Name: Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmian poziomów białek w centrosomach komórek RPE1. Ta metoda wykorzystuje normalizację do wewnętrznego standardu gamma-tubuliny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health (GM77311) oraz grant zalążkowy od The Ohio Cancer Research Associates (dla H.A.F.). SM był częściowo wspierany przez stypendium Up on the Roof z Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Użyj ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z odwrotną transkryptazą telomerazy (hTERT) (hTERT-RPE1; określanych tutaj jako RPE1). 
	UWAGA: Komórki RPE1 to prawie diploidalne, nieprzekształcone komórki ludzkie, które są powszechnie używane do badania składania centrioli i ciliogenezy. Komórki te podlegają normalnemu cyklowi duplikacji centrioli skoordynowanemu z regulowanym cyklem komórkowym.</li>
	<li>Przejście przez prawie zlewające się 100 mm naczynie do hodowli komórkowej komórek RPE1 w rozcieńczeniu 1:5 oryginalnej kultury do świeżej 100 mm pożywki zawierającej 10 ml pożywki DME/F-12 (1:1) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny (kompletna pożywka jest określana jako pożywka DME/F-12). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Inkubować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w 50 ml 1 N HCl w zakrytej szklanej zlewce, O/N bez wstrząsania, w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej lub inkubatorze.</li>
		<li>Po odrzuceniu roztworu kwasu, przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie w 100 ml wody destylowanej, inkubując przez 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Powtórz pranie podobnie w 70% etanolu i 95% etanolu.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełka nakrywkowe, rozprowadzając je pojedynczo na bibułce laboratoryjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie sterylizować promieniowaniem UV przez 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 2-4 suche szkiełka nakrywkowe w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm. Rozcieńczyć roztwór fibronektyny lub polimeru podobnego do fibronektyny (stężenie podstawowe 1 mg/ml) do stężenia 25 μg/ml w PBS hodowli komórkowej.
	<ol>
		<li>Umieścić 80-100 μl rozcieńczonego roztworu na każdym szkiełku nakrywkowym i inkubować przez 60 minut, aby pokryć wierzchnią stronę szkiełka nakrywkowego. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie za pomocą PBS przed dodaniem pełnego podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek i leczenie komórek inhibitorami proteasomów
<ol>
	<li>Pasaż 2 x 105 asynchronicznie rosnących komórek RPE1 w każdej 35-milimetrowej szalce zawierającej szkiełka nakrywkowe i hodować komórki w 2 ml kompletnej pożywki. Pożywkę należy wymieniać co 24 godziny na świeżą, wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować wpływ hamowania proteasomu na poziom centrosomalny badanego białka (w tym przypadku VDAC3 lub γ-tubuliny), należy hodować komórki na dwóch szalkach o średnicy 35 mm przez 44 godziny. Zastąp pożywkę kompletną pożywką i dodaj MG115 lub DMSO jako rozpuszczalnik kontrolny o końcowym stężeniu odpowiednio 5 μM lub 0,05%. W tym samym czasie dodać BrdU do komórek w końcowym stężeniu 40 μM i inkubować komórki przez 4 godziny.</li>
		<li>Przenieść każde szkiełko nakrywkowe do płytki 24-dołkowej. Dodać 500 μl schłodzonego metanolu do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze -20 °C przez 10 minut w celu utrwalenia komórek na szkiełkach nakrywkowych. Szkiełka nakrywkowe należy natychmiast trzykrotnie zmyć 500 μl buforu do przemywania (1x PBS zawierający 0,5 mM MgCl2 i 0,05% Triton-X 100).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać pozostałe komórki z szalki o średnicy 35 mm i odwirować komórki w sile 1 000 x g przez 5 minut. Użyj osadu komórkowego do analizy całkowitego białka metodą western blot (krok 6).</li>
</ol>
3. Test BrdU Pulse i Chase do analizy poziomów białek w różnych fazach cyklu komórkowego
<ol>
	<li>Aby przeanalizować zmienność poziomu białka (tutaj VDAC3, Sas6 lub Cep135) w centrosomach w różnych fazach cyklu komórkowego, hoduj komórki na dwóch 35-milimetrowych szalkach zawierających szkiełka nakrywkowe przez 44 godziny. Zastąp pożywkę hodowlaną kompletną pożywką zawierającą 40 μM BrdU i inkubuj komórki przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Z jednego naczynia przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę 24-dołkową w celu utrwalenia komórek za pomocą schłodzonego metanolu, jak opisano w kroku 2.1.2.</li>
	<li>Po 4-godzinnym impulsie BrdU usuń pożywkę zawierającą BrdU, umyj komórki raz PBS i raz kompletną pożywką, dodaj świeżą pożywkę, a następnie hoduj komórki pod nieobecność BrdU przez różne czasy (zwykle kolejne 4 godziny dla komórek RPE1) przed utrwaleniem komórek zgodnie z opisem w kroku 2.1.2. 
	UWAGA: W przypadku komórek RPE1 większość komórek BrdU-dodatnich znajduje się w późnej fazie S lub G2 po 4-godzinnym pościgu. Należy to określić niezależnie dla każdego typu komórki.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Inkubować utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych w 200 μl buforu blokującego (2% BSA i 0,1% TritonX-100 w 1x PBS) przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał (zazwyczaj jednego hodowanego u królika, a drugiego hodowanego u myszy) rozcieńczonego w buforze blokującym O/N w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Aby przygotować nawilżoną komorę, umieść mokry ręcznik papierowy w dolnej połowie pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1,000 μl. Położyć pasek Parafilmu na powierzchni stojaka i nanieść kropelkę (15-20 μl) roztworu przeciwciała na Parafilm na każde szkiełko nakrywkowe, które ma być inkubowane. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na kroplę roztworu przeciwciała (tak, aby komórki były zanurzone) i zamknąć pokrywę pudełka z końcówką.</li>
		<li>Ponownie odwróć szkiełka nakrywkowe i włóż je z powrotem do naczynia 24-dołkowego. Umyć szkiełka nakrywkowe, a następnie inkubować je w 150 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych (tutaj barwnik zielonofluorescencyjny sprzężony z barwnikiem anty-króliczym i barwnik czerwono-fluorescencyjny sprzężony z barwnikiem anty-myszym, rozcieńczony w buforze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze słonecznej. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy. 
		UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem są wrażliwe na światło. Chronić próbki przed światłem podczas wykonywania czynności 4.1.3–5.1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować się do barwienia anty-BrdU, ponownie utrwalając wybarwione komórki RPE1 za pomocą 500 μl schłodzonego metanolu w temperaturze -20 °C przez 10 minut, jak opisano w kroku 2.1.2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie. 
	UWAGA: To utrwalenie zabezpiecza pierwszorzędowe i wtórne znakowanie przeciwciał białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu hydrolizy kwasowej w następnym etapie.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki w 200 μl 2 N HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zneutralizować 300 μl 1 M Tris-Cl, pH 8 i przemyć komórki trzykrotnie za pomocą buforu do przemywania wodą.</li>
		<li>Ponownie zablokować komórki za pomocą buforu blokującego o pojemności 200 μl na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować komórki z szczurzym przeciwciałem anty-BrdU (rozcieńczonym w buforze blokującym) przez 45 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem w naczyniu 24-dołkowym, umyć je, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko szczurom sprzężonym z barwnikiem niebiesko-fluorescencyjnym (rozcieńczonym w 150 μl buforu blokującego w naczyniu 24-dołkowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy. Na szklanym szkiełku mikroskopowym narysować kroplę (około 3-6 μl) roztworu montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu. Odwróć szkiełko nakrywkowe, stroną z komórką skierowaną w dół, na roztwór montażowy. Wytrzyj nadmiar płynu, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą miękkiej chusteczki czyszczącej. Nałóż przezroczysty lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić go na szkiełku mikroskopowym.</li>
</ol>
5. Akwizycja i analiza obrazu immunofluorescencji
<ol>
	<li>Użyj obiektywu zanurzeniowego 100X Plan Apo (z aperturą numeryczną 1.4), aby uzyskać obrazy komórek BrdU-dodatnich RPE1 w temperaturze otoczenia.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko na mikroskopie (patrz wyposażenie) dołączonym do aparatu zdolnego do obrazowania cyfrowego. Dla każdego fluoroforu określ odpowiedni czas ekspozycji (zwykle między 300-1,000 ms), ręcznie badając wszystkie próbki eksperymentu. Przed uzyskaniem obrazów komórki należy ręcznie określić odpowiednią górną i dolną płaszczyznę ogniskowej wzdłuż osi Z (zwykle rozmiar kroku 0,2 μm). Uzyskuj obrazy różnych próbek, które znajdują się na oddzielnych szkiełkach nakrywkowych, przy użyciu identycznego czasu naświetlania dla różnych fluoroforów wzdłuż osi Z, korzystając z pakietu oprogramowania do obrazowania mikroskopii cyfrowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj dekonwolucję (w tych przypadkach przy użyciu algorytmu No neighbor) wszystkich stosów obrazów uzyskanych wzdłuż osi Z.
	<ol>
		<li>Uzyskaj projekcję całkowitej intensywności każdego stosu obrazów wzdłuż osi Z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W komórkach, w których centrosomy są blisko siebie (odległość między dwoma centrosomami jest mniejsza niż 2 μm), narysuj mały kwadrat (zwykle 20-30 pikseli z każdej strony) wokół obu centrosomów i zaznacz wybrany obszar.
	<ol>
		<li>Narysuj większy kwadrat (zwykle 24-35 pikseli na bok) otaczający pierwszy kwadrat i zaznacz zaznaczony obszar dużego kwadratu.</li>
		<li>Uzyskaj powierzchnię (A) i całkowitą intensywność fluorescencji (F) każdego fluoroforu w każdym pudełku (S oznacza małe pudełko, a L oznacza duże pudełko).</li>
		<li>Przeanalizuj skorygowaną intensywność fluorescencji tła każdego fluoroforu przy użyciu wzoru opisanego przez Howella i wsp. 29: F= FS – [( FL– FS) x AS /(A L –A S)].</li>
		<li>Uzyskaj znormalizowaną intensywność fluorescencji interesującego białka (tutaj VDAC3 lub Sas6), obliczając stosunek intensywności fluorescencji skorygowanej o tło jego fluoroforu do intensywności fluoroforu użytego dla wybranego wzorca wewnętrznego (tutaj γ-tubulina, Sas6 lub Cep135).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku analizy komórek, w których centrosomy są dobrze oddzielone (odległość między dwoma centrosomami jest większa niż 2 μm), należy przeanalizować każdy centrosom osobno, rysując dwa oddzielne zestawy pól. Narysuj mały kwadrat (zwykle 15-25 pikseli z każdej strony) wokół każdego centrosomu i zaznacz wybrany obszar. Narysuj większy kwadrat (20-30 pikseli na bok) otaczający pierwszy kwadrat i zaznacz wybrany obszar.
	<ol>
		<li>Uzyskać powierzchnię (A) i całkowitą intensywność fluorescencji (F) każdego fluoroforu w każdym pudełku i obliczyć intensywności fluorescencji skorygowane o tło każdego fluoroforu, oddzielnie dla każdego centrosomu, jak opisano w kroku 5.3.3.</li>
		<li>Połącz skorygowane w tle intensywności fluorescencji każdego białka z dwóch centrosomów, aby uzyskać całkowity poziom centrosomalny tego białka w tej komórce.</li>
		<li>Uzyskaj znormalizowaną intensywność dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, obliczając stosunek jego całkowitej intensywności centrosomalnej do całkowitej intensywności centrosomalnej wzorca wewnętrznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj co najmniej 15-25 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego i narysuj wykres w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
</ol>
6. Analiza całkowitego białka za pomocą Western Blotting
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) zawierającym 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS) i inkubować przez 10 minut na lodzie w celu lizy komórek.
	<ol>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 10 000 x g przez 10 minut, oddzielić lizat od frakcji osadu i zmierzyć całkowite stężenie białka w każdym lizacie za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj 40 μg lizatu z 4x buforem ładującym SDS-PAGE (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 100 mM ditiotreitol, 0,1% błękitu bromofenolowego).
	<ol>
		<li>Gotować próbki przez 10 minut i uruchomić je na 12,5% denaturującym SDS-PAGE przy stałym napięciu 200 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść białka wydzielone na SDS-PAGE na membranę nitrocelulozową za pomocą techniki western blotting (przy stałym napięciu 90 V przez 1 godzinę w niskiej temperaturze).
	<ol>
		<li>Zablokuj błonę 3% beztłuszczowym mlekiem w 1x PBS, a następnie inkubuj błonę z roztworami rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych (w tym przypadku króliczej anty-VDAC3, króliczej anty-γ-tubuliny i mysiej anty-α-tubuliny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po trzykrotnym umyciu membrany (co 5 minut inkubacji pod wstrząsaniem) przy użyciu buforu PBS-T (1x PBS i 0,2% Tween-20), inkubować membranę w mieszaninie przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni (IR) i sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym IR (rozcieńczonych w PBS-T) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj membranę trzy razy, a następnie zeskanuj membranę, aby przeanalizować pasma za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego w podczerwieni odpowiedniego do wykrywania immunoblotów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li>
<li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li>
<li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li>
<li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1%3A+defensible+or+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9(2011).</li>
<li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976(2009).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP+proteins%3A+the+knights+of+centrosome+dynasty%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li>
<li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li>
<li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li>
<li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li>
<li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li>
<li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li>
<li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li>
<li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li>
<li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li>
<li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li>
<li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li>
<li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287(2002).</li>
<li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291(2011).</li>
<li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li>
<li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened%3A+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li>
<li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores%2C+along+spindle+fibers%2C+and+at+spindle+poles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li>
<li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li>
<li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP%2C+and+is+required+for+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li>
<li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome%3A+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li>
<li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li>
<li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li>
<li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li>
<li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li>
<li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikroskopia ilościowa w biologii komórki jest powszechnie kojarzona z testami obrazowania żywych komórek, takimi jak transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET), odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) itp. Istnieje jednak coraz więcej przykładów biologów komórkowych rozwijających różne ilościowe testy mikroskopowe dla komórek utrwalonych w ostatnich latach27,34-36. Co ważne, postęp w zrozumieniu biologii centrosomów często wymaga zrozumienia specyficznej dla centrosomów funkcji białek...

Centrosomy składają się z pary centrioli otoczonych materiałem okołocentrycznym (PCM). Będąc głównymi centrami organizowania mikrotubul (MTOC) w komórkach ssaków, centrosomy służą jako dwa bieguny wrzecion mitotycznych w dzielących się komórkach, a tym samym pomagają utrzymać integralność genomu1. W komórkach w stanie spoczynku (np. podczas fazy G0) jedna z dwóch centrioli centrosomu, a mianowicie centriola macierzysta, jest przekształcana w ciało podstawne w celu złożenia rzęski pierwotnej, organelli czuciowej wystającej z powierzchni komórki2. Gdy komórki ponownie wejdą w cykl komórkowy, rzęski pierwotne są demontowane, a każda centriola kieruje złożeniem procentriolu na jego bliższym końcu, który stopniowo wydłuża się, tworząc dojrzałą centriolę3. Na początku fazy S na powierzchni każdej istniejącej centrioli tworzy się struktura przypominająca koło wozu, która zapewnia 9-krotną symetrię centrioli, która stanie się podstawą każdej procentiroli. Sas6, który jest niezbędny do montażu centrioli, jest rekrutowany do utworzenia piasty koła wozu4-6. Inne białka centriolarne są następnie montowane na kole wozu w wysoce regulowany, proksymalny do dystalnego sposób7. Po dokładnym zakończeniu duplikacji centrioli komórki gromadzą dodatkowe materiały pericentriolne, aby zbudować dwa funkcjonalne centrosomy pod koniec fazy8 G2. Oprócz podstawowych składników centriolarnych9-11, kilka innych białek, w tym kinazy, fosfatazy, białka opiekuńcze, składniki rusztowania, białka związane z błoną i maszyneria degradacji, są związane z centriolami, ciałami podstawnymi i PCM w różnych momentach cyklu komórkowego12-16. Często zauważa się, że poziomy centrosomalne wielu białek są czasowo regulowane przez centrosomalne mechanizmy celowania i/lub degradację proteasomalną w centrosomach. Co ważne, wahania poziomu centrosomalnego kilku białek, takich jak Plk4, Mps1, Sas6 i CP110 w różnych punktach cyklu komórkowego, wydają się być kluczowe dla regulacji składania centrioli5,17-22, a w przypadku Mps1 zapobieganie tej degradacji centrosomalnej prowadzi do powstania nadmiaru centrioli19. Z drugiej strony frakcje centrosomalne kilku białek są mniej labilne w porównaniu z basenami cytozolowymi. Na przykład regulacja w dół Centrin 2 (Cetn2) za pośrednictwem siRNA doprowadziła tylko do umiarkowanego spadku poziomu białka w centriolach, pomimo znacznego obniżenia poziomu w całych komórkach23. Dlatego tak ważne jest mierzenie zmian poziomu białek centrosomalnych w centrosomie, a nie mierzenie poziomów białek w całej komórce podczas oceny ich funkcji specyficznych dla centrosomów.
W tym badaniu opracowaliśmy test wykorzystujący immunofluorescencję pośrednią (IIF) do ilościowego określenia względnego poziomu białka w centrosomach. Test ten został opracowany specjalnie do analizy komórek, które pochodzą z różnych próbek, a zatem nie mogą być obrazowane w tym samym czasie. Próbki te mogą być komórkami, które zostały potraktowane różnymi odczynnikami (tj. lek kontra kontrola), zebrane w różnych punktach czasowych (tj. impuls kontra pościg) lub znajdują się w różnych fazach cyklu komórkowego. Zasada tego testu polega na pomiarze skorygowanej intensywności fluorescencji tła odpowiadającej białku w małym regionie i znormalizowaniu tej wartości względem tego samego dla innego białka, którego poziomy nie zmieniają się w wybranych warunkach eksperymentalnych. W kilku badaniach z zakresu biologii centrosomów wykorzystano ostatnio różne techniki mikroskopii ilościowej, zarówno w żywych, jak i utrwalonych komórkach, w celu określenia specyficznej dla centrosomów funkcji białek kandydujących24-27. Podobnie jak w przypadku tych testów, niniejsza technika mierzy również intensywność fluorescencji badanego białka skorygowaną o tło. Jednak włączenie normalizacji przy użyciu wzorca wewnętrznego do tego testu prawdopodobnie zapewniłoby większą dokładność i pewność w analizie dwóch różnych próbek, które znajdują się na dwóch różnych szkiełkach nakrywkowych. Co więcej, oprócz badania poziomu białka w centrosomach, z niewielkimi korektami, metoda ta może być stosowana do różnych warunków eksperymentalnych lub w innych miejscach komórkowych.
Tutaj łączymy nasz ilościowy test mikroskopowy ze strategią pościgu za impulsami BrdU, aby porównać komórki z różnych etapów cyklu komórkowego. Zamiast używać standardowych technik zatrzymywania i uwalniania cyklu komórkowego do badania różnych punktów czasowych cyklu komórkowego, asynchronicznie rosnące komórki są inkubowane z BrdU w celu znakowania komórek w fazie S, a znakowane komórki są ścigane przez różne czasy (zwykle 4-6 godzin). Większość znakowanych komórek będzie w fazie S bezpośrednio po impulsie. Długość pościgu dobiera się tak, aby po pościgu znakowane komórki znajdowały się w późnym S, G2 lub mitozie, co można zweryfikować za pomocą cech morfologicznych, takich jak położenie centrosomów w stosunku do jąder, odległość między centrosomami, kondensacja chromosomów itp. Zatem długość pościgu zależy od średniego czasu trwania S, Faza G2 i M określonego typu komórki. Ponieważ takie podejście pozwala uniknąć inhibitorów cyklu komórkowego, takich jak hydroksymocznik, afidikolina, nokodazol itp., Pozwala na bardziej fizjologicznie istotną analizę cyklu komórkowego.
Pokazujemy tutaj, że ilościowy test mikroskopii fluorescencyjnej sam w sobie, lub w połączeniu z testem BrdU pulse-chase, jest prostą, ale potężną techniką dokładnego pomiaru względnych zmian w poziomie centrosomalnym białka kandydującego podczas niezakłóconego cyklu komórkowego. Zmierzyliśmy poziom centrosomalny VDAC3, białka, które niedawno zidentyfikowaliśmy w centrosomach oprócz mitochondriów16,28, za pomocą tych testów. Uzyskane tutaj wyniki potwierdzają naszą wcześniejszą obserwację, że pula centrosomalna VDAC3 jest regulowana przez degradację, a także zmienia się w sposób zależny od cyklu komórkowego16, co dodatkowo potwierdza możliwość zastosowania tej metody.

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Zapas 1 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Zapas 10 mM w DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Zapas 10 mM w DMSO</td></tr><tr><td>Anty-&#947;-tubulina (monoklonalny mysz, klon GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 w buforze blokującym IIF&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-VDAC3 (poliklonalny królik)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 w buforze blokującym IIF, 1:1,000 w buforze blokującym WB</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mysi monoklonalny)&nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (poliklonalny królik)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (monoklonalny szczur)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H + L)</td> <td>Technologie życia</td><td>A21093</td><td>1:200 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Technologie</td><td>życia</td><td>przeciwciał A21202</td><td>1:1,000 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Technologie</td><td>życia</td> przeciwciał <td>A21203</td><td>1:1,000 w IIF bufor blokujący</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Technologie życia</td> przeciwciał <td>A21206</td><td>1:1,000 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Technologie życia</td><td>A21207</td><td>1:1,000 w buforze blokującym IIF</td></tr><tr><td>Anty-&#947;-tubulina (poliklonalna królika)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 w buforze</td></tr> <tr><td>blokującym WBAnty-&#945;-tubulina (mysia monoklonalna, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20 000 w buforze blokującym WB</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10 000 w buforze blokującym WB</td></tr><tr><td>Mysz IgG (H& L) Przeciwciało IRDye800CW Sprzężone</td><td>przeciwciała Rockland</td><td>610-731-002</td><td>1:10 000 w buforze blokującym WB</td></tr><tr><td>Odczynnik SlowFade Gold Antifade&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Nośniki montażowe</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus IX-81</td><td>Kamera</td> na podczerwień Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju Plan Apo</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 apertura numeryczna</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do slajdów</td><td>Inteligentne innowacje</td><td></td><td></td>w obrazowaniu</tr><tr><td>System obrazowania Odyssey IR</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr> Test <tr><td>kwasu bicunchoninowego (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Wąska kostka</td> <td>UVOlympus</td><td>U-M622</td><td>Filtr</td></tr><tr><td>U-MNU2 Wąska niebieska kostka</td><td>Olympus</td><td>U-M643</td><td>Filtr</td></tr><tr><td>U-MNU2 Wąska zielona kostka</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filtr</td></tr></tbody></table>

ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomy to małe, ale ważne organelle, które służą jako bieguny wrzeciona mitotycznego w celu utrzymania integralności genomu lub składania pierwotnych rzęsek w celu ułatwienia funkcji sensorycznych w komórkach. Poziom białka może być regulowany inaczej w centrosomach niż w innych lokalizacjach komórkowych, a zmienność poziomu centrosomalnego kilku białek w różnych punktach cyklu komórkowego wydaje się być kluczowa dla prawidłowej regulacji składania centrioli. Opracowaliśmy ilościowy test mikroskopii fluorescencyjnej, który mierzy względne zmiany poziomu białka w centrosomach w utrwalonych komórkach z różnych próbek, na przykład w różnych fazach cyklu komórkowego lub po leczeniu różnymi odczynnikami. Zasada tego testu polega na pomiarze skorygowanej intensywności fluorescencji tła odpowiadającej białku w małym regionie i znormalizowaniu tego pomiaru względem tego samego dla innego białka, które nie zmienia się w wybranych warunkach eksperymentalnych. Wykorzystując ten test w połączeniu ze strategią impulsu i pościgu BrdU do badania niezakłóconych cykli komórkowych, ilościowo potwierdziliśmy naszą niedawną obserwację, że pula centrosomalna VDAC3 jest regulowana w centrosomach podczas cyklu komórkowego, prawdopodobnie przez degradację za pośrednictwem proteasomu, szczególnie w centrosomach.

Nasze niedawne badania zidentyfikowały nową lokalizację i funkcję VDAC3, jednej z poryn mitochondrialnych, w centrumsomie16,28. Barwienie immunocytochemiczne kilku linii komórek ssaków, w tym komórek RPE1, z wykorzystaniem przeciwciała specyficznego dla VDAC3 wykazało wyraźne barwienie centrumsomów i stosunkowo słabe barwienie mitochondriów. Wykazaliśmy również, że centrumsomalny VDAC3 wiąże się preferencyjnie z centriolem macierzystym, a pula centrumsomalna zarówno endogennego, jak i ektopowo eksprymowanego V...

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie względnych zmian poziomu białka w centrosomach w różnych warunkach. Na przykład w określonym momencie cyklu komórkowego po zahamowaniu proteasomu osiąga się to poprzez traktowanie komórek rosnących na szkiełkach nakrywkowych inhibitorem proteasomu MG one 15 lub rozpuszczalnikiem kontrolnym DMSO. Następnie natychmiast dodaje BRDU do obu komórek i inkubuje je przez cztery godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.Drugim krokiem jest przeniesienie szkiełek nakrywkowych na płytkę 24-dołkową w celu utrwalenia komórek. Następnie komórki są barwione przeciwciałami przeciwko BRDU i białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Ostatnim krokiem jest uzyskanie obrazów komórek BRDU dodatnich za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oprogramowania do obrazowania cyfrowego w celu zastosowania identycznego czasu ekspozycji i długości osi Z do komórek z każdej próbki.Następnie analiza obrazów w celu ilościowego określenia względnego poziomu romal VDA C3. Ostatecznie ilościowa mikroskopia immunofluorescencyjna jest stosowana w celu wykazania, że pula somalna Centro VDA C3 zwiększa się dwukrotnie, gdy proteasom jest hamowany podczas fazy S. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, immunoblotting lub mikroskop ilościowy, jest to, że technika ta analizuje względny poziom białka w dwóch różnie traktowanych próbkach, które są przetwarzane na dwóch różnych szkiełkach nakrywkowych. Metoda ta wykorzystuje normalizację do wzorca wewnętrznego w celu kontroli potrzeby przetworzenia dwóch eksperymentalnych populacji komórek.Oddzielnie, chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w regulację określonych białek w centrosomach. Może być również stosowany w innych sytuacjach, takich jak inne struktury subkomórkowe lub badanie określonych pul białek, które znajdują się w wielu miejscach w komórce. Procedurę zademonstruje schu majumder, doktor habilitowany z mojego laboratorium Aby rozpocząć eksperyment przechodząc dwa razy 10 do piątego asynchronicznie hodując RPE jedną komórkę do wcześniej przygotowanych 35-milimetrowych szalek z wargami zakrywającymi i hoduj komórki w dwóch mililitrach kompletnego podłoża.Wymieniaj pożywkę co 24 godziny na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę Po 44 godzinach. Zastąp pożywkę hodowlaną kompletną pożywką zawierającą 0,05% DMSO lub MG one 15 o końcowym stężeniu pięciu mikromolowców i jednocześnie dodaj BRDU do komórek o końcowym stężeniu 40 mikromolowców, inkubuj komórki przez cztery godziny. Następnie przenieś każde szkiełko nakrywkowe na płytkę 24-dołkową.Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie wyhodowanego metanolu do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby utrwalić komórki. Po 10 minutach natychmiast umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu do mycia. Inkubować utrwalone komórki na pokrywie, wsuwa 200 mikrolitrów buforu blokującego na 30 minut, podczas gdy komórki są w inkubacji.Przygotuj nawilżoną komorę, umieszczając mokry ręcznik papierowy w dolnej połowie pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów. Połóż pasek perfum na powierzchni stojaka i dodaj 20 mikrolitrów kropli królika anty V DDA three i mysiego przeciwciała anty gamma tubuliny rozcieńczonego w buforze blokującym na paraformę. Po zablokowaniu odwrócić szkiełko nakrywkowe na każdą kroplę roztworu przeciwciała.Upewnij się, że komórki są zanurzone i zamknij pokrywę pudełka na końcówki. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Ponownie odwróć szkiełka nakrywkowe i zwróć je do 24.Dobrze umyj szkiełka nakrywkowe, a następnie inkubuj je w 150 mikrolitrowym roztworze przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczonym w buforze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie buforem do mycia. Napraw poplamione ogniwa RPE one za pomocą 500 mikrolitrów metanolu schłodzonego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po utrwaleniu komórek przez 10 minut umyj je trzykrotnie w buforze do mycia.Następnie inkubuj komórki w 200 mikrolitrach dwóch normalnych HCL przez 30 minut. W temperaturze pokojowej zneutralizuj komórki 300 mikrolitrami jednego molowca tris CL pH osiem i umyj komórki trzy razy. Za pomocą buforu płuczącego zablokuj komórki 200 mikrolitrami buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po zablokowaniu inkubować komórki ze szczurzym przeciwciałem anty BRDU i buforem blokującym przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Zwróć slajdy okładki z powrotem do 24. Dobrze umyj naczynia i umyj komórki.Następnie inkubuj je z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w 150 mikrolitrach buforu blokującego. W naczyniu z 24 dołkami przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie jednym punktem XPBS, sześciolitrową kroplą roztworu montażowego zawierającego odczynnik Antifa na szklanym mikroskopie.Wsuń szkiełko nakrywkowe stroną z ogniwem skierowaną w dół na roztwór montażowy. Za pomocą miękkiej chusteczki czyszczącej delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu, uszczelnij szkiełko nakrywkowe na mikroskopie. Przesuń, nakładając lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego.Użyj obiektywu zanurzeniowego 100 x plan APO z aperturą numeryczną 1,4, aby uzyskać obrazy BRDU dodatnich komórek RPE one w temperaturze pokojowej. Określ odpowiednią górną i dolną płaszczyznę ogniskowej wzdłuż osi Z z krokiem 0,2 mikrona i uzyskaj obrazy wzdłuż osi Z. Następnie wykonaj dekonwolucję wszystkich stosów obrazów uzyskanych wzdłuż osi Z.Uzyskaj projekcję całkowitej intensywności każdego obrazu. Ułóż wzdłuż osi Z dla komórek, których centrosomy są oddalone od siebie o mniej niż dwa mikrony. Narysuj mały kwadrat o długości od 20 do 30 pikseli z każdej strony wokół obu centrosomów i zaznacz wybrany obszar.Narysuj większy kwadrat o wymiarach od 24 do 35 pikseli z każdej strony wokół pierwszego kwadratu i zaznacz zaznaczony obszar dużego kwadratu. Następnie uzyskaj powierzchnię i całkowitą intensywność fluorescencji każdego fluoro czterech. W każdej rubryce oblicz intensywność fluorescencji każdego fluorescencji skorygowaną o tło. Cztery.Na koniec uzyskaj znormalizowaną intensywność fluorescencji VDA C3, obliczając stosunek skorygowanej intensywności fluorescencji tła jego fluoru. Cztery do tego z fluoro, cztery użyte do wybranych obrazów wzorca wewnętrznego zostały uchwycone na losowych polach asynchronicznie rosnących komórek RPE one inkubowanych z BRDU i inhibitorem proteasomu MG one 15 lub rozpuszczalnikiem kontrolnym DMSO i wyświetlały DNA i BRDU. Tło skorygowane o intensywność fluorescencji odpowiadającą Centro Somal.VD 3 był około 2,5 razy wyższy w MG 1 15 leczonych komórkach niż w komórkach kontrolnych, jak pokazano na tym schemacie ramki i wąsów. Kiedy dane zostały znormalizowane dla całkowitej fluorescencji VD 3 w porównaniu z fluorescencją tubuliny gamma, fałd zwiększył się, nieznacznie spadł do około dwukrotności. Hamowanie proteasomu nie miało wpływu na barwienie VD C3 na cytach nieromalnych ani na całkowity poziom komórkowy VD 3.W ten sposób pula romalna VDA C3 jest regulowana przez degradację za pośrednictwem proteasomu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przeciwciała przeciwko białku testowemu i wzorzec wewnętrzny muszą być podwyższone u różnych gatunków gospodarzy oraz że obrazy obu próbek powinny być uzyskane przy użyciu identycznych parametrów obrazowania, takich jak liczba cesarskich cięć i czasy ekspozycji, w celu zminimalizowania efektu obrazowania cyfrowego.

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.

Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek

Poznaj ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmian poziomów białek w centrosomach komórek RPE1. Ta metoda wykorzystuje normalizację do wewnętrznego standardu gamma-tubuliny.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Przeglądaj więcej filmów