Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę generowania iPSC od pacjentów z dystrofią mięśniową z komórek moczu przy użyciu wirusa Sendai. Nieinwazyjna technika przeprogramowania bez integracji transgenu potwierdzona po 13 pasowaniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tego protokołu był wspierany przez Advancing a Healthier Wisconsin i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, poprzez grant numer 8UL1TR000055. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

UWAGA: Pacjenci i/lub ich opiekunowie powinni wyrazić świadomą zgodę na udział w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board.
1. i preparaty pożywek
<ol>
	<li>Bufor do przemywania: Aby przygotować 100 ml buforu do mycia, dodać 1 ml 100x roztworu wstrzykiwacza/paciorkowca (100 j./ml penicyliny + 100 μg/ml streptomycyny) do 99 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS).</li>
	<li>Pożywka dla komórek progenitorowych moczu (UPC): Aby przygotować pożywkę UPC, wymieszaj równe objętości pożywki wolnej od keratynocytów (KSF) + pożywki z komórek progenitorowych.
	<ol>
		<li>Pożywka KSF: Aby przygotować pożywkę keratynocytów, dodaj 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 50 ng/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 30 ng/ml toksyny i roztwór wstrzykiwacza/paciorkowca (100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) do 500 ml pożywki KSF.</li>
		<li>Pożywka z komórek progenitorowych: Dodaj trzy czwarte DMEM z jedną czwartą pożywki Ham-F12 i uzupełnij 10% FBS, 0,4 μg / ml hydrokortyzonu, 0,1 nM toksyny, 5 ng / ml insuliny, 1,8 x 10-4 M adenina, 5 μg / ml transferyny, 2 x 10-9 M trijodo tyroniny, 10 ng / ml EGF i roztwór pióra / paciorkowca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>hES Medium: Dodaj 20% zamiennika surowicy KO (K-SR), 1x MEM aminokwasy endogenne, 2 mM l-glutaminy, 100 μM β-merkaptoetanolu, 20 ng/ml bFGF i długopis/paciorkowca do 400 ml pożywki DMEM/F12.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek moczu
<ol>
	<li>Poinstruuj pacjentów, aby pili płyny na 30 minut przed pobraniem moczu, aby upewnić się, że można zebrać odpowiednią ilość (~30-40 ml) moczu.</li>
	<li>Przekaż pacjentom i/lub ich opiekunom zestaw do pobierania moczu zawierający następujące elementy: (1) pisemne instrukcje dotyczące sposobu uzyskania sterylnej lub czystej próbki moczu, (2) wilgotne antybakteryjne toalety oraz (3) sterylny kubek do pobierania próbek o pojemności 100 ml. Poinstruuj pacjentów, aby pobrali próbkę.</li>
	<li>Próbki moczu należy natychmiast umieścić na lodzie i przenieść do laboratorium w chłodziarce. Natychmiast przetworzyć mocz w celu izolacji komórek. Jeśli opóźnienie jest nieuniknione, przechowuj próbkę na lodzie do 4 godzin przy minimalnej utracie żywotności komórek.</li>
</ol>
3. Izolacja i ekspansja komórek moczu
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w sterylnych warunkach w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego BSL2.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnych pipet przenieś próbki moczu do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Wirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant, pozostawiając 1 ml w probówce; należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić i połączyć granulki z wielu probówek w 7 ml buforu płuczącego i powtórzyć wirowanie przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad komórkowy i ~0,2–0,5 ml supernatantu. Zawiesić ponownie w 2-3 ml pożywki z komórek progenitorowych moczu (UPC) i przenieść zawiesinę do 4-6 dołków niepowlekanej płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Po 72 godzinach uzupełnij pożywkę 0,5 ml świeżej pożywki UPC na studzienkę i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Erytrocyty i komórki płaskonabłonkowe, które nie przyczepiają się do płytki, zostaną usunięte wraz ze zmianami pożywki.</li>
	<li>Monitoruj posiew po 4–6 dniach. 
	UWAGA: Zaczną pojawiać się małe kolonie po 2–4 komórki. Komórki będą zaokrąglone lub wydłużone, które reprezentują odpowiednio typ I lub typ II komórek nabłonka nerek (RE)3.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, ponieważ gdy komórki się pojawią, przejdą fazę szybkiej ekspansji.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, około 9-15 dni po posiewie, zdysocjuj i przejdź komórki (15 000-18 000 komórek/cm2) do 2-4 dołków z 24-dołkową płytką w celu dalszej ekspansji. Oznacz to jako przejście komórkowe 1 (P1).</li>
	<li>Scharakteryzuj komórki moczu pod kątem specyfikacji linii poprzez analizę cytometrii przepływowej, barwienie immunohistochemiczne lub reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (RT-PCR).</li>
	<li>Przeprogramuj wyizolowane komórki moczu (sekcja 4) lub zamroź je w pożywce zamrażającej (DMEM uzupełniony 10% surowicy i 10% DMSO) w celu długotrwałego krioprzechowywania.</li>
</ol>
4. Przeprogramowanie komórek moczowych za pomocą wirusa Sendai
UWAGA: Podczas manipulowania środkami transfekującymi zaleca się właściwe obchodzenie się i stosowanie środków ochrony osobistej (PPE). Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2. Zaleca się właściwą utylizację czynnika transfekującego i/lub transfekowanych komórek, aby uniknąć ryzyka zagrożeń dla środowiska i zdrowia. Do przeprogramowania komórek moczu użyj zestawu do przeprogramowania Sendai z modyfikacjami protokołu zależnego od podajnika producenta, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li>Aby zapewnić wysoką skuteczność przeprogramowania za pomocą wirusa Sendai, należy użyć pasaży 1-5 komórek moczu, które szybko się dzielą. Jeśli komórki nie replikują się dobrze lub starzeją się, wyrzuć je, ponieważ nie przeprogramują się skutecznie.</li>
	<li>Wysiej 60 000 komórek na studzienkę w dwóch dołkach na płytce 6-dołkowej. Oznacz to jako Dzień -2. Dostosuj gęstość wysiewu komórek (5 x 104 – 9 x 104 komórki na studzienkę) zgodnie z potrzebami, aby osiągnąć 80–90% konfluencji do dnia 0.</li>
	<li>W dniu 0 (48 godzin po posianiu komórek) przygotuj wektory przeprogramowania Sendai (SeV) zawierające każdy z czterech czynników OSKM. Dodaj każdy z wektorów do 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki UPC. Użyj MOI 1-1,5 (5-7,5 x 105 CIU), który jest wystarczający do przeprogramowania komórek moczu. Odessać pożywkę i powoli dodawać 1 ml UPC + SeV do jednego dołka komórek moczu. Użyć drugiej studzienki jako kontroli ujemnej transdukcji.</li>
	<li>W dniu 1 wymień pożywkę UPC + SeV na nową pożywkę UPC. Pewną śmierć komórek obserwuje się po 24 godzinach z powodu cytotoksyczności wirusa.</li>
	<li>W zależności od wydajności przeprogramowanych formacji klonów i zwartej morfologii, należy zmieniać pożywkę codziennie do 6 lub 7 dnia.</li>
	<li>Na jeden dzień przed dysocjacją transdukowanych komórek (dzień 5 lub 6) należy przygotować płytki zasilające MEF, posiewając MEF-y poddane działaniu Mitomyciny-C (10 μg/ml przez 3 godziny) w gęstości 5 x 104 komórek/cm2, na 0,1% pokrytych żelatyną 100 mm2 szalkach hodowlanych.</li>
	<li>Następnego dnia (6 lub 7 dzień) zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny, ponownie zawieś komórki w pożywce UPC i płytce 5 x 104 – 2 x 105 komórek/100 mm2 MEF płytka zasilająca.</li>
	<li>Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę hES i zmieniaj pożywkę codziennie. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby monitorować przekształcone komórki. 
	UWAGA: Komórki tworzą agregaty klonalne o charakterystycznej morfologii brukowej i wyższym stosunku jądra do cytoplazmy (12–18 dni po transdukcji).</li>
	<li>W ciągu dwóch do trzech tygodni po transdukcji zbierz kolonie i przenieś je na nowe płytki w celu ekspansji klonalnej.</li>
	<li>Przeprowadzić barwienie żywych komórek w celu wybrania klonów iPSC, inkubując komórki z przeciwciałem TRA-1-81 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , a następnie barwienie przeciw specyficznym przeciwciałem wtórnym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Użyj igły 26 G 11/2 cala, aby kreskować większe klony TRA-1-81 z dodatnim iPSC na małe równe kawałki (4-6 sztuk na klon).</li>
	<li>Użyj sterylnej końcówki pipety, aby pobrać i przenieść 10–20 zakreskowanych kawałków z wielu klonów do każdego dołka 24-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem (10 μg/cm2) z podłożem hES. 
	UWAGA: Kawałki z pojedynczego klonu posiane pojedynczo w jednym dołku nie rozszerzają się ani nie utrzymują pluripotencji.</li>
	<li>Zmiana z pożywki hES na iPSC w ciągu 24–48 godzin po przymocowaniu przeprogramowanych klonów do powierzchni Matrigel.</li>
	<li>Podczas konserwacji na płytkach pokrytych Matrigelem należy ręcznie zeskrobać wszelkie zróżnicowane komórki lub zanieczyszczające komórki zasilające MEF za pomocą końcówki pipety, aby wzbogacić do w pełni przeprogramowanych i pluripotencjalnych dystroficznych klonów iPSC (MD-iPSC).</li>
	<li>Po osiągnięciu przez poszczególne klony wielkości ~100 μm, rozpręż klony, dysocjując z 0,48 mM roztworem EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) przez 3 minuty i posiewając małe agregaty komórkowe MD-iPSC zawieszone w pożywce iPSC (uzupełnionej 5 μM Y27632, inhibitorem kinazy RhO) na świeżej matrygelu (10 μg / cm2) pokrytej 12-dołkową płytką. Codziennie zmieniaj pożywkę iPSC.</li>
	<li>Pełne przeprogramowanie każdego klonu można określić zarówno przez analizę ekspresji genów OSKM, jak i immunohistochemiczne barwienie markerów pluripotencji (Oct3/4 i TRA-1-81). Należy przeprowadzić rygorystyczną ocenę potencjału pluripotencji, aby potwierdzić, że w pełni przeprogramowane linie iPSC mogą różnicować się w trzy listki zarodkowe. Można to osiągnąć za pomocą testu tworzenia i różnicowania ciał zarodkowych (EB) lub testu tworzenia potworniaków.</li>
</ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Modelowanie chorób sercowo-naczyniowych za pomocą iPSC staje się powszechnym podejściem do zrozumienia wkładu genetycznego4-6. Niektórych nieprzewidzianych trudności w pobieraniu próbek komórek od pacjentów, zwłaszcza małych dzieci, można uniknąć, oferując opcję nieinwazyjnego podejścia, takiego jak pobieranie moczu. W tej młodej populacji pacjentów często trudno jest zebrać wystarczającą ilość moczu, aby wytworzyć wystarczającą ilość komórek moczu do przeprogramowania. Szkolenie małych pacjentów, aby pili pły...

Kardiomiopatia jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a i Beckera (MD). Chociaż mutacje w genie dystrofiny sprzężonej z chromosomem X występują w stosunku 1:3500 urodzeń płci męskiej, bardzo niewiele wiadomo na temat zdarzeń molekularnych i komórkowych prowadzących do postępującego uszkodzenia mięśnia sercowego. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjentów z dystrofią mięśniową stały się nowym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw choroby i do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków1,2.
Przewidywany dyskomfort związany z biopsjami skóry lub próbkami krwi może zniechęcić młodych pacjentów i/lub ich opiekunów do wyrażenia zgody na udział w badaniu. Próbki moczu są nieinwazyjnym źródłem komórek somatycznych, które można poddać metodom przeprogramowania. Niedawno wykazaliśmy, że komórki moczu pobrane od pacjentów z dystrofią mięśniową mogą być hodowane i skutecznie przeprogramowywane do iPSC za pomocą transdukcji retrowirusowej z czynnikami Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-Myc; OSKM)1. Wadą retrowirusowego dostarczania genów jest losowa integracja genów przeprogramowujących z chromosomami gospodarza. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, użyliśmy nieintegrującego się wirusa Sendai do przeprogramowania komórek moczu.
Ten protokół szczegółowo opisuje przeprogramowanie wirusa Sendai izolowanych komórek moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową, które następnie mogą być różnicowane w kardiomiocyty lub inne typy komórek do dalszych badań. Protokół ten można również dostosować do innych chorób specyficznych dla pacjenta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały</td></tr><tr><td>4 Oz. Kubek na próbki z pokrywką</td><td>STL Zaopatrzenie medyczne</td><td>M9AMSAS340</td><td>do pobierania próbek moczu</td></tr><tr><td>15 ml Probówki BD-Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurki BD-Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przeprogramowania CytoTune-iPS Sendai Life Technologies</td><td></td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep bez glutaminy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>B-27 Suplement z insuliną (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Suplement B-27 bez insuliny (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Versene, 1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>Warm in 37 &deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>bFGF (10 &mikro; g)</td> <td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Wkłady do licznika komórek</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum (500&nbsp; ml Butelka)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratynocyte-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td>Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM, Wysoka Glukoza, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>EGF Rekombinowane białko ludzkie, Liquid Form</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311L</td><td>Warm in 37 & deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Insulina, rekombinant ludzki, Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK (Y-27632)</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Matryca z kwalifikacją hESC, LVED Free</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Kwalifikowany FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Bioreagent adeninowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Toksyna od Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>Ciepły w 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Holo-transferyna od człowieka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>3,3',5-trijodo-L-tyronina sól sodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aquous podłoże montażowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>Mouse anty CD44 - oznaczone FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anty CD146 - oznaczone PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti CD73 - oznaczone PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Mysia aktyna anty-&alfa;-mięśni gładkich</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-Vimentin</td><td>Abcam ab8978-100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty 3/4 października</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti Dystrofin</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Kardiomiopatia dystroficzna jest słabo poznaną konsekwencją dystrofii mięśniowej. Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów z dystrofią mięśniową jest nieocenionym źródłem komórkowym dla systemów modelowych chorób in vitro i może być wykorzystywane do badań przesiewowych leków. Komórki moczu pochodzące od pacjentów zostały wykorzystane w skutecznym przeprogramowaniu na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w celu modelowania kardiomiopatii dystroficznej1. Odnosząc się do obaw związanych z bezpieczeństwem integracji systemów wektorowych, przedstawiamy protokół wykorzystujący nieintegrujący wektor wirusa Sendai do transdukcji czynników Yamanaka do komórek moczu pobranych od pacjentów z dystrofią mięśniową. Protokół ten generuje w pełni przeprogramowane klony w ciągu 2-3 tygodni. Komórki pluripotencjalne są wolne od wektorów przez pasaż-13. Te dystroficzne iPSC mogą być różnicowane w kardiomiocyty i wykorzystywane do badania mechanizmów choroby lub do badań przesiewowych leków.

Większość komórek progenitorowych wyizolowanych z ludzkiego moczu wykazuje pozytywny wynik w kierunku markerów progenitorów uroepithelialnych i perycytycznych, takich jak CD44, CD73 oraz CD146 (odpowiednio 97,37%, 97,09% i 97,3%; Rycina 1A i 1B). Komórki te wykazują również ekspresję innych markerów mezenchymalnych, takich jak alfa-aktyna mięśni gładkich oraz wimentyna (Rycyna 1B). Analiza RT-PCR dostarcza dowodów na obecność mieszanej populacji komórek w kulturach, o cz...

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest efektywne generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC od pacjentów z dystrofią mięśniową, począwszy od hodowli komórkowych pochodzących z moczu i metody przeprogramowania bez integracji. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw próbek moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową. W drugim etapie komórki moczu są izolowane i namnażane do kultur komórkowych pochodzących z moczu.Następnie komórki pochodzące z moczu są transdukowane wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka i po 12 dniach pojawiają się typowe kolonie podobne do pluripotencjalnych. Ostatecznie, poprzez pasaż 13, stan wolny od transgenu pluripotencjalnych komórek macierzystych można potwierdzić za pomocą analizy R-T-P-C-R. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przeprogramowanie izolowanych fibroblastów skóry za pomocą wektorów lentiwirusowych, jest to, że dzięki tej technice komórki somatyczne można nieinwazyjnie pozyskać od pacjentów i wykorzystać do wydajnego generowania IPC przy użyciu metody przeprogramowania wirusa o zerowym śladzie.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej, takie jak to, w jaki sposób warunki te mogą być modelowane in vitro bez obaw o bezpieczeństwo stosowania u ludzi. Procedury zademonstrują Mohammad Zishan Al, doktor habilitowany Courtney Guesting, technik i doktorantka Melanie Ryder, wszyscy trzej z mojego laboratorium Aby pobrać próbkę moczu, zacznij od poinformowania pacjenta, aby pił płyny 30 minut przed pobraniem, aby upewnić się, że można zebrać około 30 do 40 mililitrów moczu. Gdy pacjent jest gotowy, należy mu przekazać zestaw do pobierania moczu zawierający następujące elementy, pisemne instrukcje, jak uzyskać sterylne lub czyste, bardziej chwytliwe i wilgotne toalety antybakteryjne oraz 100-mililitrowy sterylny kubek do pobierania próbek.Po pobraniu próbki natychmiast umieść kubek zbiorczy na lodzie i przenieś próbkę do laboratorium w chłodziarce. Następnie za pomocą sterylnych pipet przenieś próbkę moczu do sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych i obracaj probówki pod ciśnieniem 400 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, w dwóch komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL odessać cały oprócz ostatniego, mililitra supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu.Następnie umyj komórki w siedmiu mililitrach buforu płuczącego i ponownie odwiruj ogniwa. Tym razem zasysanie wszystkich oprócz ostatnich około 0,2 do 0,5 mililitra supernatantu. Teraz ponownie użyj osadu w dwóch do trzech mililitrach komórki progenitorowej moczu lub pożywki UPC i przenieś zawiesinę do czterech do sześciu dołków niepowlekanej 24-dołkowej płytki po 72 godzinach, uzupełnij kulturę 0,5 mililitra świeżej pożywki UPC na dołek.Monitoruj kulturę przez okres od czterech do sześciu dni inkubacji. Powinny zacząć pojawiać się małe, dwu- lub czterokomórkowe kolonie zaokrąglonych lub wydłużonych komórek reprezentujących odpowiednio komórki nabłonka nerkowego typu pierwszego lub drugiego. Kontynuuj zmianę podłoża co dwa do trzech dni.Ponieważ kolonie przejdą fazę szybkiej ekspansji po około dziewięciu do 15 dniach hodowli, komórki powinny w tym momencie zlewać się w 80 do 90%, podziel komórki na dwie do czterech studzienek na 24-dołkowej płytce w celu dalszej ekspansji. Oznaczając tę hodowlę jako pasaż komórkowy, komórki moczu można następnie scharakteryzować pod kątem markerów specyficznych dla linii poprzez analizę cytometrii przepływowej, barwienie immunohistochemiczne lub reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą, aby zapewnić wysoką wydajność przeprogramowania na dni przed zasiewem transdukcji, 60 000 komórek na dołek. Z przejścia od pierwszego do piątego kultura do dwóch studzienek z sześciodołkową płytką w dniu zero.Przygotuj wektor przeprogramowania Sendai, dodając każdy z czterech czynników OSKM w odpowiednim MLI do przeprogramowania na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki UPC, odessać pożywkę suspensową i powoli dodawać zawiesinę wirusa do jednego dołka komórek moczu przez następne sześć dni. Zastępować supernatant codziennie świeżą pożywką UPC w piątym dniu płytki MES zaprawionej nasionami mitomycyny na pokrytych żelatyną 100-milimetrowych kwadratowych szalkach hodowlanych szóstego dnia. Oddziel komórki moczu za pomocą trypsyny, zawieś je ponownie w pożywce UPC i umieść je na płytce pięć razy 10 czwartej do dwóch razy 10 piątych komórek na płytkę podającą metamfetaminę.Następnego dnia zastąp pożywkę UPC pożywką w ludzkim stadium embrionalnym lub pożywką HES i monitoruj komórki pod mikroskopem, aby obserwować transformowane komórki przez około 12 do 18 dni. Po transdukcji komórki powinny tworzyć agregaty klonalne o charakterystycznej morfologii brukowej i wyższym stosunku jądra do cytoplazmy. Aby zidentyfikować przeprogramowane klony IPSC, należy przeprowadzić barwienie żywych komórek pod kątem przeciwciała TRA 180 1.Następnie użyj igły o rozmiarze 26 i pół cala, aby zakreskować dodatnie agregaty klonalne TRA 180 1 na cztery do sześciu małych równych wielkości kawałków na klon. Następnie użyj sterylnej końcówki pipety, aby pobrać i przenieść od 10 do 20 zakreskowanych kawałków z wielu klonów do każdej studzienki A 24-dołkowa płytka pokryta matrycą z HESC. Średnie, 24 do 48 godzin po posiedleniu przeprogramowanych klonów na powierzchni matrycy.Wymień pożywkę na pożywkę IPSC. Użyj końcówki pipety, aby ręcznie zeskrobać wszelkie zróżnicowane komórki lub zanieczyszczające komórki karmiące metamfetaminę, aby pomóc w oczyszczeniu w pełni przeprogramowanych i pluripotencjalnych dystroficznych klonów IPSC. Po osiągnięciu przez klony wielkości około 100 mikrometrów, należy zdysocjować komórki za pomocą EDTA na trzy minuty, a następnie umieścić małe agregaty komórkowe przeprogramowanego dystroficznego IPSC, zawieszone w pożywce IPSC uzupełnionej inhibitorem kinazy RO na świeżej płytce foliowej pokrytej matrycą 12.Na koniec potwierdź pluripotencję każdego klonu zarówno poprzez analizę ekspresji genów, jak i barwienie immunohistochemiczne. W przypadku markerów pluripotencjalnych większość komórek wyizolowanych z ludzkiego moczu jest dodatnia pod kątem markerów progenitorowych i komórek macierzystych, takich jak CD 44, CD 73 i CD 1 46. Komórki wykazują również markery mezenchymalne, takie jak alfa, aktyna mięśni gładkich i menton.R-T-P-C-R izolowanych komórek dostarcza dowodów na mieszaną populację komórek w hodowlach. W tym występuje słaba ekspresja cytokeratyny siedem i UIN jeden marker A i trzy markery a komórek nabłonka euro. Komórki moczu przekształcają się z wydłużonych komórek typu drugiego w dniu zero w brukowany wzór w czwartym dniu przeprogramowania.Do 12 dnia obserwuje się typowe klony pluripotencjalne, które są w stanie utrzymać swoją morfologię pluripotencjalną w warunkach wolnych od karmienia. Barwienie żywych komórek dla TRA 180 1 może być wykorzystane do identyfikacji przeprogramowanych klonów. Aby potwierdzić generowanie wektorów i transgenów, wolnych klonów pluripotencjalnych, R-T-P-C-R można przeprowadzić przy użyciu starterów przeciwko genomowi wirusa Sendai i każdemu z egzogennych czynników OSKM.Egzogenna ekspresja genów nie jest już wykrywana przez pasaż 13, ale można zaobserwować regulację w górę czynników endogennych. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza ekspresję markerów pluripotencjalnych na IPC, ale nie na komórkach moczu. Ekspresję białka i genu dystrofiny można następnie zweryfikować przez dalsze barwienie immunofluorescencyjne, odpowiednio western blotting i R-T-P-C-R, jak wykazano na tych reprezentatywnych obrazach z linii kontrolnych typu dzikiego i dystroficznych.Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do osiągnięcia bezene przeprogramowania UCS. W ciągu kilku tygodni po tej procedurze możemy różnicować IPC na kardiomiocyty lub miocyty szkieletowe, aby pogłębić nasze mechanizmy stojące za dystrofią mięśniową.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-muscular-dystrophy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.

Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Poznaj metodę generowania iPSC od pacjentów z dystrofią mięśniową z komórek moczu przy użyciu wirusa Sendai. Nieinwazyjna technika przeprogramowania bez integracji transgenu potwierdzona po 13 pasowaniach.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Przeglądaj więcej filmów