Name: Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj testy toksykologiczne leku epigenetycznego DZNep wpływającego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii. Metoda obejmuje ekspozycję wodną larw oraz pokarmową dorosłych osobników z analizą aktywności enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Victorowi Marquezowi za dostarczenie DZNep.HCl i Scotty'emu Bollingowi za wyprodukowanie podajników krwi. Szczepy Mopti i SUA2La An. gambiae uzyskano z Centrum Badań nad Malarią i Referencyjnych Odczynników (MR4). Prace te były wspierane przez Fralin Life Science Institute i grant z National Institutes of Health 1R21AI094289 dla Igora V. Sharakhova.

UWAGA: Trzy części protokołu opisują ekspozycję na wodę leku DZNep na larwy komarów, ekspozycję na DZNep we krwi dorosłym samicom w celu zbadania jego wpływu na płodność, oraz hamowanie hydrolazy SAH przez DZNep mierzone za pomocą prostej techniki kolorymetrycznej. Schematyczne przedstawienie tych testów pokazano na rysunku 1.
1. Testy rozwoju i przeżywalności niedojrzałych komarów
UWAGA: Ta sekcja wyjaśnia zastosowanie rozpuszczalnego w wodzie leku, który wpływa na rozwój i przeżycie larw komarów.
<ol>
	<li>Wylęgać jaja A. gambiae w temperaturze 28 °C w wodzie destylowanej (dH2O) i wychowywać je do postaci larw w drugim stadium rozwojowym.</li>
	<li>Weź sześciodołkową płytkę do hodowli komórkowej wolnej od DNAzy, RNAzy i wlej 10 ml dH2O do każdej studzienki.</li>
	<li>Wybierz larwy komarów w 2. stadium i dodaj 15 larw do dołka. Przed dodaniem 2 larw w stadium rozwojowym do talerza połóż je na ręczniku papierowym na 2-3 sekundy, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Oznacz studzienki kolorowymi taśmami, aby losowo wylosować eksperyment. Oznaczyć 2 studzienki na każde stężenie testowe na każdej płytce (rysunek 2).</li>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór podstawowy chlorowodorku DZNep (MW = 298,73), rozpuszczając 0,3 mg DZNep w 1 mldH2O. Dodać roztwór podstawowy DZNep.HCl do znakowanych studzienek, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 μM i 5,0 μM. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas (od 1 dnia do miesiąca) lub -20 °C przez długi czas (dłużej niż jeden miesiąc). 
	UWAGA: Dodanie roztworu podstawowego dla wyżej wymienionych stężeń nie zmieni znacząco objętości wody w studniach. Jednak w przypadku znacznie wyższych stężeń wskazane jest rozpuszczenie związku w pożywce larwalnej, aby uniknąć niepotrzebnego rozcieńczenia związku.</li>
	<li>Dodaj równą ilość płatkowego pokarmu dla ryb do każdej studzienki. Przykryć płytki i inkubować je w inkubatorze w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Zapisz śmiertelność larw komarów leczonych i nieleczonych DZNep po 24-godzinnym okresie ekspozycji. Usuń i wyrzuć wszelkie martwe larwy. Powtarzaj ten zapis codziennie, aż wszystkie larwy umrą lub przepoczwarzą się i wyłonią się jako dorosłe osobniki. Rejestruj wielkość larw co drugi dzień, tj. dzień 0, 2, 4, 6, 8, aż do przepoczwarzenia.</li>
	<li>Analizuj dane dotyczące rozwoju larw i śmiertelności za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej. 
	UWAGA: Wykres słupkowy może być używany do przedstawiania danych dotyczących śmiertelności w programie Microsoft Excel. Wielowymiarowa analiza wariancji (MANOVA) przeprowadzona za pomocą oprogramowania takiego jak JMP lub SPSS ujawni, czy różne dawki leku skutkują znacząco różną przeżywalnością larw komarów.</li>
</ol>
2. Test płodności poprzez podawanie leku przez sztuczny karmnik samicom komarów
UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje dodawanie leku do krwi i podawanie go dorosłym samicom komarów za pomocą systemu sztucznego karmienia.
<ol>
	<li>Ustaw klatki dla dorosłych komarów z równą liczbą komarów męskich i żeńskich do klatki kontrolnej i testowej. Do obu klatek należy dostarczyć 10% roztwór cukru nasączony wacikami, aż samice będą gotowe do karmienia (3-5 dni jest optymalne dla Anopheles gambiae).</li>
	<li>Na 2 godziny przed karmieniem krwią usuń waciki, aby upewnić się, że samice są głodne.</li>
	<li>Zmontuj dwa sztuczne podajniki krwi, które składają się z odwróconego szklanego lejka z szerokim dnem (średnica = 50 mm, długość = 70 mm) i otaczającego go tworzywa sztucznego uszczelnionego klejem przemysłowym. Rurki z tworzywa sztucznego (średnica = 7 mm) należy podłączyć do dwóch wylotów podajników (średnica = 10 mm) za pomocą łączników do dopływu i odpływu wody. Oznacz dwa podajniki jako "Kontrola" i "5 μM DZNep".</li>
	<li>Korzystając z dostępnego w handlu elementu grzejnego, skonfiguruj program do karmienia. W "Menu" przejdź do "Ustawienia" i wybierz "Nastawy"; Pojawią się wstępnie załadowane programy. Wybierz "SP1" i ustaw temperaturę na 37 °C. 
	UWAGA: Element grzejny zapewnia, że podawana krew jest utrzymywana w stałej temperaturze. Dodatkowe ustawienia programu mogą być używane dla różnych gatunków komarów lub owadów.</li>
	<li>Napełnij wiadro wodą i zanurz element grzejny w wodzie.</li>
	<li>Wytnij kwadratowy kawałek Parafilmu (50 mm x 50 mm) i rozciągnij go, aby uzyskać cienką błoniastą folię. Przykryj spód sztucznych karmników Parafilmem. Wytnij kolejny kawałek Parafilmu (50 mm x 10 mm), rozciągnij go i uszczelnij krawędzie podajników.</li>
	<li>Zmontuj system, łącząc podajniki i element grzejny za pomocą rurek. Po zakończeniu włącz system i wybierz "SP1". Naciśnij "Enter", aby uruchomić system. 
	UWAGA: Woda zostanie podgrzana do 37 °C i utrzymana w tej temperaturze.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę wody za pomocą termometru w wiadrze na wodę. 
	UWAGA: Złącza i rurki pomagają utrzymać stałą cyrkulację wody w systemie, dzięki czemu temperatura krwi pozostaje na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Napełnij tacę z płaskim dnem 10% roztworem wybielacza, który zostanie użyty do odkażenia rozlanej krwi.</li>
	<li>Dodać 2 ml zdefibrylowanej krwi owczej do probówki do mikrowirówki. Oznacz to jako "Kontrola". Powtórz proces dla probówki doświadczalnej oznaczonej jako "5 μM DZNep". Dodać 6 μl roztworu podstawowego DZNep (patrz krok 1.5) do probówki doświadczalnej oznaczonej "5 μM DZNep" Delikatnie wymieszać krew i lek, kilkakrotnie odwracając go. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodaj 2 ml próbki kontrolnej i przebadaj krew na wierzchu odpowiednio oznakowanych karmników. Wyrzuć pipetę do roztworu wybielacza. Przykryj klatkę ciemną torbą i od czasu do czasu wdychaj powietrze na klatce, aby zachęcić samice do karmienia.</li>
	<li>Pozwól komarom żerować przez około 30 minut. Po zakończeniu karmienia wyłącz element grzejny, wyjmij podajniki i usuń Parafilm. Namocz karmnik w roztworze wybielacza na około 5 minut i dobrze spłucz w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Wyjmij karmniki i połóż waciki z wodą z cukrem na klatkach na 48 godzin. Umieść na noc w klatkach naczynie na jajka zawierające wodę i bibułę filtracyjną, aby ułatwić składanie jaj. Oznaczyć każde danie jajeczne odpowiednim stężeniem testowym lub kontrolnym.</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij miskę na jajka i zbadaj liczbę i strukturę jaj pod mikroskopem stereoskopowym. Uzyskaj obrazy za pomocą oprogramowania Q-colors5. Policz liczbę jaj. Analizuj różnicę w liczbie jaj uzyskanych z klatek testowych i kontrolnych. 
	UWAGA: Niesparowany test t może być użyty do określenia, czy liczba jaj różni się znacząco (p ≤0,05).</li>
</ol>
3. Biochemiczne badanie hamowania enzymów komarów przez lek
UWAGA: Ta sekcja opisuje test aktywności enzymatycznej przy użyciu DTNB jako wskaźnika do określenia wpływu DZNep na hamowanie hydrolazy SAH u dorosłych samców i samic komarów.
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 M Na2HPO4 (dwuzasadowy fosforan sodu), dodając 14,19 g Na2HPO4 do 1 l dH2O. Następnie przygotować 0,1 M NaH2PO4 (jednozasadowy fosforan sodu), dodając 13,79 g NaH2PO4 do 1 l dH2O.</li>
	<li>Miareczkować roztwór 0,1 M Na2HPO4 roztworem 0,1 M NaH2PO4 do pH 8,5, 
	UWAGA: Będzie to roboczy roztwór podstawowy 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5).</li>
	<li>Przygotować roztwór homogenizacyjny 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5) dodając 0,3% Triton X-100, 
	UWAGA: Roztwór homogenizacyjny można przechowywać w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Przygotować roztwór 1,6 mM SAH (MW = 384,4), rozpuszczając 6,15 mg SAH w 10 ml 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5).</li>
	<li>Przygotować 1,6 mM ROZTWÓR DTNB (MW = 396,4), rozpuszczając 6,3 mg DTNB w 10 ml 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5). Świeży roztwór DTNB należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór DZNep.HCl (MW = 298,73), rozpuszczając 0,3 mg DZNep w 1 mldH2O. Następnie rozcieńczyć roztwór 1 mM DZNep do szeregu stężeń od 1 000 μM do 0,002 μM w dH2O.</li>
	<li>Aby zmierzyć inhibicję hydrolazy SAH przez DZNep, przygotuj surowy ekstrakt enzymatyczny komarów: Homogenizuj 10 dorosłych komarów niekarmionych krwią w 1 ml lodowatego 0,1 M NaH2PO4 (pH 8,5), zawierającego 0,3% Triton X-100, używając homogenizatora szklanej tkanki. Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować homogenat przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Użyć supernatantu jako źródła enzymu do testu biochemicznego SAH.</li>
	<li>W przypadku ślepej próby (tj. bez DZNep, bez enzymu) dodać 50 μl 1,6 mM SAH, 50 μl 1,6 mM DTNB i 100 μl 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5) do poszczególnych studzienek 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem.</li>
	<li>Do kontroli (tj. bez DZNep) do poszczególnych studzienek dodać 50 μl 1,6 mM SAH, 50 μl 1,6 mM DTNB, 50 μl 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,5) i 50 μl enzymu (hydrolaza SAH otrzymana z surowego ekstraktu).</li>
	<li>W przypadku zabiegów DZNep dodaj 50 μl 1,6 mM SAH, 50 μl 1,6 mM DTNB, 50 μl enzymu i 50 μl wybranego stężenia DZNep do poszczególnych studzienek. Przygotować 4 powtórzenia na zabieg i kontrolę.</li>
	<li>Odczytać gęstość optyczną (OD) próbek enzymu SAH przy długości fali 405 nm przez 5 minut w odstępach 20 sekund za pomocą 96-dołkowego czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Odjąć ślepą próbę OD od kontroli i traktowania OD uzyskanego z każdej studzienki. Obliczyć procentową pozostałą aktywność hydrolazy SAH, korzystając z następującego równania: % aktywności resztkowej = (OD po poddaniu działaniu substancji/OD kontrolny) x 100.</li>
</ol>

<ol><li>CDC Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/malaria">http://www.cdc.gov/malaria</a> (2010).</li>
<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+International+Journal+of+Organic+Evolution%22%5BJournal%5D)">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li>
<li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li>
<li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147(2009).</li>
<li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li>
<li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Direct%22%5BJournal%5D)">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless%2FdSetDB1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li>
<li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster%3A+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li>
<li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMA-1%2C+a+Mutant+p53+Reactivator%2C+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962(2014).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%2C+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase%2C+promotes+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li>
<li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40(2011).</li>
<li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).</li>
<li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li>
<li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+%28PRC2%29+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka kroków niezbędnych do pomyślnego zastosowania tego protokołu. W przypadku testu na obecność larw należy dołożyć starań, aby prawidłowo oznaczyć i powtórzyć każde badane stężenie. Randomizacja próbek testowych i dodawanie wyznaczonej ilości leku do odpowiednich dołków testowych jest ważną częścią tego zestawu eksperymentalnego. Przed dodaniem 2 larw komarów w stadium rozwojowym do 96-dołkowej mikropłytki, każdą larwę można położyć na ręczniku papierowym na 2-3 sekundy, aby usunąć nadmiar wody. Ab...

Malaria jest odpowiedzialna za największą liczbę zgonów związanych z owadami na świecie. Szacuje się, że rocznie na całym świecie występuje 219 milionów przypadków, co skutkuje około 660 000 zgonów, głównie w Afryce 1. Pomimo wspólnych wysiłków, programy walki z malarią stoją przed kilkoma wyzwaniami. Podczas gdy moskitiery nasączone środkami owadobójczymi i opryskiwanie resztkowe w pomieszczeniach stanowią kluczowe elementy programu, odporność na insektycydy w lokalnych populacjach utrudnia te wysiłki 2. Szybki wzrost populacji komarów odpornych na środki owadobójcze przypisuje się w dużej mierze zdolności komarów malarii do szybkiego przystosowania się do zmian w środowisku i wykorzystania różnych nisz 3,4,5. Aby przezwyciężyć istniejące mechanizmy oporności na insektycydy, uzasadnione jest zbadanie nowych celów insektycydowych i związków nowej generacji. Prosty, krok po kroku protokół określający skuteczność eksperymentalnych środków owadobójczych na różnych etapach życia komarów wywołujących malarię znacznie zwiększyłby te wysiłki.
Badania farmakologiczne wpływu leków na linie komórkowe i modele zwierzęce wykazały użycie leków epigenetycznych jako użytecznego narzędzia do modulowania genetyki i fizjologii komórek i organizmów. Metylacja DNA i modyfikacja histonów to dwa mechanizmy epigenetyczne, które wpływają na ekspresję genów w organizmach wielokomórkowych bez zmiany leżącej u podstaw sekwencji DNA 6. Modyfikacje potranslacyjne, takie jak metylacja, odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności komórkowej i ekspresji genów oraz mogą wpływać na kilka podstawowych procesów 7,8,9. Badania nad niektórymi gatunkami owadów podkreśliły znaczenie epigenetyki w procesach obejmujących oogenezę i utrzymanie komórek macierzystych 10 , a także kompensację dawki 11 . Jednak takie aspekty w przypadku wektorów chorób nie zostały jeszcze zbadane. Użycie związku do modulowania tego systemu u komarów może dostarczyć nam wglądu w nowe szlaki docelowe insektycydów. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) jest znanym inhibitorem metylacji histonów, którego wpływ na różne rodzaje nowotworów badano 12,13,14,15,16. DZNep jest stabilnym, rozpuszczalnym w wodzie lekiem epigenetycznym, który pośrednio hamuje N-metylotransferazę lizyny histonowej (EZH2), składnik kompleksu represyjnego polycomb 2 (PRC2) w komórkach ssaków. PRC2 odgrywa ważną rolę w regulacji wzrostu komórek macierzystych w organizmach wielokomórkowych, a metylacja histonów jest kluczowym aspektem wyciszania genów za pośrednictwem PRC2. U myszy z obniżoną odpornością wykazano, że komórki wstępnie potraktowane DZNep są mniej rakotwórcze 17. Lek ten jest stosowany do badania innych chorób, takich jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby, w której EZH2 jest zaangażowany 18. DZNep jest uznanym inhibitorem hydrolazy S-adenozylohomocysteiny (SAH) 19,20. Hamowanie hydrolazy SAH powoduje akumulację SAH, a to z kolei prowadzi do zahamowania aktywności metylotransferazy poprzez ograniczenie dostępnych grup donorowych metylu. SAH jest pochodną aminokwasu wykorzystywaną przez wiele organizmów, w tym owady, w ich szlakach metabolicznych. Niedawne badanie wykazało, że DZNep w małych dawkach może wpływać na diapauzę i opóźniać rozwój owadów 21.
Tutaj opracowany jest solidny protokół do badania wpływu rozpuszczalnego w wodzie związku na różne etapy życia komarów. Trzy części tego protokołu zawierają instrukcje dotyczące badania wpływu rozpuszczalnego w wodzie związku na niedojrzałe komary, dorosłe samice żywiące się krwią oraz aktywność enzymatyczną dorosłych samców i samic komarów. Po pierwsze, DZNep rozpuszcza się w wodzie w celu zbadania rozwoju i przetrwania niedojrzałych komarów. Przeprowadza się to przy dwóch stężeniach w celu porównania wszelkich różnic wynikających z 10-krotnego wzrostu ekspozycji na lek. Aby zbadać wpływ leku na dorosłe samice komarów, DZNep dodaje się do defibrylowanej krwi owiec i sztucznie podaje krew samicom. Następnie badany jest wpływ leku na płodność. Na koniec przeprowadza się test aktywności enzymatycznej przy użyciu kwasu 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowego) (DTNB) jako wskaźnika w celu określenia wpływu DZNep na hamowanie hydrolazy SAH u dorosłych samców i samic komarów. Chociaż protokół ten został opracowany z komarem malarii, Anopheles gambiae, można go łatwo dostosować do badania wpływu interesujących związków na dowolny gatunek komarów lub innych owadów. Techniki wyszczególnione w niniejszym protokole mogą nie być skutecznie stosowane w przypadku leku o ograniczonej rozpuszczalności lub zerowej rozpuszczalności w wodzie lub środowisku wodnym.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa mikropłytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>Można użyć innej wirówki</td></tr><tr><td>Kolorowe rolki taśmy</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr>Kubki <td></td><td></td><td></td>do<td>misek na jajka</td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Podajniki szkła</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td></td><td></td><td></td>tkanek szklanych</tr><tr><td>Element grzejny</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Percival naukowy</td><td>I36VLC8</td><td>Można użyć innego inkubatora</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki, 1,5&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr&nbsp;</td>Czytnik płytek <td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>sklep pod adresem -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Odporność na insektycydy stanowi poważny problem dla programów kontroli malarii. Komary szybko przystosowują się do szerokiego zakresu zmian w środowisku, co sprawia, że zwalczanie malarii jest wszechobecnym problemem w krajach tropikalnych. Pojawienie się populacji odpornych na insektycydy uzasadnia badanie nowych szlaków docelowych leków i związków do zwalczania komarów-wektorów. Leki epigenetyczne są dobrze ugruntowane w badaniach nad rakiem, jednak niewiele wiadomo o ich wpływie na owady. Badanie to dostarcza prostego protokołu do badania toksykologicznego wpływu 3-deazaneplanocyny A (DZNep), eksperymentalnego leku epigenetycznego do terapii raka, na wektora malarii, Anopheles gambiae. U niedojrzałych komarów narażonych na działanie DZNep zaobserwowano zależny od stężenia wzrost śmiertelności i zmniejszenie rozmiaru, podczas gdy związek ten zmniejszał płodność dorosłych komarów w porównaniu z leczeniem kontrolnym. Ponadto stwierdzono zależny od leków spadek aktywności hydrolazy S-adenozylohomocysteiny (SAH) u komarów po ekspozycji na DZNep w porównaniu z leczeniem kontrolnym. Protokoły te zapewniają badaczowi prostą, krok po kroku procedurę oceny wielu toksykologicznych punktów końcowych dla eksperymentalnego leku, a co za tym idzie, demonstrują unikalne, wielotorowe podejście do badania toksykologicznych skutków rozpuszczalnych w wodzie leków epigenetycznych lub związków będących przedmiotem zainteresowania przeciwko komarom wektorom i innym owadom.

Rycina 1 przedstawia schemat analiz; opisuje ona poszczególne etapy procedury wymienionej w niniejszym artykule. Ponieważ protokół opiera się na różnych stadiach rozwojowych komarów, w przypadku opisanych tutaj eksperymentów nie ma określonej kolejności przeprowadzania. Użytkownik może zdecydować się na wykonanie jednej lub kilku analiz jednocześnie, w zależności od dostępności próbek.

Rysunek 2 przedstawia układ płytek dla testów rozwoju i przeżywalno...

Protokół został opracowany w celu zbadania wpływu epigenetycznego leku DZNep na rozwój, płodność i przeżywalność komarów. W tym miejscu opisujemy procedury wodnej ekspozycji DZNep na niedojrzałe komary oraz ekspozycji DZNep we krwi na dorosłe komary, a także pomiar hamowania hydrolazy SAH.

Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu leku epigenetycznego na różne etapy życia komarów wywołujących malarię. Osiąga się to poprzez rozpuszczenie leku w środowisku niedojrzałych komarów w celu określenia jego wpływu na larwy, przeżywalność i wielkość ciała. Lek dodaje się również do krwi ssaków i karmi dorosłymi samicami komarów, które przetestują wpływ leku na rozrodczość.Na koniec przeprowadza się test enzymatyczny w celu zbadania hamowania enzymu komara przez lek. Wyniki pokazują wpływ zmian epigenetycznych na przeżywalność komarów malarii, a w przypadku Conti na podstawie analizy testów biologicznych, Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego protokołu. Kiedy dowiadujemy się o tym, że dine jest rozwijany jako obiecujący przeciwnowotworowy lek epigenetyczny, lek ten indukuje śmierć apoptotyczną w ludzkich komórkach rakowych, ponieważ mechanizmy modyfikacji histo są konserwatywne zwierzęta hormonalne, w pewnym sensie degustujemy jako aplikację do działania na komara malarii.Na początek wybierz larwy komara Novelis Gambi na drugim miejscu w gwiazdce i połóż je na ręczniku papierowym na dwie do trzech sekund, aby usunąć nadmiar wody. Następnie delikatnie dodaj 1

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym wywiadzie George Dimopoulos skupia się na mechanizmach fizjologicznych wykorzystywanych przez komary do zwalczania infekcji wywoływanych przez Plasmodium falciparum oraz wirusa dengi. Wyjaśniono, w jaki sposób identyfikuje się u komarów kluczowe geny refrakcyjne, czyli geny nadające odporność na patogeny wektora, oraz jak tę wiedzę można wykorzystać do stworzenia transgenicznych komarów, które nie są w stanie przenosić pasożyta malarii ani wirusa dengi.

Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

W tym filmie pokazujemy miejscowy test testowy w celu określenia toksyczności potencjalnego środka owadobójczego na dorosłe samice komarów. Wykorzystując antagonistę receptora dopaminy, który powoduje śmiertelne hamowanie neuroprzekaźnictwa u komarów, metoda ta opisuje sposób oceny toksycznego działania insektycydów po miejscowym stosowaniu.

Test do badań miejscowych: technika oceny potencjału owadobójczego antagonistów receptora dopaminy u dorosłych samic komarów poprzez zastosowanie miejscowe

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.

Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów

Opisana to oszczędzająca czas i miejsce metoda liczenia jaj i określania szybkości wylęgu poszczególnych komarów za pomocą 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, co może znacznie zwiększyć skalę i szybkość testów płodności i płodności.

Ulepszony test płodności i płodności dla Aedes aegypti przy użyciu 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (płytki EAgaL)

Opisujemy metodologię i znaczenie testu biologicznego do stosowania miejscowego do pomiaru podatności na insektycydy u komarów i muszek owocowych. Prezentowany test jest wysokoprzepustowy, wykorzystuje masę owadów - co pozwala na obliczenie zrelatywizowanej dawki śmiertelnej zamiast stężenia - i prawdopodobnie ma mniejszą zmienność niż inne podobne metody.

Test biologiczny do stosowania miejscowego w celu ilościowego określenia toksyczności insektycydów dla komarów i muszek owocowych

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj testy toksykologiczne leku epigenetycznego DZNep wpływającego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii. Metoda obejmuje ekspozycję wodną larw oraz pokarmową dorosłych osobników z analizą aktywności enzymatycznej.

Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

Przeglądaj więcej filmów