamp electrophysiology complement calcium imaging studies?
Patch clamp electrophysiology provides precise control of neuronal membrane potential, enabling researchers to correlate specific electrical states with calcium dynamics. When individual neurons are simultaneously filled with calcium indicator dye and patch-clamp recorded, scientists gain detailed insight into how membrane potential changes influence intracellular calcium flux dynamics.
Q6: What can calcium imaging reveal about neuronal network activity?
Calcium imaging enables researchers to assess fluorescent signals from multiple neurons simultaneously, allowing determination of network properties such as signal propagation and neural correlations. By imaging 40 or more neurons at once, scientists can visualize the highly synchronous network activity that occurs during coordinated neuronal communication and information processing.
Q7: How is calcium imaging used to study sensory processing in neurons?
Researchers incubate sensory tissue with calcium indicator dyes like Fura-2 and image neurons while presenting specific stimuli such as odorants or pheromones. By manipulating the expression of sensory receptor proteins and visualizing resulting calcium responses, scientists can directly determine how individual proteins influence a cell's ability to detect and respond to external signals from the environment.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:49
Biochemistry of Calcium Indicator Dyes
3:03
Procedure for Calcium Imaging in Neurons
6:33
Applications
8:11
Summary
Videos from this collection: