Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie podzbiorów komórek szpikowych myszy w niedokrwionym mózgu za pomocą dwóch różnych metodologii. Po pierwsze, wprowadzany jest stały model niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie zarówno tętnicy szyjnej wspólnej lub CCA, jak i dystalnego pnia tętnicy środkowej mózgu lub zawału MCA, który wpływa głównie na korę mózgową. Następnie, w celu stereologicznej kwantyfikacji podzbiorów komórek szpikowych, seryjne odcinki koronalne mózgu są barwieniem immunologicznym dla komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie naciekane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą optycznego frakcjonatora.

Alternatywnie, komórki szpikowe można wyizolować ze świeżej tkanki mózgowej przez mechaniczną dysocjację, a następnie wybarwić i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie dokładna kwantyfikacja i szczegółowa charakterystyka jakościowa specyficznych podzbiorów komórek szpikowych, które infiltrują mózg myszy po niedokrwieniu mózgu, można osiągnąć odpowiednio za pomocą stereokwantyfikacji i wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Główną zaletą tego seryjnego modelu niedokrwienia w porównaniu z innymi istniejącymi jest to, że nasza technika ma znacznie niższy wskaźnik śmiertelności niż inne metody, minimalizując liczbę zwierząt potrzebnych do badania.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie udaru, takie jak rola mikroreaktywacji, wynaczynienia makrofagów krwiotwórczych lub neutrofili w uszkodzeniu mózgu? Dokładna teologiczna kwantyfikacja podejść cytometrii wieloparametrycznej zademonstrowana w tym artykule może dostarczyć wglądu w liczbę, fenotyp i funkcję populacji komórek szpikowych zarówno w wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na niedokrwienie CE. Aby najpierw podwiązać CCA, wykonaj jednocentymetrowe nacięcie linii środkowej wokół brzusznej powierzchni szyi zwierzęcia pod mikroskopem chirurgicznym.

Po wycięciu użyj nylonowego szwu z sześcioma zerami, aby zakryć lewe CCA za pomocą stałego węzła, aby podwiązać dystalną MCA. Następnie wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego od prawej do lewej. Następnie wykonaj drugie pionowe nacięcie po prawej stronie mięśnia skroniowego.

Uważając, aby nie przeciąć żyły skroniowej. Odciągnij mięsień skroniowy od czaszki i przytrzymaj go szwem, aby utrzymać czystą powierzchnię czaszki. Następnie oczyść czaszkę zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby wykryć dokładną pozycję lewego MCA poprzez przezroczystość czaszki.

Po zidentyfikowaniu MCA użyj zadzioru ze stali nierdzewnej, aby wykonać jednomilimetrową okrągłą kraniotomię w płacie czołowym między łukiem jarzmowym a kością płaskonabłonkową. Ostrożnie wyjmij czaszkę, odsłaniając MCA. Następnie użyj dziewięciokrotnego szwu nylonowego, aby zamknąć lewy MCA w dystalnym tułowiu tuż przed rozwidleniem między przednimi i tylnymi gałęziami MCA za pomocą stałego węzła.

Aby usunąć mózg, odetnij głowę uświęconej myszy tuż nad rdzeniem kręgowym i wykonaj tylne przednie nacięcie w skórze, aby odsłonić czaszkę. Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia na styku ścian bocznych i podstawy czaszki i usuń mały kawałek kości. Następnie wykonaj przecięcie czaszki wzdłuż szwu strzałkowego i użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę pokrywającą każdą półkulę, aby odsłonić mózg.

Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg od czaszki i przenieś go do 4% roztworu PFA. Po trzech godzinach usuń PFA i inkubuj mózg w 30% roztworze sacharozy, aby kriochronić mózg. Po 48 godzinach usuń roztwór sacharozy i szybko zamroź mózg w ujemnym 40 stopniach Celsjusza izop pentanie, a następnie użyj mikrotomu do zamrażania, aby wykonać 30-mikrometrowe koronalne sekcje mózgu.

Zebranie 10 zestawów seryjnych w roztworze krio konserwującym. Każdy zestaw szeregowy składa się z około 14 do 16 wycinków koronalnych o odległości między warstwami wynoszącej 300 mikrometrów. Aby zapewnić odpowiednie pobieranie próbek z mózgu myszy między 1,94 a minus 2,46 za bgma, aby oszacować całkowitą liczbę naciekanych neutrofili.

Po zamknięciu MCA za pomocą frakcjonatora optycznego najpierw wybarwić immunogranulofile przeciwciałem szczurzym anty LY six G i odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym na pływających odcinkach za pomocą konwencjonalnej techniki immunofluorescencji. Następnie zamontuj skrawki mózgu na szkiełkach mikroskopowych super frosts z obszarem zawału umieszczonym po prawej stronie i otwórz oprogramowanie stereo investigator. Następnie kliknij menu menedżera sekcji szeregowych narzędzi i dodaj nową sekcję za pomocą przycisku nowej sekcji.

Ustaw interwał oceny na 10 dla jednej frakcji próbkowania 10. wycinka. A następnie z menu kontur w dół wybierz narzędzie do konturowania obszaru po zawale. Narysuj kontur, aby obrysować obszar zawału pod obiektywem 10x.

Następnie przełącz się na obiektyw 100 x w mikroskopie i w menu obiektywu. Aby określić ilościowo neutrofile w menu sond, wybierz teraz frakcjonator optyczny i ustaw rozmieszczenie ramek zliczających XY na 230 zarówno dla rozmiarów siatki X, jak i Y. Teraz wybierz przycisk neutrofili z paska znaczników i zaznacz barwione neutrofile w obszarze zawału.

Eksportuj wyniki kwantyfikacji do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby rozdzielić mózg na zawiesinę pojedynczej komórki. Po usunięciu mózgu, jak właśnie pokazano, wypreparuj rdzeń i obszary wokół zawału kory ipsilateralnej z mózgu myszy niedokrwionej mózgu. Zważ tkankę mózgową i umieść ją w pięciu mililitrach lodowatego RPMI na wezwanie do normalizacji między grupami eksperymentalnymi, a następnie użyj młynka do tkanek z tłuczkami teflonowymi, aby zdysocjować tkankę na zawiesinę pojedynczej komórki.

Przenieś zawiesiny komórek do 50-mililitrowej probówki ultrawirówkowej i dodaj do próbek pięć dodatkowych mililitrów RPMI na roztwór wywołania. Następnie po odwirowaniu zawiesin komórek przez 30 minut w temperaturze 7, 800 GS i 25 stopni Celsjusza. Upewnij się, że na górze roztworu znajduje się biała warstwa odpowiadająca mielinie.

Ostrożnie usuń warstwę mieliny i przefiltruj całą zawiesinę komórek, w tym komórki granulowane, przez sitko z nylonowej siatki o grubości 40 mikrometrów. Umyj sitko 10 mililitrami RPMI, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przefiltrowane przez siatkę, a następnie przenieś roztwór do 50-mililitrowej probówki. Dodaj 20 mililitrów RPMI do komórek, a następnie po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad leukocytów.

W jednym mililitrze PBS inkubuj komórki przez dwie do trzech minut w czterech mililitrach buforu do lizy w temperaturze pokojowej, aby przelicytować erytrocyty, a następnie odwirować komórki. Oznaczyć komórki w 200 mikrolitrach PBS zawierających 1% BSA i odpowiednie przeciwciała na lodzie. Następnie po 45 minutach przemyć próbki jednym mililitrem zimnego PBS i Resus ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach bufora przepływu faksu do analizy cytometrycznej przepływowej.

Model ten charakteryzuje się wysoce powtarzalnymi objętościami zawału po 24 godzinach od niedrożności tętnicy środkowej mózgu, oszacowaną metodą cavalieri. W skrawkach barwionych nialem zgodnie z wcześniejszymi badaniami naciek neutrofili jest bezpośrednio skorelowany z wielkością zawału. Dodatkowo, izolacja leukocytów i charakterystyka cytometrii przepływowej pozwala na izolację komórek szpikowych z kory półkuli zmiany chorobowej IPS myszy niedokrwiennych, które stanowią od 10 do 30% wszystkich zdarzeń znalezionych w zawiesinie komórek i wykazują niski parametr rozpraszania do przodu, który jest związany z resztkami komórkowymi.

Komórki CD 11 B dodatnie mają wyższą wartość rozproszenia do przodu, co sugeruje, że szczątki komórkowe nie są znakowane tym markerem i, jak wskazano wcześniej, że można je wykluczyć z dalszej analizy, ustawiając próg FSC na 200 neutrofili scharakteryzowanych jako LY sześć komórek G dodatnich jest najliczniejszą infiltrowaną populacją komórek znalezioną po 24 godzinach od okluzji MCA w niedokrwionym mózgu myszy przy użyciu tego modelu niedokrwienia mózgu i zawierają od 70 do 80% wysokich komórek CD 11 B dodatnich CD 45. Reszta komórek to głównie subpopulacja CD 11 B, dodatniego CD 45, wysokiego LY 6 G, ujemnie sześciu C o wysokim poziomie prozapalnym, które znajdują się w podwyższonej liczbie w niedokrwionych obszarach mózgu od 24 do 48 godzin po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Ten model P-M-C-A-O można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo Zgodnie z procedurą cytometrii przepływowej.

Inne metody, takie jak sortowanie określonego podzbioru komórek, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wzorce ekspresji, zmiany metaboliczne lub aktywność octowa komórek szpikowych w tym systemie modelowym. Po obejrzeniu tego filmu tylko po to, aby dobrze zrozumieć, jak stworzyć model niedokrwienia i co najważniejsze, jak scharakteryzować liczbę i fenotyp naciekających komórek szpikowych za pomocą dwóch różnych podejść w urazie mózgu myszy lub tpe po modelu niedokrwienia cere.