Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie i analiza dynamiki sodu w małych przedziałach komórkowych, takich jak kolce i dendryty neuronów centralnych w nienaruszonej tkance. Osiąga się to poprzez przygotowanie ostrego wycinka hipokampa myszy, załadowanie neuronu piramidowego wrażliwym na sód barwnikiem fluorescencyjnym SBFI przez pipetę łatową i wizualizację morfologii komórkowej za pomocą wzbudzenia wielofotonowego. Następnym krokiem jest wybór kolczastego dendrytu do eksperymentu i wstrzyknięcie Foleyowi związku aktywowanego zdjęciem, takiego jak glutaminian w klatce, w pobliżu tego dendrytu.

Błysk UV jest następnie nakładany na nieklatkowany glutaminian Foleya za pomocą lasera UV, który został dokładnie ustawiony tak, aby celować w niewielką objętość w pobliżu wybranego dendrytu. Ostatnim krokiem jest monitorowanie wynikających z tego zmian we fluorescencji SBFI w dendrycie oraz monitorowanie wynikających z nich zmian sodu w sąsiednich kolcach. Rejestrowane są również towarzyszące prądy membranowe.

Docelowo zastosowanie odpowiednich narzędzi farmakologicznych, takich jak blokery receptorów, umożliwi zbadanie mechanizmów generujących wywołane wewnątrzkomórkowe sygnały sodowe. Metoda ta stanowi wiarygodne narzędzie do badania wewnątrzkomórkowych sygnałów sodu w małych przedziałach komórkowych i w nienaruszonej tkance mózgowej. Tutaj łączymy klamrę z całą komórką i wielofotonowe obrazowanie sodu ze zmodyfikowaną procedurą rozmieszczania w klatkach wywołanego światłem UV.

With pozwala nam monitorować odpowiedzi komórkowe na precyzyjne i ogniskowe zastosowania związków neuroaktywnych. Procedura zostanie zademonstrowana przez Karla KA i Kaana Kleinhansa, doktoranta w moim laboratorium. Aby rozpocząć sekcję tkanki, natychmiast umieść mózg na szalce Petriego z lodowatą sekcją, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub płynem mózgowo-rdzeniowym A i wypreparuj półkulę, wykonując strzałkowe cięcie wzdłuż linii środkowej.

Wykonaj drugie cięcie w żądanej orientacji jako powierzchnię blokującą. Następnie przymocuj to do etapu cięcia vibram za pomocą super kleju. Po wyjęciu komory krojenia i elementu chłodzącego wibramu z zamrażarki, należy umieścić stopień tnący z sekcją mózgową w komorze.

Następnie umieść element chłodzący w komorze i zanurz tkankę w lodowatej sekcji A CSF. Następnie tnij o grubości 250 mikrometrów. Plasterki parastrzałkowe hipokampa z viome.

Upewnij się, że płyny CS są przez cały czas bąbelkowane. Po pokrojeniu trzymaj tkankę na siatce w zlewce z normalnym płynem mózgowo-rdzeniowym A i inkubuj w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji utrzymuj tkankę w temperaturze pokojowej.

Ten eksperyment powinien być przeprowadzony w ciemnym otoczeniu, ale jest pokazany tutaj w słabych warunkach oświetleniowych w celach filmowych. Aby przygotować sprzęt, najpierw włącz elementy systemu wielofotonowego i dostosuj wyrównanie wiązki laserowej w podczerwieni zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dostosuj długość fali lasera wielofotonowego i intensywność wiązki, zmieniając ustawienia komórki pcal i mnożników zdjęć.

Następnie włącz i skalibruj system odblokowywania, umieszczając szkiełko z próbką fluorescencyjną pod soczewką obiektywu. Rozpocznij procedurę kalibracji oprogramowania sterującego jednostką odblokowującą. Ustaw laser UV w kilku punktach w jego zakresie skanowania, podczas gdy fluorescencja jest rejestrowana za pomocą kamery CCD, klikając plamkę lasera UV.

W każdym punkcie dostosuj położenie luster skanowania galwanicznego tak, aby odpowiadało określonej współrzędnej w oprogramowaniu. Dokładne pozycjonowanie miejsca odtworzenia klatki uzyskuje się poprzez zaimportowanie obrazu systemu obrazowania za pośrednictwem połączenia sieciowego między komputerami do odblokowywania i obrazowania. Korzystając z oprogramowania do przechwytywania ekranu, w sposób ciągły odczytuj klatki oprogramowania do obrazowania i dostosuj obrazowanie.

A po zakończeniu klatkowania klatki konsekwentnie eksportują co 10 klatkę z oprogramowania do obrazowania jako obraz referencyjny do jednostki błyskowej, aby zapewnić prawidłowe dostosowanie podczas całego eksperymentu. Następnie włącz komponenty elektrofizjologii mikromanipulatorów i urządzenie do aplikacji ciśnienia, aby dostarczyć związek w klatce do obszaru docelowego. Wyciągnij pipety do zacisku krosowego całych komórek i miejscowej obfitości za pomocą polerowanych ogniowo kapilar ze szkła boro-krzemianowego.

Następnie umieść plasterek w kąpieli doświadczalnej i aby utrwalić go za pomocą siatki, umieść kąpiel na stoliku mikroskopu i trwale perfuj plasterek za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego. Zaciskanie łaty na całej komórce należy rozpocząć od napełnienia pipety krosowej roztworem wewnątrzkomórkowym lub ICS zawierającym SBFI, a następnie załadować lokalną pipetę perfuzyjną związkiem umieszczonym w sadzce. Podłącz pipety do odpowiednich mikromanipulatorów i umieść elektrodę odniesienia w kąpieli.

Wybierz jedną komórkę piramidalną CA z somą, która znajduje się od 30 do 70 mikrometrów pod powierzchnią wycinka, aby zapewnić nienaruszoną morfologię komórki, a także niskie rozpraszanie i tłumienie wiązki odłączającej. Zbliżyć się do tej komórki za pomocą pipety z plastrem, wykorzystując mikroskopię wideo IR DIC. Zastosuj delikatne ssanie, aż do uzyskania giga uszczelnienia.

Skompensuj dużą pojemność. Następnie przerwij błonę i otwórz komórkę, aby uzyskać konfigurację komórki. Na koniec oceń żywotność ogniwa w bieżącym trybie cęgowym.

Wstrzyknij prąd depolaryzujący i sprawdź wynikającą z tego aktywność skokową, aby wykonać obrazowanie i stymulację. Najpierw dodaj tetro DOIND do A CSF, aby zapobiec aktywacji kanałów sodowych bramkowanych napięciem i generowaniu potencjałów czynnościowych. Wizualizacja morfologii komórkowej za pomocą wzbudzenia wielofotonowego i wynikającej fluorescencji SBFI.

Wybierz kolczasty dendryt do eksperymentu. Powiększ obrazy, aby uzyskać wyższą rozdzielczość, i umieść ramkę klipu wokół dendrytu. Następnie umieść pipetę ze związkiem w sadzce w pobliżu dendrytu.

Ustawić pipetę tak, aby umożliwić efektywną miejscową perfuzję wybranego dendrytu. Dostosuj laser do odblokowywania, aby ustawić miejsce odtworzenia w pobliżu interesującej Cię struktury. Następnie ustaw obszary zainteresowania na wybranym dendrycie i sąsiednich kolcach za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Zbliżyć się do obszaru zainteresowania i wstrzykiwać związek w klatce przez kilka sekund z niskociśnieniową łatką startową, zaciskiem i zapisami fluorescencji za pomocą sygnału spustowego. Podczas miejscowej obfitości związku w klatce wiązka wzbudzająca jest całkowicie przyciemniona, aby zapobiec bieleniu. Następnie zatrzymaj miejscową obfitość związku w klatce.

Następnie zwiększ intensywność lasera dwufotonowego, aby umożliwić skuteczne wzbudzenie SBFI i zastosuj błysk UV, aby zainicjować na monitorze klatkowym zmiany fluorescencji SBFI, a także prądu somatycznego, przystąp do zatrzymania zapisu po powrocie fluorescencji SBFI do wartości wyjściowej. Aby uzyskać morfologię, zapisz stos XY, Z obszaru pudełka zaciskowego ustawionego dla wykonywanych pomiarów. Upewnij się, że ten stos jest nadmiernie próbkowany przestrzennie, aby umożliwić optymalną dekonwolucję obrazu oraz zwiększyć jakość i rozdzielczość obrazu.

Ładowanie neuronów SBFI przez pipetę plastrową umożliwiło wizualizację całej komórki, w tym drobnych dendrytów i przyległych kolców, poprzez zastosowanie wzbudzenia wielofotonowego po miejscowej perfuzji glutaminianu w klatce. Zastosowanie błysku UV w pobliżu dendrytu spowodowało przejściowy spadek emisji fluorescencyjnej SBFI, odzwierciedlający wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia sodu. W tym samym czasie, podczas aplikacji SOMA błysku UV do plastrów, które nie zostały wstępnie perfundowane glutaminianem w klatce, zarejestrowano prąd wewnętrzny

Nigdy nie wywołano zmian we fluorescencji SBFI ani prądów wewnętrznych wskazujących, że sygnały te są spowodowane odkleinowaniem glutaminianu. Amplitudy pików były nieco wyższe w kolcach w pobliżu miejsca odklejenia, podczas gdy wzorce dla dalszych kolców przypominały dendryt macierzysty. Szlak napływu sodu do dendrytów i kolców w odpowiedzi na rozpakowanie glutaminianu w klatce badano przy użyciu selektywnych blokerów dla przepuszczalnych dla przepuszczalnych dla sodu jonotropowych receptorów glutaminianu, wewnątrzkomórkowych sygnałów sodowych indukowanych glutaminianem, a wywołane prądy somatyczne pominięto w obecności tych blokerów.

Po wypłukaniu blokerów sygnały są odzyskiwane, co pokazuje, że uwolnienie glutaminianu w klatce aktywuje cytotropowe receptory glutaminianu na około jednym neuronach piramidowych, powodując wewnątrzkomórkowe prądy przejściowe i wewnętrzne sodu. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby wybrać najniższą możliwą intensywność lasera na podczerwień, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia preparatu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć krytyczne etapy naszego eksperymentalnego podejścia do badania sygnalizacji sodu w mikroszczątkach komórkowych Po opanowaniu technika ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości aktywności wywołanych wewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w nienaruszonej tkance, która jest wolna od artefaktów ruchu, jak wprowadziły inne techniki.