Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie względnych zmian poziomu białka w centrosomach w różnych warunkach. Na przykład w określonym momencie cyklu komórkowego po zahamowaniu proteasomu osiąga się to poprzez traktowanie komórek rosnących na szkiełkach nakrywkowych inhibitorem proteasomu MG one 15 lub rozpuszczalnikiem kontrolnym DMSO. Następnie natychmiast dodaje BRDU do obu komórek i inkubuje je przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Drugim krokiem jest przeniesienie szkiełek nakrywkowych na płytkę 24-dołkową w celu utrwalenia komórek. Następnie komórki są barwione przeciwciałami przeciwko BRDU i białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Ostatnim krokiem jest uzyskanie obrazów komórek BRDU dodatnich za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania cyfrowego w celu zastosowania identycznego czasu ekspozycji i długości osi Z do komórek z każdej próbki.

Następnie analiza obrazów w celu ilościowego określenia względnego poziomu romal VDA C3. Ostatecznie ilościowa mikroskopia immunofluorescencyjna jest stosowana w celu wykazania, że pula somalna Centro VDA C3 zwiększa się dwukrotnie, gdy proteasom jest hamowany podczas fazy S. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, immunoblotting lub mikroskop ilościowy, jest to, że technika ta analizuje względny poziom białka w dwóch różnie traktowanych próbkach, które są przetwarzane na dwóch różnych szkiełkach nakrywkowych. Metoda ta wykorzystuje normalizację do wzorca wewnętrznego w celu kontroli potrzeby przetworzenia dwóch eksperymentalnych populacji komórek.

Oddzielnie, chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w regulację określonych białek w centrosomach. Może być również stosowany w innych sytuacjach, takich jak inne struktury subkomórkowe lub badanie określonych pul białek, które znajdują się w wielu miejscach w komórce. Procedurę zademonstruje schu majumder, doktor habilitowany z mojego laboratorium Aby rozpocząć eksperyment przechodząc dwa razy 10 do piątego asynchronicznie hodując RPE jedną komórkę do wcześniej przygotowanych 35-milimetrowych szalek z wargami zakrywającymi i hoduj komórki w dwóch mililitrach kompletnego podłoża.

Wymieniaj pożywkę co 24 godziny na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę Po 44 godzinach. Zastąp pożywkę hodowlaną kompletną pożywką zawierającą 0,05% DMSO lub MG one 15 o końcowym stężeniu pięciu mikromolowców i jednocześnie dodaj BRDU do komórek o końcowym stężeniu 40 mikromolowców, inkubuj komórki przez cztery godziny. Następnie przenieś każde szkiełko nakrywkowe na płytkę 24-dołkową.

Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie wyhodowanego metanolu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby utrwalić komórki. Po 10 minutach natychmiast umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu do mycia. Inkubować utrwalone komórki na pokrywie, wsuwa 200 mikrolitrów buforu blokującego na 30 minut, podczas gdy komórki są w inkubacji.

Przygotuj nawilżoną komorę, umieszczając mokry ręcznik papierowy w dolnej połowie pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów. Połóż pasek perfum na powierzchni stojaka i dodaj 20 mikrolitrów kropli królika anty V DDA three i mysiego przeciwciała anty gamma tubuliny rozcieńczonego w buforze blokującym na paraformę. Po zablokowaniu odwrócić szkiełko nakrywkowe na każdą kroplę roztworu przeciwciała.

Upewnij się, że komórki są zanurzone i zamknij pokrywę pudełka na końcówki. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Ponownie odwróć szkiełka nakrywkowe i zwróć je do 24.

Dobrze umyj szkiełka nakrywkowe, a następnie inkubuj je w 150 mikrolitrowym roztworze przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczonym w buforze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie buforem do mycia. Napraw poplamione ogniwa RPE one za pomocą 500 mikrolitrów metanolu schłodzonego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po utrwaleniu komórek przez 10 minut umyj je trzykrotnie w buforze do mycia.

Następnie inkubuj komórki w 200 mikrolitrach dwóch normalnych HCL przez 30 minut. W temperaturze pokojowej zneutralizuj komórki 300 mikrolitrami jednego molowca tris CL pH osiem i umyj komórki trzy razy. Za pomocą buforu płuczącego zablokuj komórki 200 mikrolitrami buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po zablokowaniu inkubować komórki ze szczurzym przeciwciałem anty BRDU i buforem blokującym przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Zwróć slajdy okładki z powrotem do 24. Dobrze umyj naczynia i umyj komórki.

Następnie inkubuj je z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w 150 mikrolitrach buforu blokującego. W naczyniu z 24 dołkami przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie jednym punktem XPBS, sześciolitrową kroplą roztworu montażowego zawierającego odczynnik Antifa na szklanym mikroskopie.

Wsuń szkiełko nakrywkowe stroną z ogniwem skierowaną w dół na roztwór montażowy. Za pomocą miękkiej chusteczki czyszczącej delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu, uszczelnij szkiełko nakrywkowe na mikroskopie. Przesuń, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Użyj obiektywu zanurzeniowego 100 x plan APO z aperturą numeryczną 1,4, aby uzyskać obrazy BRDU dodatnich komórek RPE one w temperaturze pokojowej. Określ odpowiednią górną i dolną płaszczyznę ogniskowej wzdłuż osi Z z krokiem 0,2 mikrona i uzyskaj obrazy wzdłuż osi Z. Następnie wykonaj dekonwolucję wszystkich stosów obrazów uzyskanych wzdłuż osi Z.

Uzyskaj projekcję całkowitej intensywności każdego obrazu. Ułóż wzdłuż osi Z dla komórek, których centrosomy są oddalone od siebie o mniej niż dwa mikrony. Narysuj mały kwadrat o długości od 20 do 30 pikseli z każdej strony wokół obu centrosomów i zaznacz wybrany obszar.

Narysuj większy kwadrat o wymiarach od 24 do 35 pikseli z każdej strony wokół pierwszego kwadratu i zaznacz zaznaczony obszar dużego kwadratu. Następnie uzyskaj powierzchnię i całkowitą intensywność fluorescencji każdego fluoro czterech. W każdej rubryce oblicz intensywność fluorescencji każdego fluorescencji skorygowaną o tło. Cztery.

Na koniec uzyskaj znormalizowaną intensywność fluorescencji VDA C3, obliczając stosunek skorygowanej intensywności fluorescencji tła jego fluoru. Cztery do tego z fluoro, cztery użyte do wybranych obrazów wzorca wewnętrznego zostały uchwycone na losowych polach asynchronicznie rosnących komórek RPE one inkubowanych z BRDU i inhibitorem proteasomu MG one 15 lub rozpuszczalnikiem kontrolnym DMSO i wyświetlały DNA i BRDU. Tło skorygowane o intensywność fluorescencji odpowiadającą Centro Somal.

VD 3 był około 2,5 razy wyższy w MG 1 15 leczonych komórkach niż w komórkach kontrolnych, jak pokazano na tym schemacie ramki i wąsów. Kiedy dane zostały znormalizowane dla całkowitej fluorescencji VD 3 w porównaniu z fluorescencją tubuliny gamma, fałd zwiększył się, nieznacznie spadł do około dwukrotności. Hamowanie proteasomu nie miało wpływu na barwienie VD C3 na cytach nieromalnych ani na całkowity poziom komórkowy VD 3.

W ten sposób pula romalna VDA C3 jest regulowana przez degradację za pośrednictwem proteasomu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przeciwciała przeciwko białku testowemu i wzorzec wewnętrzny muszą być podwyższone u różnych gatunków gospodarzy oraz że obrazy obu próbek powinny być uzyskane przy użyciu identycznych parametrów obrazowania, takich jak liczba cesarskich cięć i czasy ekspozycji, w celu zminimalizowania efektu obrazowania cyfrowego.