Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie względnych zmian poziomu białka w centrosomach w różnych warunkach. Na przykład w określonym momencie cyklu komórkowego po zahamowaniu proteasomu osiąga się to poprzez traktowanie komórek rosnących na szkiełkach nakrywkowych inhibitorem proteasomu MG one 15 lub rozpuszczalnikiem kontrolnym DMSO. Następnie natychmiast dodaje BRDU do obu komórek i inkubuje je przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Drugim krokiem jest przeniesienie szkiełek nakrywkowych na płytkę 24-dołkową w celu utrwalenia komórek. Następnie komórki są barwione przeciwciałami przeciwko BRDU i białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Ostatnim krokiem jest uzyskanie obrazów komórek BRDU dodatnich za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania cyfrowego w celu zastosowania identycznego czasu ekspozycji i długości osi Z do komórek z każdej próbki.