Name: Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Odkryj metodę wielofotonowego obrazowania sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampu myszy. Technika łączy patch-clamp z fotouwalnianiem glutaminianu UV do badania dynamiki jonowej w mikroprzestrzeniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG, Ro2327/6-1) dla C.R.R. Autorzy pragną podziękować S. Durry'emu i C. Roderigo za fachową pomoc techniczną oraz M. Dübbertowi (Laboratorium Elektroniki, Instytut Zoologiczny, Uniwersytet w Kolonii, Niemcy) za pomoc we wdrożeniu sterownika ogniw Pockelsa i przełącznika HF.

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
<li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+Na%2B+signals+in+spines+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li>
<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
<li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li>
<li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Roy.+Soc.+B-Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li>
<li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li>
<li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mismatch+between+the+Na%2B+flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li>
<li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na%2B+influx+between+axon+and+soma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li>
<li>Denk, W., Piston, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenk%2C+W+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).</li>
<li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Ca%282%2B%29+and+Na%28%2B%29+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li>
<li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK+pump+current+and+%5BNa%5D%28i%29+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+Local+%5BNa%5D%28i%29+depletion+and+Na+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li>
<li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li>
<li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mobility+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li>
<li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li>
<li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm%3A+photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li>
<li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikolenko%2C+V+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22">Cold Spring Harbor protocols</a>. , 1132-1141 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. Autorzy otrzymali wsparcie finansowe umożliwiające publikację w otwartym dostępie przez firmę Rapp Optoelectronic (Wedel, Niemcy), która produkuje instrument wykorzystany w artykule wideo. Firma nie była zaangażowana ani w eksperymenty, ani w przetwarzanie danych, ani w pisanie manuskryptów.

Niniejsze badanie pokazuje, że SBFI dobrze nadaje się do dwufotonowego obrazowania wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych sodu w małych przedziałach komórkowych. Należy jednak pamiętać, że sprawność kwantowa SBFI jest raczejniska15 , a względne zmiany stężenia sodu są dość małe przy aktywności fizjologicznej. W związku z tym pomiar stanów nieustalonych Na+ w wysokiej rozdzielczości w precyzyjnych procesach jest stosunkowo żmudnym zadaniem, a grupowanie lub uśrednianie kilku prób może być konieczne w celu uzyskania zadowalających sygnałów. Ponadto kinetyka stanów przejściowych sodu jest zaskakująco powolna, co sprawia, że konieczne jest rejestrowanie przez dłuższy czas. Obserwacja ta koresponduje z obserwacją wcześniejszych badań, w których monowykładniczy rozpad przejściowych sodu w dendrytach neuronalnych i astrocytach charakteryzował się dużymi stałymi czasu rozpadu w zakresie 10 sekund w temperaturze pokojowej1,2,6. Wydaje się zatem, że stany przejściowe sodu mają znacznie wolniejszy przebieg w czasie i znacznie większe stałe czasu rozpadu w porównaniu z stanami przejściowymi wapnia16.
Pomijając te wady, obrazowanie sodu okazuje się cennym narzędziem do badania fizjologicznych właściwości subdomen neuronalnych. Na przykład obrazowanie sodu może służyć do monitorowania pobudzającej aktywności synaps w aktywnych synapsach lub w ich pobliżu. Ponieważ sód zasadniczo nie jest buforowany8,17, stany przejściowe sodu wywołane aktywnością są liniowo związane z szerokim zakresem uwalniania glutaminianu synaptycznego lub egzogennie stosowanego glutaminianu. Reprezentują one zatem bezpośrednie i bezstronne wskaźniki aktywności glutaminergicznej neuronów. Ponadto barwniki wskaźnikowe sodu wykazują wysoką zawartość Kd (Kd SBFI mieści się w zakresie 25 mM1). Nawet przy stosunkowo wysokich stężeniach barwnika wewnątrzkomórkowego stosowanych do osiągnięcia wystarczającej jasności (zwykle 0,5 - 1 mM), wysokie Kd oznaczają, że barwniki same w sobie nie działają jako dla sodu. W związku z tym nie zniekształcają one amplitudy ani przebiegu czasowego stanów przejściowych sodu, co zawsze stanowi problem, gdy do komórek wprowadzane są barwniki wrażliwe na wapń18. Można zatem założyć, że wykryte sygnały stanowią dobrą miarę "rzeczywistych" zmian w wewnątrzkomórkowym sodzie. Ich powolny bieg w czasie sugeruje zatem, że prędkość wewnątrzkomórkowej dyfuzji sodu w neuronach jest znacznie mniejsza niż wcześniej zakładano19.
Krytycznym wymogiem dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów dotyczących właściwości pobudzającej transmisji synaptycznej i szlaków napływu sodu do kolców i dendrytów jest indukcja szybkiej i wysoce zlokalizowanej aktywacji struktur postsynaptycznych. Można to uzyskać poprzez szybkie i miejscowe zastosowanie glutaminianu lub agonistów glutaminianu w bezpośrednim sąsiedztwie kręgosłupa lub dendrytu poprzez błyskawiczną fotolizę związków w klatkach. Fotoliza błyskowa nie uszkadza mechanicznie tkanki, jest wolna od artefaktów ruchowych i jest dobrze znana do badania powiązanych zagadnień (np . lokalnej sygnalizacji wapniowej). Średnica miejsca odtworzenia wynosiła 1,5 μm w płaszczyźnie xy. Rozpakowanie w klatkę w pobliżu kolczastego dendrytu wywołało sygnały sodowe w obu kolcach i dendrycie macierzystym. Podczas gdy sygnały były zwykle największe w kolcach znajdujących się najbliżej miejsca odklejenia, amplitudy w macierzystym dendrycie i kolcach dalej były nadal raczej podobne do tych w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca odklejenia. Odblokowanie przeprowadzono na 300 ms, podczas którego prądy wewnętrzne zwiększyły swoją amplitudę. Glutaminian bez klatki mógł dyfundować w tkance w tym samym czasie, aktywując jonotropowe receptory glutaminianu i napływ sodu na obszary dendrytyczne i kolce dalej od miejsca uwolnienia.
Nieodłącznym problemem, który pojawia się podczas stosowania lasera UV do fotolizy związków w klatkach podawanych za pośrednictwem roztworu do kąpieli komórek, jest "filtracja wewnętrzna". Ze względu na wysoki współczynnik absorpcji klatki, światło UV jest silnie tłumione na drodze od obiektywu do miejsca stymulacji20,21. Wykonalnym sposobem uniknięcia tego jest miejscowa perfuzja z klatką, która jest ograniczona tylko do miejsca stymulacji, co ponadto zmniejsza do minimum ilość potrzebnego związku w klatce. W porównaniu z odblokowywaniem za pośrednictwem skaningu laserowego UV, odblokowywanie dwufotonowe w bliskiej podczerwieni22 jest przestrzennie bardziej precyzyjne, głównie dlatego, że dokładność stymulacji jest zwiększona w osi z. Z drugiej strony, ze względu na mały przekrój poprzeczny powszechnie stosowanych klatek dla dłuższych fal, stosowanych w przypadku wzbudzenia dwufotonowego, potrzebne jest albo wysokie stężenie związku w klatce, albo bardzo wysokie, potencjalnie fototoksyczne natężenie światła. Ponadto dwufotonowe rozpakowanie wymaga znacznie większych inwestycji w sprzęt; Potrzebny jest m.in. dodatkowy laser na podczerwień oraz wymagane elementy optyczne.
Zarówno SBFI, jak i glutaminian MNI-są pobudliwe w identycznym zakresie długości fal. Może to prowadzić do niezamierzonej współzależności lasera do odkrzętowania UV i lasera obrazującego SBFI lub IR i glutaminianu MNI, co skutkuje wybielaniem SBFI przez błysk odblokowujący i/lub ciągłym odklejaniem glutaminianu przez wiązkę podczerwieni. Jednak, jak pokazano na rysunku 6C, ani sam błysk UV, ani obrazowanie wielofotonowe nie powodowały takich wzajemnych efektów w naszych warunkach eksperymentalnych.
Systemy błysków UV podobne do tego opisanego tutaj są rutynowo używane w wielu innych laboratoriach i mogą być stosunkowo łatwo włączone do dowolnego istniejącego mikroskopu do obrazowania wielofotonowego. Ma to tę zaletę, że wiązka laserowa do fotolizy może być dowolnie ustawiana w polu widzenia. Ponadto system umożliwia szybką i zautomatyzowaną zmianę położenia wiązki laserowej i objętości uwalniania odpowiednio w polu widzenia podczas eksperymentu. Nasza modyfikacja upraszcza i poprawia dokładne pozycjonowanie miejsca do odblokowania, dzięki czemu ramki oprogramowania do obrazowania mogą służyć do konsekwentnego dostosowywania ramek obrazowania i odcinania.
Podsumowując, obrazowanie całych komórek i wielofotonowe obrazowanie sodu w dendrytach i kolcach neuronów centralnych, w połączeniu ze zmodyfikowaną procedurą rozmieszczania glutaminianu w klatkach wywołanym światłem UV, umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance. Może zatem służyć do analizy właściwości pobudzającego przekaźnictwa synaptycznego i postsynaptycznych sygnałów sodowych w neuronach w nienaruszonej tkance.

Ostatnie ulepszenia w technikach mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia wielofotonowa, umożliwiły badanie parametrów morfologicznych i fizjologicznych komórek mózgowych w nienaruszonej tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W połączeniu z elektrofizjologią, techniki te są obecnie szeroko stosowane do analizy sygnałów elektrycznych związanych z aktywnością neuronów, a także jednoczesnych sygnałów wapniowych w małych przedziałach subkomórkowych, a mianowicie w drobnych dendrytach i kolcach dendrytycznych. Oprócz stanów przejściowych wapnia, aktywność synaptyczna indukuje również sygnały sodowe w dendrytach i kolcach, których właściwości są w dużej mierze niezbadane. Takie sygnały mogą być analizowane za pomocą dwufotonowego obrazowania wewnątrzkomórkowego sodu ([Na+]i), co umożliwia pomiar on-line stanów nieustalonych [Na+]i przez dłuższy czas bez znacznego bielenia barwnika lub fotouszkodzeń1,2.
Do obrazowania [Na+]i dostępnych jest tylko kilka chemicznych barwników wskaźnikowych, np. CoroNa Green lub Asante Natrium Green3,4. Najczęściej stosowaną sondą fluorescencyjną do obrazowania Na+ jest izoftalan benzofuranu wiążący sód (SBFI). Jest to barwnik ratiometryczny, wzbudzony promieniami UV, podobny do dobrze znanego barwnika wrażliwego na wapń fura-2 i jest stosowany do konwencjonalnego obrazowania Na+ w wielu typach komórek (np. 5,6). Istnieją różne możliwości wzbudzenia barwnika i zebrania jego fluorescencji. Jeżeli wymagana jest wysoka rozdzielczość czasowa (tj. duża liczba klatek na sekundę obrazowania) w połączeniu z informacjami przestrzennymi, SBFI może być wzbudzany za pomocą ksenonowej lampy łukowej lub urządzenia z diodą elektroluminescencyjną (LED) dużej mocy, a jego emisja jest wykrywana za pomocą szybkiej kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)7,8. Aby uzyskać maksymalną rozdzielczość przestrzenną w głębi tkanki, metodą z wyboru jest wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa9. Stosunkowo niska sprawność kwantowa SBFI wymaga stosunkowo wysokich stężeń barwnika (0,5 - 2 mM) oraz bezpośredniego ładowania nieprzepuszczalnej dla membrany formy SBFI za pomocą ostrej mikroelektrody10 lub pipety krosowej1.
Korzystając z SBFI, wcześniejsze prace przeprowadzone na ostrych wycinkach tkanki hipokampa gryzoni wykazały związane z aktywnością przejściowe stany sodu w dendrytach i kolcach neuronów piramidowych CA1, które są głównie spowodowane napływem sodu przez jonotropowe receptory NMDA1,2. Do bardziej szczegółowego badania właściwości takich lokalnych sygnałów sodowych dobrze dopasowaną metodą jest specyficzna aktywacja receptorów postsynaptycznych poprzez zastosowanie agonistów receptorów. Aby naśladować aktywność presynaptyczną i uwalnianie przekaźnika, aplikacja powinna być stosunkowo krótka i skoncentrowana, aby umożliwić miejscową stymulację. Okazuje się to jednak dość trudne w nienaruszonej tkance. Miejscowe uciskanie agonistów receptorów za pomocą pipety z cienką końcówką umożliwia bardzo ogniskową aplikację, ale niesie ze sobą potencjalne ryzyko wywołania ruchu interesującej nas struktury (np. takiej jak dendryt lub kolce dendrytyczne), a tym samym utrudnia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Przydatność jonoforezy substancji neuroaktywnych zależy od ich właściwości elektrycznych, a wysokie amplitudy prądu mogą również powodować powstawanie artefaktów komórkowych.
Jednym ze sposobów na obejście tych przeszkód jest zastosowanie związków aktywowanych światłem i ich fotolizy błyskowej. Zasadniczo, do fotoaktywacji substancji w klatkach stosuje się dwie różne zasady: I) Fotoliza błyskowa o szerokim poluwidzenia 11 i II) Ogniskowe odtworzenie w klatkach z wykorzystaniem modułów skanujących w połączeniu z laserami12. Podczas gdy fotoliza błyskowa o szerokim polu widzenia jest wykorzystywana do aktywacji większych obszarów zainteresowania, np. całej komórki, ogniskowe odblokowywanie jest stosowane do specyficznej stymulacji małych przedziałów komórkowych. W niniejszym badaniu demonstrujemy procedurę obrazowania sodowego w całych komórkach w postaci klamry i wielofotonowych w dendrytach i kolcach neuronów centralnych, w połączeniu ze zmodyfikowaną procedurą odcinania glutaminianu wywołanego światłem UV, co umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance.

<table><tbody><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, grubość ścianki 0,3 mm</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC Oprogramowanie do</td></tr><tr><td>dekonwolucji</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr światłowodowy</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Miniaturowy spektrometr światłowodowy</td></tr><tr><td>Rurki filtracyjne</td>Filtr centralny <td>VWR</td><td></td>, <td>0,2 i mikro; </td></tr><tr><td>m Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c,</td> kontroler mocy wiązki IR Tiempo <td></td></tr><tr><td></td><td>Niestandardowa</td><td></td><td>kontrola intensywności wiązki laserowej + szybkie przełączanie na zero po flyback za pomocą lasera IR Pockels cell</td></tr><tr><td></td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsed Ti:Sa przestrajalny laser (710 - 990 nm); UWAGA</td></tr><tr><td>Monitor mocy podczerwieni</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop/system obrazowania</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Zarówno mikroskop, jak i systemy obrazowania zostały silnie zmodyfikowane</td></tr><tr><td>Koło filtra ND</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>Krzemionka topiona UV, gęstość optyczna 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Narishige</td><td>Model PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczny system wyrzucania leków</td><td>NPI Elektroniczna</td><td>komórka PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, używana jako szybki przełącznik i do regulacji mocy</td></tr><tr><td>Ogniwo Pockels sterownik</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>Wysokonapięciowy wzmacniacz różnicowy</td></tr><tr><td>Migawka</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>Ostrza BeCu z powłoką ALMgF2</td></tr><tr><td>Kontroler migawki Sterownik migawki</td><td>Niestandardowa konstrukcja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterownik migawki</td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do odblokowywania</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; UWAGA</td></tr><tr><td>System skanowania laserowego UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>System skanowania galwanometrycznego</td></tr><tr><td>Nazwa związku</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/ Opis</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Antagonista receptora Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA; UWAGA</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>Antagonista receptora NMDA; UWAGA</td></tr><tr><td>SBFI K+ sól</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor kanałów Na+ zależnych od napięcia; UWAGA</td></tr><tr><td>L-glutaminian Nmi-Clatek,</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Glutamian w klatce uwalniany po absobcji UV</td></tr></tbody></table>

wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania uv w neuronach piramidowych ca1

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa umożliwiła analizę parametrów morfologicznych i fizjologicznych komórek mózgowych w nienaruszonej tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W połączeniu z elektrofizjologią jest szeroko stosowany do badania sygnałów wapniowych związanych z aktywnością w małych przedziałach subkomórkowych, takich jak dendryty i kolce dendrytyczne. Oprócz stanów przejściowych wapnia, aktywność synaptyczna indukuje również postsynaptyczne sygnały sodowe, których właściwości są tylko marginalnie poznane. W tym miejscu opisujemy metodę połączonego obrazowania sodowego za pomocą całokomórkowych krosówek i wielofotonowych w mikrodomenach komórkowych neuronów centralnych. Ponadto wprowadzamy zmodyfikowaną procedurę rozmieszczania glutaminianu w klatkach pod wpływem światła ultrafioletowego (UV), która umożliwia niezawodną i ogniskową aktywację receptorów glutaminianu w tkance. W tym celu przeprowadzono zapisy całych komórek na neuronach piramidowych Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) w ostrych wycinkach tkanki hipokampa myszy. Neurony wypełniono wrażliwym na sód barwnikiem fluorescencyjnym SBFI za pomocą pipety łatkowej, a wzbudzenie wielofotonowe SBFI umożliwiło wizualizację dendrytów i sąsiednich kolców. Aby ustalić indukowane promieniowaniem UV ogniskowe rozmieszczanie, przetestowano i zoptymalizowano kilka parametrów, w tym natężenie światła, objętość, na którą wpływa wiązka uwalniająca UV, położenie wiązki, a także stężenie związku w klatce. Nasze wyniki pokazują, że miejscowa perfuzja glutaminianu w klatce (MNI-glutaminianu) i jego ogniskowe odkleinanie UV powodują prądy wewnętrzne i stany przejściowe sodu w dendrytach i kolcach. Przebieg czasowy i amplituda zarówno prądów wewnętrznych, jak i sygnałów sodowych korelują z czasem trwania impulsu odblokowującego. Co więcej, nasze wyniki pokazują, że wewnątrzkomórkowe sygnały sodu są blokowane w obecności blokerów jonotropowych receptorów glutaminianu, co pokazuje, że pośredniczy w nich napływ sodu przez ten szlak. Podsumowując, nasza metoda stanowi wiarygodne narzędzie do badania wewnątrzkomórkowych sygnałów sodowych indukowanych przez ogniskową aktywację receptora w nienaruszonej tkance mózgowej.

W niniejszym badaniu przedstawiamy procedurę wielofotonowej mikroskopii dynamiki sodu w komórkach z wykorzystaniem zależnego od sodu barwnika fluorescencyjnego SBFI w neuronach piramidalnych obszaru CA1 w ostrych skrawkach tkanki hipokampa myszy. Ponadto pokazujemy, jak połączyć tę technikę obrazowania z uwolnieniem związków neuroaktywnych za pomocą skanującego lasera (np. klatkowanego glutaminianu) oraz jego precyzyjnym nakierowaniem na mikrodomeny komórkowe.
Wprowadzenie SBFI do neuronów za pomocą pipety patch-clamp umożliwiło wizualizację całej komórki, w tym cienkich dendrytów i sąsiadujących kolców, dzięki zastosowaniu wzbudzenia wielofotonowego (Rycina 6A, B, D oraz Rycina 7A).
<img alt="Analiza sygnałów neuronalnych; dynamika sodu; wykresy elektrofizjologiczne; stymulacja MNI-glutaminianem." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Sygnały sodowe i prądy synaptyczne indukowane błyskawiczną fotolizą klatkowanego glutaminianu. (A) Obraz maksymalnej projekcji neuronu piramidowego obszaru CA1, do którego wprowadzono SBFI za pomocą pipety patch (PP). Ramka wskazuje obszar powiększony na B. LP oznacza pozycję i orientację pipety do lokalnej perfuzji klatkowanego glutaminianu. (B) Maksymalna projekcja o dużym powiększeniu stosu przekrojów optycznych dendrytu z przyległymi kolcami dendrytycznymi. Stosy przekrojów optycznych poddano wyrównaniu w osi z oraz dekonwolucji. Czerwony krzyżyk wskazuje docelowy obszar wiązki odklatkowującej. Pomarańczowa linia przerywana wyznacza obszar zainteresowania, z którego rejestrowano emisję fluorescencji. Ramka wskazuje obszar powiększony na D. (C) Lewo: Sygnał sodowy (górny rząd) i somatyczny prąd wewnątrzkomórkowy (dolny rząd) indukowane błyskawiczną fotolizą klatkowanego glutaminianu (oznaczoną żółtym błyskiem). Czerwona linia reprezentuje dopasowanie do danych eksperymentalnych. Szary obszar reprezentuje okres, w którym błysk odklatkowujący (300 msec) blokował obrazowanie fluorescencji SBFI. Prawo: Bez uprzedniej perfuzji klatkowanym glutaminianem ten sam błysk UV nie wywołał ani zmiany emisji SBFI, ani prądu wewnątrzkomórkowego. (D) Lewo: Obraz o dużym powiększeniu dendrytu i przyległych kolców, zgodnie z wyznaczeniem w B. Obok ten sam obraz z odwróconymi wartościami szarości. Linie przerywane wskazują obszary zainteresowania, w których rejestrowano emisję fluorescencji. Czerwony krzyżyk wskazuje lokalizację wiązki odklatkowującej. Prawo: Przejściowe zmiany poziomu sodu indukowane fotolizą klatkowanego glutaminianu błyskiem UV. Ślad niebieski: sygnały sodowe w dendrycie; ślad czerwony: uśredniona odpowiedź z trzech kolców sąsiadujących z miejscem odklatkowania; ślad zielony: uśredniona odpowiedź z trzech oddalonych kolców. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po lokalnej perfuzji klatkowanym glutaminianem, zastosowanie błysku UV w pobliżu dendrytu spowodowało przejściowy spadek emisji fluorescencji SBFI, odzwierciedlający wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia sodu (Rysunek 6C, D i Rysunek 7B). Jednocześnie w somie zarejestrowano prąd wewnątrzpochodny (Rysunek 6C i Rysunek 7B). Wydłużenie czasu trwania błysku UV doprowadziło do wzrostu amplitud zarówno wywołanych prądów wewnątrzpochodnych, jak i sygnałów sodowych (dane nie pokazano), co wskazuje, że system znajdował się w pełni w zakresie swojej dynamiki i że ani proces uwalniania z klatki, ani odpowiedzi komórkowe nie uległy nasyceniu. Zastosowanie błysku UV o identycznym lub dłuższym czasie trwania w preparatach, które nie zostały uprzednio poddane perfuzji klatkowanym glutaminianem, nigdy nie wywołało zmian w fluorescencji SBFI ani prądów wewnątrzpochodnych, co wskazuje, że sygnały te wynikają z uwalniania glutaminianu z klatki (Rysunek 6C). Ponadto wyniki te pokazują, że w naszych warunkach eksperymentalnych nie obserwuje się współzależności między komponentami obrazowania a komponentami uwalniania z klatki. Sygnały sodowe można było wykryć również w kolcach dendrytycznych (Rysunek 6D). Chociaż nie podejmowaliśmy prób stymulacji pojedynczego kolca wyłącznie za pomocą uwalniania glutaminianu z klatki, amplitudy szczytowe miały tendencję do bycia nieco wyższymi w kolcach znajdujących się blisko miejsca uwalniania, podczas gdy kolce położone dalej wykazywały niemal identyczne zmiany fluorescencji jak dendryt macierzysty (Rysunek 6D).
Na koniec zbadaliśmy ścieżkę napływu sodu do dendrytów i kolców w odpowiedzi na odblokowanie glutaminianu. W tym celu zastosowaliśmy CNQX oraz APV, które są selektywnymi blokerami odpowiednio jonotropowych receptorów glutaminianu podtypów AMPA i NMDA, przepuszczalnych dla sodu. Nasze wyniki pokazują, że w obecności tych blokerów zniesiono indukowane glutaminianem wewnątrzkomórkowe sygnały sodowe oraz wywołane prądy somatyczne (Rysunek 7B). Po wypłukaniu blokerów sygnały zostały przywrócone. Dowodzi to, że odblokowanie glutaminianu aktywuje jonotropowe receptory glutaminianu w neuronach piramidowych CA1, które pośredniczą w napływie sodu do dendrytów i kolców, co skutkuje wewnątrzkomórkowymi przejściowymi wzrostami stężenia sodu i prądami wewnątrzkomórkowymi.
<img alt="Schemat aktywności neuronu; sygnał sodowy, analiza prądu somatycznego; wyniki badań elektrofizjologicznych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Profil farmakologiczny wywołanych sygnałów sodowych i prądów wewnątrzkomórkowych. (A) Neuron piramidowy obszaru CA1 wypełniony SBFI z pipetą patch (PP) przytwierdzoną do somy. (B) Lewo: Przejściowy wzrost stężenia sodu i prąd somatyczny wywołane fotoaktywacją „zakratowanego” glutaminianu w dendrycie i przyległych kolcach. Środek: Perfuzja z zastosowaniem blokerów jonotropowych receptorów glutaminianu CNQX i APV hamuje zarówno sygnał sodowy, jak i prąd wewnątrzkomórkowy wywołany odblokowaniem glutaminianu. Prawo: Po wypłukaniu blokerów sygnały zostają przywrócone. Czerwona linia reprezentuje dopasowanie do danych eksperymentalnych. Szary obszar reprezentuje okres, w którym błysk odblokowujący (300 msec) zakłócał obrazowanie fluorescencji SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie i analiza dynamiki sodu w małych przedziałach komórkowych, takich jak kolce i dendryty neuronów centralnych w nienaruszonej tkance. Osiąga się to poprzez przygotowanie ostrego wycinka hipokampa myszy, załadowanie neuronu piramidowego wrażliwym na sód barwnikiem fluorescencyjnym SBFI przez pipetę łatową i wizualizację morfologii komórkowej za pomocą wzbudzenia wielofotonowego. Następnym krokiem jest wybór kolczastego dendrytu do eksperymentu i wstrzyknięcie Foleyowi związku aktywowanego zdjęciem, takiego jak glutaminian w klatce, w pobliżu tego dendrytu.Błysk UV jest następnie nakładany na nieklatkowany glutaminian Foleya za pomocą lasera UV, który został dokładnie ustawiony tak, aby celować w niewielką objętość w pobliżu wybranego dendrytu. Ostatnim krokiem jest monitorowanie wynikających z tego zmian we fluorescencji SBFI w dendrycie oraz monitorowanie wynikających z nich zmian sodu w sąsiednich kolcach. Rejestrowane są również towarzyszące prądy membranowe.Docelowo zastosowanie odpowiednich narzędzi farmakologicznych, takich jak blokery receptorów, umożliwi zbadanie mechanizmów generujących wywołane wewnątrzkomórkowe sygnały sodowe. Metoda ta stanowi wiarygodne narzędzie do badania wewnątrzkomórkowych sygnałów sodu w małych przedziałach komórkowych i w nienaruszonej tkance mózgowej. Tutaj łączymy klamrę z całą komórką i wielofotonowe obrazowanie sodu ze zmodyfikowaną procedurą rozmieszczania w klatkach wywołanego światłem UV.With pozwala nam monitorować odpowiedzi komórkowe na precyzyjne i ogniskowe zastosowania związków neuroaktywnych. Procedura zostanie zademonstrowana przez Karla KA i Kaana Kleinhansa, doktoranta w moim laboratorium. Aby rozpocząć sekcję tkanki, natychmiast umieść mózg na szalce Petriego z lodowatą sekcją, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub płynem mózgowo-rdzeniowym A i wypreparuj półkulę, wykonując strzałkowe cięcie wzdłuż linii środkowej.Wykonaj drugie cięcie w żądanej orientacji jako powierzchnię blokującą. Następnie przymocuj to do etapu cięcia vibram za pomocą super kleju. Po wyjęciu komory krojenia i elementu chłodzącego wibramu z zamrażarki, należy umieścić stopień tnący z sekcją mózgową w komorze.Następnie umieść element chłodzący w komorze i zanurz tkankę w lodowatej sekcji A CSF. Następnie tnij o grubości 250 mikrometrów. Plasterki parastrzałkowe hipokampa z viome.Upewnij się, że płyny CS są przez cały czas bąbelkowane. Po pokrojeniu trzymaj tkankę na siatce w zlewce z normalnym płynem mózgowo-rdzeniowym A i inkubuj w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji utrzymuj tkankę w temperaturze pokojowej.Ten eksperyment powinien być przeprowadzony w ciemnym otoczeniu, ale jest pokazany tutaj w słabych warunkach oświetleniowych w celach filmowych. Aby przygotować sprzęt, najpierw włącz elementy systemu wielofotonowego i dostosuj wyrównanie wiązki laserowej w podczerwieni zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dostosuj długość fali lasera wielofotonowego i intensywność wiązki, zmieniając ustawienia komórki pcal i mnożników zdjęć.Następnie włącz i skalibruj system odblokowywania, umieszczając szkiełko z próbką fluorescencyjną pod soczewką obiektywu. Rozpocznij procedurę kalibracji oprogramowania sterującego jednostką odblokowującą. Ustaw laser UV w kilku punktach w jego zakresie skanowania, podczas gdy fluorescencja jest rejestrowana za pomocą kamery CCD, klikając plamkę lasera UV.W każdym punkcie dostosuj położenie luster skanowania galwanicznego tak, aby odpowiadało określonej współrzędnej w oprogramowaniu. Dokładne pozycjonowanie miejsca odtworzenia klatki uzyskuje się poprzez zaimportowanie obrazu systemu obrazowania za pośrednictwem połączenia sieciowego między komputerami do odblokowywania i obrazowania. Korzystając z oprogramowania do przechwytywania ekranu, w sposób ciągły odczytuj klatki oprogramowania do obrazowania i dostosuj obrazowanie.A po zakończeniu klatkowania klatki konsekwentnie eksportują co 10 klatkę z oprogramowania do obrazowania jako obraz referencyjny do jednostki błyskowej, aby zapewnić prawidłowe dostosowanie podczas całego eksperymentu. Następnie włącz komponenty elektrofizjologii mikromanipulatorów i urządzenie do aplikacji ciśnienia, aby dostarczyć związek w klatce do obszaru docelowego. Wyciągnij pipety do zacisku krosowego całych komórek i miejscowej obfitości za pomocą polerowanych ogniowo kapilar ze szkła boro-krzemianowego.Następnie umieść plasterek w kąpieli doświadczalnej i aby utrwalić go za pomocą siatki, umieść kąpiel na stoliku mikroskopu i trwale perfuj plasterek za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego. Zaciskanie łaty na całej komórce należy rozpocząć od napełnienia pipety krosowej roztworem wewnątrzkomórkowym lub ICS zawierającym SBFI, a następnie załadować lokalną pipetę perfuzyjną związkiem umieszczonym w sadzce. Podłącz pipety do odpowiednich mikromanipulatorów i umieść elektrodę odniesienia w kąpieli.Wybierz jedną komórkę piramidalną CA z somą, która znajduje się od 30 do 70 mikrometrów pod powierzchnią wycinka, aby zapewnić nienaruszoną morfologię komórki, a także niskie rozpraszanie i tłumienie wiązki odłączającej. Zbliżyć się do tej komórki za pomocą pipety z plastrem, wykorzystując mikroskopię wideo IR DIC. Zastosuj delikatne ssanie, aż do uzyskania giga uszczelnienia.Skompensuj dużą pojemność. Następnie przerwij błonę i otwórz komórkę, aby uzyskać konfigurację komórki. Na koniec oceń żywotność ogniwa w bieżącym trybie cęgowym.Wstrzyknij prąd depolaryzujący i sprawdź wynikającą z tego aktywność skokową, aby wykonać obrazowanie i stymulację. Najpierw dodaj tetro DOIND do A CSF, aby zapobiec aktywacji kanałów sodowych bramkowanych napięciem i generowaniu potencjałów czynnościowych. Wizualizacja morfologii komórkowej za pomocą wzbudzenia wielofotonowego i wynikającej fluorescencji SBFI.Wybierz kolczasty dendryt do eksperymentu. Powiększ obrazy, aby uzyskać wyższą rozdzielczość, i umieść ramkę klipu wokół dendrytu. Następnie umieść pipetę ze związkiem w sadzce w pobliżu dendrytu.Ustawić pipetę tak, aby umożliwić efektywną miejscową perfuzję wybranego dendrytu. Dostosuj laser do odblokowywania, aby ustawić miejsce odtworzenia w pobliżu interesującej Cię struktury. Następnie ustaw obszary zainteresowania na wybranym dendrycie i sąsiednich kolcach za pomocą oprogramowania do obrazowania.Zbliżyć się do obszaru zainteresowania i wstrzykiwać związek w klatce przez kilka sekund z niskociśnieniową łatką startową, zaciskiem i zapisami fluorescencji za pomocą sygnału spustowego. Podczas miejscowej obfitości związku w klatce wiązka wzbudzająca jest całkowicie przyciemniona, aby zapobiec bieleniu. Następnie zatrzymaj miejscową obfitość związku w klatce.Następnie zwiększ intensywność lasera dwufotonowego, aby umożliwić skuteczne wzbudzenie SBFI i zastosuj błysk UV, aby zainicjować na monitorze klatkowym zmiany fluorescencji SBFI, a także prądu somatycznego, przystąp do zatrzymania zapisu po powrocie fluorescencji SBFI do wartości wyjściowej. Aby uzyskać morfologię, zapisz stos XY, Z obszaru pudełka zaciskowego ustawionego dla wykonywanych pomiarów. Upewnij się, że ten stos jest nadmiernie próbkowany przestrzennie, aby umożliwić optymalną dekonwolucję obrazu oraz zwiększyć jakość i rozdzielczość obrazu.Ładowanie neuronów SBFI przez pipetę plastrową umożliwiło wizualizację całej komórki, w tym drobnych dendrytów i przyległych kolców, poprzez zastosowanie wzbudzenia wielofotonowego po miejscowej perfuzji glutaminianu w klatce. Zastosowanie błysku UV w pobliżu dendrytu spowodowało przejściowy spadek emisji fluorescencyjnej SBFI, odzwierciedlający wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia sodu. W tym samym czasie, podczas aplikacji SOMA błysku UV do plastrów, które nie zostały wstępnie perfundowane glutaminianem w klatce, zarejestrowano prąd wewnętrzny.Nigdy nie wywołano zmian we fluorescencji SBFI ani prądów wewnętrznych wskazujących, że sygnały te są spowodowane odkleinowaniem glutaminianu. Amplitudy pików były nieco wyższe w kolcach w pobliżu miejsca odklejenia, podczas gdy wzorce dla dalszych kolców przypominały dendryt macierzysty. Szlak napływu sodu do dendrytów i kolców w odpowiedzi na rozpakowanie glutaminianu w klatce badano przy użyciu selektywnych blokerów dla przepuszczalnych dla przepuszczalnych dla sodu jonotropowych receptorów glutaminianu, wewnątrzkomórkowych sygnałów sodowych indukowanych glutaminianem, a wywołane prądy somatyczne pominięto w obecności tych blokerów.Po wypłukaniu blokerów sygnały są odzyskiwane, co pokazuje, że uwolnienie glutaminianu w klatce aktywuje cytotropowe receptory glutaminianu na około jednym neuronach piramidowych, powodując wewnątrzkomórkowe prądy przejściowe i wewnętrzne sodu. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby wybrać najniższą możliwą intensywność lasera na podczerwień, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia preparatu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć krytyczne etapy naszego eksperymentalnego podejścia do badania sygnalizacji sodu w mikroszczątkach komórkowych Po opanowaniu technika ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości aktywności wywołanych wewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w nienaruszonej tkance, która jest wolna od artefaktów ruchu, jak wprowadziły inne techniki.

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Odkryj metodę wielofotonowego obrazowania sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampu myszy. Technika łączy patch-clamp z fotouwalnianiem glutaminianu UV do badania dynamiki jonowej w mikroprzestrzeniach komórkowych.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1 (Wideo) | JoVE Journal

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Przeglądaj więcej filmów