Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest efektywne generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC od pacjentów z dystrofią mięśniową, począwszy od hodowli komórkowych pochodzących z moczu i metody przeprogramowania bez integracji. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw próbek moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową. W drugim etapie komórki moczu są izolowane i namnażane do kultur komórkowych pochodzących z moczu.

Następnie komórki pochodzące z moczu są transdukowane wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka i po 12 dniach pojawiają się typowe kolonie podobne do pluripotencjalnych. Ostatecznie, poprzez pasaż 13, stan wolny od transgenu pluripotencjalnych komórek macierzystych można potwierdzić za pomocą analizy R-T-P-C-R. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak przeprogramowanie izolowanych fibroblastów skóry za pomocą wektorów lentiwirusowych, jest to, że dzięki tej technice komórki somatyczne można nieinwazyjnie pozyskać od pacjentów i wykorzystać do wydajnego generowania IPC przy użyciu metody przeprogramowania wirusa o zerowym śladzie.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej, takie jak to, w jaki sposób warunki te mogą być modelowane in vitro bez obaw o bezpieczeństwo stosowania u ludzi. Procedury zademonstrują Mohammad Zishan Al, doktor habilitowany Courtney Guesting, technik i doktorantka Melanie Ryder, wszyscy trzej z mojego laboratorium Aby pobrać próbkę moczu, zacznij od poinformowania pacjenta, aby pił płyny 30 minut przed pobraniem, aby upewnić się, że można zebrać około 30 do 40 mililitrów moczu. Gdy pacjent jest gotowy, należy mu przekazać zestaw do pobierania moczu zawierający następujące elementy, pisemne instrukcje, jak uzyskać sterylne lub czyste, bardziej chwytliwe i wilgotne toalety antybakteryjne oraz 100-mililitrowy sterylny kubek do pobierania próbek.

Po pobraniu próbki natychmiast umieść kubek zbiorczy na lodzie i przenieś próbkę do laboratorium w chłodziarce. Następnie za pomocą sterylnych pipet przenieś próbkę moczu do sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych i obracaj probówki pod ciśnieniem 400 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, w dwóch komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL odessać cały oprócz ostatniego, mililitra supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Następnie umyj komórki w siedmiu mililitrach buforu płuczącego i ponownie odwiruj ogniwa. Tym razem zasysanie wszystkich oprócz ostatnich około 0,2 do 0,5 mililitra supernatantu. Teraz ponownie użyj osadu w dwóch do trzech mililitrach komórki progenitorowej moczu lub pożywki UPC i przenieś zawiesinę do czterech do sześciu dołków niepowlekanej 24-dołkowej płytki po 72 godzinach, uzupełnij kulturę 0,5 mililitra świeżej pożywki UPC na dołek.

Monitoruj kulturę przez okres od czterech do sześciu dni inkubacji. Powinny zacząć pojawiać się małe, dwu- lub czterokomórkowe kolonie zaokrąglonych lub wydłużonych komórek reprezentujących odpowiednio komórki nabłonka nerkowego typu pierwszego lub drugiego. Kontynuuj zmianę podłoża co dwa do trzech dni.

Ponieważ kolonie przejdą fazę szybkiej ekspansji po około dziewięciu do 15 dniach hodowli, komórki powinny w tym momencie zlewać się w 80 do 90%, podziel komórki na dwie do czterech studzienek na 24-dołkowej płytce w celu dalszej ekspansji. Oznaczając tę hodowlę jako pasaż komórkowy, komórki moczu można następnie scharakteryzować pod kątem markerów specyficznych dla linii poprzez analizę cytometrii przepływowej, barwienie immunohistochemiczne lub reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą, aby zapewnić wysoką wydajność przeprogramowania na dni przed zasiewem transdukcji, 60 000 komórek na dołek. Z przejścia od pierwszego do piątego kultura do dwóch studzienek z sześciodołkową płytką w dniu zero.

Przygotuj wektor przeprogramowania Sendai, dodając każdy z czterech czynników OSKM w odpowiednim MLI do przeprogramowania na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki UPC, odessać pożywkę suspensową i powoli dodawać zawiesinę wirusa do jednego dołka komórek moczu przez następne sześć dni. Zastępować supernatant codziennie świeżą pożywką UPC w piątym dniu płytki MES zaprawionej nasionami mitomycyny na pokrytych żelatyną 100-milimetrowych kwadratowych szalkach hodowlanych szóstego dnia. Oddziel komórki moczu za pomocą trypsyny, zawieś je ponownie w pożywce UPC i umieść je na płytce pięć razy 10 czwartej do dwóch razy 10 piątych komórek na płytkę podającą metamfetaminę.

Następnego dnia zastąp pożywkę UPC pożywką w ludzkim stadium embrionalnym lub pożywką HES i monitoruj komórki pod mikroskopem, aby obserwować transformowane komórki przez około 12 do 18 dni. Po transdukcji komórki powinny tworzyć agregaty klonalne o charakterystycznej morfologii brukowej i wyższym stosunku jądra do cytoplazmy. Aby zidentyfikować przeprogramowane klony IPSC, należy przeprowadzić barwienie żywych komórek pod kątem przeciwciała TRA 180 1.

Następnie użyj igły o rozmiarze 26 i pół cala, aby zakreskować dodatnie agregaty klonalne TRA 180 1 na cztery do sześciu małych równych wielkości kawałków na klon. Następnie użyj sterylnej końcówki pipety, aby pobrać i przenieść od 10 do 20 zakreskowanych kawałków z wielu klonów do każdej studzienki A 24-dołkowa płytka pokryta matrycą z HESC. Średnie, 24 do 48 godzin po posiedleniu przeprogramowanych klonów na powierzchni matrycy.

Wymień pożywkę na pożywkę IPSC. Użyj końcówki pipety, aby ręcznie zeskrobać wszelkie zróżnicowane komórki lub zanieczyszczające komórki karmiące metamfetaminę, aby pomóc w oczyszczeniu w pełni przeprogramowanych i pluripotencjalnych dystroficznych klonów IPSC. Po osiągnięciu przez klony wielkości około 100 mikrometrów, należy zdysocjować komórki za pomocą EDTA na trzy minuty, a następnie umieścić małe agregaty komórkowe przeprogramowanego dystroficznego IPSC, zawieszone w pożywce IPSC uzupełnionej inhibitorem kinazy RO na świeżej płytce foliowej pokrytej matrycą 12

Na koniec potwierdź pluripotencję każdego klonu zarówno poprzez analizę ekspresji genów, jak i barwienie immunohistochemiczne. W przypadku markerów pluripotencjalnych większość komórek wyizolowanych z ludzkiego moczu jest dodatnia pod kątem markerów progenitorowych i komórek macierzystych, takich jak CD 44, CD 73 i CD 1 46. Komórki wykazują również markery mezenchymalne, takie jak alfa, aktyna mięśni gładkich i menton.

R-T-P-C-R izolowanych komórek dostarcza dowodów na mieszaną populację komórek w hodowlach. W tym występuje słaba ekspresja cytokeratyny siedem i UIN jeden marker A i trzy markery a komórek nabłonka euro. Komórki moczu przekształcają się z wydłużonych komórek typu drugiego w dniu zero w brukowany wzór w czwartym dniu przeprogramowania.

Do 12 dnia obserwuje się typowe klony pluripotencjalne, które są w stanie utrzymać swoją morfologię pluripotencjalną w warunkach wolnych od karmienia. Barwienie żywych komórek dla TRA 180 1 może być wykorzystane do identyfikacji przeprogramowanych klonów. Aby potwierdzić generowanie wektorów i transgenów, wolnych klonów pluripotencjalnych, R-T-P-C-R można przeprowadzić przy użyciu starterów przeciwko genomowi wirusa Sendai i każdemu z egzogennych czynników OSKM.

Egzogenna ekspresja genów nie jest już wykrywana przez pasaż 13, ale można zaobserwować regulację w górę czynników endogennych. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza ekspresję markerów pluripotencjalnych na IPC, ale nie na komórkach moczu. Ekspresję białka i genu dystrofiny można następnie zweryfikować przez dalsze barwienie immunofluorescencyjne, odpowiednio western blotting i R-T-P-C-R, jak wykazano na tych reprezentatywnych obrazach z linii kontrolnych typu dzikiego i dystroficznych.

Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do osiągnięcia bezene przeprogramowania UCS. W ciągu kilku tygodni po tej procedurze możemy różnicować IPC na kardiomiocyty lub miocyty szkieletowe, aby pogłębić nasze mechanizmy stojące za dystrofią mięśniową.