Name: Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj metody stereologii i cytometrii przepływowej do charakterystyki subpopulacji leukocytów mieloidalnych w mózgu po udarze. Techniki te umożliwiają dokładną ilościową i jakościową analizę komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez dotacje z hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) i RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), oraz od Samorządu Lokalnego Madrytu S2010/BMD-2336 (MAM) i S2010/BMD-2349 (IL). IB i MIC są stypendystami hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności.

<ol><li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+after+trauma%3A+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods%3A+the+optical+disector+and+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li>
<li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke%3B+a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Circulation%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li>
<li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174(2011).</li>
<li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li>
<li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li>
<li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung%3A+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li>
<li>Hernández-Jiménez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li>
<li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li>
<li>García-Yébenes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+overload%2C+measured+as+serum+ferritin%2C+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li>
<li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent%2C+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPAR%CE%B3+Agonist+Rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li>
<li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tutaj model niedokrwienia mózgu daje wysoce powtarzalne objętości zawału określone 24-48 godzin i 7 dni po podwiązaniu MCA różnymi podejściami8,15,17. Ten model MCAO ma niski wskaźnik śmiertelności (mniej niż 1%) w porównaniu z innymi, minimalizując liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach. Kluczowym krokiem do uzyskania tak niskiego wskaźnika śmiertelności jest utrzymanie odpowiednich warunków aseptycznych, aby uniknąć infekcji, które mogłyby pogorszyć przeżycie po indukcji udaru. Ten model MCAO może być używany nie tylko jako stały model MCAO, który jest uważany za model klinicznie istotny dla badań translacyjnych18, ale także jako model przejściowy przez przejściowe podwiązanie CCA i MCA z węzłem ślizgowym i reperfuzją tylną w pożądanym czasie19. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana u myszy i szczurów17,20. Wszystkie te dowody wskazują, że MCAO przez podwiązanie jest wysoce wszechstronnym modelem niedokrwienia mózgu o wielu zastosowaniach. Krytycznym etapem tej techniki jest to, że wymaga ona inwazyjnej operacji pod mikroskopem stereoskopowym; kraniotomia powinna być wykonana bardzo ostrożnie, aby nie uszkodzić kości jarzmowej, a także MCA. Jednak wykorzystanie zwierząt pozorowanych (które są poddawane zabiegowi chirurgicznemu, ale nie wykonuje się podwiązania CCA i MCA) stanowi użyteczne narzędzie do rozróżniania efektów zależnych od zabiegu chirurgicznego. Zakres uszkodzenia mózgu po zastosowaniu tej techniki można określić ilościowo za pomocą kilku metod. Nasz protokół sekcji mózgu, barwienia Nissl i późniejszego oszacowania objętości przez Cavalieri pozwala na dokładne ilościowe określenie uszkodzonego obszaru i minimalizuje liczbę myszy wykorzystywanych w tego typu badaniach, ponieważ seryjne sekcje mózgu mogą być również wykorzystywane do różnych analiz immunohistochemicznych. Aby uzyskać lepsze wyniki tej metodyki, kluczowe znaczenie ma wybór odpowiednich parametrów stosowanych w oprogramowaniu do stereologii (tabela 1), które będą niezbędne do oszacowania objętości różnych obszarów za pomocą wzoru: V = 1/ssf*af*t*ΣPi (Ssf jest frakcją próbkowania warstwy, t jest średnią grubością odcinków, af to obszar odstępu siatki, a ∑P to liczba punktów uderzających w strukturę).
Dystalne MCAO przez podwiązanie może być przydatne do scharakteryzowania naciekających subpopulacji leukocytów i komórek odpornościowych8,13 , które uczestniczą w procesie zapalnym po urazie mózgu1-4. W tym miejscu proponujemy dwie różne metodologie charakterystyki komórek odpornościowych mózgu, precyzyjne podejście stereologiczne i analizę cytometrii przepływowej w celu lepszego scharakteryzowania subpopulacji wielu leukocytów.
Korzystając z seryjnego podziału mózgu, ilościowe określenie całkowitej liczby neutrofili można osiągnąć za pomocą metody frakcjonowania optycznego16, która szacuje całkowitą liczbę komórek na podstawie liczby komórek pobranych za pomocą systematycznego zestawu losowo próbkowanych (SRS) bezstronnych wirtualnych przestrzeni zliczających obejmujących cały obszar zainteresowania, w naszym przypadku obszar zawału, z jednakową odległością między bezstronnymi wirtualnymi przestrzeniami zliczającymi w kierunkach X, Y i Z. Metoda ta zapewnia dokładne narzędzie do oszacowania całkowitej liczby neutrofili w niedokrwionym mózgu w różnych momentach po podwiązaniu. Chociaż nie wykazano tego w tym badaniu, protokół ten może być również stosowany do szacowania różnych subpopulacji neutrofili po niedokrwieniu21 oraz do dokładnej kwantyfikacji dowolnej innej populacji komórek znajdujących się w niedokrwionym mózgu, takich jak inne naciekane leukocyty (monocyty / makrofagi), a także do szacowania neuronów, które przeżyły, a nawet do kwantyfikacji neurogenezy po udarze. Najważniejszym krokiem do dokładnego oszacowania w pożądanym obszarze jest wybór odpowiednich parametrów, takich jak te przedstawione w Tabeli 3 dla kwantyfikacji neutrofili w obszarze niedokrwiennym. Parametry te zostaną wykorzystane w oprogramowaniu stereologicznym do obliczenia całkowitej dodatniej liczby komórek (N) przy użyciu równania N = ΣQ- x 1/ssf x 1/asf x 1/tsf (ΣQ- to całkowita liczba komórek zliczonych za pomocą frakcjonatora, ssf to frakcja próbkowania sekcji, asf to powierzchnia frakcji próbkowania, a tsf to grubość frakcji próbkowania)5. Chociaż metodologia ta jest wolniejsza niż inne techniki kwantyfikacji (na przykład analiza markerów neutrofili w mg tkanki, densytometria reprezentatywnych obrazów lub liczba neutrofili w polu), ma tę zaletę, że jest bezstronną i solidną techniką, która zapewnia precyzyjną kwantyfikację liczby komórek.
Metoda izolacji leukocytów w mózgu pozwala na jednoczesną identyfikację i kwantyfikację kilku podtypów komórek odpornościowych bez konieczności wypaczania systemu poprzez barwienie in vivo lub manipulacje genetyczne. Późniejsze sortowanie komórek ze scharakteryzowanych populacji szpiku lub ich separacja immunomagnetyczna może być wykorzystana do wielu dalszych zastosowań, takich jak dalsze badania nad ekspresją genów lub białek. Dokładna charakterystyka neutrofili, monocytów i mikrogleju uzyskana tą metodą zapewnia wysoką specyficzność w odniesieniu do istniejących metod, takich jak badania immunohistochemiczne, co pozwala przypisać określone funkcje różnym komórkom szpikowym, które pośredniczą w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej mózgu. Ponadto można go dalej rozszerzyć, aby scharakteryzować inne populacje mózgu z odpowiednią etykietą, takie jak makrofagi urodzone we krwi (CD11b + CD45hiCD68 +), i może być stosowany do badania innych patologii lub urazów OUN. Dlatego technika ta stanowi niezbędne narzędzie do badania niejednorodności reakcji zapalnej w mózgu. Głównym ograniczeniem tej techniki jest przygotowanie zawiesin leukocytów ze świeżej tkanki mózgowej, które mogą zmienić stan aktywacji komórek lub ich zmianę antygenu. Chociaż technika ta pozwala na bardziej szczegółową charakterystykę jakościową w porównaniu z badaniami immunohistochemicznymi, zapewnia mniej dokładną kwantyfikację opartą na izolacji komórek. Mimo to skuteczność naszego protokołu izolacji komórek jest podobna do innych opublikowanych metodologii9 i może być skutecznie wykorzystana do wykrywania różnic w liczbie komórek odpornościowych mózgu między grupą kontrolną a grupą MCAO, a nawet między grupami MCAO poddanymi różnym zabiegom8.
Krytycznymi etapami tego protokołu są rozwarstwienie tkanki, procedura rozerwania tkanki i usunięcie mieliny. Jeśli chodzi o pobieranie tkanek, można uwzględnić etap normalizacji (poprzez zważenie pobranej tkanki), aby uniknąć zmienności spowodowanej różnymi wydajnościami sekcji. Ponadto normalizacja między różnymi grupami MCAO może również wystąpić poprzez objętość zawału (wcześniej określaną przez rezonans magnetyczny). Innym sposobem rozwiązania tego problemu jest użycie całej półkuli ipsilateralnej zarówno grupy niedokrwiennej, jak i kontrolnej, a nawet użycie przeciwległej półkuli myszy niedokrwionej jako kontroli, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt. Chociaż takie podejście pozwala uniknąć różnic między każdą sekcją, ma główną wadę; Współczynnik rozcieńczenia dodaje się poprzez zwiększenie całkowitej liczby komórek, ale nie liczby komórek szpikowych, które znajdują się wyłącznie w obszarach rdzenia i okołozawałowych kory ipsilateralnej. Jeśli chodzi o rozerwanie tkanek, protokół ten ilustruje etapy mechanicznego rozerwania komórek mózgowych, unikając zabiegów enzymatycznych i zapobiegając powierzchniowej zmianie antygenu9,22, co jest istotną kwestią dla dalszej analizy jakościowej i ilościowej subpopulacji komórek zapalnych. Oprócz przygotowania zawiesiny komórkowej, która jest przedmiotem zainteresowania, usunięcie mieliny z próbek mózgu jest wysoce zalecanym krokiem w celu uniknięcia zakłóceń w dalszych zastosowaniach, takich jak immunomagnetyczna separacja komórek lub cytometria przepływowa23,24. Można to osiągnąć za pomocą różnych metod, takich jak gradienty sacharozy lub Percollu lub kulki antymielinowe. Tutaj, a także w oparciu o wcześniejsze badania, które porównują różne metody izolacji zawiesiny komórek mózgowych, zakłócenia mechaniczne w połączeniu z użyciem Percollu do usuwania mieliny są stosowane w celu poprawy wydajnościi żywotności komórek.

Uważa się, że zmiany morfologiczne, fenotypowe i ekspresji genów mikrogleju, a także wynaczynienie i aktywacja hematogennych makrofagów i neutrofili odgrywają kluczową rolę w patofizjologicznej kaskadzie po urazie mózgu1-4. Protokół ten zapewnia dwa podejścia do oszacowania liczby różnych podzbiorów komórek szpikowych w niedokrwionym mózgu i przeprowadzenia ich charakterystyki fenotypowej. Ponadto zawiera również opis eksperymentalnego modelu niedokrwienia mózgu u myszy, który składa się z przejściowego lub trwałego podwiązania zarówno dystalnej tętnicy środkowej mózgu (MCA), jak i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), w tym sposobu oceny zawału za pomocą dokładnej metody Cavalieriego przy użyciu oprogramowania stereologicznego.
Pierwszym podejściem do scharakteryzowania podzbiorów komórek szpikowych niedokrwionego mózgu jest metoda stereologiczna oparta na podejściu frakcjonowania optycznego5. Jest to najczęściej stosowana sonda stereologiczna w naukach przyrodniczych i zapewnia wysoki stopień precyzji przy niskich współczynnikach błędu5-7. Jest to najlepszy wybór do oznaczania ilościowego komórek, gdy tkanka jest cięta na sekcje, ponieważ pozwala uniknąć stronniczości w szacowaniu komórek z powodu fragmentacji tkanki na sekcje. Metoda ta jest bardzo skutecznym sposobem charakteryzowania liczby, dynamiki i zmian fenotypowych naciekających subpopulacji neutrofili tkanki niedokrwiennej8.
Drugie podejście do charakterystyki opiera się na zmodyfikowanym protokole Campanelli i współpracowników9, który zapewnia prosty sposób na wyizolowanie zawiesin leukocytów w mózgu i scharakteryzowanie ich za pomocą cytometrii przepływowej. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik immunohistochemicznych, charakterystyka cytometrii przepływowej pozwala na różnicowanie mikrogleju (CD45loCD11b+) i naciekanych komórek szpikowych (CD45hiCD11b+) na podstawie ich różnych poziomów ekspresji CD45 9-13. Ponadto można wyróżnić monocyty prozapalne (CD45hiCD11b+Ly-6G-Ly-6C hi), neutrofile (CD45hiCD11b+Ly-6G+) i inne podzbiory leukocytów tkanki niedokrwiennej. Podejście to zapewnia wiarygodny i szybki test do oceny zapalenia nerwów w eksperymentalnych modelach niedokrwienia mózgu. Jednak przetwarzanie tkanek może wpływać na stan aktywacji i liczbę różnych populacji komórek znajdujących się w tkance niedokrwiennej, zapewniając półilościową charakterystykę.

<table><tbody><tr><td>Photonic Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>Regulator</td></tr><tr><td>temperatury sprzętu&nbsp;</td><td>Panlab&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Frezy ze stali nierdzewnej</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Kleszcze do materiałów chirurgicznych</td></tr><tr><td>Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Szew 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Szew 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Materiał chirurgiczny</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Wetochinol</td><td>570681</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>zamrażania Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Octan fioletu kresylowego</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Mikroskop chemiczny</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>XYZ zmotoryzowany stolik komputerowy i kontroler</td><td>Ludl electronics Produkty</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Stereo Investigator System</td><td>Microbrightfield</td><td>Wersja oprogramowania 7.003</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie 5 ml Młynek do tkanek, Potter-Elv z tłuczkiem teflonowym</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Polipropylen 50 ml Dąb Ridge Probówka wirówkowa</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Beckman Wyposażenie</td><td>redlic</td><td></td> Beckman <td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki Beckman Coulter 45 Ti</td><td>Wyposażenie redlic</td><td></td><td></td>Beckman BD</tr><tr><td>Sterylne sitko komórkowe, 40 mikronów</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Materiał laboratoryjny</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Odczynnik blokujący, mysz</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, ludzkie i mysie</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>CD45-PE, mysz</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, mysz</td><td>Przeciwciało Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom Ly-6C Biolegend 128012 PerCP/Cy5.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4-kolorowe</td><td>342975</td><td></td><td>oprogramowanie BD</td></tr><tr><td>Cell Quest Pro Oprogramowanie</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> Oprogramowanie <tr><td>FlowJo</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Uważa się, że aktywacja mikrogleju, jak również wynaczynienie hematogennych makrofagów i neutrofili, odgrywają kluczową rolę w uszkodzeniach mózgu po udarze. Te subpopulacje komórek szpikowych mogą wykazywać różne fenotypy i funkcje i muszą być rozróżniane i charakteryzowane w celu zbadania ich regulacji i wkładu w uszkodzenie tkanek. Protokół ten zapewnia dwie różne metodologie charakterystyki komórek odpornościowych mózgu: precyzyjne podejście stereologiczne i analizę cytometrii przepływowej. Podejście stereologiczne opiera się na metodzie frakcjonowania optycznego, która oblicza całkowitą liczbę komórek w obszarze zainteresowania (mózg z zawałem) oszacowaną przez systematyczne losowe pobieranie próbek. Drugie podejście do charakterystyki zapewnia prosty sposób izolowania zawiesin leukocytów w mózgu i charakteryzowania ich za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala na scharakteryzowanie mikrogleju, naciekanych monocytów i neutrofili w tkance niedokrwionej. Ponadto szczegółowo opisano model niedokrwienia mózgu u myszy, który wpływa wyłącznie na korę mózgową, generując wysoce powtarzalne zawały o niskim wskaźniku śmiertelności, a także procedurę histologicznego przetwarzania mózgu w celu scharakteryzowania objętości zawału metodą Cavalieriego.

Przedstawiony tutaj model niedokrwienia mózgu generuje zawały widoczne wyłącznie w korze, bez wpływu na tkankę prążkowia, ponieważ gałęzie soczewkowato-prążkowane MCA, które unaczyniają prążkowie, nie zostają zamknięte (Rysunek 1). Dzięki barwieniu Nissla obszar uszkodzony można zidentyfikować jako hipochromatyczny obszar korowy (Rysunek 2). Model ten charakteryzuje się wysoką powtarzalnością objętości zawałów 24 h po MCAO (%IH 15,89 ± 0,28), oszacowaną metodą Cavalieriego w sekcjach barwionych metodą Nissla (Rysunek 2). Szacowanie objętości zawału metodą Cavalieriego jest dokładnym podejściem o niskim błędzie, co odzwierciedla współczynnik błędu (CE) Gundersena w półkulach przeciwstronnych do uszkodzenia i tych samych po stronie uszkodzenia, a także w obszarze zawału (Tabela 2). Objętość uszkodzonej tkanki może być wyrażona w mm3 , ale także jako % IH przy użyciu wzoru w sekcji 3.2.13. Dodatkowo, oszacowanie całkowitej objętości obszarów po stronie uszkodzenia i przeciwstronnych pozwala na obliczenie wskaźnika obrzęku w celu skorygowania objętości zawału i uniknięcia przeszacowania uszkodzonej tkanki (Tabela 2).
Biorąc pod uwagę proces seryjnego cięcia tkanki mózgowej, można to wykorzystać do dokładnej oszacowania całkowitej liczby subpopulacji komórek, takich jak infiltrujące neutrofile w obszarze niedokrwiennym, stosując metodę Optical Fractionator (Rysunek 3 i Tabela 4) z parametrami przedstawionymi w Tabeli 3. Zgodnie z tym protokołem, całkowita liczba neutrofili (komórek Ly6G-dodatnich) w obszarze zawału u myszy po pMCAO wynosi 23 328 ± 3 623 w 24. godzinie oraz 82 856 ± 8 143 w 48. godzinie (Rysunek 3D). Zgodnie z poprzednimi badaniami, infiltracja neutrofili jest bezpośrednio skorelowana z wielkością zawału (Rysunek 3E). Oszacowanie liczby neutrofili metodą Optical Fractionator jest precyzyjnym podejściem o niskim błędzie, co odzwierciedla współczynnik CE wg Gundersena (Tabela 4).
Protokół izolacji leukocytów i charakterystyki metodą cytometrii przepływowej pozwala na wyizolowanie 47 922 ± 23 174 komórek mieloidalnych z kory półkuli ipsilesjonalnej u myszy z niedokrwieniem mózgu. Stanowi to 10-30% wszystkich zdarzeń znalezionych w zawiesinie komórkowej. Zdecydowana większość zdarzeń zarejestrowanych przy użyciu tego protokołu wykazuje niski parametr FSC, co wiąże się z obecnością debris komórkowego (Rycina 4). Barwienie na CD11b wykazuje, że komórki CD11b+ mają wyższą wartość FSC (Rycina 4), co sugeruje, że debris komórkowy nie jest znakowany tym markerem i, jak wskazano wcześniej, może zostać wykluczony z dalszej analizy poprzez ustawienie progu FSC na 2009. Zmienna ilość uzyskanego tą metodą debris komórkowego sugeruje, że może to wynikać z różnic w przetwarzaniu próbek (czas, konserwacja tkanki, temperatura próbki, efektywne usuwanie mieliny, itp.). Ponadto konieczne jest zastosowanie sit komórkowych (cell strainers), aby uniknąć obecności skupisk komórkowych w próbkach; ten etap musi zostać wykonany przed barwieniem komórek. Stosując strategię bramkowania (gating strategy) przedstawioną na Rycini 5, opartą na ekspresji CD11b i CD45, możemy odróżnić rezydentne komórki mieloidalne od komórek naciekających w tkance niedokrwionej. Populacja CD11b+ zwiększa się w półkuli niedokrwionej w porównaniu z grupą naiwną oraz grupą sham, w której komórki te są w większości powiązane z niską ekspresją CD45, co wskazuje na proliferację mikrogleju po niedokrwieniu (Rycina 4, Rycina 5 oraz Tabela 5). Różnica ta wynika prawdopodobnie z infiltracji komórek z obwodu, o czym świadczy pojawienie się subpopulacji komórek CD11b+CD45hi w niedokrwionym mózgu (Rycina 4, Rycina 5 oraz Tabela 5), której liczba jest niska w mózgach naiwnych i w grupie sham. Wkład nacieków do populacji komórek CD11b+ w niedokrwieniu mózgu jest procesem bardzo dynamicznym4. W modelu MCAO z użyciem ligature może on wynosić od 30% do 60% wszystkich komórek CD11b+ w zależności od wielkości zmiany i czasu przeprowadzenia charakterystyki. Neutrofile, charakteryzowane jako komórki Ly-6G+ , są najliczniejszą populacją komórek naciekających znalezioną 24 h po MCAO w niedokrwionym mózgu myszy w tym modelu niedokrwienia mózgu, ponieważ stanowią one 70-80% komórek CD11b+CD45hi. Pozostałe komórki to głównie subpopulacja prozapalnych monocytów CD11b+CD45hiLy-6G-Ly-6Chi . W tym modelu populacja ta będzie zwiększać swoją liczebność w obszarach niedokrwienia mózgu od 24 do 48 h po MCAO.
<img alt="Model niedokrwienia mózgu psa, kraniektomia, schemat okluzji MCA, analiza przekroju mózgu, badanie udaru." src="/files/ftp_upload/52031/52031fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura chirurgiczna ligacji MCA. (A) Po odsunięciu mięśnia skroniowego w czaszce myszy wykonuje się małą kraniotomię. MCA zostaje podwiązana za pomocą węzła lub węzła poślizgowego przy użyciu nici chirurgicznej 9/0. (B) Reprezentatywne obrazy uszkodzenia kory wywołanego modelem MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat regionów mózgu i histologia z wykresem punktowym %IH ilustrującym wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowe określenie objętości zawału metodą Cavalieriego. (A) Reprezentatywne obrazy przekrojów mózgu barwionych metodą Nissla 24 h po trwałym podwiązaniu tętnicy środkowej mózgu (MCA). Duże powiększenie ukazuje obszar hipochromatyczny po barwieniu metodą Nissla, który identyfikuje obszar uszkodzony (rdzeń) po MCAO. Przedstawiono również obszar okołozawałowy (P.I). (B) Ilościowe określenie objętości zawału przedstawione jako % zawału półkuli (%IH) przy użyciu metody Cavalieriego w seryjnych przekrojach barwionych metodą Nissla, 24 h po MCAO (n = 50 myszy).
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna neutrofili; wykres słupkowy i punktowy przedstawiają dane dotyczące liczby neutrofili." src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Stereologiczne ilościowe oznaczenie neutrofili w obszarze zawału 24 i 48 h po podwiązaniu, z zastosowaniem metody Optical Fractionator. (A) Reprezentatywny obraz naciekających neutrofili (komórki Ly6G-dodatnie) w obszarze niedokrwiennym 24 h po MCAO. Obrys wyznacza obszar zawału. (B, C) Przykłady dyssektora optycznego do ilościowego oznaczania neutrofili metodą optical fractionator. (D) Ilościowe oznaczenie całkowitej liczby neutrofili w obszarze zawału w 24. i 48. godzinie (n = 4 myszy). (E) Korelacja liczby neutrofili z wielkością zawału 24 i 48 h po podwiązaniu tętnicy mózgowiej środkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych, bramkowane CD11b i CD45Hi, po MCAO." src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywna analiza rozrzutu (dot-plot) leukocytów mózgowych uzyskanych z półkul naiwnych, pozorowanych i niedokrwiennych (24 h po MCAO) na podstawie parametrów fizycznych (SSC i FSC). We wszystkich grupach zidentyfikowano populację zdarzeń wykazujących ekspresję CD11b (czerwony). Populacja ta została poddana bramkowaniu i scharakteryzowana zgodnie z ekspresją CD45. Komórki wykazujące niski poziom CD45 (zielony) występowały w niedokrwiennej i niedokrwiennej korze mózgu i odpowiadały komórkom mikrogleju. W przeciwieństwie do nich, komórki wykazujące wysoki poziom CD45 (żółty) znaleziono tylko w półkuli niedokrwiennej oraz w mniejszym stopniu w grupie pozorowanej. Dalsza analiza populacji CD11b+CD45hi wskazuje, że neutrofile (komórki Ly-6G+ , niebieski) oraz monocyty prozapalne (komórki Ly-6Chi , pomarańczowy) są głównymi subpopulacjami komórek występującymi w naciekach mózgowych 24 h po udarze.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej porównujący komórki CD11b+ i CD45+; analiza odpowiedzi immunologicznej po MCAO." src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Strategie bramkowania w celu odróżnienia rezydentnych komórek mieloidalnych od tych zinfiltrowanych w tkance niedokrwiennej. Komórki CD11b+ zostały najpierw wyselekcjonowane zgodnie z intensywnością fluorescencji izotypu (A). Reprezentatywny wykres kropkowy zawiesin komórkowych z niedokrwiennego mózgu przedstawiono w prawym górnym rogu panelu. Dodatkowo pokazano typowe wartości dla całkowitej liczby zdarzeń oraz dla liczby zdarzeń CD11b+ uzyskanych za pomocą tej techniki (liczba komórek/półkula mózgu z niedokrwieniem; (A) Analiza intensywności fluorescencji CD45 dla komórek CD11b+ jest przedstawiona na panelu B. Reprezentatyczna analiza wykresu kropkowego ekspresji CD45 i CD11b dla wyselekcjonowanej subpopulacji CD11b+ znajduje się w prawym górnym rogu panelu. Dodatkowo przedstawiono typową liczbę komórek CD45lo oraz CD45hi uzyskanych na jedną półkulę mózgu z niedokrwieniem przy użyciu tej techniki (B).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2">
	</colgroup>
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Parametry użyte w metodzie Cavalieriego</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grubość przekroju (t)</td>
			<td >30 µm</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Obiektyw</td>
			<td >10X</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Ułamek próbkowania plastrów (ssf)</td>
			<td >1/20</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Odległość między przekrojami</td>
			<td >600 µm</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >Rozstaw siatki</td>
			<td >100 µm</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry wykorzystane do stereologicznej ilościowej oceny tkanki zawałowej.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Wyniki</td>
			<td >Strona przeciwległa do zmiany</td>
			<td >Strona z zapadalem</td>
			<td >Zawał</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Powierzchnia (µm²)</td>
			<td >151,460,000</td>
			<td >155,060,000</td>
			<td >22,600,000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość (µm³)</td>
			<td >90,876,000,000</td>
			<td >93,036,000,000</td>
			<td >13,560,000,000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Objętość skorygowana o  
			nadprojekcję (µm³)</td>
			<td >89,957,100,000</td>
			<td >92,046,300,000</td>
			<td >13,416,600,000</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Współczynnik błędu (Gundersen), 
			m=0</td>
			<td >0.068</td>
			<td >0.077</td>
			<td >0.067</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Współczynnik błędu (Gundersen), 
			m=1</td>
			<td >0.015</td>
			<td >0.017</td>
			<td >0.015</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Współczynnik błędu (Gundersen), 
			alpha(q)</td>
			<td >0.068</td>
			<td >0.077</td>
			<td >0.067</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2" >% półkuli zawalonej</td>
			<td colspan="2" >14.90</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2" >Obrzęk mózgu (Obj. Ips / Obj. Cont)</td>
			<td colspan="2" >1.02</td>
		</tr >
	</tbody >
</table >
Tabela 2: Reprezentatywne przykłady objętości przeciwstronnych, ipsilateralnych oraz objętości zawału wyznaczonych metodą Cavalieriego przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Parametry stosowane w metodzie optycznego frakcjonatora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grubość przekroju (tsf)</td>
			<td>30 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frakcja próbkowania plastrów (ssf)</td>
			<td>1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wysokość ramki do liczenia</td>
			<td>40 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szerokość ramki liczenia</td>
			<td>40 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar siatki X</td>
			<td>230 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar siatki X</td>
			<td>230 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zabezpieczenie</td>
			<td>2 µm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wysokość optycznego disektora</td>
			<td>14 µm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Parametry użyte do stereologicznego ilościowania naciekających neutrofili po niedokrwieniu mózgu z wykorzystaniem sondy optical fractionator w oprogramowaniu Stereo Investigator.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Oszacowanie liczby neutrofili za pomocą optycznego frakcjonatora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba punktów poboru prób</td>
			<td>430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Współczynnik kształtu</td>
			<td>6.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita liczba policzonych markerów</td>
			<td>166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szacowanie liczby neutrofili metodą Optical Fractionator</td>
			<td>117,608.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Współczynnik błędu (Gundersen), m=0</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Współczynnik błędu (Gundersen), m=1</td>
			<td>0.09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Reprezentatywny przykład szacowanej liczby zinfiltrowanych neutrofili po niedokrwieniu mózgu z wykorzystaniem sondy Optical Fractionator przy użyciu oprogramowania Stereo Investigator.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cd11b+</td>
			<td>Neutrofile</td>
			<td>Monocyty</td>
			<td>Mikrogliwia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naiwny</td>
			<td>25,863 ± 4,575.8</td>
			<td>473 ± 75.8</td>
			<td>525 ± 191.4</td>
			<td>19,012 ± 1,523</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operacja pozorowana 24 godz.</td>
			<td>24,563 ± 5,263</td>
			<td>873 ± 192.5</td>
			<td>1,124 ± 391.5</td>
			<td>23,734 ± 2,910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCAO 24 h</td>
			<td>47,922 ± 23,174</td>
			<td>4,874 ± 748.7 </td>
			<td>4,826 ± 1,345 </td>
			<td>35,395 ± 10,833 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Reprezentatywne wyniki oszacowanej liczby komórek mieloidalnych po niedokrwieniu mózgu z zastosowaniem cytometrii przepływowej.

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie podzbiorów komórek szpikowych myszy w niedokrwionym mózgu za pomocą dwóch różnych metodologii. Po pierwsze, wprowadzany jest stały model niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie zarówno tętnicy szyjnej wspólnej lub CCA, jak i dystalnego pnia tętnicy środkowej mózgu lub zawału MCA, który wpływa głównie na korę mózgową. Następnie, w celu stereologicznej kwantyfikacji podzbiorów komórek szpikowych, seryjne odcinki koronalne mózgu są barwieniem immunologicznym dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie naciekane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą optycznego frakcjonatora.Alternatywnie, komórki szpikowe można wyizolować ze świeżej tkanki mózgowej przez mechaniczną dysocjację, a następnie wybarwić i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie dokładna kwantyfikacja i szczegółowa charakterystyka jakościowa specyficznych podzbiorów komórek szpikowych, które infiltrują mózg myszy po niedokrwieniu mózgu, można osiągnąć odpowiednio za pomocą stereokwantyfikacji i wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Główną zaletą tego seryjnego modelu niedokrwienia w porównaniu z innymi istniejącymi jest to, że nasza technika ma znacznie niższy wskaźnik śmiertelności niż inne metody, minimalizując liczbę zwierząt potrzebnych do badania.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie udaru, takie jak rola mikroreaktywacji, wynaczynienia makrofagów krwiotwórczych lub neutrofili w uszkodzeniu mózgu? Dokładna teologiczna kwantyfikacja podejść cytometrii wieloparametrycznej zademonstrowana w tym artykule może dostarczyć wglądu w liczbę, fenotyp i funkcję populacji komórek szpikowych zarówno w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na niedokrwienie CE. Aby najpierw podwiązać CCA, wykonaj jednocentymetrowe nacięcie linii środkowej wokół brzusznej powierzchni szyi zwierzęcia pod mikroskopem chirurgicznym.Po wycięciu użyj nylonowego szwu z sześcioma zerami, aby zakryć lewe CCA za pomocą stałego węzła, aby podwiązać dystalną MCA. Następnie wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego od prawej do lewej. Następnie wykonaj drugie pionowe nacięcie po prawej stronie mięśnia skroniowego.Uważając, aby nie przeciąć żyły skroniowej. Odciągnij mięsień skroniowy od czaszki i przytrzymaj go szwem, aby utrzymać czystą powierzchnię czaszki. Następnie oczyść czaszkę zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby wykryć dokładną pozycję lewego MCA poprzez przezroczystość czaszki.Po zidentyfikowaniu MCA użyj zadzioru ze stali nierdzewnej, aby wykonać jednomilimetrową okrągłą kraniotomię w płacie czołowym między łukiem jarzmowym a kością płaskonabłonkową. Ostrożnie wyjmij czaszkę, odsłaniając MCA. Następnie użyj dziewięciokrotnego szwu nylonowego, aby zamknąć lewy MCA w dystalnym tułowiu tuż przed rozwidleniem między przednimi i tylnymi gałęziami MCA za pomocą stałego węzła.Aby usunąć mózg, odetnij głowę uświęconej myszy tuż nad rdzeniem kręgowym i wykonaj tylne przednie nacięcie w skórze, aby odsłonić czaszkę. Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia na styku ścian bocznych i podstawy czaszki i usuń mały kawałek kości. Następnie wykonaj przecięcie czaszki wzdłuż szwu strzałkowego i użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę pokrywającą każdą półkulę, aby odsłonić mózg.Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg od czaszki i przenieś go do 4% roztworu PFA. Po trzech godzinach usuń PFA i inkubuj mózg w 30% roztworze sacharozy, aby kriochronić mózg. Po 48 godzinach usuń roztwór sacharozy i szybko zamroź mózg w ujemnym 40 stopniach Celsjusza izop pentanie, a następnie użyj mikrotomu do zamrażania, aby wykonać 30-mikrometrowe koronalne sekcje mózgu.Zebranie 10 zestawów seryjnych w roztworze krio konserwującym. Każdy zestaw szeregowy składa się z około 14 do 16 wycinków koronalnych o odległości między warstwami wynoszącej 300 mikrometrów. Aby zapewnić odpowiednie pobieranie próbek z mózgu myszy między 1,94 a minus 2,46 za bgma, aby oszacować całkowitą liczbę naciekanych neutrofili.Po zamknięciu MCA za pomocą frakcjonatora optycznego najpierw wybarwić immunogranulofile przeciwciałem szczurzym anty LY six G i odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym na pływających odcinkach za pomocą konwencjonalnej techniki immunofluorescencji. Następnie zamontuj skrawki mózgu na szkiełkach mikroskopowych super frosts z obszarem zawału umieszczonym po prawej stronie i otwórz oprogramowanie stereo investigator. Następnie kliknij menu menedżera sekcji szeregowych narzędzi i dodaj nową sekcję za pomocą przycisku nowej sekcji.Ustaw interwał oceny na 10 dla jednej frakcji próbkowania 10. wycinka. A następnie z menu kontur w dół wybierz narzędzie do konturowania obszaru po zawale. Narysuj kontur, aby obrysować obszar zawału pod obiektywem 10x.Następnie przełącz się na obiektyw 100 x w mikroskopie i w menu obiektywu. Aby określić ilościowo neutrofile w menu sond, wybierz teraz frakcjonator optyczny i ustaw rozmieszczenie ramek zliczających XY na 230 zarówno dla rozmiarów siatki X, jak i Y. Teraz wybierz przycisk neutrofili z paska znaczników i zaznacz barwione neutrofile w obszarze zawału.Eksportuj wyniki kwantyfikacji do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby rozdzielić mózg na zawiesinę pojedynczej komórki. Po usunięciu mózgu, jak właśnie pokazano, wypreparuj rdzeń i obszary wokół zawału kory ipsilateralnej z mózgu myszy niedokrwionej mózgu. Zważ tkankę mózgową i umieść ją w pięciu mililitrach lodowatego RPMI na wezwanie do normalizacji między grupami eksperymentalnymi, a następnie użyj młynka do tkanek z tłuczkami teflonowymi, aby zdysocjować tkankę na zawiesinę pojedynczej komórki.Przenieś zawiesiny komórek do 50-mililitrowej probówki ultrawirówkowej i dodaj do próbek pięć dodatkowych mililitrów RPMI na roztwór wywołania. Następnie po odwirowaniu zawiesin komórek przez 30 minut w temperaturze 7, 800 GS i 25 stopni Celsjusza. Upewnij się, że na górze roztworu znajduje się biała warstwa odpowiadająca mielinie.Ostrożnie usuń warstwę mieliny i przefiltruj całą zawiesinę komórek, w tym komórki granulowane, przez sitko z nylonowej siatki o grubości 40 mikrometrów. Umyj sitko 10 mililitrami RPMI, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przefiltrowane przez siatkę, a następnie przenieś roztwór do 50-mililitrowej probówki. Dodaj 20 mililitrów RPMI do komórek, a następnie po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad leukocytów.W jednym mililitrze PBS inkubuj komórki przez dwie do trzech minut w czterech mililitrach buforu do lizy w temperaturze pokojowej, aby przelicytować erytrocyty, a następnie odwirować komórki. Oznaczyć komórki w 200 mikrolitrach PBS zawierających 1% BSA i odpowiednie przeciwciała na lodzie. Następnie po 45 minutach przemyć próbki jednym mililitrem zimnego PBS i Resus ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach bufora przepływu faksu do analizy cytometrycznej przepływowej.Model ten charakteryzuje się wysoce powtarzalnymi objętościami zawału po 24 godzinach od niedrożności tętnicy środkowej mózgu, oszacowaną metodą cavalieri. W skrawkach barwionych nialem zgodnie z wcześniejszymi badaniami naciek neutrofili jest bezpośrednio skorelowany z wielkością zawału. Dodatkowo, izolacja leukocytów i charakterystyka cytometrii przepływowej pozwala na izolację komórek szpikowych z kory półkuli zmiany chorobowej IPS myszy niedokrwiennych, które stanowią od 10 do 30% wszystkich zdarzeń znalezionych w zawiesinie komórek i wykazują niski parametr rozpraszania do przodu, który jest związany z resztkami komórkowymi.Komórki CD 11 B dodatnie mają wyższą wartość rozproszenia do przodu, co sugeruje, że szczątki komórkowe nie są znakowane tym markerem i, jak wskazano wcześniej, że można je wykluczyć z dalszej analizy, ustawiając próg FSC na 200 neutrofili scharakteryzowanych jako LY sześć komórek G dodatnich jest najliczniejszą infiltrowaną populacją komórek znalezioną po 24 godzinach od okluzji MCA w niedokrwionym mózgu myszy przy użyciu tego modelu niedokrwienia mózgu i zawierają od 70 do 80% wysokich komórek CD 11 B dodatnich CD 45. Reszta komórek to głównie subpopulacja CD 11 B, dodatniego CD 45, wysokiego LY 6 G, ujemnie sześciu C o wysokim poziomie prozapalnym, które znajdują się w podwyższonej liczbie w niedokrwionych obszarach mózgu od 24 do 48 godzin po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Ten model P-M-C-A-O można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo Zgodnie z procedurą cytometrii przepływowej.Inne metody, takie jak sortowanie określonego podzbioru komórek, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wzorce ekspresji, zmiany metaboliczne lub aktywność octowa komórek szpikowych w tym systemie modelowym. Po obejrzeniu tego filmu tylko po to, aby dobrze zrozumieć, jak stworzyć model niedokrwienia i co najważniejsze, jak scharakteryzować liczbę i fenotyp naciekających komórek szpikowych za pomocą dwóch różnych podejść w urazie mózgu myszy lub tpe po modelu niedokrwienia cere.

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje szybki protokół wydajnej izolacji komórek mononuklearnych z tkanek mózgu i rdzenia kręgowego, które mogą być skutecznie wykorzystane w analizach cytometrycznych.

Izolacja mononuklearnych komórek mózgu i rdzenia kręgowego z wykorzystaniem gradientów Percollu

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Przedstawiono sposób na uzyskanie nowego wglądu w złożoność reakcji zapalnej mózgu. Opisujemy protokoły oparte na immunofluorescencji, po których następuje trójwymiarowa analiza konfokalna w celu zbadania wzorca koekspresji markerów fenotypu mikrogleju / makrofagów w mysim modelu ogniskowego niedokrwienia.

Trójwymiarowa analiza konfokalna markerów polaryzacji mikrogleju/makrofagów w eksperymentalnym uszkodzeniu mózgu

Modele udaru zakrzepowo-zatorowego są kluczowymi narzędziami do optymalizacji terapii rekanalizacyjnej. W tym miejscu przedstawiamy mysi model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu niedotlenienia i niedokrwieniu mózgu (tHI), które wywołuje zakrzepicę i zawał oraz pozytywnie reaguje na fibrynolizację za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w oknie terapeutycznym podobnym do tych u pacjentów po udarze.

Model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu-niedokrwieniu mózgu

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Poznaj metody stereologii i cytometrii przepływowej do charakterystyki subpopulacji leukocytów mieloidalnych w mózgu po udarze. Techniki te umożliwiają dokładną ilościową i jakościową analizę komórek.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Przeglądaj więcej filmów